CN116355893B - 一种磁珠法核酸提取试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种磁珠法核酸提取试剂盒及其应用。本发明提供了一种组合物，包含以下体积百分比的组分：20～80％甘油和20～60％乙醇。该组合物作为核酸提取中的清洗液可以提高核酸提取的质量，提取核酸的质量与全自动核酸提取仪的质量相当，并且手动提取核酸的整个过程约5min，同时，其可以与核酸提取仪联用，可以进一步将时间缩短为3～5分钟；该组合物可用于制备用于核酸提取的产品(试剂、试剂盒、系统)。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种磁珠法核酸提取试剂盒及其应用。
背景技术
核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命必不可少的组成物质，广泛存在于动植物细胞、微生物体内，分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。目前，在分子生物学科的各个研究检测领域都离不开核酸的检测，核酸的提取纯化是分子生物学研究和临床检测的基础。
目前全国乃至全球对于核酸样本处理的卡脖子问题就是时间太长、步骤繁琐，操作复杂。免提取快速处理法(常规需要5-10分钟)存在效果差、提取的核酸量少且纯度较低，容易导致漏检错检等问题。现有的核酸提取方法主要包括碱裂解法、酚氯仿抽提法、螯合树脂法、离心柱膜吸附法以及磁珠法等。其中，碱裂解法等由于在提取过程中使用了有毒有害的有机溶剂，具有核酸质量不佳、操作步骤繁琐、耗时较长的缺陷。相较于其他方法，磁珠法操作更为简便，能够保证核酸的质量，适用于多种样品类型，并且对样品要求较低，但是，存在操作步骤繁琐，时间长(普遍约30～60分钟)等问题。因此，有必要开发一种保证核酸质量、提取速度快的核酸提取试剂和方法。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供甘油在制备清洗液中的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供一种组合物。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第二方面的组合物的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂。
本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第六方面的目的，在于提供一种检测系统。
本发明第七方面的目的，在于提供一种核酸提取方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供甘油在作为和/或制备清洗液中的应用，所述清洗液用于核酸提取。
发明人首次发现甘油可以作为清洗液的主要成分，用于核酸提取，并且与传统的清洗液相比，在减少清洗次数的情况下，其核酸提取质量反而更高。
优选地，所述清洗液用于磁珠法核酸提取。
优选地，所述甘油在所述清洗液中的含量为20～80v/v％；进一步为25～75v/v％；更进一步为40～50v/v％；再进一步为50v/v％。
优选地，所述甘油为无水甘油。
优选地，所述清洗液还包含乙醇。
优选地，所述乙醇在所述清洗液中的含量为20～60v/v％；进一步为25～50v/v％；更进一步为50v/v％。
优选地，所述乙醇为无水乙醇。
优选地，所述清洗液还包含水。
优选地，所述水的用量为余量。
优选地，所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述核酸来自细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒中的至少一种；进一步优选地，所述核酸来自DNA病毒。
优选地，所述核酸提取的样本包含：血液、唾液、尿液、胸腹水、痰液、粪便、咽拭子样本中的至少一种；进一步包含唾液、咽拭子样本中的至少一种。
优选地，所述核酸用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，包含以下体积百分比的组分：20～80％甘油和20～60％乙醇。
发明人首次发现甘油可以作为清洗液的主要成分，用于核酸提取，并且首次将其与乙醇组合作为清洗液，用于核酸提取，其中，甘油是一种有机溶剂，甘油能溶解疏水性的蛋白；而核酸不溶于乙醇，但乙醇能溶解一部分蛋白和其它杂质，从而达到清洗的效果。
优选地，所述甘油在所述组合物中的含量为25～75v/v％；进一步为40～50v/v％；更进一步为50v/v％。
优选地，所述甘油为无水甘油。
优选地，所述乙醇在所述组合物中的含量为25～50v/v％；进一步为50v/v％。
优选地，所述乙醇为无水乙醇。
优选地，所述组合物还包含水。
优选地，所述水的用量为余量。
优选地，所述组合物作为核酸提取的清洗液。
优选地，所述组合物作为磁珠法核酸提取的清洗液。
优选地，所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述核酸来自细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒中的至少一种；进一步优选地，所述核酸来自DNA病毒。
优选地，所述核酸提取的样本包含：血液、唾液、尿液、胸腹水、痰液、粪便、咽拭子样本中的至少一种；进一步包含唾液、咽拭子样本中的至少一种。
优选地，所述核酸用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交。
本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面的组合物在作为和/或制备产品中的应用，所述产品用于核酸提取。
优选地，所述产品用于磁珠法核酸提取。
优选地，所述产品包含：试剂、试剂盒、系统中的至少一种。
优选地，所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述核酸来自细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒中的至少一种；进一步优选地，所述核酸来自DNA病毒。
优选地，所述核酸提取的样本包含：血液、唾液、尿液、胸腹水、痰液、粪便、咽拭子样本中的至少一种；进一步包含唾液、咽拭子样本中的至少一种。
优选地，所述核酸用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交。
本发明的第四个方面，提供一种试剂，包含本发明第二个方面的组合物。
优选地，所述试剂用于核酸提取。
优选地，所述试剂用于磁珠法核酸提取。
优选地，所述试剂用作磁珠法核酸提取的清洗液。
优选地，所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述核酸来自细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒中的至少一种；进一步优选地，所述核酸来自DNA病毒。
优选地，所述核酸提取的样本包含：血液、唾液、尿液、胸腹水、痰液、粪便、咽拭子样本中的至少一种；进一步包含唾液、咽拭子样本中的至少一种。
优选地，所述核酸用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交。
本发明的第五个方面，提供一种试剂盒，包含b1)～b2)中至少一种：
b1)本发明第二个方面的组合物；
b2)本发明第四个方面的试剂。
优选地，所述试剂盒还包含：裂解液。
优选地，所述裂解液包含：胍盐、柠檬酸三钠、表面活性剂、还原剂和糖原。
优选地，所述胍盐能够溶解蛋白裂解细胞、抑制DNA酶和RNA酶的活性。
优选地，所述胍盐包含盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍中的至少一种；进一步包含异硫氰酸胍。
优选地，所述胍盐在所述裂解液中的浓度为0.1～10M；进一步为1～10M；更进一步为4M。
优选地，所述柠檬酸三钠在所述裂解液中的的浓度为5～50mM；进一步为10～50mM；更进一步为25mM。
优选地，所述表面活性剂具有使蛋白质变性并包裹蛋白质的功能。
优选地，所述表面活性剂包含阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂中的至少一种；进一步包含阴离子表面活性剂；更进一步包含十二烷基肌氨酸钠、十二氨基丙磺酸中的至少一种；再进一步包含十二烷基肌氨酸钠。
优选地，所述表面活性剂在所述裂解液中的浓度为5～50mM；进一步为10～40mM；更进一步为20mM。
优选地，所述还原剂具有还原二硫键的功能。
优选地，所述还原剂包含二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、TECP(三(2-羧乙基)膦)中的至少一种；进一步包含DTT。
优选地，所述还原剂在所述裂解液中的浓度为0.1～10mM；进一步为0.5～5mM；更进一步为1mM。
优选地，所述糖原的分子量为10000～120000；进一步为25000～100000。
优选地，所述糖原在所述裂解液中的浓度为0.05～1μg/mL；进一步为0.1～0.5μg/mL；更进一步为0.1μg/mL。
优选地，所述裂解液包含：异硫氰酸胍、柠檬酸三钠、十二烷基肌氨酸钠、DTT和糖原。
裂解液液主要通过与样本的混匀方式，使样本中的核酸以游离状态释放出来。其中，异硫氰酸胍是一种强效的蛋白变性剂，它能够溶解蛋白裂解细胞，使核酸释放出来，并且异硫氰酸胍也能够抑制DNA酶和RNA酶的活性，从而维持核酸的稳定；柠檬酸三钠是一种抗凝血剂，在处理血液样品时具有良好的抗凝血功能，它也能通过去除Mg离子的方式抑制DNA酶活性；十二烷基肌氨酸钠是一种表面活性剂，它具有使蛋白质变性并包裹蛋白质的功能；DTT是一种能还原分子内部二硫键的还原剂，它能抑制蛋白或核酸间巯基的相互作用，并抑制形成聚集体，从而保持蛋白质结构的稳定；糖原则有助于捕获核酸，使它们形成沉淀，以提高核酸的回收效率。
优选地，所述试剂盒还包含：洗脱液。
优选地，所述洗脱液包含：缓冲液和螯合剂。
优选地，所述缓冲液包含：Tris-HCl、PBS中的至少一种；进一步包含Tris-HCl。
优选地，所述缓冲液在所述洗脱液中的浓度为1～100mM；进一步为5～20mM；更进一步为10mM。
优选地，所述螯合剂包含：乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种；进一步包含：乙二胺四乙酸。
优选地，所述螯合剂在所述洗脱液中的浓度为0.1～10mM；进一步为0.5～2mM；更进一步为1mM。
优选地，所述洗脱液的pH为7～9；进一步为7.5～8.5；更进一步为8。
优选地，所述洗脱液包含：Tris-HCl和乙二胺四乙酸；其中，洗脱液的Tris-HCl主要维持溶液的pH值；EDTA则能作为一种螯合剂，将金属离子螯合到酶中，从而降低DNA酶和RNA酶活性。
优选地，所述试剂盒还包含：磁珠；磁珠能与核酸特异性识别，并高效结合；在洗脱时，洗脱液又能将与磁珠结合的核酸溶解，从而达到分离核酸的效果。
优选地，所述试剂盒用于核酸提取。
优选地，所述试剂盒用于磁珠法核酸提取。
优选地，所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述核酸来自细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒中的至少一种；进一步优选地，所述核酸来自DNA病毒。
优选地，所述核酸提取的样本包含：血液、唾液、尿液、胸腹水、痰液、粪便、咽拭子样本中的至少一种；进一步包含唾液、咽拭子样本中的至少一种。
优选地，所述核酸用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交。
本发明的第六个方面，提供一种系统，包含：c1)～c3)中至少一种和核酸提取仪：
c1)本发明第二个方面的组合物；
c2)本发明第四个方面的试剂；
c3)本发明第五个方面的试剂盒。
优选地，所述核酸提取仪为全自动核酸提取仪。
优选地，所述系统用于核酸提取。
优选地，所述系统用于磁珠法核酸提取。
优选地，所述核酸包含DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述核酸来自细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒中的至少一种；进一步优选地，所述核酸来自DNA病毒。
优选地，所述核酸提取的样本包含：血液、唾液、尿液、胸腹水、痰液、粪便、咽拭子样本中的至少一种；进一步包含唾液、咽拭子样本中的至少一种。
优选地，所述核酸用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建或Southern杂交。
本发明的第七个方面，提供一种核酸提取方法，包含：采用d1)～d4)中至少一种的步骤；
d1)本发明第二个方面的组合物；
d2)本发明第四个方面的试剂；
d3)本发明第五个方面的试剂盒；
d4)本发明第六个方面的系统。
优选地，所述方法包含：e1)～e3)中至少一种：
e1)采用本发明第二个方面的组合物和/或本发明第四个方面的试剂清洗核酸的步骤；
e2)采用本发明第五个方面的试剂盒提取和/或清洗核酸的步骤；
e3)采用本发明第六个方面的系统提取核酸的步骤。
优选地，所述方法包括如下步骤：将磁珠、裂解液、待测样本混合反应，再经本发明第二个方面的组合物清洗后，利用洗脱液洗脱，得到核酸溶液。
优选地，所述方法包括如下步骤：将磁珠和裂解液混合，得到混合液A；将混合液A与待测样本混合，裂解，磁吸附；加入本发明第二个方面的组合物进行清洗，磁吸附去除液体；加入洗脱液洗脱，磁吸附得到核酸溶液。
优选地，所述磁珠为去除磁珠缓冲液的磁珠。
优选地，所述磁珠和裂解液的混合时间为25～35s。
优选地，所述裂解的时间为50～90s。
优选地，所述加入清洗液前的磁吸附的时间为20～40s。
优选地，所述磁吸附去除液体前还包括如下步骤：将清洗液与磁珠混匀。
优选地，所述磁吸附去除液体中磁吸附的时间为20～40s。
优选地，所述磁吸附得到核酸溶液前还包括如下步骤：将洗脱液与磁珠混匀。
优选地，所述磁吸附得到核酸溶液中磁吸附的时间为20～40s。
优选地，所述核酸提取方法的时间为4.5～8.5min；进一步为4.5～6.5min；更进一步为4.5～5.5min。
本发明的有益效果是：
本发明基于发明人首次发现甘油可以作为清洗液的主要成分，用于核酸提取，并且与传统的清洗液相比，在减少清洗次数的情况下，其核酸提取质量反而更高，因此，本发明首次提出甘油在作为和/或制备用于核酸提取的清洗液中的应用。
本发明提供了一种组合物，包含以下体积百分比的组分：20～80％甘油和20～60％乙醇。该组合物作为核酸提取中的清洗液可以提高核酸提取的质量，提取核酸的质量与全自动核酸提取仪的质量相当，并且手动提取核酸的整个过程约5min，同时，其可以与核酸提取仪联用，可以进一步将时间缩短为3～5分钟；该组合物可用于制备用于核酸提取的产品(试剂、试剂盒、系统)。
附图说明
图1是本申请(实施例7～12)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增曲线图。
图2是本申请(实施例9～10)、对比例2的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增曲线图。
图3是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取稀释倍数50的RSV得到的核酸扩增曲线图。
图4是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取稀释倍数5-1的RSV得到的核酸扩增曲线图。
图5是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取稀释倍数5-2的RSV得到的核酸扩增曲线图。
图6是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取稀释倍数5-3的RSV得到的核酸扩增曲线图。
图7是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取稀释倍数5-4的RSV得到的核酸扩增曲线图。
图8是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取稀释倍数5-5的RSV得到的核酸扩增曲线图。
图9是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的RSV的核酸的扩增曲线图。
图10是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的ADV的核酸的扩增曲线图。
图11是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的咽拭子-RSV的核酸的扩增曲线图。
图12是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的咽拭子-SARS-CoV-2的核酸的FAM通道的扩增曲线图。
图13是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的咽拭子-SARS-CoV-2的核酸的VIC通道的扩增曲线图。
图14是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的咽拭子-SARS-CoV-2的核酸的ROX通道的扩增曲线图。
图15是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的咽拭子-ADV的核酸的扩增曲线图。
图16是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的唾液-RSV的核酸的扩增曲线图。
图17是本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的唾液-ADV的核酸的扩增曲线图。
图18是本申请(实施例10)、对比例4、6、8、10、12的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。下述实施例中的糖原的分子量为25000～100000(上海生工，A620301-0005)。
下述实施例、对比例中的甘油为无水甘油，乙醇为无水乙醇，异丙醇为无水异丙醇。
实施例1一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：25％甘油、25％乙醇和余量水。
实施例2一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：40％甘油、25％乙醇和余量水。
实施例3一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：50％甘油、25％乙醇和余量水。
实施例4一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：50％甘油和50％乙醇。
实施例5一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：60％甘油、25％乙醇和余量水。
实施例6一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：75％甘油和25％乙醇。
实施例7一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为实施例1中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0。
实施例8一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为实施例2中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
实施例9一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为实施例3中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
实施例10一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为实施例4中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
实施例11一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为实施例5中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
实施例12一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为实施例6中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
对比例1一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，包含：100v/v％异丙醇和75v/v％乙醇；其中，异丙醇和乙醇独立存在。
对比例2一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为对比例1中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
对比例3一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，按体积百分比计，由以下组分组成：50％甘油和50％异丙醇。
对比例4一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为对比例3中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
对比例5一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，由以下组分组成：50v/v％甘油和2.5M氯化钠。
对比例6一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为对比例5中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
对比例7一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，由以下组分组成：50v/v％甘油和10wt％PEG6000。
对比例8一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为对比例7中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
对比例9一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，由以下组分组成：50v/v％甘油和50mM Tris-HCl；其中，清洗液的pH为8.0。
对比例10一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为对比例9中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
对比例11一种用于磁珠法核酸提取的清洗液
一种用于磁珠法核酸提取的清洗液，由以下组分组成：50v/v％甘油和1wt％TritonX-100。
对比例12一种磁珠法核酸提取试剂盒
一种磁珠法核酸提取试剂盒，由裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠组成；其中，
裂解液由以下组分组成：4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、20mM十二烷基肌氨酸钠、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1μg/mL糖原；
清洗液为对比例11中的清洗液；
洗脱液由以下组分组成：10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0。
效果实施例1
以10倍稀释的呼吸道合胞病毒(RSV，1×105copies/mL)的细胞培养液为样本，分别以本申请(实施例10)、对比例4、6、8、10、12的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取，同时，以商品化全自动核酸提取仪(朗司MGX-800e)及其配套提取试剂进行核酸提取作为对照(具体操作步骤参照说明书)。
以本申请(实施例10)、对比例4、6、8、10、12的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的方法，具体步骤如表1所示。
表1以本申请(实施例10)、对比例4、6、8、10、12的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的步骤
每组实验进行三次平行操作，提取后的核酸用呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行上机检测，记录扩增的Ct值。结果如图18及表2所示：采用本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸的质量最高(质量高于以甘油与异丙醇/氯化钠/PEG6000/Tris-HCl/TritonX-100组成的清洗液的磁珠法核酸提取试剂盒)，得到的核酸浓度最高，最接近全自动核酸提取仪的质量，因此，选择甘油和乙醇作为清洗液的组分。
表2本申请(实施例10)、对比例4、6、8、10、12的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增的Ct值
| 提取方法 | Ct值平均值±SD |
| 实施例10 | 31.47±0.06 |
| 对比例4 | 34.72±0.40(与实施例10相比，P＜0.001) |
| 对比例6 | 37.60±1.61(与实施例10相比，P＝0.006) |
| 对比例8 | 32.92±0.66(与实施例10相比，P＝0.04) |
| 对比例10 | 34.63±0.27(与实施例10相比，P＜0.001) |
| 对比例12 | 35.41±0.45(与实施例10相比，P＜0.001) |
| 全自动核酸提取仪 | 28.94±0.07 |
效果实施例2
以10倍稀释的呼吸道合胞病毒(RSV，1×105copies/mL)的细胞培养液为样本，分别以本申请(实施例7～12)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取，同时，以商品化全自动核酸提取仪(朗司MGX-800e)及其配套提取试剂进行核酸提取作为对照(具体操作步骤参照说明书)。
以本申请(实施例7～12)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的方法，具体步骤如表1所示。
每组实验进行三次平行操作，提取后的核酸用呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行上机检测，记录扩增的Ct值。结果如图1及表3所示：采用本申请(实施例7～12)的磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸的质量与全自动核酸提取仪的质量相当，但是，采用本申请(实施例7～12)的磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸整个过程仅需5min，而全自动核酸提取仪需要25min；并且当清洗液中甘油的浓度为50％时(实施例10)，其核酸提取效果最佳(Ct值显著低于实施例7、8、11、12，P值分别为0.01、0.03、0.02、0.01；尽管与实施例9不存在显著性差异，但是其Ct值仍略低于实施例9)。
表3本申请(实施例7～12)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增的Ct值
| 提取方法 | Ct值平均值±SD |
| 实施例7 | 31.23±0.14 |
| 实施例8 | 31.09±0.18 |
| 实施例9 | 30.84±0.34 |
| 实施例10 | 30.51±0.18 |
| 实施例11 | 31.25±0.20 |
| 实施例12 | 31.38±0.20 |
| 全自动核酸提取仪 | 29.10±0.23 |
效果实施例3
以10倍稀释的呼吸道合胞病毒(RSV，1×105copies/mL)的细胞培养液为样本，分别以本申请(实施例9～10)、对比例2的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取，同时，以商品化全自动核酸提取仪进行核酸提取作为对照(具体操作步骤参照说明书)。
以本申请(实施例9～10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的方法，具体步骤如表1所示。
以对比例2的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取，具体步骤如表1所示，区别仅在于：步骤4：向软管中加入100uL 100％异丙醇，待清洗液流至磁珠处，用手轻揉软管1min使磁珠与清洗液充分混匀；向软管中加入100uL 75％乙醇，待清洗液流至磁珠处，用手轻揉软管1min使磁珠与清洗液充分混匀，乙醇清洗重复1次。随后，磁铁在软管外吸附磁珠，并让剩余液体随重力从软管中流出。
每组实验进行三次平行操作，提取后的核酸用呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行上机检测，记录扩增的Ct值。结果如图2及表4所示：采用本申请(实施例9～10)的磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸的质量与全自动核酸提取仪的质量相当，但是，采用本申请(实施例9～10)的磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸整个过程仅需5min，而全自动核酸提取仪需要25min；并且，与传统的异丙醇和75％乙醇多次清洗(对比例2)相比，以包含甘油和乙醇的清洗液(本申请(实施例9～10))仅进行一次清洗的提取质量反而更高(实施例9、10与对比例2有显著性差异(P值均小于0.01)，表明以包含甘油和乙醇的清洗液作为磁珠核酸提取试剂盒中的清洗液具有更高的核酸提取效率。
表4本申请(实施例9～10)、对比例2的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增的Ct值
| 提取方法 | Ct值平均值±SD |
| 实施例9 | 31.17±0.01 |
| 实施例10 | 30.69±0.28 |
| 对比例2 | 34.05±0.48 |
| 全自动核酸提取仪 | 29.39±0.26 |
效果实施例4
以呼吸道合胞病毒(RSV，1×106copies/mL)的细胞培养液为样本，按照5×浓度梯度稀释，以本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取，同时，以商品化全自动核酸提取仪进行核酸提取作为对照(具体操作步骤参照说明书)。
以本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的方法，具体步骤如表1所示。
每组实验进行三次平行操作，提取后的核酸用呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行上机检测，记录扩增的Ct值。结果如图3～8及表5所示：采用本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒和全自动核酸提取仪提取5-4的呼吸道合胞病毒(RSV)的细胞培养液都能检测到Ct值，但提取5-5的呼吸道合胞病毒(RSV)的细胞培养液均不能检测到Ct值，可见，采用本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒和全自动核酸提取仪提取的灵敏度相当。
表5本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的核酸扩增的Ct值
效果实施例5
为评价本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒提取DNA和RNA的效果，选择含腺病毒ADV(DNA病毒)和含呼吸道合胞病毒RSV(RNA病毒)的咽拭子临床样品，并分别以本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取(以本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的方法，具体步骤如表1所示)，同时，以商品化全自动核酸提取仪进行核酸提取作为对照(具体操作步骤参照说明书)，提取后分别用腺病毒荧光定量PCR检测试剂盒和呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行检测，记录Ct值。结果如图9、10及表6所示：当样本病毒为RNA病毒RSV时，采用本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒的核酸提取质量略差于全自动核酸提取仪；当样本病毒为DNA病毒ADV时，采用本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒的核酸提取质量略好于全自动核酸提取仪。说明采用本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒提取临床样本一样有比较好的效果，尤其时当样本病毒为无包膜的DNA病毒时，效果更好。
表6本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的DNA/RNA扩增的Ct值
效果实施例6
为评价本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒是否可以提取不同类型的呼吸道样品，如咽拭子和唾液等(具体如表7所示)，分别以本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取(以本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的方法，具体步骤如表1所示)，同时，以商品化全自动核酸提取仪进行核酸提取作为对照(具体操作步骤参照说明书)，提取后分别用腺病毒荧光定量PCR检测试剂盒、呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测试剂盒、新型冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒(其中，对新型冠状病毒的检测包含了三个荧光通道，依次为FAM、VIC和ROX)进行检测，记录Ct值。结果如图11～17及表7所示：提取临床样本咽拭子和唾液的核酸时，本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸效果均很好：其中，当样本为咽拭子或唾液中的RSV时，本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒的提取质量接近全自动核酸提取仪；当样本为咽拭子中的SARS-CoV-2或咽拭子、唾液中的ADV时，本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒的提取质量均优于全自动核酸提取仪。说明本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒具有良好的临床样本检测前景。
表7本申请(实施例10)的磁珠法核酸提取试剂盒以及全自动核酸提取仪提取得到的不同类型的呼吸道样品的核酸扩增的Ct值
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：将磁珠、裂解液、待测样本混合反应，再经清洗液清洗后，利用洗脱液洗脱，得到核酸溶液；
所述裂解液包含：0.1～10M胍盐、5～50mM柠檬酸三钠、5～50mM表面活性剂、0.1～10mM还原剂和0.05～1μg/mL糖原；
所述洗脱液包含：1～100mM缓冲液和0.1～10mM 螯合剂；
所述清洗液为组合物；
所述组合物由50 v/v% 甘油和50 v/v % 乙醇组成；
所述核酸来自DNA病毒、和/或RNA病毒；
所述核酸提取方法的时间为4.5～8.5min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述胍盐包含：盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂包含：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂包含：阴离子表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂包含：十二烷基肌氨酸钠、十二氨基丙磺酸中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述还原剂具有还原二硫键的功能。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述还原剂包含二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖原的分子量为10000～120000。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述糖原的分子量为25000～100000。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液包含：Tris-HCl、PBS中的至少一种；和/或
所述螯合剂包含：乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种。
11.根据权利要求1～10任一项所述的方法，其特征在于：
所述方法采用核酸提取仪进行。
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