CN1187538A

CN1187538A - Dna的回收方法

Info

Publication number: CN1187538A
Application number: CN97114849A
Authority: CN
Inventors: 林崎良英
Original assignee: Rike Corp
Current assignee: Rike Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1996-06-18
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 1998-07-15

Abstract

回收纯化的DNA的方法。其一是在载体存在下使微生物菌体溶菌,使由溶菌得到的DNA吸附在载体上;将溶菌和吸附用的溶液与载体分离;用可使DNA溶出的溶液使吸附于载体上的DNA溶出而回收。另一法是,向装有膜滤器和载体的柱供给微生物菌体;将柱中的微生物菌体溶菌,使由溶菌得到的DNA吸附在载体上;由柱中除去溶菌和吸附用的溶液;将可使DNA溶出用溶液加入柱中,对载体上的DNA进行吸引回收。

Description

DNA的回收方法

本发明是关于微生物中含有的DNA的回收方法。

在基因工程的领域中，常常需要使大肠杆菌等微生物进行性状转变，培养所得到的性状转变体、从复制扩增的性状转变体回收所希望的质粒DNA。

但是，从性状转变体回收、纯化质粒DNA需要很多道工序，要花费工夫。因此，有人提出了更简单地回收、纯化质粒DNA的方法。

例如，在特开平4-360686中公开了，通过膜滤器从将微生物菌体进行溶菌的溶液中除去溶液中的不溶物，接着利用超滤除去杂质，然后将DNA浓缩的质粒DNA和/或粘接DNA的纯化方法。

再有，在特开平8-23976中公开了，利用平均孔径10nm-35nm的过滤器，从质粒混合液中除去杂质的超卷曲状质粒DNA的纯化方法。

但是，在用这些方法纯化的DNA中，在微生物菌体中还含有与DNA同时含有的RNA，为了只回收DNA，需要另外的RNA分解工序。

作为分离RNA和DNA的方法，已经知道同时使用DNA吸附性载体和离液序列高的溶液的方法(离液序列高的离子法)(R.Roomet al，J.Clin.MicroBiol。Vol.28，No.3，P495-503)。利用该方法除去微生物菌体中与DNA同时含有的RNA，仅纯化DNA的方法，在特开平7-250681中已被揭示。

该方法是包括下述工序的质粒DNA的提取纯化方法，即将性状转变体培养液集菌在第1DNA提取纯化用滤筒中的工序；溶菌及不要的RNA的分离工序；利用第1DNA提取纯化用滤筒过滤杂质的工序；用第2DNA提取纯化用滤筒进行吸附、洗净、溶出DNA的工序。

但是，该方法必须使用2个滤筒，而且上述第1DNA提取纯化用滤筒至少具有捕集过滤器和膜滤器，第2DNA提取纯化用滤筒至少具有玻璃纤维滤器和玻璃粉末层及膜滤器，与简单的过滤器相比，其构造十分复杂。另外，该方法使用上述的2个过滤筒，需要几次反复进行溶液的供给和排出(利用吸引)。

因此，本发明的目的是，提供利用离液序列高的离子法、使用构造更简单的器具、通过较少的操作来回收纯化的DNA的方法。

本发明是关于DNA的回收方法(第1方法)，该方法是将微生物菌体进行溶菌，使游离的DNA吸附在载体上，回收吸附在载体上的DNA的方法，其特征在于，该方法由下列工序组成：在上述载体的存在下，将微生物菌体进行溶菌，而且将溶菌所得到的DNA吸附在上述载体上的工序；从上述载体中分离用于溶菌和吸附的溶液的工序；以及用DNA溶出用溶液使吸附在上述载体上的DNA溶出而回收的工序。

另外，本发明是关于DNA的回收方法(第2方法)，该方法是将微生物菌体进行溶菌，使游离的DNA吸附在载体上，回收吸附在载体上的DNA的方法，其特征在于，该方法由下列工序组成：向在具有溶液保持能力和在吸引时具有溶液渗透能力的膜滤器上设置载体的柱上供给微生物菌体的工序；接着，将上述柱中的微生物菌体溶菌，而且使由溶菌得到的DNA吸附在上述载体上的工序；利用吸引从柱中除去在前面的工序中用于溶菌和吸附的溶液的工序；向柱供给DNA溶出用溶液，进行吸引而回收吸附在上述载体上的DNA的工序。

以下说明本发明。

本发明的第1方法和第2方法都是将微生物菌体溶菌，使游离的DNA吸附在载体上，回收吸附在载体上的DNA的方法。

对本发明方法的对象-微生物菌体没有特别的限制，只要是包含目的DNA的微生物菌体就可以。例如可以是将作为目的的DNA导入缩主微生物的性状转变体。

本发明方法中的(1)微生物菌体的溶菌和(2)游离DNA向载体吸附和溶出各自是公知的方法。

然而本发明方法的特征是，在一个槽(pot)中进行上述微生物菌体的溶菌和游离DNA向载体的吸附。

本发明的第1方法是，在载体存在下，浓次向微生物菌体中添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述载体上，或者在载体存在下，向微生物菌体中依次添加溶菌用溶液和中和及DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述载体上。

在含有离液序列高的离子的DNA吸附用溶液存在下，玻璃吸附DNA，但不吸附RNA(R.Room et al.，J.Clin.MicroBiol.Vol.28，No.3，P495-503)。作为载体，可以从玻璃、硅胶、阴离子交换树脂、羟基磷灰石和DiatomaceousEarth之类的硅藻土制品中选择。对载体的形状不加特别限制，但以具有吸附用的大表面积者为佳。载体例如可以是筛网过滤器、有孔玻璃殊或粉末。例如，载体可以是玻璃过滤器、有孔玻璃珠或玻璃粉末。

DNA吸附用溶液是含有离液序列高的离子的溶液。另外，溶菌用溶液可由菌体的细胞壁分解溶液(溶液I)、碱-离子化表面活性剂溶液(溶液II)和中和液(溶液III)组成，或者可由菌体的细胞壁分解溶液(溶液I)和碱-离子化表面活性剂溶液(溶液II)组成。但是，在后者的场合(溶菌用溶液由溶液I和溶液II组成的场合)，使用含有中和剂和离液序列高的离子的单一溶液即中和及DNA吸附用溶液。

菌体的细胞壁分解溶液(溶液I)具有使菌体原生质球化的作用，例如可举出Tris-EDTA-葡萄糖-溶菌酶水溶液(溶液I)。另外，碱-离子化表面活性剂溶液(溶液II)具有使菌体的膜和蛋白质溶解而进行溶菌，同时使DNA变性的作用，例如可举出NaOH-SDS水溶液(溶液II)。中和液(溶液III)具有中和利用溶液II成为碱性的溶液的作用，例如可举出乙酸钾水溶液。可以向菌体中依次添加这三种或二种溶液进行溶菌。根据菌体的种类和量，适当决定各溶液的浓度和使用量。

作为中和及DNA吸附用溶液，使用含有中和剂(例如乙酸钾)和离液序列高的离子的溶液，可以与溶液的中和同时进行DNA的吸附，具有能缩短处理时间的优点。另外，作为DNA吸附用溶液使用含有中和剂和离液序列高的离子的溶液时，将溶液的pH调整在6-12的范围，从防止混入RNA的角度考虑是有利的。但是，该pH范围因为也取决于离子强度，所以可以根据条件适当决定。再者，为了防止RNA的混入，也可以向溶液1中添加核糖核酸酶。

另外，作为DNA吸附用溶液和中和及DNA吸附用溶液的含有离液序列高的离子的溶液，例如可举出含有LiClO₄、KI、NaI、LiCl、NaCO₂H、盐酸胍等的水溶液。离液序列高的溶液的浓度和用量可以根据菌体的种类和数量适当决定。DNA吸附用溶液或者中和及DNA吸附用溶液，在载体存在下，再添加到与先添加溶菌用溶液的菌体混合的混合物中。添加DNA吸附用溶液后，从菌体中溶解的DNA被吸附在载体上。

本发明的特征在于，被添加的上述各溶液，不需要分离除去先前添加的溶液，只要依次注入添加即可、不需要合适添加，不必要分离溶液。

再有，在添加一种溶液后，例如放置1秒至60分钟后，添加下一种溶液来进行各溶液的添加，从可靠地进行各操作的观点看，这是合适的。

接着使吸附DNA的载体与溶液分离。可以用倾滤、离心分离、过滤等方法进行载体与溶液的分离。从溶液中分离出的载体，根据需要可以进行洗净、干燥。在洗净时例如可以使用Tris-EDTA-NaCl/乙醇混合液、乙醇、乙醇/丙三醇混合液等。

接着，用DNA溶出用溶液使吸附在上述载体上的DNA溶出而进行回收。DNA溶出用溶液，例如可以使用Tris-EDTA缓冲液。

本发明的第2方法，使用在具有溶液保持能力和在吸引时具有溶液渗透能力的膜滤器上设置载体的柱。使用该柱，可以更简便地进行分离回收操作。在同时并行处理少量、多个样品的场合，可以将多个柱捆扎在一起使用。另外，在具有数个贯通孔的平板的一方开口中设置膜滤器，在穴(小井)中填充载体，可以作为柱使用。

膜滤器，只要是具有溶液保持能力和在吸引时具有溶液透过能力者就可以使用，没有特别限制。可以直接使用市售的膜滤器。另外，载体可以使用与上述第1方法中所说的相同的载体。柱的大小和形状等，可以考虑处理菌的量和溶液的量适当决定。

向上述柱中供给微生物菌体。供给的微生物菌体可以通过另外的过滤或离心分离等从培养液中分离出的微生物菌体，但是含有微生物菌体的培养液可原封不动地供给上述柱，吸引培养液，通过用膜滤器捕集微生物菌体，可以供给微生物菌体。

随后，向上述柱中依次添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述载体上，或者向上述柱中依次添加溶菌用溶液和中和及DNA吸附用溶液，使DNA吸附在上述载体上。这里所使用的溶菌用溶液、DNA吸附用溶液和中和及DNA吸附用溶液，与在上述第1方法中所说明的相同。如上所述，本发明的特征是，向柱中添加的各溶液，不需要分离除去先前添加的溶液而原封不动地依次注入添加，不需要合适的添加，不需要分离溶液。

在全部溶液的添加结束后，通过经过膜滤器的吸引，从柱中除去溶液。这样，菌体的残渣留在滤器上，并且DNA也吸附在载体上，残留在滤器上。接着，根据需要，将包含载体的柱洗净，除去游离的RNA和蛋白质等夹杂物后，可进行干燥。从提高所回收的DNA的纯度的观点看，最好进行上述洗净。洗净例如可以使用Tris-EDTA-NaCl/乙醇混合液、乙醇、乙醇/丙三醇混合液等。

接着，向柱供给DNA溶出用溶液，并进行吸引，回收吸附在上述载体上的DNA。DNA溶出用溶液，例如可以使用Tris-EDTA缓中液。

本发明的第1方法和第2方法都由三个工序组成，即依次添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液或者中和及DNA吸附用溶液的工序；从溶液中分离载体的工序；以及从载体中溶出DNA的工序，通过这三个工序可以从微生物菌体回收DNA。另外，从提高回收到的DNA的纯度的观点看，在DNA的溶出工序之前设置夹杂物的洗净工序是有利的。

利用本发明的方法回收的DNA是二根链的环状质粒DNA，粘粒DNA、Bacterial Artificial Chromosome (BAC)、Pl-derived ArtificialChromosome(PAC)也包括在质粒DNA中。

以下，通过实施例详细地说明本发明。

实施例1

在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中将大肠杆菌SOLR菌株培养一夜，该菌株具有插入来自小鼠的5.6Kb的cDNA的质粒pBluescript Sk(+)。将其中的0.6ml培养液移到96孔的玻璃滤器和用膜封闭的小井中，通过吸引过滤培养液，将菌体集中在玻璃滤器中。向含有菌体的各井中添加25μl的溶液(50mmol葡萄糖、25mmol三盐酸缓冲液(pH8.0)、10mmol EDTA、10mg/ml(溶菌酶)，放置5分钟。然后，添加50μl的溶液II(0.2N氢氧化钠、1％十二烷基硫酸钠)，放置5分钟后，加入37.5μl的溶液III(3mol乙酸钾(pH4.8))，放置5分钟。再添加120μl的7mol胍基盐酸盐溶液(吸附用溶液)，通过吸引进行过滤。

接着，添加300μl的洗净缓冲液(100mmol三盐酸盐缓冲液(pH8.0)、5mmolEDTA、0.2mol氧化钠、60％乙醇)，通过吸引进行2次过滤过程，以300μl的80％乙醇进行1次，以300μl的100％乙醇进行1次。此后，进行20分钟的吸引，干燥玻璃滤器上的质粒DNA，最后添加25-50μl的65％加温的TE缓冲液(10mmol三盐酸盐(pH8.0)、1mmol EDTA)，通过吸引使质粒DNA溶出。

通过这样的操作，可以得到4-6μg的质粒DNA。另外，其纯度，相对于280nm的260nm的吸光度比高2左右，即使在利用双脱氧法的DNA碱基序列决定法中使用也能充分使用。

实施例2

在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中将大肠杆菌SOLR菌株培养一夜，该菌株具有插入来自小鼠的5.6Kb的cDNA的质粒pBluescript SK(+)。将其中0.6ml的培养液移到96孔的玻璃滤器和以膜封闭的井中，通过吸引过滤培养液，使菌体集中在玻璃滤器中。向含有菌体的各井中添加25μl的溶液I(50mmol葡萄糖、25mmol三盐酸缓冲液(pH8.0)、10mmol EDTA、10mg/ml溶菌酶)，放置5分钟。此后，添加50μl的溶液II(0.2N氢氧化钠、1％十二烷基硫酸钠)，放置5分钟后，添加160μl的中和及吸附用溶液(0.7mol乙酸钾(pH4.8)、5.3mol胍基盐酸盐溶液)，放置5分钟。

接着，从井中通过吸引过滤混合溶液后，用300μl的80％乙醇洗净3次，用300μl的80％乙醇-20％丙三醇洗净1次。此后，进行20分钟吸引，干燥玻璃滤器上的质粒DNA，最后添加25-50μl的65％加温的TE缓冲液(10mmol三盐酸(pH8.0)、1mol EDTA)，进行吸引而溶出质粒DNA。

通过这样的操作，可以得到4-6μg的质粒DNA。另外，其纯度，相对于280nm的260nm的吸光度比高2左右，即使在利用双脱氧法的DNA碱基序列决定法中使用也没有问题。另外，作为吸附用溶液，使用乙酸钾和胍盐酸盐的混合溶液，因此与实施例1相比，处理时间可以缩短约15分钟。另外，在洗净时使用80％乙醇、20％丙三醇，与使用100％乙醇的实施例1相比，向在溶出中使用TE缓冲液的玻璃滤器的浸透良好，看到质粒DNA的回收量有某些改进的优点。

实施例3

代替玻璃滤器，使用硅藻土(BiO RAD ∞&Ltd.)、玻璃粉(リケン)、多孔质高表面积玻璃(Bio101)或者阴离子交换树脂(Qiagen)作为载体，除此之外，反复进行与实施例1相同的操作，各载体上得到4-6μg的质粒DNA。4-6μg的质粒DNA是最大收获量，因此上述收获量与实施例1是同等程度。每mg载体的质粒DNA的收获量，与载体的表面积成正比，下面示出每10mg载体的质粒DNA的回收率。

硅藻土(Bio RAD ∞&Ltd.) 15-20μg

玻璃粉末(リケン) 5μg

多孔质高表面积玻璃(Bio101) 10-20μg

阴离子交换树脂(Qiagen) 5μg

Claims

1、DNA的回收方法，该方法是将微生物菌体溶菌，使游离的DNA吸附在载体上，回收吸附在载体上的DNA的方法，其特征在于，由以下工序组成：在上述载体存在下，将微生物菌体进行溶菌，使由溶菌得到的DNA吸附在上述载体上的工序；将用于溶菌和吸附的溶液从上述载体分离的工序；以及用DNA溶出用溶液使吸附在上述载体上的DNA溶出并回收的工序。

2、DNA的回收方法，该方法是将微生物菌体溶菌，使游离的DNA吸附在载体上，回收吸附在载体上的DNA的方法，其特征在于，由以下工序组成：向在具有溶液保持能力和在吸引时具有溶液透过能力的膜滤器上设置载体的柱供给微生物菌体的工序；接着，将上述柱中的微生物菌体溶菌，而且使由溶菌得到的DNA吸附在上述载体上的工序；通过吸引将前面的工序中用于溶菌和吸附的溶液从柱中除去的工序；向柱供给DNA溶出用溶液，进行吸引而回收吸附在上述载体上的DNA的工序。

3、权利要求2所述的DNA回收方法，其特征在于，通过供给含有微生物菌体的培养液、接着吸引该培养液、用膜滤器捕集微生物菌体，进行微生物菌体的供给。

4、权利要求1-3中任一项所述的DNA回收方法，其特征在于，向微生物菌体中依次添加溶菌用溶液和DNA吸附用溶液，使DNA吸附在载体上。

5、权利要求4所述的DNA的回收方法，其中，溶菌用溶液由菌体的细胞壁分解溶液(溶液I)、碱-离子化表面活性剂溶液(溶液II)和中和液(溶液III)组成，DNA吸附用溶液是含有离液序列高的离子的溶液。

6、权利要求5所述的DNA回收方法，其中，溶液I是Tris-EDTA-葡萄糖-溶菌酶水溶液，溶液II是NaOH-SDS水溶液，溶液III是乙酸钾水溶液。

7、权利要求1-3中任一项所述的DNA回收方法，其特征在于，向微生物菌体中依次添加溶菌用溶液和中和及DNA吸附用溶液，使DNA吸附在载体上。

8、权利要求7所述的DNA回收方法，其中，溶菌用溶液由菌体的细胞壁分解溶液(溶液I)和碱-离子化表面活性剂溶液(溶液II)组成，中和及DNA吸附用溶液是含有中和剂和离液序列高的离子的单一溶液。

9、权利要求8所述的DNA回收方法，其中，溶液I是Tris-EDTA-葡萄糖-溶菌酶水溶液，溶液II是NaOH-SDS水溶液，中和及DNA吸附用溶液是含有乙酸钾和离液序列高的离子的溶液。

10、权利要求5或8所述的DNA回收方法，其中，溶液I含有核糖核酸酶。

11、权利要求7所述的DNA回收方法，其中，中和及DNA吸附用溶液被调整到pH6-12的范围。

12、权利要求1-11中任一项所述的DNA回收方法，其特征在于，用DNA溶出用溶液洗净溶出前的载体，并进行干燥。

13、权利要求1-12中任一项所述的DNA回收方法，其中，载体选自玻璃、硅胶、阴离子交换树脂、羟基磷灰石和硅藻土。

14、权利要求13所述的DNA回收方法，其中，载体是筛网过滤器、珠球或粉末。