CN105969708B - 具硝化功能的枯草芽孢杆菌sc228及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌SC228，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌SC228 Bacillus subtilisSC228，保藏号为：CCTCC NO：M 2016304。本发明还同时提供了上述枯草芽孢杆菌SC228的用途：作为硝化功能菌，去除水体中的氨态氮。

Description

具硝化功能的枯草芽孢杆菌SC228及其用途

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC228及其用途。

背景技术

我国是世界水产大国，同时也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家。自上世纪80年代，在改革开放和经济效益的驱动下，我国的水产业取得了举世瞩目的成就，水产养殖业在我国的国民经济，特别是农业经济发展中占有越来越重要的地位。2012年中国的水产品总产量达到5907.68万吨，渔业总产值8706.01亿元，占中国农业总产值的9.73％。2013年我国水产品出口克服了国内生产成本增加以及人民币升值、世界经济尚未完全摆脱低迷局面、贸易壁垒增多等不利因素影响，实现了出口的较快增长，水产品出口额首次突破200亿美元，再创历史新高，连续12年位居全球首位。

集约化生产在提高经济效益的同时也带来新的问题，如养殖污水排放量剧增等一系列环境问题。据统计，2012年，全国废水排放量684.8亿吨，其中水产养殖业氨氮排放量2.3万吨，排放化学需氧量54.8万吨。水产养殖中，投放的饵料只有少部分被鱼类吸收，大部分则直接排放到水体中。由于残饵和鱼类代谢物不能及时清除而沉积水底，导致水体缺氧、水质恶化。养殖污水中富含N、P等营养物质，直接排入水环境会造成水体富营养化，污染水体，还会造成水资源和能源的大量浪费。研究表明，饲料中仅有13.9％的氮和25.4％的磷被水产动物利用，其他的氮磷富集在水体中或沉积在底泥中。1999-2000年，水产养殖污染事件发生2067起，导致20亿美元的经济损失。水质的恶化主要表现在pH值、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐、硫化物以及化学需氧量(COD)等指标的变化上。其中氨氮、亚硝酸盐氮是水产养殖环境中重要的污染胁迫因子。

目前，国内外水产养殖水质净化的方法一般采用物理法、化学法或者生物法，但是这些方法存在很多弊端。比如在养殖的间歇期，人们也常用干塘和清淤的方法去除池塘沉积物中的污染物，但这种方法耗时耗力，成本较高。近年来，有益微生物因其生长繁殖快、比面值大、吸收转化快、适应性强以及种类多、分布广等优势被广泛应用。但是，目前所用微生态制剂存在有益菌株种类偏少、有效活菌数目低、不耐高温、耐盐范围较窄等缺陷，不能完全满足生产实践中的需要，从而制约了微生态制剂在水产养殖水质净化上的应用。

枯草芽孢杆菌能够改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。

枯草芽孢杆菌可以减少对虾病害发生，可以大大提高对虾产量，从而提高经济效益，生物环保，刺激水产动物免疫器官的发育，增强机体免疫力；减少对虾病害发生，明显提高对虾产量，从而提高经济效益，净化水质，无污染，无残留。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC228及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌SC228，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌SC228 Bacillus subtilisSC228，保藏号为：CCTCC NO：M 2016304。

本发明还同时提供了上述枯草芽孢杆菌SC228的用途：作为硝化功能菌。

作为本发明的枯草芽孢杆菌SC228的用途的改进：去除水体中的氨态氮。水体为养殖水体。

该菌株在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，琼脂16g/L，其余为水；pH7.0，121℃灭菌20分钟)平板上菌落直径为2.5-3.0mm，菌落表面粗糙褶皱、不透明，不闪光，扩张，边缘不整齐，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，菌株数量可高达1×10⁸cfu/g以上。

菌株SC228在好氧条件下，在24h内可去除50mg/L氨态氨及100mg/L亚硝酸态氮。

本发明的枯草芽孢杆菌SC228具有如下技术优势：

1)、培养方便，生长速度快；

2)、培养发酵后的活菌菌株数目高；

3)、该菌可有效去除养殖水体中的氨态氮、亚硝酸态氮，从而显著改善水质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、枯草芽孢杆菌SC228的获得

1、菌的分离纯化

取草鱼池水，稀释涂布于LB固体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，琼脂16g/L，其余为水；pH7.0，121℃灭菌20分钟)表面连续划线培养，选择那些形态不一样的菌落，重复几次后便可形成单独孤立的菌落，因而获得纯培养菌株。

2、菌株的初筛

根据不同含氮化合物的化学性质，用相应的显色剂分别与每株菌利用三种氮源后产生的代谢产物(含氮化合物)进行显色反应，根据颜色的有无或深浅，定性地鉴定该菌种是否参与水体氮转化以及在氮循环中的具体作用。

具体如下：

1)、亚硝酸盐氮的定性检测：培养液用亚硝酸盐显色剂点样，若出现红色则说明培养液中存在亚硝酸盐氮，且颜色越深浓度越大。

2)、氨氮的定性检测：用钠氏试剂点样，若出现黄色反应，说明培养液中存在氨氮，且颜色越深浓度越大。

3)、硝酸盐氮的定性检测：

(1)对于含有亚硝酸盐的培养液检测硝酸盐时：

对于1mL培养液中残余的亚硝酸盐(浓度≤150mg/L)，加入1mol/L的盐酸50μL，混匀，加入50g/L的氨基磺酸铵溶液50μL，混匀，以消除亚硝酸盐对硝酸盐显色的影响。将2μL的该培养液滴入10μL的二苯胺溶液中，根据是否显示蓝色及蓝色的深浅，初步判断培养液中硝酸盐含量的多少。

(2)对于不含有亚硝酸盐的培养液检测硝酸盐时：

对于1mL的待检测培养液，由于已知培养液中不含有亚硝酸盐，直接将2μL的该培养液滴入10μL的二苯胺溶液中，根据是否显示蓝色及蓝色的深浅，初步判断培养液中硝酸盐含量的多少。

从中筛选出能够降氨氮和亚硝酸盐氮的菌株。

测定方法采用国家环保总局推荐方法(国家环保局，2002)。

3、菌株复筛

经初筛的菌株涂布于BTB培养基(柠檬酸钠5.66g、Na₂HPO₄ 7.9g、NaNO₃ 0.8415g/NaNO₂ 0.683g/NH₄Cl 0.5296g、KH₂PO₄ 1.5g、Mg₂SO₄·7H₂O 0.01g、微量元素溶液2mL、去离子水1000mL、pH 7.2，121℃灭菌20分钟)上进行复筛，得到一株硝化效果较好的菌，命名为SC228。

4、采用甘油保藏法

在灭菌的菌种管中，加入l.0ml细菌培养液，0.5ml 50％(体积浓度)的甘油，混匀后于-80℃冰箱保存。

5、菌种鉴定

(1)形态特征

枯草芽孢杆菌SC228在LB固体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，琼脂16g/L，其余为水；pH7.0，121℃灭菌，20分钟)平板上菌落直径为2.5-3.0mm，菌落表面粗糙褶皱、不透明，不闪光，扩张，边缘不整齐，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

(2)16S rDNA序列分析

对分离筛选到菌株SC228进行进一步的16S rDNA序列分析与比对。引物序列如下：上游引物(P1)：5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’下游引物(P6)：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以筛选得到的菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(50L)为：10×Buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL，dNTP 4.0μL，Taq酶0.5μL，模板1.0μL，ddH₂O 37.5μL；反应条件为94℃预变性5min，94℃，变性50s，52℃退火60S，72℃延伸1min30s，共30个循环。目的片断按照常规方法(Sambrook,et al.,2001)进行克隆和序列测定，测定结果与GenBank中所登录的16S rDNA序列(登录号：NC_000964.3、NC_016047.1和NC_001766.1等)进行比对分析，基因同源性达到99％以上。根据《Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology》(Holt,J.G.,Gibbons,N.E.,1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英等，2001)，通过性态特征和16S rDNA序列分析，确定菌株SC228为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

将该菌株SC228进行了保藏，保藏名称为：枯草芽孢杆菌SC228BacillussubtilisSC228，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2016.6.2，保藏号：CCTCC NO：M 2016304。

实施例2、

按1％(v/v)的比例将菌株SC228接种于LB液体培养基中(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其余为水；pH7.0，121℃灭菌，20分钟)，35℃培养24小时后，4℃、5000rpm/min离心，取菌沉淀，50℃恒温干燥6～8小时，与玉米淀粉按4:1(w:w)混合而制成干菌粉--枯草芽孢杆菌SC228菌粉，每克菌粉活菌数为1.0×10⁸cfu。

实施例3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC228对模拟养殖废水的净化作用

在6个1000L锥形瓶中分别装入500ml模拟废水，其中C/N为4，氨氮20mg/L，亚硝酸盐氮10mg/L，硝酸盐氮10mg/L。向模拟废水中按照1×10⁸cfu/m³的终浓度添加枯草芽孢杆菌SC228菌粉作为实验组，以不添加菌粉为对照组，每组三个重复。用纳氏试剂光度法测定氨氮(NH₄ ⁺-N)、N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)、紫外分光光度法测定硝酸盐氮(NO₃ ^--N)。24h后检测到：

实验组：

氨氮(NH₄ ⁺-N)的浓度为：0.18mg/L，亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)的浓度为：5.07mg/L，硝酸盐氮(NO₃ ^--N)的浓度为：4.89mg/L。

对照组：

氨氮(NH₄ ⁺-N)的浓度为：19.29mg/L，亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)的浓度为：12.72mg/L，硝酸盐氮(NO₃ ^--N)的浓度为：10.67mg/L。

因此，枯草芽孢杆菌SC228有明显降低水中氨氮的效果，改善了水质，适合于作为水质净化剂在水产养殖上应用。

实施例4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC228对养殖水体的调控

将6个容量为2000L的PE桶，随机分成2组(对照组和试验组)，每组三个重复。每桶注入1400L的浙江省绍兴县孙端镇大畈河(经纬度：30°03′38″N，120°40′52″E)河水，其中氨氮含量为0.35mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.075mg/L，化学需氧量COD为27.03mg/L，可溶性总磷含量为0.148mg/L。草鱼用2.5％的食盐水进行浸泡消毒，饲养10d后，选取平均体重约50g的草鱼120尾，随机分为两组，每组设3个平行重复，每个平行草鱼20尾：对照组在水中不添加任何菌，处理组向水中按照1×10⁸cfu/m³添加枯草芽孢杆菌SC228菌粉，二组均饲喂基础日粮。3天后分别检测试验组和对照组的水质指标变化，具体如表1所示。

结果发现，氨氮去除率为95.4％。表明，枯草芽孢杆菌SC228有明显降低水中氨氮含量的效果，可改善养殖水质，适合于作为水产养殖中的水质净化剂。

表1

	试验组	对照组
			氨氮含量(mg/L)	0.017±0.005b	0.395±0.023a
亚硝酸盐氮含量(mg/L)	0.036±0.003b	0.085±0.011a
			化学需氧量COD(mg/L)	68.315±10.819b	129.012±27.125a
可溶性总磷含量(mg/L)	0.167±0.051	0.123±0.013

对比例1、将下述枯草芽孢杆菌(具体如表1所述)替代本发明的枯草芽孢杆菌SC228，添加浓度仍为1×10⁸cfu/m³，检测时间仍为24小时；其余等同于实施例3。所得结果与本发明的对比如表2所述。

表2

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学、绍兴文理学院

<120> 具硝化功能的枯草芽孢杆菌SC228及其用途

<160> 2

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>上游引物P1

<400> 1

agagtttgat cctggtcaga acgaacgct 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物P 6

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28

Claims (2)

1.枯草芽孢杆菌SC228，其特征是，保藏名称为：枯草芽孢杆菌SC228 BacillussubtilisSC228，保藏号为：CCTCC NO：M 2016304。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SC228的用途，其特征是：作为硝化功能菌，去除养殖废水中的氨态氮。