CN114621885A

CN114621885A - 一株高效去除氨态氮和亚硝态氮的枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

Info

Publication number: CN114621885A
Application number: CN202011434958.3A
Authority: CN
Inventors: 凌红丽; 高烁; 周英俊; 梁莉
Original assignee: Shandong Vland Biotech Co ltd
Current assignee: Qingdao Ulan Biotechnology Co Ltd Email Co; Qingdao Weilan Tiancheng Biological Technology Co ltd; Shandong Vland Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN114621885B

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并提供了其在水产养殖中的应用。所述枯草芽孢杆菌的保藏编号CCCTCC NO：M2020356，能高效去除养殖水体中的氨态氮和亚硝态氮，实现水体净化，应用前景广泛。

Description

一株高效去除氨态氮和亚硝态氮的枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株高效去除氨态氮和亚硝态氮的枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。

背景技术

近年来，水产养殖业在我国迅猛发展，目前主要以规模化、集约化、工厂化养殖模式为主。这种养殖模式满足了人们对水产品的需求，节约了大量资源和成本，但同时养殖过程带来的污染问题不容忽视，不仅会造成水质恶化，富营养化现象增多，导致养殖动物的发病、死亡，增加养殖成本，严重时残留在养殖动物体内的污染物甚至危害人类健康。

目前应用于水质处理的有物理、化学、生物等修复方法。微生物修复是一种利用微生物对环境污染物吸收、代谢降解的技术。20世纪90年代初，澳大利亚著名微生物学家Moriarty在养殖系统内部的微生物生态学方面进行了长期地研究，提出了利用微生物生态技术控制养殖病害的可行性及其对养殖可持续发展的重要意义。有益微生物能够将复杂的有机物转化为供浮游生物生长繁殖所需的简单无机物，同时净化环境，维持水产养殖环境的生态平衡。

微生物修复的原理即有益微生物的净水原理是：水体中的有益微生物分解有机物作为碳源和能源而生活，有机物在微生物各种酶的作用下，经过厌氧或好氧的过程，最后被降解为无害物质。它能使养殖者在不中断养殖过程的情况下，清除养殖池塘水域底部长时间积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体，使之先分解为小分子，最终分解为二氧化碳、硝酸盐等，有效地降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨氮与亚硝酸盐、硫化物的浓度降低，从而有效改善水质。

目前已报到用于净水的微生物有硝化细菌、光合细菌、芽孢杆菌、放线菌、酵母菌和短乳杆菌等。硝化细菌可用于控制养殖水体氨的浓度，使用相当方便，能发挥立竿见影的效果。梁拥军等研究硝化细菌对工厂化养殖银鲈水体的影响，结果表明，提前和定期投加硝化细菌能够缓解养殖水体环境氨氮和亚硝酸盐氮的积累，减少危害。光合细菌施入水体后，可利用其独特的光合作用降解水体中的残存饲料、鱼类的粪便及其他有机物；同时，还能吸收利用水体中的氨、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，起到净化水质的作用。彭利民等利用沼泽红假单胞菌FTG-1、球形红假单胞菌FTH-2和桃红荚硫菌FT-3生理生化特性不同，代谢途径不同，通过不同功能的光合细菌的协同效应，可有效降解水体中有机物、氨氮和硫化氢，改善水质。芽孢杆菌可以直接利用水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，从而起到改善水质的作用，同时还能利用其分泌的蛋白酶等多种酶类和抗生素，抑制其他细菌的生长，减少水产动物的病害。李雅华等提供的枯草芽孢杆菌NC108对南美白对虾海水养殖池水中亚硝态氮去除率95％以上、铵态氮去除率85％以上。放线菌作为清除者可分解蛋白质、纤维素及其他有机物，某些菌还具有除异味的功能。不但能够降解氨氮等物质而且能改善水体的味道并具有消毒作用。吴伟等利用诺氏杆菌及其与酵母菌的融合细胞处理养殖水体时，得到的氨氮去除率分别为32％和28％，另外还能大幅度去除水体中的COD、NO2--N等，稳定pH值，提高水中的DO。近年来将酵母菌应用到水质调节中也取得了较好的效果。王磊等从健康、活力强的凡纳滨对虾肠道分离出一株酿酒酵母MST01，能够显著抑制病原菌，提高水产动物的免疫力和抗病力，可在水产养殖和水质净化中应用。短乳杆菌是乳酸菌的一种，可以利用糖类等有机物进行生长，降低污染水体的COD和BOD，是一类重要的污水处理微生物。吴伟等研究短乳杆菌在养殖水体中去除亚硝酸盐的能力以及主要影响因素的试验中发现，短乳杆菌能够在复杂的养殖水环境中有效去除亚硝酸盐。

随着水体污染给水产养殖业不断造成巨大损失，人们日益认识到水质的重要性。低成本、收效大、无污染的微生物修复技术必将引起高度重视。

发明内容

本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并提供了其在水产养殖中的应用。所述枯草芽孢杆菌能高效去除养殖水体中的氨态氮和亚硝态氮，实现水体净化，应用前景广泛。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌VSB098(Bacillussubtilis VSB098)，已于2020年7月27日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020356。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在水质净化中的应用。

本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述枯草芽孢杆菌VSB098。

所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、乳酸菌、光合细菌、丁酸梭菌、盐单胞菌、海杆菌、假交替单胞菌中的任意一种或两种或多种的组合。

所述的芽孢杆菌优选地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌或暹罗芽孢杆菌。

所述的乳酸菌优选屎肠球菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或戊糖片球菌。

所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌VSB098的活菌量至少为10⁸CFU/g。

本发明还提供了上述微生物制剂在水产养殖中的应用。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在水质净化中的应用。

本发明筛选获得的枯草芽孢杆菌VSB098能高效去除水体中的氨态氮和亚硝态氮，而且在不同盐度下均表现出良好的脱氮性能，尤其在30‰盐度条件下，氨态氮和亚硝态氮的去除率均能达到100％，取得了意料不到的效果。该菌株还具有较高的产蛋白酶能力，其发酵上清液中蛋白酶活力高达185U/ml。此外，枯草芽孢杆菌VSB098具有广谱的抑菌能力，对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌均具有一定抑制性；对低温具有一定的耐受性，在15℃条件下可以正常生长；安全性好，不具备溶血性，对水产养殖常用抗生素均敏感，不存在耐药性，可广泛应用于淡水和海水养殖领域。

枯草芽孢杆菌VSB098对养殖水体的净化效果非常明显。相较于使用前，枯草芽孢杆菌VSB098菌粉使用4h后，池塘水体表面泡沫由淡黄色大泡沫变为洁净的细小气泡，水面清爽，且整个使用周期均能保持此状态；而且水质指标分析结果显示，VSB098菌粉使用后，水体中的氨态氮和亚硝酸态氮的浓度得到大幅度下降，取得了意料不到的技术效果。

附图说明

图1为VSB098菌株菌落图；

图2为VSB098菌株蛋白质谱峰图；

图3为VSB098菌株基因指纹图谱；

图4为VSB098菌粉使用前后养殖池水面对比图，其中图a为使用前，图b为使用4h后。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于本发明所涉及的培养基配方如下：

①NH₃富集培养基：葡萄糖0.5g，CH3COONa 0.5g，(NH4)₂SO₄0.1g，K2HPO4.·H2O1.2g,MgSO4·7H2O 0.5g经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1L，pH7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(NH4)2SO4，将(NH4)2SO4溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中；(N 20mg/L，C/N 10)②NO₂富集培养基：CH3COONa0.5g，NaNO₂ 0.1g，K₂HPO₄·H₂O 1.2g，Fe₃PO₄·H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1L，pH 7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。(N 20mg/L，C/N 10)

③NH₄ ⁺-N初筛培养基：葡萄糖0.25g，(NH₄)₂SO₄ 0.05g，K₂HPO₄·3H₂O 1.2g，MgSO₄·7H₂O

0.5g，经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1L，pH 7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(NH₄)₂SO₄，将(NH₄)₂SO₄溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中；筛选培养基加2％的琼脂。(N 10mg/L，C/N10)。

④NO₂-N初筛培养基：CH₃COONa 0.25g，NaNO₂ 0.05g，K₂HPO₄·3H₂O 1.2g，Fe₃PO₄·H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，经过0.45um微孔滤膜过滤除菌的海水定容至1L，pH 7.5，121℃下高压蒸汽灭菌20min。筛选培养基加2％的琼脂。(N 10mg/L，C/N 10)。

⑤NH₄ ⁺-N复筛培养基：葡萄糖0.05g，(NH₄)₂SO₄ 0.01g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KH₂PO₄0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，NaCl 30g。定容至1L，pH8.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(NH₄)₂SO₄，将(NH₄)₂SO₄溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中。

⑥NO₂-N复筛培养基：葡萄糖0.125g，NaNO₂ 0.025g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KH₂PO₄0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，NaCl 30g。定容至1L，pH8.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。

⑦复合氮源培养基：葡萄糖0.1g，(NH₄)₂SO₄ 0.01g，NaNO₂ 0.01g，K₂HPO₄·3H₂O1g，KH₂PO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，NaCl 30g。定容至1L，pH 8.0，121℃下高压蒸汽灭菌20min。其中灭菌前不加入(NH₄)₂SO₄，将(NH₄)₂SO₄溶液通过0.22um微孔滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的上述培养基中。

⑧2216E培养基：购自青岛海博生物技术有限公司，121℃高温灭菌15min。

实施例1菌株的分离与筛选

1、样品来源：山东烟台南美白对虾养殖场池塘水体。

2、富集：

从养殖池取10ml水样至盛有100mL富集培养基的250ml锥形瓶中放入摇床28℃，150r/min富集培养三天，其中每天换一半已过滤灭菌的富集培养基。

3、初筛分离：

将富集液梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个梯度的稀释液100ul分别涂布到NH₄ ⁺-N和NO₂-N初筛培养基上，28℃恒温培养24-48h直到长出菌落。根据大小、颜色、形态得到不一致的菌落，继续在初筛培养基上分离纯化直到获得单菌，共5株，将菌株编号A、B、C、D、E，在2216E培养基上划线纯化，进行液体甘油保种。

4、复筛：

挑取初筛得到的5株单菌落分别接种于800ul NH₄ ⁺-N和NO₂-N复筛培养基中，以不接种菌株的相应培养基作为空白对照，28℃、150rpm摇床中培养48h，然后4500rpm离心5min，参考国标GB 17378.4-2007所述方法对上清液中氨氮、亚硝态氮含量进行测定。分别按照以下公式计算菌株对氨氮和亚硝态氮的去除率，具体结果见表1。

氨氮去除率(％)＝(X1-X2)/X1。

亚硝态氮去除率(％)＝(Y1-Y2)/Y1。

X1为培养48h后空白对照中氨氮含量，X2为培养48h后试验组培养基中氨氮含量；Y1为培养48h后空白对照中亚硝态氮含量，Y2为培养48h后试验组培养基中亚硝态氮含量。

表1不同菌株对氨氮和亚硝态氮的去除率

菌株编号	氨氮去除率	亚硝态氮去除率
			A	45.3％	100.0％
B	100.0％	100.0％
			C	95.5％	87.3％
D	61.4％	100.0％
			E	100.0％	60.3％

由表1的结果可知，本发明筛选到的五株菌中菌株B对复筛培养基中氨态氮和亚硝态氮的去除效果最好，均达到100％。申请人将该菌株命名为VSB098，并对其作进一步评价。

实施例2VSB098菌株的鉴定

2.1菌落形态鉴定

将VSB098菌株接种于营养琼脂培养基上，37℃培养24h后，观察其菌落形态特征。如图1所示，VSB098菌株菌落直径大小约为0.5-1mm，菌落呈圆形，污白色，不透明，中间稍凸，表面粗糙，边缘不规则，无粘液。

2.2 16S rDNA分子鉴定

采用试剂盒提取VSB098菌株的基因组。然后以该基因组为模板，利用特异性引物27F和1492R对其16S rDNA进行扩增。

27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；

1492R：5’-TAGGGTTACCTTACGACTT-3’。

PCR体系包括：0.7μl 27F，0.7μl 1492R，4μl模板DNA，17.5μl SuperMiX和12.1μl水。PCR反应条件设置为：(1)94℃5min；(2)94℃预变性30s；(3)55℃30s；(4)72℃1min；执行步骤(2)至(4)35循环；(5)72℃10min。将扩增得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示PCR产物大小为1500bp左右，符合要求。

将该PCR扩增产物送测序公司进行测序，结果显示VSB098菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，其与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的相似性最高。因此，初步确定VSB098菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

2.3MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定

取少量VSB098单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，VSB098菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其蛋白质谱峰图如图2所示。

2.4RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定

根据全自动微生物基因指纹鉴定系统操作说明对菌株VSB098进行了上机鉴定，得到其rRNA基因指纹图，如图3所示。通过与已知标准菌株库指纹图进行比对发现，菌株VSB098与枯草芽孢杆菌的相似度高达90％以上，因此，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

综上，申请人利用16S rRNA鉴定、MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定三种分子生物学方法对菌株VSB098进行鉴定，鉴定结果一致。再结合菌株VSB098的菌落形态特征，申请人确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌VSB098(Bacillus subtilis VSB098)。

申请人已于2020年7月27日将上述枯草芽孢杆菌VSB098保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020356。

实施例3枯草芽孢杆菌VSB098的安全性评价

1、溶血性：

将活化后的枯草芽孢杆菌VSB098点种到血平板，28℃恒温培养24h后观察菌落周围是否产生透明水解圈。结果显示无水解圈产生，表明枯草芽孢杆菌VSB098不具备溶血性，可以应用于水产养殖中。

2、耐药性：

菌株的耐药性可能会导致生产应用过程中的安全隐患。为防止枯草芽孢杆菌VSB098存在耐药性，对其抗生素敏感性进行研究。根据CLSI抗生素敏感试验梯度稀释法确定枯草芽孢杆菌VSB098在9种常见抗生素中的最小抑菌浓度(MIC值)，所用抗生素为Sigma标准品，参照EFSA(2012)标准评估VSB098对抗生素的敏感程度。具体结果参见表2.

表2抗生素对枯草芽孢杆菌VSB098的最小抑菌浓度(MIC值)

注：单位ug/ml，根据菌株对抗生素敏感性评价标准EFSA(2012)，S表示敏感；R表示耐药。

从表2的结果可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌VSB098对常见的9种抗生素均敏感，不存在耐药性，可以应用于水产养殖中。

3、动物试验：

为了进一步验证菌株的安全性，评估菌株对养殖动物是否安全，在水产养殖循环系统中进行动物试验，受试动物为南美白对虾。

采用浸浴法。试验前，选取规格相近的南美白对虾暂养4天，后随机选取暂养后的南美白对虾20尾置于60L玻璃水缸内，每天将实验组菌株VSB098的浸染浓度设为10⁵CFU/ml，对照组不做处理，实验组和对照组各设三个平行，为期7d。实验期间每天观察对虾的生活状态并记录存活情况，计算存活率；实验0d和7d分别称量每个水缸中对虾总体重，计算增重率，具体结果见表3。

表3枯草芽孢杆菌VSB098对南美白对虾生长和存活的影响

	对虾存活率	对虾增重率
			对照组	96.5％±2.4％<sup>a</sup>	8.2％±1.2％<sup>b</sup>
实验组	100.0％±0.0％<sup>a</sup>	8.6％±0.9％<sup>b</sup>

从表3的结果可以看出，与对照组相比，饲喂枯草芽孢杆菌VSB098的实验组对虾的存活率和增重率均得到显著提高，从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌VSB098安全性好，对南美白对虾的生长和存活无影响，而且还能有效改善对虾的肠道环境，促进其生长。

实施例4枯草芽孢杆菌VSB098产酶特性

水产养殖水体中的残饵、粪便富含多种有机蛋白质，为评价枯草芽孢杆菌VSB098利用蛋白质的能力，申请人采用点种法对该菌株的产蛋白酶能力进行评价，并对其发酵酶活进行测定。

将枯草芽孢杆菌VSB098以1％的比例接种至蛋白酶产酶液体培养基(干酪素0.8g，Na₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄ 0.05g，NaCl 0.5g，牛肉浸出粉0.3g，琼脂1.5g，超纯水100mL，pH 7.4)中，28℃、150rpm培养24h。然后将发酵液4500rpm离心20min，取上清，进行蛋白酶酶活测定。

(1)蛋白酶活力定义：37℃，每分钟分解牛血清蛋白产生1μmol的色氨酸所需酶量即为一个酶活单位。

(2)酶活测定方法：取50μL浓度为1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)，酶液450μL，与浓度为0.1mol/L，pH 7.0的1.5mL乙酸钠缓冲液混合，在37℃下保温5min。以0.5mL浓度为10％的三氯乙酸终止反应，在280nm处测定吸光值。

空白对照管：以蒸馏水代替酶液如上同样条件操作。

酶活公式：酶活(U/mL)＝(k×w)(/v×T)，其中K为酶液稀释倍数；W为生成的色氨酸量(μmol)；V为反应酶液体积(mL)；T为反应时间(min)。

结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌VSB098具有较高的产蛋白酶能力，水解透明圈直径达18.2mm，发酵上清液中蛋白酶活力高达185U/ml，取得了意料不到的效果。

实施例5枯草芽孢杆菌VSB098对水产常见致病菌的抑菌能力评价

选取水产养殖常见的几种致病菌：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，在相应液体培养基中28℃、150rpm培养16h，然后利用麦氏比浊仪将其浓度稀释至10⁸CFU/mL并取100ul均匀涂至营养琼脂平板上。采用打孔法，每个营养琼脂平板上保留3个直径0.9mm的圆孔，将100ul同等浓度的枯草芽孢杆菌VSB098接种至圆孔内，于37℃生化培养箱中培养24h，通过测定抑菌圈直径大小(cm)评价菌株VSB098对上述致病菌的抑菌能力。结果见表4。

表4枯草芽孢杆菌VSB098对常见致病菌的抑菌效果

致病菌	哈维氏弧菌	副溶血弧菌	溶藻弧菌	嗜水气单胞菌
					抑菌圈	1.3	1.1	1.4	1.6

从表4的结果可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌VSB098对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌均具有一定抑制性。该菌株的广谱性抑菌能力有利于其在水产养殖中的广泛应用。

实施例6枯草芽孢杆菌VSB098对低温的耐受性

采用点种法将枯草芽孢杆菌VSB098接种于营养琼脂平板中，分别将其置于不同温度梯度(5℃、10℃、15℃、20℃)培养箱中培养48h，观察生长状况。

结果显示：枯草芽孢杆菌VSB098在5℃下无明显菌落出现，几乎不生长；在10℃下菌落小而透明，在15℃、20℃条件下菌落较大而明显，可正常生长。从而说明，枯草芽孢杆菌VSB098对低温具有一定耐受性，可广泛应用于海参、虹鳟等适宜在冷水条件下生长的经济物种的养殖。

实施例7枯草芽孢杆菌VSB098在不同盐度下对氨态氮和亚硝态氮的去除效果

将枯草芽孢杆菌VSB098接种于2216E培养基中，28℃、160rpm条件下活化16h。取1ml活化后菌液于4000rpm离心5min。将沉淀用0.9％生理盐水洗涤三次后接种至50ml复合氮源培养基中，空白对照不作处理，28℃、150rpm震荡培养48h后，4500rpm离心5min取上清，分别测定上清中氨态氮、亚硝态氮的含量，测定方法参考国标GB17378.4-2007。具体结果见表5。

氨态氮去除率(％)＝(X1-X2)/X1。

亚硝态氮去除率(％)＝(Y1-Y2)/Y1。

X1为培养48h后空白对照中氨态氮含量，X2为培养48h后试验组培养基中氨态氮含量；Y1为培养48h后空白对照中亚硝态氮含量，Y2为培养48h后试验组培养基中亚硝态氮含量。

表5枯草芽孢杆菌VSB098在不同盐度下对氨态氮、亚硝态氮的去除效果

盐度	氨氮去除率	亚硝态氮去除率
			0‰NaCl	100％	97.6％
10‰NaCl	76.5％	98.7％
			20‰NaCl	72.6％	98.8％
30‰NaCl	100％	100.0％

从表5的结果可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌VSB098在不同盐度下均表现出良好的脱氮性能，尤其在30‰盐度条件下，氨态氮和亚硝态氮的去除率均达到100％，取得了意料不到的效果。所述枯草芽孢杆菌VSB098可广泛应用于淡水和海水养殖中。实施例8枯草芽孢杆菌VSB098在对虾养殖现场的应用效果

1、枯草芽孢杆菌VSB098菌粉制备

将枯草芽孢杆菌VSB098在发酵罐中进行液体发酵，镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵，然后将发酵液进行离心后加入适量载体再喷雾干燥，经稀释最终获得150亿CFU/g菌粉。

2、枯草芽孢杆菌VSB098菌粉在对虾养殖场的应用效果

选取烟台某南美白对虾工厂化养殖场作为试验地，养殖池面积45㎡，水深0.8m。试验池每三天为一个周期使用枯草芽孢杆菌VSB098菌粉，按水体体积计，每试验池使用剂量为1.5ppm，连续使用三个周期；对照池不做处理，试验池和对照池各设三个重复。对周期内水面状况进行观察，并进行水质指标分析。

如图4所示，相较于使用前(图a)，枯草芽孢杆菌VSB098菌粉使用4h后(图b)，池塘水体表面泡沫由淡黄色大泡沫变为洁净的细小气泡，水面清爽，且整个使用周期均能保持此状态。而且水质指标分析结果显示，VSB098菌粉使用后，水体中的氨态氮和亚硝酸态氮的浓度得到大幅度下降。

此外，申请人在枯草芽孢杆菌VSB098菌粉使用期间对养殖动物的生理状态进行了跟踪，对虾活力良好，肠道饱满，摄食和排便正常。由此可见，本发明提供的枯草芽孢杆菌VSB098具备使用安全性且能够有效分解富集在水体表面的残饵、粪便等有机物，减小水体表面张力，增加水体溶氧，这在一定程度上也会降低因有机杂质蓄积导致的病原菌感染风险；同时，这些有机杂质的去除，能够有效阻断其向氨氮、亚硝酸盐等有害物质的转化路径，从而有效降低水体中氨态氮和亚硝态氮的浓度。

综上所述，本发明分离筛选得到的枯草芽孢杆菌VSB098可高效去除水体中的氨态氮和亚硝态氮，去除率可达100％，且对低温和盐度均具有很强的耐受性。该菌株不具有溶血性，不产生耐药性，安全性好，因此，可广泛应用于淡水和海水养殖。

序列表

<110> 山东蔚蓝生物科技有限公司

<120> 一株高效去除氨态氮和亚硝态氮的枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

acttcggcgg ctggctccta aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60

gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120

attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180

gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240

cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300

tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360

tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420

cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480

gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540

gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600

atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660

ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720

agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780

cccgctacac gtggaattcc actctcctct tctgcactca agttccccca gtttccaatg 840

accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc tgcgagccct 900

ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg 960

tagttagccg tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtac cgccctattc gaacggtact 1020

tgttcttccc taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct tcatcactca cgcggcgttg 1080

ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg 1140

ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg catcgttgcc 1200

ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg ggtccatctg taagtggtag 1260

ccgaagccac cttttatgtt tgaaccatgc ggttcaaaca accatccggt attagccccg 1320

gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc 1380

cgctaacatc agggagcaag ctcccatctg tccgctcgac tgcatgtata gcac 1434

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2020356。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在水质净化中的应用。

4.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂还包含芽孢杆菌、乳酸菌、光合细菌、丁酸梭菌、盐单胞菌、海杆菌、假交替单胞菌中的任意一种或两种或多种的组合。

6.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述的的芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌或暹罗芽孢杆菌中的任意一种或两种或多种的组合。

7.如权利要求5或6所述的微生物制剂，其特征在于，所述的乳酸菌为屎肠球菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或戊糖片球菌中的任意一种或两种或多种的组合。

8.如权利要求4-7任一所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂中枯草芽孢杆菌的活菌量至少为10⁸CFU/g。

9.权利要求4-7任一所述的微生物制剂在水产养殖中的应用。

10.权利要求4-7任一所述的微生物制剂在水质净化中的应用。