CN104164391A - 一株枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

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本发明提供了一株新型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，筛选自三文鱼循环水养殖废水处理塔的水样中，保藏编号为CCTCC NO：M2014276。所述菌株具有自养及硝化性能，对水产养殖肥水中的NO2 --N有很强的降解作用(p＜0.05)，利用该菌株处理72h后，水体中NO2-N的去除率达到94.69％；此外，通过在饲料中添加所述枯草芽孢杆菌ZX-2，南美白对虾的料肉比降低了9.5％，可见该菌株能有效促进南美白对虾对饲料的利用率。所述枯草芽孢杆菌ZX-2可用于养殖水体和生活污水的净化处理，还可作为饲料添加剂，应用前景广阔。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。
背景技术
近几年来，我国水产养殖业迅猛发展，集约化、高密度养殖规模日益扩大，集中投饵造成养殖水体中积累大量的残饵、粪便及动植物尸体，导致水体氮元素含量严重超标，富营养化加剧，使得养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。硝化过程是将NO2 --N转化为NO3 --N，是自然界中氮循环中的重要一环。随着水产养殖高密度的发展，投饵量持续上升，自然界中脱氮负荷不断加大，造成氮的积累。研究表明，NO2 --N是水产动物致病的主要根源之一，NO2 --N能优先与血红蛋白及血蓝蛋白结合，造成养殖对象缺氧，进而引发各种疾病。所以控制养殖水体中的NO2 --N成为水产养殖水质处理的重点，也是目前水质处理的难点。
由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点，逐渐成为工业污水、生活污水及水产养殖废水处理的主要方式。脱氮功能微生物菌种是整个生物脱氮技术的核心，而菌种的质量是决定反应性能的关键因素之一，因此，筛选性能优良的脱氮微生物成为目前本领域的研发热点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一株新型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。所述枯草芽孢杆菌具有自养及硝化性能，可作为水体净化剂和饲料添加剂，用于降低水体中的NO2-N，提高水产动物的生长性能，效果显著。
本发明一方面提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZX-2，已于2014年6月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014276。
本发明的另一方面提供了包含上述枯草芽孢杆菌的微生物制剂。
所述微生物制剂可以为液体制剂，制备过程为：将枯草芽孢杆菌ZX-2活化、扩大培养，经液态发酵，离心收集菌泥，稀释于生理盐水，做成108～109CFU/mL的菌液。
所述微生物制剂可以为菌粉，制备过程为：将枯草芽孢杆菌ZX-2活化、扩大培养，经液态发酵，喷雾干燥后，做成菌体含量约为100亿/g的菌粉。
本发明还提供了上述微生物制剂在水体净化中的应用。
本发明还提供了上述微生物制剂在饲料中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的枯草芽孢杆菌ZX-2筛选自三文鱼循环水养殖废水处理塔的水样中，其具有自养及硝化性能，对水产养殖肥水中的NO2 --N有很强的降解作用(p＜0.05)，利用该菌株处理72h后，水体中NO2-N的去除率达到94.69％；此外，通过在饲料中添加所述枯草芽孢杆菌ZX-2，南美白对虾的料肉比降低了9.5％，可见该菌株能有效促进南美白对虾对饲料的利用率。所述枯草芽孢杆菌ZX-2可用于养殖水体和生活污水的净化处理，还可作为饲料添加剂，应用前景广阔。
具体实施方式：
实施例1：菌株的分离、筛选与鉴定
1、样品：
取自烟台东方海洋集团三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样；
2、自养硝化培养基配方：
名称 用量
NaCl 2.7g
MgSO4·7H2O 1.4g
NaNO2 2.5g
NaHCO3 16.0g
KH2PO4 0.66g
琼脂 20.0g
H2O 定容至1000mL
3、筛选方法
采用梯度稀释法将上述水样稀释至适当浓度；取0.1mL稀释后的水样均匀涂布于上述自养硝化培养基表面，置入恒温培养箱，30℃下培养2～3d后，用接种环挑取培养基上的单菌落，进行分离纯化，即为初筛菌株。
本次试验共挑取了10株单菌落，依次命名为ZX-1、ZX-2、ZX-3、……ZX-10。分别接种上述单菌落至营养肉汤培养基，在30℃、160r/min条件下进行液体培养，24h后，将发酵液在无菌条件下进行离心，用生理盐水重悬菌泥，制成菌液，其中菌浓度为108～109CFU/mL。
按1％(v/v)的比例将上述菌液分别接种到已灭菌的养殖废水中(NO2-N浓度为1.13mg/L)，30℃、160r/min条件下进行摇瓶处理，72h后分别取样测定养殖废水中NO2-N的浓度，计算NO2-N的去除率。具体结果如表1所示：
NO2-N的浓度采用重氮-偶氮光度法进行检测；
去除率＝(初始浓度-终止浓度)/初始浓度×100％。
表1 处理72h后养殖废水中NO2-N的去除情况
菌株编号 初始NO2 --N(mg/L) 终止NO2 --N(mg/L) 去除率
ZX-1 1.13 0.34 69.91％
ZX-2 1.13 0.05 95.58％
ZX-3 1.13 0.76 32.74％
ZX-4 1.13 0.69 38.94％
ZX-5 1.13 0.44 61.06％
ZX-6 1.13 0.62 45.13％
ZX-7 1.13 0.36 68.14％
ZX-8 1.13 0.90 20.35％
ZX-9 1.13 0.71 37.17％
ZX-10 1.13 0.45 60.18％
从表1的实验结果可知，本发明提供的菌株ZX-2能有效降解养殖废水中NO2-N，处理72h后，水体中NO2-N的去除率高达95.58％，显著高于筛选到的其他菌株。
4、菌株鉴定
1)菌落形态特征：将上述菌株ZX-2在营养琼脂培养基上培养24小时，菌落直径约1mm，为灰白色、略带黄，呈半透明、表面略湿润、无皱褶，镜检其细胞为短杆状。
2)利用试剂盒提取上述菌株ZX-2的基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA序列，测序后获得长度为1415bp的片段。通过BLAST比对分析，其与已公布的多株具有自养硝化功能的枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度为100％，鉴定证实菌株ZX-2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subitlis)，与生化鉴定结果一致。
菌株ZX-2的16S rRNA序列如下所示：
ATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACG
GGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGG
GGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGG
CTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCAC
CAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA
CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA
GTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTT
GTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAG
AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTG
TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAG
CCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAG
GAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG
CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA
GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT
ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA
GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG
ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG
ATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGG
AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT
GCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAA
ATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCT
AGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC
CCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAG
3)将上述菌株ZX-2命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZX-2，并于2014年6月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014276。
实施例2：枯草芽孢杆菌ZX-2处理水产养殖水体实验
将枯草芽孢杆菌ZX-2进行活化，扩大培养，经液态发酵、喷雾干燥制成约100亿/g的菌粉。
实验地点设在江苏如东的小棚虾养殖池进行。
选取水质指标相近的三个养殖池作为三个平行，分别用塑料布将养殖池的水体隔开，一半水体作为实验组，另一半水体作为对照组。首先分别检测各组水体中NO2 --N的初始浓度，然后向实验组水体中添加10ppm上述枯草芽孢杆菌ZX-2菌粉，对照组不加。实验温度为28-30℃，实验期间不间断曝气，且各组曝气量一致。72h后分别测定各实验组和对照组水体中NO2 --N的浓度，将三个平行组的检测结果取平均值，计算去除率。具体结果如表2所示：
表2处理72h后养殖水体中NO2-N的去除情况
组别 初始NO2 --N(mg/L) 终止NO2 --N(mg/L) 去除率
对照组 1.17±0.03 1.14±0.02 2.56％
实验组 1.23±0.03 0.09±0.02 92.68％
从表2的实验结果来看，本发明所述枯草芽孢杆菌ZX-2对水产养殖肥水中的NO2 --N有很强的降解作用(p＜0.05)，处理72h后，实验组水体中NO2-N的去除率达到92.68％，远高于对照组。因亚硝态氮在血液中优先与血红蛋白或血蓝蛋白结合，能严重影响水产养殖对象的代谢，所以亚硝态氮的降解问题是目前水产养殖上的难点之一，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌ZX-2能有效降解水体中的亚硝态氮，可开发为水质净化剂，减少高密度养殖对水体的污染。
实施例3：枯草芽孢杆菌ZX-2对水产动物料肉比的影响
实验地点：江苏如东的小棚虾养殖池；
选取水质指标正常、对虾健康养殖池塘，在养殖池塘中用塑料布搭建6个长宽高分别为4m×4m×2m的围隔，围隔中注入等量的本池塘中的水，围隔中带有等量的曝气石，将曝气量调节均匀一致。随机抽取3个作为实验组，另3个作为对照组。各组投放健康的南美白对虾1000尾，投放之前，从每组中随机选出500尾对虾进行称重，三个实验组和对照组各取平均值。
南美白对虾的饲料选择市售的对虾配合饲料，其中实验组的饲料中按1‰的质量比添加上述枯草芽孢杆菌ZX-2菌粉，而对照组的饲料中不加。每天投喂2次饲料，实验组和对照组投喂饲料的重量及时间均一致，记录每次投喂的饲料重量。实验期间不间断曝气，其他管理均一致。饲喂20天后，从每组中随机选出500尾对虾进行称重，三个实验组和对照组各取平均值，然后计算料肉比，具体结果如表3所示：
表3 枯草芽孢杆菌ZX-2制剂对水产动物料肉比的影响
从表3的数据可以看出，实验组的南美白对虾因为饲料中添加了本发明所述枯草芽孢杆菌ZX-2，其料肉比比未添加枯草芽孢杆菌ZX-2的对照组降低了9.5％，可见枯草芽孢杆菌ZX-2能有效促进南美白对虾对饲料的利用率，因此可作为饲料添加剂使用，有利于节省饲料成本，增加养殖户的经济效益。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCC NO：M2014276。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在水产饲料中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备微生物制剂中的应用。
4.一种微生物制剂，所述的微生物制剂包含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的微生物制剂，其正在于该微生物制剂为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的菌粉。
6.权利要求4或5所述的微生物制剂在水产养殖或污水处理中的应用。
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C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
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Effective date of registration: 20220628

Address after: 273100 Jianxin Village West, Weishan County Economic Development Zone, Jining City, Shandong Province

Patentee after: Shandong Kewei Biological Products Co.,Ltd.

Address before: 266101 No. 11, Xindong Road, Jiulong sub district office, Jiaozhou City, Qingdao, Shandong Province

Patentee before: QINGDAO MASTER BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
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Denomination of invention: A Bacillus subtilis strain and its application in aquaculture

Effective date of registration: 20221116

Granted publication date: 20161026

Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Weishan sub branch

Pledgor: Shandong Kewei Biological Products Co.,Ltd.

Registration number: Y2022980022103