CN115335505A - 具有降解无机氮化合物能力的芽孢杆菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够有效降解无机氮化合物并且还能够抑制水生动物病原体生长的新型芽孢杆菌菌株。

Description

具有降解无机氮化合物能力的芽孢杆菌菌株
本发明涉及能够有效降解无机氮化合物并且还能够抑制水生动物病原体生长的新型芽孢杆菌(Bacillus)菌株。
从水生系统(aquatic system)中生物法去除无机氮化合物(诸如铵和硝酸盐)是特别令人感兴趣的主题，因为无机氮化合物促进富营养化并且对许多水生生物有毒。因此，不希望这些物质在水生系统中(特别是在饲养水中)的水平增加。过去，描述了自营养的硝化和反硝化细菌(其将铵转化成氮，以硝酸盐作为中间体)的组合用于实现修复。同时，还描述了替代方法，例如在US 2016/0326034中，其中描述了用于降低硝酸盐水平的杆菌和乳酸菌的混合物。在现有技术中公开的方法中，通常使用不同微生物的聚生体(consortia)来去除不需要的氮化合物，其中不同的微生物发挥不同的功能，并且只有聚生体作为一个整体能够达到令人满意的结果。
根据本发明，令人惊讶地发现，芽孢杆菌属的特定细菌能够有效地降解不同的无机氮化合物，特别是选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐，即使没有其它微生物的帮助。本发明的“降解”优选是指这些化合物转化成分子氮。
进一步令人惊讶地证明，所确定的细菌不仅能够降解无机氮化合物，而且它们还具有其它有益特性，特别是对水生动物的病原体的抑制活性，这使得它们成为益生菌(也称为“直接饲喂微生物”或“DFM”)。
因此，基于该菌株的特征，本发明的主题特别是本发明的菌株用于降解无机氮化合物的用途，特别是在水产养殖系统中，以及它们作为益生菌的用途，特别是在饲料工业中，并且在水产养殖中是非常优选的。下面将更详细地解释本发明的不同主题。
芽孢杆菌菌株DSM 33349、DSM 33350、DSM 33351和DSM 33352已经通过靶向筛选天然存在的分离物进行了确定，并被分类为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty on theInternational Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose ofPatent Procedure)的规定，它们已于2019年12月3日以申请人Evonik Operations GmbH的名义以如前所述的保藏号保藏于DSMZ(Leibniz Institute DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig,Germany)。
因此，本发明的第一个主题是一种芽孢杆菌菌株(特别是枯草芽孢杆菌菌株)或其制剂，其中该菌株或制剂能够降解至少一种无机氮化合物并且还能够抑制至少一种病原体的生长。
根据本发明，可被本发明的菌株和制剂降解的无机氮化合物优选选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐。
根据本发明的芽孢杆菌菌株，特别是枯草芽孢杆菌菌株，或其制剂优选选自下组：
a)以下列编号之一保藏于DSMZ的芽孢杆菌菌株：DSM 33349、DSM 33350、DSM33351、DSM 33352；
b)(a)中所列的芽孢杆菌菌株的突变体，其与(a)中所列的菌株具有至少95％，优选至少98％，99或99.5％的序列同一性；
c)根据(a)或(b)的菌株的制剂；
d)包含如(a)或(b)所列的菌株中所含的化合物的有效混合物或如(c)的制剂中所含的化合物的有效混合物的制剂。
本发明的芽孢杆菌菌株优选具有与根据SEQ ID NO：1(特别是菌株DSM 33349或其突变体)、SEQ ID NO：6(特别是菌株DSM 33350或其突变体)、SEQ ID NO：11(特别是菌株DSM33351或其突变体)或SEQ ID NO：16(特别是菌株DSM 33352或其突变体)的序列具有至少99％，优选至少99.5％或99.8％，特别是100％的序列同一性的16S rDNA序列。
在本发明的一个优选实施方案中，芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33349或其突变体，表现出至少一种，特别是至少2、3或4种，优选全部的以下特征：
a)16S rDNA序列，其与根据SEQ ID NO：1的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的16S rDNA序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
b)yqfD序列，其与根据SEQ ID NO：2的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的yqfD序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
c)gyrB序列，其与根据SEQ ID NO：3的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的gyrB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
d)rpoB序列，其与根据SEQ ID NO：4的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的rpoB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
e)groEL序列，其与根据SEQ ID NO：5的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的groEL序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
f)recT序列，其与根据SEQ ID NO：21的多核苷酸序列具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％，特别是100％的序列同一性。
在本发明的另一个优选实施方案中，芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33350或其突变体，表现出至少一种，特别是至少2、3或4种，优选全部的以下特征：
a)16S rDNA序列，其与根据SEQ ID NO：6的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的16S rDNA序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
b)yqfD序列，其与根据SEQ ID NO：7的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的yqfD序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
c)gyrB序列，其与根据SEQ ID NO：8的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的gyrB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
d)rpoB序列，其与根据SEQ ID NO：9的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的rpoB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
e)groEL序列，其与根据SEQ ID NO：10的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的groEL序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性。
在本发明的另一个优选实施方案中，芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33351或其突变体，表现出至少一种，特别是至少2、3或4种，优选全部的以下特征：
a)16S rDNA序列，其与根据SEQ ID NO：11的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的16S rDNA序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
b)yqfD序列，其与根据SEQ ID NO：12的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的yqfD序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
c)gyrB序列，其与根据SEQ ID NO：13的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的gyrB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
d)rpoB序列，其与根据SEQ ID NO：14的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的rpoB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是至少100％的序列同一性；
e)groEL序列，其与根据SEQ ID NO：15的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的groEL序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
f)与根据SEQ ID NO：22的多核苷酸序列(编码假定的γ-聚谷氨酸盐水解酶PghZ)具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％，特别是100％的序列同一性的序列；
g)与根据SEQ ID NO：23的多核苷酸序列(编码假定蛋白)具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％，特别是100％的序列同一性的序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33352或其突变体，表现出至少一种，特别是至少2、3或4种，优选全部的以下特征：
a)16S rDNA序列，其与根据SEQ ID NO：16的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的16S rDNA序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
b)yqfD序列，其与根据SEQ ID NO：17的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的yqfD序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
c)gyrB序列，其与根据SEQ ID NO：18的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的gyrB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
d)rpoB序列，其与根据SEQ ID NO：19的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的rpoB序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
e)groEL序列，其与根据SEQ ID NO：20的多核苷酸序列和/或与保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的groEL序列具有至少99.5％，优选至少99.8％，特别是100％的序列同一性；
f)与根据SEQ ID NO：24的多核苷酸序列(编码假定的噬菌体尾部带测量蛋白(phage tail tape measure protein))具有至少95％，优选至少98％，99％或99.5％，特别是100％的序列同一性的序列；
g)与根据SEQ ID NO：25的多核苷酸序列(编码假定蛋白)具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％，特别是100％的序列同一性的序列。
因此，本发明的特别主题也是芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33349或其突变体，其表现出以下特征：
a)根据SEQ ID NO：1的16S rDNA序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的16SrDNA序列；
优选地，该芽孢杆菌菌株表现出至少一种、两种或三种，优选全部的如下进一步的特征：
b)根据SEQ ID NO：2的yqfD序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的yqfD序列；
c)根据SEQ ID NO：3的gyrB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的gyrB序列；
d)根据SEQ ID NO：4的rpoB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的rpoB序列；
e)根据SEQ ID NO：5的groEL序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33349的groEL序列；
f)根据SEQ ID NO：21的recT序列。
因此，本发明的特定主题也是芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33350或其突变体，其表现出以下特征：
a)根据SEQ ID NO：6的16S rDNA序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的16SrDNA序列；
优选地，该芽孢杆菌菌株表现出至少一种、两种或三种，优选全部的如下进一步的特征：
b)根据SEQ ID NO：7的yqfD序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的yqfD序列；
c)根据SEQ ID NO：8的gyrB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的gyrB序列；
d)根据SEQ ID NO：9的rpoB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的rpoB序列；
e)根据SEQ ID NO：10的groEL序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33350的groEL序列。
因此，本发明的特定主题也是芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33351或其突变体，其表现出以下特征：
a)根据SEQ ID NO：11的16S rDNA序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的16SrDNA序列；
优选地，该芽孢杆菌菌株表现出至少一种、两种或三种，优选全部的如下进一步的特征：
b)根据SEQ ID NO：12的yqfD序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的yqfD序列；
c)根据SEQ ID NO：13的gyrB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的gyrB序列；
d)根据SEQ ID NO：14的rpoB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的rpoB序列；
e)根据SEQ ID NO：15的groEL序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33351的groEL序列；
f)根据SEQ ID NO：22的序列；
e)根据SEQ ID NO：23的序列。
因此，本发明的特定主题也是芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株，特别是菌株DSM 33352或其突变体，其表现出以下特征：
a)根据SEQ ID NO：16的16S rDNA序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的16SrDNA序列；
优选地，该芽孢杆菌菌株表现出至少一种、两种或三种，优选全部的如下进一步的特征：
b)根据SEQ ID NO：17的yqfD序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的yqfD序列；
c)根据SEQ ID NO：18的gyrB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的gyrB序列；
d)根据SEQ ID NO：19的rpoB序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的rpoB序列；
e)根据SEQ ID NO：20的groEL序列和/或保藏于DSMZ的菌株DSM 33352的groEL序列；
f)根据SEQ ID NO：24的序列；
g)根据SEQ ID NO：25的序列。
如果没有另外明确描述，根据本发明的术语“突变体”或“变体”涉及相对于亲本菌株的基因组DNA具有至少95％，96％或97％，优选至少98％、99％或99.5％，更优选至少99.8％或99.9％的序列同一性的菌株。即在本文中，如果没有另外明确提及，术语“序列同一性”总是与完整的基因组DNA相关。
本发明的另一个主题是一种组合物，其含有至少两种根据本发明的芽孢杆菌菌株或其制剂，其中该芽孢杆菌菌株及其制剂优选选自下组：
a)以下列编号之一保藏于DSMZ的芽孢杆菌菌株：DSM 33349、DSM 33350、DSM33351和DSM 33352；
b)(a)中所列的芽孢杆菌菌株的突变体，其与(a)中所列的菌株具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％的序列同一性；
c)根据(a)或(b)的菌株的制剂；
d)包含如(a)或(b)所列的菌株中所含的化合物的有效混合物或如(c)的制剂中所含的化合物的有效混合物的制剂。
根据本发明非常优选的是含有菌株DSM 33351和DSM 33352的组合的组合物。
本发明的细菌能够降解无机氮化合物，优选至少一种，更优选至少两种选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐的无机氮化合物。
因此，本发明的另一个主题是一种降低水系统中无机氮化合物的量和/或控制水系统中无机氮化合物的量的方法，其中无机氮化合物优选选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐，非常优选地选自铵和亚硝酸盐，该方法包含向该水系统供应至少一种根据本发明的芽孢杆菌菌株或其制剂，特别是至少根据本发明的枯草芽孢杆菌菌株或其制剂，或根据本发明的组合物，其中该芽孢杆菌菌株和/或其制剂和/或组合物能够降解至少一种无机氮化合物并且还能够抑制至少一种病原体(特别是至少一种水生动物的病原体)的生长，其中该芽孢杆菌菌株和制剂，特别是组合物的芽孢杆菌菌株和制剂优选选自下组：
a)芽孢杆菌菌株，特别是枯草芽孢杆菌菌株，其以下列编号之一保藏于DSMZ：DSM33349、DSM 33350、DSM 33351、DSM 33352；
b)(a)中所列的芽孢杆菌菌株的突变体，其与(a)中所列的菌株具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％的序列同一性；
c)根据(a)或(b)的菌株的制剂；
d)包含如(a)或(b)所列的菌株中所含的化合物的有效混合物或如(c)的制剂中所含的化合物的有效混合物的制剂。
本发明的水系统可以是任何种类的水系统，特别是天然或人工水系统，如湖泊、池塘、盆地、观赏池塘、水族馆、水产养殖设施或海洋、湖泊或河流中的隔离区域。优选地，水系统是用于饲养动物，特别是用于饲养水生动物的蓄水池。因此，水系统非常优选是饮用水或饲养水，特别是用于饲养水生动物。根据要饲养的动物种类，水可以是咸水以及淡水。
由于能够降解无机氮化合物并且同时适合作为益生菌的细菌在本领域的现有技术中尚未公开，因此，本发明的另一个主题是能够降解无机氮化合物并且同时表现出益生菌活性(特别是针对水生动物)的细菌，特别是芽孢杆菌属的细菌，优选枯草芽孢杆菌种的细菌，其中该细菌优选包含如本申请中所公开的进一步表征特征，特别是如上所述表征DNA序列。
根据本发明的能够降解无机氮化合物优选是指在至少一种测试条件下，优选地在所有测试条件下，如工作实施例1中所述，细菌能够去除至少50％，更优选至少80％或90％，特别是大于95％的氨和/或硝酸盐。
根据本发明的细菌优选地也能够在其中C:N比非常低的环境中，特别是在C基本培养基中，有效地降解无机氮化合物。特别是，它们优选能够在C:N比为100以下，特别是20至100、30至90或40至80的环境中有效地降解无机氮化合物。
根据本发明的细菌优选能够在高盐条件下(特别是在1重量％的NaCl存在下，更优选在1.5重量％或2重量％的NaCl存在下，特别是在2.5重量％或3重量％的NaCl存在下)生长至少一天。此外，根据本发明的细菌优选能够在具有如此大量氯化钠的水环境中有效降解无机氮化合物，特别是选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐的无机氮化合物。
本发明的细菌的孢子优选能够在C基本培养基中(即在碳源的量相对低的环境中)有效萌发。优选地，C基本培养基是其中碳源的量在50g/kg以下，更优选25g/kg以下，特别是10至50g或15至25g碳源/kg培养基的范围内的培养基。优选地，本发明的孢子在这种基本培养基中在不超过30小时内，更优选在不超过25小时内长出(outgrow)。
本发明的细菌还优选能够抑制至少一种病原微生物，特别是至少一种病原细菌，其中该至少一种病原微生物或细菌优选对水生动物具有病原性。
非常优选地，本发明的细菌能够抑制至少一种选自哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和/或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的细菌，优选抑制无乳链球菌。
能够抑制根据本发明的病原体优选是指根据Parente等人(1995)的孔扩散拮抗试验中，相对于所述病原体，该菌株能够引起至少3mm，优选至少5或10mm的病原体清除。
根据本发明特别优选的是，根据本发明的细菌能够非常有效地抑制无乳链球菌的生长，特别是无乳链球菌DSM 2134的生长。特别是，它们优选特征在于，在LBKelly琼脂平板上对无乳链球菌DSM 2134的孔扩散拮抗试验中，至少10mm，更优选至少15mm的病原体清除率。
本发明的细菌优选特征在于至少一种，更优选至少两种、三种或四种的如下进一步的特征：
它们优选能够在厌氧条件下生长。此外，它们优选能够在这种厌氧条件下降解水不溶性纤维素和/或蛋白质。
此外，本发明的细菌优选还能够在需氧条件下，特别是在2mM胆汁存在下，降解水不溶性纤维素和/或蛋白质。
根据本发明的细菌优选地进一步特征在于表现出以下酶活性中的至少一种、两种或三种，优选地全部：纤维素酶活性；木聚糖酶活性；蛋白酶活性；过氧化氢酶活性；超氧化物歧化酶活性。
蛋白水解活性和降解无机氮化合物的能力的组合存在是本发明非常优选的实施方案，因为这样的组合活性允许从饲养水中完全去除未消化的饲料蛋白，并因此表现出所需的协同效应。
本发明的细菌优选还产生乳酸盐，并且它们优选还能够降解霉菌毒素(mycotoxin)。
根据本发明的细菌优选进一步的特征在于能够在2mM胆汁存在下，更优选在4mM胆汁存在下，和/或在0.3重量％猪胆汁存在下和/或在0.3重量％鸡胆汁存在下生长。特别是，它们优选的特征在于能够在这样高的胆汁浓度下快速增殖。
此外，本发明的细菌，即相应样品的显著部分(特别是至少80％)，优选在造粒动物饲料所需的高温下存活，特别是它们优选在80℃，更优选95或99℃的温度下存活至少20分钟。
不希望受任何理论束缚，认为根据本发明的芽孢杆菌菌株能够通过多方面的作用模式增强动物健康，特别是肠道健康和/或水生动物的健康，包括通过更好地消耗可利用的营养物产生具有选择性功效的抗菌代谢物以及与病原细菌竞争，从而抑制病原细菌的有效建立，特别是在肠道、鳃中或皮肤上。因此，由芽孢杆菌产生的酶可以通过提供预消化的营养物来帮助建立平衡的微生物群，特别是在水生动物中。
与抗生素相比，益生菌的一大优势是它们既不会不加区别地攻击细菌，也不会导致病原细菌的耐抗生素菌株。通常，它们能够通过产生具有特定功效的抗微生物物质而选择性地与病原细菌竞争，并且理想地能够同时增强有益微生物群落的生长和活力，特别是在肠道或鳃中。此外，它们优选能够刺激所治疗动物的全身免疫应答。
根据本发明的突变体或变体优选是自发突变体。术语“自发突变体”是指在没有有意使用诱变剂的情况下由亲本菌株产生的突变体或变体。即它们被认为是非转基因的(non-GMO)。这种自发突变体可以通过经典方法获得，例如在UV光存在下和/或通过施加高温或原生质体形成和/或在亲本菌株敏感的某些抗生素存在下培养枯草芽孢杆菌菌株，并测试任何抗性突变体的提高生物活性或改善增强动物健康(特别是肠道健康)的一种或多种指标的能力。鉴定自发突变体的其它方法是本领域普通技术人员已知的。但是除了这些优选的自发突变体之外，所有其它种类的突变体或变体，如通过基因工程获得的突变体，也包括在本发明中。
本发明的一个具体实施方案是本发明的细菌，特别是菌株DSM 33349、DSM 33350、DSM 33351或DSM 33352的天然不存在的突变体，特别是如上定义的自发突变体，其特征在于上述特征。
在本发明的一个优选实施方案中，菌株DSM 33349、DSM 33350、DSM 33351或DSM33352的突变体和变体具有与其来源的亲本菌株相同的鉴定特征。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的细菌、制剂和组合物经口服施用于动物或人。
因此，本发明的另一个主题是组合物，诸如饲料、食物、饮用水和饲养水以及药物组合物，特别是治疗组合物，其含有至少一种本发明的细菌(特别是至少一种芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株)和/或至少一种本发明的制剂和/或至少一种本发明的组合物，如前所述。
本发明的另一个主题还是本发明的至少一种细菌(特别是至少一种芽孢杆菌菌株，优选枯草芽孢杆菌菌株)和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物作为饲料或食品中的益生菌成分(DFM)的用途。
特别是，可以使用本发明的至少两种或三种菌株的混合物或组合，非常优选选自菌株DSM 33349、DSM 33350、DSM 33351和DSM 33352的至少两种或至少三种菌株的混合物或组合。
根据本发明优选的食物是乳制品，特别是酸奶、奶酪、牛奶、黄油和凝乳(quark)。
本发明的细菌的细胞可以以孢子(休眠的)、营养细胞(正在生长的)、过渡态细胞(从生长阶段过渡到孢子形成阶段)或至少两种，特别是所有这些类型的细胞的组合，存在，特别是存在于本发明的组合物中。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物主要包含孢子，其中优选至少80％或至少90％的芽孢杆菌细胞是孢子，或仅包含孢子，即组合物中所含的所有芽孢杆菌细胞均为孢子。
此外或作为替代，细菌细胞也可以以非活的、灭活的形式使用，因为非活细胞也预期仍具有益生菌效果。灭活细胞的方法是本领域技术人员已知的。
本发明的细菌，当施用于动物时，优选增强此类动物的健康和/或改善此类动物的总体身体状况和/或提高此类动物的饲料转化率和/或降低此类动物的死亡率和/或提高此类动物的存活率和/或改善此类动物的体重增加和/或提高此类动物的生产力和/或提高此类动物的抗病能力和/或调节此类动物的免疫应答和/或在此类动物中建立或维持健康的肠道微生物群落和/或改善此类动物的肉质(特别是肉的弹性和/或肉的硬度)和/或减少病原体通过此类动物的粪便排出。特别是，本发明的菌株和组合物可用于帮助在出于治疗目的施用抗生素后重建肠道或鳃微生物群落的健康平衡。
因此，本发明的另一个主题是一种增强动物的健康和/或改善动物的总体身体状况和/或提高动物的饲料转化率和/或降低动物的死亡率和/或提高动物的存活率和/或改善动物的体重增加和/或提高动物的生产力和/或提高动物的抗病能力和/或调节动物的免疫应答和/或在动物中建立或维持健康的肠道微生物群落和/或改善动物的肉质和/或减少病原体通过动物粪便排出的方法，其中将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物施用于动物，特别是水生动物，优选在水产养殖中。
因此，本发明的另一个主题还是本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物用于增强动物的健康和/或改善动物的总体身体状况和/或提高动物的饲料转化率和/或降低动物的死亡率和/或提高动物的存活率和/或改善动物的体重增加和/或提高动物的生产力和/或提高动物的抗病能力和/或调节动物的免疫应答和/或在动物中建立或维持健康的肠道微生物群落和/或改善动物的肉质和/或减少病原体通过动物粪便排出的用途，其中将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物施用于动物，特别是水生动物，优选在水产养殖中。
因此，本发明的另一个主题也是本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物，用于增强动物的健康和/或改善动物的总体身体状况和/或提高动物的饲料转化率和/或降低动物的死亡率和/或提高动物的存活率和/或改善动物的体重增加和/或提高动物的生产力和/或提高动物的抗病能力和/或调节动物的免疫应答和/或在动物中建立或维持健康的肠道微生物群落和/或改善动物的肉质和/或减少病原体通过动物粪便排出，其中该动物优选为水生动物，特别是在水产养殖中饲养的水生动物。
“提高动物的生产力”特别是指以下任一项：生产更多或更高质量的蛋、奶或肉或增加断奶后代的产量。
本发明的菌株、制剂和组合物的方法和用途可以是治疗性的或非治疗性的。在本发明的一个特别优选的实施方案中，该方法和用途是非药学的，特别是饲养应用。
由于病原细菌和其它成分，未经处理的动物粪肥可能具有有害的环境影响，特别是对于动物本身和/或对于接触粪肥的人类，这可以通过用本发明的细菌、组合物或制剂喂养动物或直接处理粪肥或动物的铺垫物来避免，因此，本发明的另一个主题是一种控制和/或避免粪肥或受污染液体的有害环境影响的方法，该方法包含将根据本发明的至少一种菌株、至少一种制剂和/或至少一种组合物应用于粪肥、受污染液体、垫料(litter)、坑(pit)或粪肥池的步骤。优选地，该组合物以液体形式(例如通过喷雾)应用，或作为粉末(例如通过撒播)应用。
由于有害细菌可能对垫料的稠度(consistency of litter)具有负面影响，并且特别可能影响相当流动(fluid)或高度流动的垫料，这可能导致家禽的足垫损伤，而这可以通过用本发明的菌株、组合物或制剂喂养动物来避免，因此本发明的另一主题是一种控制和/或改善垫料的稠度的方法，特别是一种确保垫料的固体稠度的方法和/或一种避免足垫损伤的方法，该方法包含用本发明的至少一种菌株、至少一种制剂和/或至少一种组合物喂养动物(特别是家禽)的步骤。
本发明的细菌、制剂和组合物非常优选用于改善水或水溶液的质量。因此，本发明的另一个主题还是一种控制和/或改善水或水溶液(特别是饮用水和/或饲养水和/或循环用水和/或废水)的质量的方法，其包括将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物应用于水或水溶液的步骤。
无机氮化合物不仅在水产养殖设施的水和水溶液中存在问题，而且例如在不同种类的循环用水和废水中，特别是在废水处理设施中也存在问题。土壤的处理经常导致富含无机氮化合物的水的富营养化。用根据本发明的菌株和/或制剂和/或组合物处理循环用水或废水可有助于解决该问题。
此外，本发明的细菌、制剂和组合物也可用于治疗植物的微生物病害。因此，本发明的另一主题还是一种治疗和/或预防植物(特别是栽培植物)的微生物病害的方法，其包括将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物应用于该植物的步骤。该应用可以以液体形式(诸如通过喷雾)或以固体形式(特别是作为粉末，优选作为配制的粉末)进行。
通过使用本发明的菌株、制剂和组合物，优选实现前述特征中的至少一个的改善，其中该特征的实现优选意指与适当的阴性对照相比至少1％，更优选至少3％或至少5％的改善。可以使用畜牧业领域已知的阴性对照平均值，但优选使用进行与所测试的动物相同处理但不施用本发明的菌株和/或制剂和/或组合物的阴性对照动物。
特别是，本发明的菌株、制剂和组合物可以以有效抑制和/或减少病原细菌、病毒和原生动物，特别是在动物肠道或水生动物鳃中生长的量施用于或饲喂给动物。此类致病菌包括梭菌属(Clostridia)、李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、气单胞菌属(Aeromonas)、链球菌属(Streptococci)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏菌属(Shigella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、短螺旋体属(Brachyspira)、黄杆菌属(Flavobacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、爱德华菌属(Edwardsiella)、肾杆菌属(Rennibacterium)、巴氏杆菌属(Pasteurella)和弧菌属(Vibrio)。相关地，本发明的方法可用于减少动物粪便中排出的病原细菌、病毒和原生动物的量。本发明的方法也可用于维持或增加有益菌(诸如乳酸菌)的生长，特别是在动物肠道或水生动物的鳃中。通过减少病原细菌和/或增加或维持有益细菌，本发明的组合物能够维持总体健康的微生物群落，特别是在肠道中、皮肤上或水生动物的鳃中。
因此，本发明的另一个主题还是一种抑制和/或减少病原细菌的生长和/或维持和/或增加有益细菌的生长的方法，特别是在动物肠道中、动物皮肤上或在水生动物的鳃中，其中使用本发明的菌株、制剂和组合物，并且其中病原细菌优选选自梭菌属，特别是产气荚膜梭菌(C.perfringens)、艰难梭菌(C.difficile)、诺维梭菌(C.novyi)、败毒梭菌(C.septicum)和肠道梭菌(C.colinum)，李斯特氏菌属，特别是单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)，沙门氏菌属，特别是肠道沙门氏菌(S.enterica)，包括亚种肠道沙门氏菌(enterica)、亚利桑那沙门氏菌(arizonae)、邦戈尔沙门氏菌(bongori)，且特别是血清型(serovars)，鸡沙门氏菌(S.gallinarum)、鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(S.cholerasuis)、海德堡沙门氏菌(S.heidelberg)和婴儿沙门氏菌(S.infantis)，肠球菌属，特别是粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)和盲肠肠球菌(E.cecorum)，葡萄球菌属，特别是金黄色葡萄球菌(S.aureus)，气单胞菌属，特别是嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌(A.salmonocida)，链球菌属，特别是猪链球菌(S.suis)、鸡链球菌(S.gallinaceus)和无乳链球菌(S.agalactiae)，弯曲杆菌属，特别是空肠弯曲杆菌(C.jejuni)和大肠弯曲杆菌(C.coli)，大肠杆菌，嗜血杆菌属，特别是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，短螺旋体属，特别是猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)，黄杆菌属，特别是柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)，沙雷氏菌属，特别是液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)，耶尔森氏菌属，特别是鲁氏耶尔森氏菌(Y.ruckeri)，爱德华菌属，特别是迟钝爱德华菌(E.tarda)和叉尾鮰爱德华菌(E.ictaluria)，肾杆菌属，特别是鲑鱼肾杆菌(R.salmoninarum)，巴氏杆菌属，特别是杀鱼巴氏杆菌(P.piscicida)，弧菌属，特别是副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、奥氏弧菌(V.ordalii)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、费氏弧菌(V.fischeri)和杀鲑弧菌(V.salmonicida)，且有益细菌优选选自乳酸菌，特别是乳杆菌(lactobacilli)和双歧杆菌(bifidobacteria)。非常优选地，被抑制的菌株选自水生动物的致病菌株，特别是链球菌属，特别是无乳杆菌属，弧菌属，特别是副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、奥氏弧菌、溶藻弧菌、费氏弧菌和杀鲑弧菌，黄杆菌属，特别是柱状黄杆菌，以及气单胞菌属，特别是嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌。
在本发明的一个优选实施方案中，水产动物的至少一种病原细菌的量，特别是无乳链球菌(特别是无乳链球菌DSM 2134)、哈维氏弧菌(特别是哈维氏弧菌DSM 19623)、副溶血弧菌(特别是副溶血弧菌DSM 10027)和/或嗜水气单胞菌(特别是嗜水气单胞菌DSM30187)的量，显著降低，优选降低至少0.5log，更优选降低至少1log、2log或3log，其中特别优选降低无乳链球菌。
因此，本发明的另一个主题还是本发明的菌株、制剂和组合物，用于抑制和/或减少病原细菌的生长和/或用于维持和/或增加有益细菌在动物肠道中或在动物皮肤上或在水生动物鳃中的生长，其中所述病原细菌优选选自梭菌属，特别是产气荚膜梭菌、艰难梭菌、诺维梭菌、败毒梭菌和肠道梭菌，李斯特氏菌属，特别是单核细胞增多性李斯特氏菌、西尔李斯特菌和威尔斯李斯特菌，沙门氏菌属，特别是肠道沙门氏菌，包括亚种肠道沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌，且特别是血清型，鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、海德堡沙门氏菌和婴儿沙门氏菌，肠球菌属，特别是粪肠球菌、屎肠球菌和盲肠肠球菌，葡萄球菌属，特别是金黄色葡萄球菌，气单胞菌属，特别是嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌，链球菌属，特别是猪链球菌、鸡链球菌和无乳链球菌，弯曲杆菌属，特别是空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌，大肠杆菌，嗜血杆菌属，特别是副猪嗜血杆菌，短螺旋体属，特别是猪痢疾短螺旋体，黄杆菌属，特别是柱状黄杆菌，沙雷氏菌属，特别是液化沙雷氏菌，耶尔森氏菌属，特别是鲁氏耶尔森氏菌，爱德华菌属，特别是迟钝爱德华菌和叉尾鮰爱德华菌，肾杆菌属，特别是鲑鱼肾杆菌，巴氏杆菌属，特别是杀鱼巴氏杆菌，以及弧菌属，特别是副溶血弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、奥氏弧菌、溶藻弧菌、费氏弧菌和杀鲑弧菌，且有益细菌优选选自乳酸菌，特别是乳杆菌和双歧杆菌。
包括病原细菌或者除了病原细菌之外，还可以抑制其它病原体，特别是病毒和藻类。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的菌株和/或制剂和/或组合物能够抑制至少一种选自以下的病毒：白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSv)，桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)，黄头病毒(Yellow Head Virus，YHV)，引起传染性皮下和造血组织坏死的病毒(IHHN)和IHHNV，引起南美白对虾(penaeus vannamei)慢性矮小残缺综合症或RDS的病毒，杆状病毒样病毒，传染性胰腺坏死病毒(InfectiousPancreatic Necrosis Virus，IPNV)，牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，HIRRV)，石斑鱼腹水病毒(Yellowtail Ascites Virus，YAV)，条纹鲹神经坏死病毒(Striped JackNervous Necrosis Virus，SJNNV)，虹彩病毒(iridovirus)，传染性鲑鱼贫血(USA)病毒(infectious salmon anemia(USA)virus)，引起胰腺疾病(Pancreas Disease，PD)或病毒性出血性败血症(Viral Hemorrhagic Septicemia，VHS)的病毒，引起病毒性出血性败血症的病毒，鲤鱼传染性胰腺坏死或病毒血症的病毒，斑点叉尾鮰病毒(channel catfishvirus)，草鱼出血性病毒，野田村病毒科(nodaviridae)诸如神经坏死病毒，传染性鲑鱼贫血病毒。
在本发明的另一个具体的实施方案中，本发明的菌株和/或制剂和/或组合物能够抑制至少一种微藻、原生动物或毒素，其选自寄生虫角孢子虫(Ceratomyxa shasta)、多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifillius)、Cryptobia salmositica、鲑疮痂鱼虱(Lepeophtherius salmonis)、四膜虫(Tetrahymena)、车轮虫(Trichodina)、Epistylus，以及鞭毛藻毒素，包括引起腹泻性贝类中毒(Diaarhetic Shellfish Poisoning，DSP)、麻痹性贝类中毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)，神经毒素中毒(Neurotoxinpoisoning，NSP)和鱼肉毒(Ciguatera)的毒素。
病原体的出现和/或增加的生长确实或可能会导致某些疾病的爆发。
已知弧菌与虾的疾病和高死亡率相关，但也可感染有鳍鱼。罗非鱼感染可与无乳链球菌(一种广泛分布的细菌)相关，可引起例如出血或游泳不稳定(erratic swimming)。柱状杆菌病是由柱状黄杆菌感染淡水鱼引起的。例如，鲑鱼和鳟鱼养殖场报告的年损失很高。
此外，产气荚膜梭菌的出现和/或增加的生长可导致肠道疾病的爆发，特别是猪和家禽中坏死性肠炎的爆发。产气荚膜梭菌的出现和/或增加的生长还可以导致其他疾病的爆发，如细菌性肠炎、坏疽性皮炎和胆管肝炎。甚至最轻微形式的产气荚膜梭菌感染也可能伴有腹泻，这导致垫料潮湿，并且由此可能导致继发性疾病如足垫皮炎。同时C型产气荚膜梭菌通常被认为是仔猪中坏死性肠炎和坏死性出血性肠炎的主要原因，A型与轻度坏死性小肠结肠炎和绒毛萎缩的哺乳和饲喂猪的肠道疾病有关。
艰难梭菌是一种主要在新生猪中引起腹泻的重要新出现的病原体。受影响的小猪可能有呼吸困难、腹胀和阴囊水肿。
已知盲肠肠球菌会导致肉鸡跛行、关节炎和骨髓炎，通常由关节和/或骨组织的炎症引起。此外，盲肠肠球菌可引起心包炎症。
鸡链球菌可引起家禽败血病。眼观病变包括脾肿大、肝肿大、肾肿大和充血。还观察到肝脏和脾脏中与瓣膜性心内膜炎相关的多个坏死和/或梗塞区域。
大肠弯曲杆菌是一种食源性细菌，大多数人通常因食用含有该细菌的猪肉而感染。它会引起人类胃肠炎和急性小肠结肠炎，以及急性腹泻疾病。猪是主要的宿主，但它也可以感染人类、鸟类和多种其它动物。
空肠弯曲杆菌感染是世界范围内胃肠炎的最常见原因之一[Acheson等人2001]。感染由摄入受污染的食物或水引起。空肠弯曲杆菌通常与家禽相关，并且其天然地定殖许多鸟类[Colles等人2009](20-100％的零售鸡受到污染)以及牛(尤其是小牛)的消化道。据报道一些空肠弯曲杆菌菌株会导致新孵化的小鸡和幼禽中出现肠炎和死亡。
猪链球菌是一种猪的重要病原体，并且是断奶后仔猪细菌死亡的最重要原因之一，可引起败血症、脑膜炎和多种其它感染。
病原体可以引起其他疾病，如多发性关节炎、纤维素性多发性浆膜炎、断奶后肠紊乱如断奶后腹泻和水肿疾病以及猪痢疾。
因此，本发明的另一个主题也是一种治疗组合物，其包含本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物。
因此，本发明的一个非常优选的主题是一种用于治疗和/或预防水生动物(特别是有鳍鱼，优选罗非鱼，或甲壳类动物，优选虾)的疾病的治疗组合物，其包含本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物，该疾病特别是选自：出血、游泳不稳定、柱形病(Columnaris disease)、白斑综合症(White Spot Syndrome)和/或鳃的疾病。
因此，本文中进一步优选的主题是一种用于治疗和/或预防动物(优选猪或家禽)中的坏死性肠炎和坏死性出血性肠炎(特别是亚临床坏死性肠炎和坏死性出血性肠炎)的治疗组合物，其包含本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物。
因此，本文中另一个优选的主题是一种用于治疗和/或预防动物(优选猪或家禽)中的细菌性肠炎、坏疽性皮炎、胆管肝炎、梭菌病、腹泻、呼吸困难、腹胀、阴囊水肿、禽掌炎、足垫皮炎、链球菌性乳腺炎、跛行、关节炎、多发性关节炎、纤维蛋白性多浆膜炎、断奶后肠道病症如断奶后腹泻和水肿病、痢疾、骨髓炎、关节和/或骨组织炎症、心包炎症、脾肿大、肝肿大、肾肿大、充血、坏死、肝或脾梗死、瓣膜性心内膜炎、败血症和/或脑膜炎的治疗组合物，其包含本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物。
因此，本发明的另一个优选主题也是治疗和/或预防水生动物(特别是有鳍鱼，优选罗非鱼，或甲壳类动物，优选虾)的疾病，并且该疾病特别是选自出血、游泳不稳定和柱形病，其中将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物施用于有此需要的水生动物。
因此，本发明的另一个主题还是治疗和/或预防猪或家禽中的疾病，特别是肠道疾病，优选坏死性肠炎或坏死性出血性肠炎，特别是亚临床坏死性肠炎或亚临床坏死性出血性肠炎，其中将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物施用于有此需要的动物。
因此，本发明的另一主题还是治疗和/或预防疾病，优选猪或家禽的疾病，其选自：细菌性肠炎、坏疽性皮炎、胆管肝炎、梭菌病、腹泻、呼吸困难、腹胀、阴囊水肿、禽掌炎、足垫皮炎、链球菌性乳腺炎、跛行、关节炎、多发性关节炎、纤维蛋白性多浆膜炎、断奶后肠道病症如断奶后腹泻和水肿病、痢疾、骨髓炎、关节和/或骨组织炎症、心包炎症、脾肿大、肝肿大、肾肿大、充血、坏死、肝或脾梗死、瓣膜性心内膜炎、败血症和/或脑膜炎，其中将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种组合物施用于有此需要的动物。
本发明的菌株和/或制剂和/或组合物可以在整个动物生命或在动物生命的特定阶段或部分期间在多天内以饲料和/或饮用水和/或饲养水施用于动物。例如，该菌株和/或制剂和/或组合物可以仅在农场动物的开口饮食(starter diet)或仅在育肥饮食(finisher diet)中施用。
本发明的一个具体主题还是一种增强人类健康和/或改善人类总体身体状况和/或提高人类抗病能力和/或调节人类的免疫应答和/或在人类中建立或维持健康的肠道微生物群落的方法，其中本发明的菌株和/或制剂或本发明的组合物(其包含此类菌株)被施用于人类。
因此，本发明的另一个主题还是本发明的菌株和/或制剂和/或组合物用于增强人类的健康和/或用于改善人类的总体身体状况和/或用于增加人类的抗病能力和/或用于调节人类的免疫应答和/或用于在人类中建立或维持健康的肠道微生物群落的用途，其中本发明的菌株和/或制剂或本发明的组合物(其包含此类菌株)被施用于人类。
本发明的组合物，特别是饲料、食品和药物组合物以及饮用水、饲养水、循环用水或废水优选包含本发明的菌株，并且以约1×103至约2×1012CFU/g饲料或ml水的比率，特别是以约1×103或约1×104或约1×105或约1×106或约1×107或约1×108或约1×109或约1×1010或约1×1011或约1×1012CFU/g饲料或ml水的比率，优选以约1×104至约1×1010CFU/g饲料或ml水的量，更优选以1×104至1×107CFU/g饲料或ml水的量施用于动物。
相应地，本发明的饲料、食品和水组合物中本发明的菌株和/或制剂的优选量为0.1重量％至10重量％，更优选为0.2重量％至5重量％，特别是0.3重量％至3重量％。
本发明的方法可用于所有种类的动物，特别是所有种类的非人类和非昆虫动物，更优选所有种类的脊椎动物诸如哺乳动物、水生动物和鸟类，特别优选水生动物。
可从本发明受益的动物包括但不限于农场动物、宠物、外来动物、动物园动物、用于运动、娱乐或工作的动物。
宠物优选选自狗、猫、家禽和家养的外来动物。
根据本发明的水生动物优选为有鳍鱼，特别是辐鳍鱼纲(Actinopterygii)，或甲壳类。辐鳍鱼纲包括，特别是，罗非鱼和其它丽鱼科鱼(cichlid)，鲤鱼和其它鲤科鱼，鲑鱼和其它鲑科鱼，鲶鱼，特别是非洲鲶鱼(African catfish)和巨鲶属(pangasius)，金枪鱼，河鲈(perch)，鳕鱼，胡瓜鱼(smelt)，遮目鱼，丝足鱼(gourami)，海鲈(seabass)，特别是澳洲肺鱼(barramundi)，海鲷，石斑鱼(grouper)和蛇头鱼。
本文中优选类型的鲑鱼和鲑科鱼是大西洋鲑鱼、红鲑(红大马哈鱼)、山女鳟(樱鲑)、鲑鱼王(Chinook salmon)、狗鲑(马苏大马哈鱼)、银鲑鱼、多瑙哲罗鱼、太平洋鲑鱼、粉鲑和鳟鱼。根据本发明的水生动物是非常优选的罗非鱼。
甲壳类动物特别包括虾、龙虾、螃蟹、对虾和小龙虾。
本文中优选的虾类型为滨对虾属(Litopenaeus)、美对虾属(Farfantepenaeus)和对虾属(Penaeus)，特别是南美蓝对虾(Penaeus stylirostris)、南美白对虾(Penaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeus chinensis)、西方对虾(Penaeus occidentalis)、加州对虾(Penaeus calif orniensis)、短沟对虾(Penaeussemisulcatus)、澳洲对虾(Penaeus esculentu)、白对虾(Penaeus setiferus)、日本对虾(Penaeus japonicus)、褐对虾(Penaeus aztecus)、桃红对虾(Penaeus duorarum)、印度对虾(Penaeus indicus)和墨吉对虾(Penaeus merguiensis)。根据本发明非常优选的虾是南美白对虾，也称为白脚虾。
用根据本发明的菌株和/或制剂和/或组合物治疗或喂养的水生动物，特别是虾，可以特别是幼体、后期幼体或幼虾。
水生动物尤其还可以是随后加工成鱼粉或鱼油的鱼。在这方面，鱼优选是鲱鱼、绿鳕、鳕鱼或小型远洋鱼如凤尾鱼、蓝芽鳕(blue whiting)、毛鳞鱼、玉鲳、杰克鱼、鲭鱼、鲱鱼、沙丁鱼或竹荚鱼。由此获得的鱼粉或鱼油又可用于养殖食用鱼或甲壳类动物的水产养殖。
水生动物还可以是牡蛎、蛤蜊、鸟蛤、赤贝、双壳贝、贻贝或扇贝。
然而，水生动物也可以是在水产养殖中用作饲料的小型生物。这些小型生物可以为例如线虫、小型甲壳动物或轮虫的形式。
水生动物的养殖可以在池塘、水池、盆地中或在海洋或湖泊或河流中的隔离区域中进行，特别是在这种情况下在网箱或网栏中。养殖可用于养殖成品食用鱼，但也可用于养殖随后被放归以再补充野生鱼种的鱼苗。
在鲑鱼养殖中，鱼优选首先在淡水池或人工水道中培育成小鲑鱼，然后在漂浮在海洋、池塘或河流中且优选锚定在海湾或峡湾中的网箱或网栏中生长。
因此，本发明的饲料优选是用于上述动物养殖的饲料。
根据本发明，本发明的菌株、制剂和组合物可以以宽的剂量范围使用。日剂量为，例如，每千克活体重约1mg至约500mg，特别是约5mg至约200mg，约10mg至约100mg或约20mg至约60mg的范围内。
在本发明的另一个实施方案中，动物为农场动物，其被饲养用于食用或作为食品生产者，诸如家禽、猪和反刍动物。
家禽可以选自生产性家禽或家养家禽，但也可以选自观赏型家禽或野禽。在本文中优选的生产性家禽是鸡、火鸡、鸭和鹅。在本文中，生产性牲畜优选为优化用于生产幼畜的家禽或优化用于产肉的家禽。优选的观赏型家禽或野禽是孔雀、雉鸡、鹧鸪、石鸡(chukkar)、珍珠鸡、鹌鹑、雷鸟(capercaillies)、松鸡(grouse)、鸽子和天鹅，特别优选鹌鹑。进一步优选的家禽是平胸类动物，特别是鸵鸟和鸸鹋以及鹦鹉。
根据本发明的反刍动物优选选自牛、山羊和绵羊。在一个实施方案中，可以将本发明的组合物喂给反刍动物幼崽(preruminant)以增强其健康，特别是降低这些动物腹泻发生率。反刍动物幼崽是年龄范围从出生到约12周的反刍动物，包括小牛。
本发明的组合物可包含至少一种载体或典型的饲料成分或其组合。
合适的载体是惰性制剂成分，其被添加以改善回收率、功效或物理性质和/或有助于包装和给药。这些载体可以单独或组合添加。这些载体可以选自防结块剂、抗氧化剂、蓬松剂、粘结剂、结构剂、包衣和/或保护剂。有用的载体的实例包括多糖(特别是淀粉、麦芽糖糊精、甲基纤维素、树胶、壳聚糖和/或菊粉)，蛋白质源(特别是脱脂奶粉和/或甜乳清粉)，肽，糖(特别是乳糖、海藻糖、蔗糖和/或葡萄糖)，脂质(特别是卵磷脂、植物油和/或矿物油)，盐(特别是氯化钠、碳酸钠、碳酸钙、白垩、石灰石、碳酸镁、磷酸钠、磷酸钙、磷酸镁和/或柠檬酸钠)以及硅酸盐(特别是粘土，特别是beolite clay、无定形二氧化硅、热解法/沉淀二氧化硅、沸石、漂白土、
Figure BDA0003739173360000161
clintpolite、蒙脱土、硅藻土、滑石、膨润土和/或硅酸盐如硅酸铝、硅酸镁和/或硅酸钙)。用于动物饲料添加剂的合适载体如American FeedControl Officials,Inc.'s Official Publication(其每年出版一次)中所述。参见，例如Official Publication of American Feed Control Officials,Sharon Krebs,主编,2006版,ISBN 1-878341-18-9。可以在浓缩发酵液之后和/或在干燥过程中和/或之后添加载体。本发明优选的载体选自碳酸钙、硅藻土和植物油。
本发明的一个优选实施方案是浓缩组合物，特别是饲料添加剂组合物，即适合于制备饲料组合物的组合物，其包含本发明的至少一种菌株和至少一种如上所述的载体，其中该至少一种菌株的含量优选为0.1-10重量％的量，更优选以0.2-5重量％的量，特别是以0.3-3重量％的量，尤其是以0.4-2.2重量％的量，并且该至少一种载体的含量优选为至少90重量％的量，优选以90-99.9重量％的量，更优选以95-99.8重量％的量，特别是以97-99.7重量％的量，尤其是以97.8-99.6重量％的量，并且其中载体优选基本上由石灰石(特别是具有较少部分的硅藻土和/或植物油的石灰石)组成。
本发明的这些优选的组合物(其含有稳定的菌株)可用于制备饲料和药物组合物以及饮用水和饲养水，其优选包含如上述说明书中所述量的本发明的菌株。在优选的实施方案中，每吨饲料、饮用水或饲养用水使用50-1000克这种浓缩组合物，特别是50、100、250、500或1000克这种浓缩组合物，以提供可用于饲养动物的组合物。这些浓缩组合物优选包含本发明的至少一种菌株，其量为每克浓缩组合物1×109-2×1011CFU，特别是2×109-1×1011CFU。
从这些浓缩组合物开始，可以通过将浓缩组合物分别与典型的饲料或食品成分混合来制备饲料和食品组合物。
可以包含在根据本发明的组合物中和/或用于从根据本发明的浓缩组合物开始制备饲料组合物的合适的典型动物饲料成分包括以下的一种或多种：蛋白质、碳水化合物、脂肪、其它益生菌和/或其它无机氮化合物降解微生物、益生元、酶、维生素、免疫调节剂、代乳品、矿物质、氨基酸、载体、球虫抑制剂、基于酸的产品和/或药物，诸如抗生素。
根据本发明可以使用的含有碳水化合物的组分是例如草料、粗饲料、小麦粉、玉米粉、向日葵粉或大豆粉及其混合物。
可以根据本发明使用的含有蛋白质的组分是例如大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦蛋白、玉米蛋白、大米、菜籽粉(canola meal)、海洋动物粗粉(特别是鱼粉)、陆生动物粗粉及其混合物。“海洋动物粗粉”包括肉粉、肉骨粉、血粉、肝粉、家禽粉、蚕粉、蚕蛹粉及其组合。
脂肪通常作为海洋动物油、植物油或微生物油，特别是微藻油或其组合提供。植物油的实例是大豆油、菜籽油、葵花籽油、低芥酸菜子油(canola oil)、棉籽油、亚麻籽油和棕榈油。海洋动物油包括鱼油以及磷虾、双壳贝、鱿鱼或虾的油，以及来自鳀科(Engraulidae)、鲹科(Carangidae)、鲱科(Clupeidae)、胡瓜鱼科(Osmeridae)、鲭科(Scombridae)和/或玉筋鱼科(Ammodytidae)的鱼类的其它脂肪油。微藻的油的实例特别是盘蜷纲(Labyrinthulea)的油，优选Schizochytria或Thraustochytria的油。除了分离的油之外，脱脂生物质本身也可以用作脂肪源，即特别是海洋动物粗粉(优选鱼粉)或植物粗粉(特别是大豆粉、油菜籽粉、向日葵粉、菜籽粉(canola meal)、棉籽粉和/或亚麻籽粉)。
可根据本发明使用的含有蛋白质的组分(其另外含有脂肪)为例如鱼粉、磷虾粉、双壳贝粉、鱿鱼粉或虾壳及其组合。
根据本发明的饲料优选具有20至50重量％的总蛋白质含量和/或1至15重量％的总脂肪含量和/或20至60重量％的总碳水化合物含量。
可根据本发明与本发明的菌株和制剂组合使用的其它益生菌(DFM)和/或微生物优选为选自以下种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus alevi、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis)、屎肠球菌和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。优选的实例为短小芽孢杆菌DSM 32539和枯草芽孢杆菌DSM 32540(二者均于2017年6月14日根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定保藏于DSMZ)及其衍生菌株，地衣芽孢杆菌DSM 32314和枯草芽孢杆菌DSM 32315(二者均于2016年5月12日根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定保藏于DSMZ)及其衍生菌株，枯草芽孢杆菌PB6(如美国专利号7,247,299中所述并以ATCC Accession No.PTA-6737保藏)，其由Kemin以商标
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销售，枯草芽孢杆菌C-3102(如美国专利号4,919,936中所述，并以FERM BP-1096保藏于日本Fermentation Research Institute,Agency ofIndustrial Science and Technology)，由Calpis以
Figure BDA0003739173360000182
销售，枯草芽孢杆菌DSM 17299，由Chr.Hansen以商标
Figure BDA0003739173360000183
销售，地衣芽孢杆菌DSM 17236，由Chr.Hansen以商标
Figure BDA0003739173360000184
销售，地衣芽孢杆菌DSMZ 5749和枯草芽孢杆菌DSMZ 5750孢子的混合物，由Chr.Hansen以商标
Figure BDA0003739173360000185
YC销售，枯草芽孢杆菌DSM 29784，由Adisseo/Novozymes以商标
Figure BDA0003739173360000186
销售，枯草芽孢杆菌，由Chr.Hansen以商标
Figure BDA0003739173360000187
销售，或美国专利号6,849,256中所述的凝结芽孢杆菌菌株。其它非芽孢杆菌益生菌，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或汉逊氏酵母(Hansenula)，也可用于本发明的组合物中。特别是在食品组合物中，可以使用已知对人类健康有用的其它益生菌，诸如产乳酸细菌，特别是乳杆菌或双歧杆菌。如果所述另外的益生菌配制为本发明组合物的一部分，则它们可与本发明组合物一起(同时或在不同时间)施用。
可根据本发明使用的益生元优选为低聚糖，特别是选自低聚半乳糖、唾液酸低聚糖、乳果糖、乳蔗糖、低聚果糖、帕拉金糖或异麦芽低聚糖、糖基蔗糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖浆、环糊精、低聚龙胆糖、大豆低聚糖、低聚木糖、葡聚糖、果胶、聚半乳糖醛酸、鼠李糖聚半乳糖醛酸、甘露聚糖、半纤维素、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、抗性淀粉、mehbiose、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、菊粉、塔格糖、聚葡萄糖和藻酸盐。
可用于根据本发明的饲料组合物中并且可有助于饲料消化的酶优选选自植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、半乳糖苷酶，特别是α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4)、磷脂酶，特别是磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、A2(EC 3.1.1.4)、C(EC 3.1.4.3)和D(EC 3.1.4.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)，淀粉酶，特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)、葡聚糖酶，特别是β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)、葡糖淀粉酶、纤维素酶、果胶酶或其任何混合物。
可商购获得的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM Phytase(Novozymes)、
Figure BDA0003739173360000188
P和HiPhosTM(DSM Nutritional Products)、NatuphosTM(BASF)、
Figure BDA0003739173360000189
和
Figure BDA00037391733600001810
Blue(AB Enzymes)、
Figure BDA00037391733600001811
XP(Verenium/DuPont)和
Figure BDA00037391733600001812
PHY(DuPont)。其它优选的植酸酶包括例如WO 98/28408、WO 00/43503和WO 03/066847中描述的那些。
可商购获得的木聚糖酶的实例包括
Figure BDA00037391733600001813
WX和G2(DSM NutritionalProducts)、
Figure BDA00037391733600001814
XT和Barley(AB Vista)、
Figure BDA00037391733600001815
(Verenium)和
Figure BDA00037391733600001816
XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，DuPont)。可商购获得的蛋白酶的实例包括
Figure BDA00037391733600001817
ProAct(DSMNutritional Products)。
可根据本发明使用的维生素为例如维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K，例如维生素K3、维生素B12、生物素、胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸，例如Ca-D-泛酸，或其组合。
可以使用的免疫调节剂为例如抗体、细胞因子、喷雾干燥的血浆、白介素或干扰素，或其组合。
可根据本发明使用的矿物为例如硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒、锌、钙，磷、镁、钾或钠，或其组合。
可根据本发明使用的氨基酸为例如赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，或其组合。
本发明的饲料可以进一步包含甜菜碱和/或胆碱和/或其它生理有效的甲基供体。该饲料可以进一步包含多不饱和脂肪酸，特别是DHA和/或EPA。
因此，本发明的另一个实施方案是一种制备动物饲料组合物的方法，其包含将本发明的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种浓缩组合物，特别是以有效增强动物健康(特别是肠道健康)的量，与饲料成分(诸如蛋白质、脂质和/或碳水化合物)，以及任选存在的其它有益物质(优选如前所述)混合，以得到饲料产品。该方法还可以包含例如造粒步骤。
可以使用本领域技术人员已知的标准造粒方法，包括干燥或半湿进料的挤出加工。优选的造粒温度为约65℃至约120℃。
本发明的菌株和组合物可以通过根据本领域熟知的方法培养本发明的菌株来获得，包括通过使用例如US 6,060,051、EP0287699或US2014/0010792中描述的培养基和其他方法。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。在发酵接近尾声时，随着营养物耗尽，菌株的细胞开始从生长期向孢子形成期过渡，使得发酵的最终产物大部分为孢子、代谢物和残余的发酵培养基。孢子形成是这些菌株的自然生命周期的一部分，并且通常由细胞响应于营养限制而启动。配置发酵以获得高水平的枯草芽孢杆菌细胞集落形成单位并促进孢子形成。发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物可直接使用或通过常规工业方法如离心、切向流过滤、深层过滤和蒸发来浓缩。浓缩的发酵液可以例如经由渗滤过程洗涤，以去除残余的发酵液和代谢物。
可以使用常规干燥工艺或方法(如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、转鼓式干燥或蒸发)在添加或不添加载体的情况下干燥发酵液或发酵液浓缩物。所得干燥产物可以进一步加工，例如通过研磨或造粒，以获得特定的粒度或物理形式。如上所述，载体也可以在干燥后加入。
本发明菌株的制剂可以是无细胞制剂或含有细胞碎片的制剂或含有完整细胞和细胞碎片的混合物的制剂。
本发明的菌株的无细胞制剂可以例如通过离心和/或过滤发酵液获得。根据所使用的技术，这些无细胞制剂可能不会完全没有细胞，但可能仍然包含较少量的细胞。由于细胞将化合物如代谢物、酶和/或肽分泌到周围培养基中，细胞的上清液包含此类化合物的混合物，特别是由细胞分泌的代谢物、酶和/或肽。因此，在本发明的一个优选实施方案中，菌株的制剂为发酵液的上清液。菌株的制剂，特别是上清液，也可以以干燥形式使用，其中干燥可以例如通过喷雾干燥或冷冻干燥进行。
包含菌株细胞碎片的组合物可以通过应用本领域技术人员已知的技术例如通过机械方法或通过施加高压来破裂细胞而获得。根据施加的力的程度，获得仅包含破裂细胞的组合物或包含细胞碎片和完整细胞的混合物的组合物。细胞的均质化可以例如通过使用French细胞压榨机、超声波仪、均质器、微流化仪、球磨机、棒磨机、砾磨机、珠磨机、高压磨辊、立轴冲击器、工业混合器、高剪切混合器、桨式混合器和/或polytron均质器来实现。合适的替代方案为细胞的酶促和/或化学处理。
本发明的无细胞制剂还包含这样的制剂，其通过首先应用如上所述的技术破裂细胞，并随后去除细胞碎片和剩余的完整细胞而获得。去除细胞碎片和剩余的完整细胞可以特别地通过离心和/或过滤进行。
本发明菌株的制剂可包含作为活性化合物的至少一种代谢物，优选如下文进一步描述的代谢物的混合物，和/或至少一种选自蛋白酶(特别是枯草杆菌蛋白酶)、木聚糖酶和/或纤维素酶的酶，和/或至少一种肽，和/或其组合。
可以例如根据美国专利号6,060,051中所述的方法获得含有如上所述的本发明的菌株中和/或细胞制剂中所含代谢物的有效混合物的制剂。特别是，该制剂可以通过使用有机溶剂如乙酸乙酯沉淀前述制剂中所含的代谢物并随后将沉淀的代谢物再溶解在合适的溶剂中来获得。随后可通过基于截留分子量将代谢物分组为不同级分的尺寸排阻过滤来纯化代谢物。
含有本发明代谢物的有效混合物的制剂优选包含至少五种，更优选至少6、7、8、9、10或12种，特别是本发明各菌株的所有代谢物。代谢物优选具有400-5000道尔顿，更优选800-4000道尔顿的分子量。
优选地，根据本发明，在本发明的实施方案中总是使用有效量的本发明的菌株和/或制剂和/或组合物。术语“有效量”是指与未施用本发明的菌株和/或制剂和/或组合物，但除了施用相同的饮食(包括饲料和其它化合物)的动物相比，对动物和/或环境产生至少一种有益效果的量，特别是就如前所述的特征而言。
在治疗应用的情况下，优选使用治疗量的本发明的菌株和/或制剂和/或组合物。术语“治疗量”是指足以改善、逆转或预防动物疾病状态的量。对于各种动物的最佳剂量水平，可以由本领域技术人员通过评估尤其是组合物对以下的能力：(i)在不同剂量下抑制或减少肠道或腮中的病原细菌，(ii)增加或维持有益细菌的水平和/或(iii)在不同剂量下增强动物健康(特别是肠道健康)来容易地确定。
工作实施例
实施例1：菌株减少氮的能力
从不同环境样品中针对水修复特性筛选芽孢杆菌菌株。为了获得用于水产养殖生物修复的优良菌株，进行了各种试验以测定在广泛条件下减少氮化合物的能力。在不同盐度(0-3％)和不同C:N比(20-2600)下测试菌株。四种枯草芽孢杆菌菌株DSM 33351、DSM33352、DSM 33349和DSM 33350显示出非常有前景的特性，如下所述。
所有的亚硝酸盐(NO2-N)测量均是使用亚硝酸盐比色皿试验(Nitrite cuvettetest)0.015-0.6mg/L NO2-N和亚硝酸盐比色皿试验0.6-6.0mg/L NO2-N(Hach Company,Loveland,Colorado,USA)进行的。所有氨(NH4+-N)浓度均通过流动注射分析仪(FIA，应用系统：FOSS FIAstar 5000)测定。在系统内，将样品等分试样碱化以从溶剂化铵离子(NH4+)定量生成氨(NH3)。氨通过半透膜扩散(气体扩散)。然后可以通过指示剂溶液(光度检测，基于5',5”-二溴邻甲酚磺酰酞(“Bromkresolpurpur”，Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)应用的指示剂)监测pH的变化。随着氨浓度的升高，消光会非线性增加，并需要适当校准。该方法的有效测量区域为1-13mg/L(线性范围)和10-130mg/L(非线性范围)。
在不同盐度下，在仅含有葡萄糖作为碳源和5ppm氨作为唯一氮源的C基本培养基中测试所有菌株的氨减少能力。对于每种枯草芽孢杆菌菌株，将50μl甘油原液接种到C:N比为68的10ml C基本培养基(0.0352g/l MnSO4×1H2O，2.46g/l MnSO4×7H2O，0.2KH2PO4，0.6g/l K2HPO4，0.02FeSO4×7H2O，0.2792g/l(NH4)2SO4，10g/l葡萄糖和0或15或30g/lNaCl)中，并在100ml摇瓶中在28℃和200rpm下孵育。孵育48小时后，用上述方法测量氨的浓度。参照初始浓度计算各菌株减少的氨的百分比量，该初始浓度在各盐度的未接种对照中测定(表1.1)。菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350能够有效去除仅含有葡萄糖作为碳源和5ppm氨作为氮源的C基本培养基中的氨，因为在所有盐度条件下48小时后仍可检测到最大0.3％的初始氨浓度。
表1.1在不同盐度下在仅含有葡萄糖作为碳源和5ppm氨作为氮源的C基本培养基中的氨减少
Figure BDA0003739173360000211
进一步测试了所有菌株在仅含有葡萄糖作为碳源和5ppm亚硝酸盐作为氮源的C基本培养基中减少亚硝酸盐的能力。对于每种枯草芽孢杆菌菌株，将50μl甘油原液接种到C:N比为2600的10ml C基本培养基(0.0352g/l MnSO4×1H2O，2.46g/l MnSO4×7H2O，0.2KH2PO4，0.6g/l K2HPO4，0.02FeSO4×7H2O，0.0075g/l NaNO2，10g/l葡萄糖和0或15或30g/l NaCl)中，并在100ml摇瓶中在28℃和200rpm下孵育。孵育48小时后，用上述方法测量亚硝酸盐的浓度。参照初始浓度计算各菌株减少的亚硝酸盐百分比，该初始浓度在各盐度的未接种对照中测定(表1.2)。在0和15％盐度下，菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350能够在48小时内有效去除所有亚硝酸盐。在3％盐度下，菌株DSM 33351和DSM 33350将亚硝酸盐降低至0mg/ml，而菌株DSM 33352和DSM 33349分别去除了的67％和87％，参考初始浓度为5.15mg/l。
表1.2在不同盐度下在仅含有葡萄糖作为碳源和5ppm亚硝酸盐作为氮源的C基本培养基中的亚硝酸盐减少
Figure BDA0003739173360000221
在仅含有葡萄糖作为碳源和亚硝酸盐和氨二者的终浓度为2.5ppm且C:N比为20的C基本培养基中测试所有菌株的减少氨和亚硝酸盐的能力。将在37℃下在TSA琼脂上生长24小时的菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349或DSM 33350的单菌落接种于10ml相应培养基(0.0352g/l MnSO4×1H2O，2.46g/l MnSO4×7H2O，0.2KH2PO4，0.6g/l K2HPO4，0.02FeSO4×7H2O，0.1396g/l(NH4)2SO4，0.00375g/l NaNO2，1.517g/l葡萄糖和0或15或30g/l NaCl)。将培养物在28℃下以200rpm孵育。48小时后，用上述方法测定氨和亚硝酸盐的浓度。参照初始浓度计算各菌株减少的氨和亚硝酸盐的量，该初始浓度在各盐度的未接种对照中测定(表1.3)。菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350能够在仅含有葡萄糖作为碳源和终浓度为2.5ppm亚硝酸盐和氨作为氮源的C基本培养基中在所有盐度下48小时后同时去除99.7％的初始氨和100％的初始亚硝酸盐。
表1.2不同盐度下仅含葡萄糖作为碳源和终浓度为2.5ppm亚硝酸盐和氨作为氮源的C基本培养基中氨和亚硝酸盐的减少
Figure BDA0003739173360000222
总体而言，这些数据表明，枯草芽孢杆菌菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350可以使用氨和亚硝酸盐二者作为唯一的氮源，并在48小时内有效地去除这两种化合物。
实施例2：C基本培养基中的孢子的生长晕(outgrowth)和氮减少
芽孢杆菌菌株产生孢子的能力对于获得长期稳定的产品是一大优势。
为了产生枯草芽孢杆菌DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350的孢子，菌株在30℃下在50g培养基中预生长14小时并以200rpm振荡，该培养基含有43g/kg大豆粉和22g/kg糖溶液(320g/kg葡萄糖，90g/kg果糖，350g/kg麦芽糖和100g/kg麦芽三糖)。接下来，将14g之前的培养物接种200g产孢子培养基，并在30℃下孵育，同时以200rpm振荡。产孢子培养基由21g/kg上述糖溶液、43g/kg大豆粉，0.29g/kg MgSO4×7H2O，0.032g/kg MnSO4×H2O，0.023g/kg FeSO4×7H2O和0.003g/kg ZnSO4×7H2O组成。孵育48小时后，通过离心收获孢子并将其再悬浮于含20％甘油的PBS缓冲液中并储存在-80℃下。
测试了孢子DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350在以氨和亚硝酸盐作为氮源的C基本培养基中长出(grow out)的潜力以及它们有效减少氨和亚硝酸盐的能力。
为了在基于微量滴定板的测定中测试生长晕，将菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM33349和DSM 33350的106CFU/ml孢子接种到终体积为150μl ml的相应C基本培养基中，其中葡萄糖作为唯一碳源且氨和亚硝酸盐作为氮源(0.0352g/l MnSO4×1H2O，2.46g/l MnSO4×7H2O，0.2KH2PO4，0.6g/l K2HPO4，0.02FeSO4×7H2O，0.1396g/l(NH4)2SO4，0.00375g/l NaNO2和10g/l葡萄糖(C:N比＝20))并补充有10％PrestoBlueTM(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)。将孢子在微量滴定板读数器(TECAN
Figure BDA0003739173360000231
M1000 Pro)中在37℃，350rpm轨道振荡下孵育30h。通过正在长出细胞的代谢活性检测孢子生长晕，其会将PrestoBlueTM的非荧光刃天青还原为亮红色荧光试卤灵。在培养过程中实时测量荧光(激发滤光片：550-12nm；发射滤光片：590nm)。所得动力学用于基于限定阈值计算孢子生长晕的时间点。菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350的直至生长晕的小时数描述于表2.1中。所有菌株均能够在23.35h内在仅含有葡萄糖作为C源和终浓度为2.5ppm亚硝酸盐和氨的C基本培养基中长出，而DSM 33349长出得最快，为18.89h。
表2.1孢子在仅含有葡萄糖作为碳源和终浓度为2.5ppm亚硝酸盐和氨作为氮源的C基本培养基中的生长晕。
菌株 直至生长晕的时间[h]
DSM 33351 23.35
DSM 33352 21.14
DSM 33349 18.89
DSM 33350 20.00
还测试了菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350的孢子在仅含有葡萄糖作为碳源和各终浓度为2.5ppm的亚硝酸盐和氨的C基本培养基中去除氨和亚硝酸盐的能力。在100ml摇瓶中，向10ml相应培养基(0.0352g/l MnSO4×1H2O，2.46g/l MnSO4×7H2O，0.2KH2PO4，0.6g/l K2HPO4，0.02FeSO4×7H2O，0.1396g/l(NH4)2SO4，0.00375g/l NaNO2和10g/l葡萄糖(C:N比＝20))中接种107CFU/ml的孢子储备液。将培养物在28℃和200rpm下孵育。52小时后，用上述方法测定氨和亚硝酸盐的浓度。参照在未接种对照中测定的初始浓度计算各菌株减少的氨和亚硝酸盐的量(表2.2)。从接种有菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM33349和DSM 33350的孢子的烧瓶中有效去除氨和亚硝酸盐。这些菌株能够在52小时内同时去除最少99.6％的氨和100％的亚硝酸盐。
表2.2在仅含有葡萄糖作为C源和终浓度为2.5ppm亚硝酸盐和氨作为氮源的接种有孢子的C基本培养基中氨和亚硝酸盐的减少
Figure BDA0003739173360000241
这些数据表明，菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350的孢子不仅能够在含有2.5ppm亚硝酸盐和氨作为唯一氮源的C基本培养基中萌发和长出，而且它们还能够在52小时内去除各2.5ppm的亚硝酸盐和氨。
实施例3：菌株抑制病原体的能力
使用孔扩散拮抗试验(Parente等人,1995)分析了抑制水产养殖中重要的不同病原体的能力。在这些测定中测试的病原体是哈维氏弧菌DSM 19623、副溶血弧菌DSM 10027、嗜水气单胞菌DSM 30187、无乳链球菌DSM2134和柱状黄杆菌DSM 25092。
已知弧菌与虾的疾病和高死亡率相关，但也可感染鱼(Chatterjee and Haldar,2012)。罗非鱼感染可能与无乳链球菌(一种广泛分布的细菌)有关，可引起例如出血或游泳不稳定(Mishra等人,2018)。柱状杆菌病是由柱状黄杆菌感染淡水鱼引起的。例如，鲑鱼和鳟鱼养殖场报告的年损失很高(Pulkkinen等人,2010)。
病原体在适当的条件下在液体培养基中生长，直到OD600的光密度达到至少1.0。用无菌刮刀将病原体接种在Caso Yeast琼脂平板的表面上。在干燥的板中切出直径为9mm的孔。菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350在100ml摇瓶中在LB-Kelly(补充有DSMZ培养基1032的微量元素溶液的LB培养基)中在37℃和200rpm下生长16小时。用未接种培养基作为对照和100μl OD5.0调整过的菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM33350的培养物填充切出的孔。将板在合适的条件下孵育，并测定从切出的孔的边缘到清除的菌苔的边界的清除区(以mm计)。该区域水平和垂直测量，取平均值。根据表3.1应用低(+)、中(++)、高(+++)和非常高(++++)抑制评分。
表3.1在孔扩散拮抗试验中基于孔径和清除区的病原体抑制评分
评分 孔径+清除区[mm]
低(+) ≤9.5mm
中(++) >9.5≤15
高(+++) >15≤25
非常高(++++) >25≤30
菌株DSM 33351、DSM 33352、DSM 33349和DSM 33350对病原体的抑制结果分别见表3.2至3.6。
表3.2枯草芽孢杆菌DSM 33351在Caso Yeast培养基上的孔扩散拮抗试验中对不同病原体的抑制能力，抑制强度根据表4.1进行评分。
病原体 抑制强度
哈维氏弧菌DSM 19623 +
副溶血弧菌DSM 10027 +
嗜水气单胞菌DSM 30187 ++
无乳链球菌DSM 2134 ++++
数据显示，枯草芽孢杆菌DSM 33351可抑制哈维氏弧菌DSM 19623、副溶血弧菌DSM10027、嗜水气单胞菌DSM 30187和无乳链球菌DSM2134的生长。
表3.3枯草芽孢杆菌DSM 33352在Caso Yeast培养基上的孔扩散拮抗试验中对不同病原体的抑制能力，抑制强度根据表5.1进行评分。
病原体 抑制强度
嗜水气单胞菌DSM 30187 ++
无乳链球菌DSM 2134 +++
数据显示，枯草芽孢杆菌DSM 33352可抑制嗜水气单胞菌DSM 30187和无乳链球菌DSM2134的生长。
表3.4枯草芽孢杆菌DSM 33349在Caso Yeast培养基上的孔扩散拮抗试验中对不同病原体的抑制能力，抑制强度根据表6.1进行评分。
病原体 抑制强度
哈维氏弧菌DSM 19623 +
嗜水气单胞菌DSM 30187 ++
无乳链球菌DSM 2134 ++++
柱状黄杆菌DSM 25092 +
数据显示，枯草芽孢杆菌DSM 33349可抑制哈维氏弧菌DSM 19623、嗜水气单胞菌DSM 30187、无乳链球菌DSM2134和柱状黄杆菌DSM 25092的生长。
表3.4枯草芽孢杆菌DSM 33350在Caso Yeast培养基上的孔扩散拮抗试验中对不同病原体的抑制能力，抑制强度根据表7.1进行评分。
病原体 抑制强度
哈维氏弧菌DSM 19623 +
副溶血弧菌DSM 10027 +
嗜水气单胞菌DSM 30187 ++
无乳链球菌DSM 2134 ++++
柱状黄杆菌DSM 25092 +
数据显示，枯草芽孢杆菌DSM 33350可抑制哈维氏弧菌DSM 19623、副溶血弧菌DSM10027、嗜水气单胞菌DSM 30187、无乳链球菌DSM2134和柱状黄杆菌DSM 25092的生长。
文献
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Chatterjee,S.and Haldar,S.(2012).Vibrio Related Diseases inAquaculture and Development of Rapid and Accurate IdentificationMethods.J.Marine Sci.Res.Dev.S1:002.doi:10.4172/2155-9910.S1-002.
Pulkkinen,K.,Suomalainen,L.-R.,Read,A.F.,Ebert,D.,
Figure BDA0003739173360000261
P.andValtonen,E.T.(2010).Intensive fish farming and the evolution of pathogenvirulence:the case of columnaris disease in Finland.Proc.R.Soc.B.277,593–600.
Mishra,A.,Nam,G.H.,Gim,J.A.,Lee,H.E.,Jo,A.and Kim,H.S.(2018).CurrentChallenges of Streptococcus Infection and Effective Molecular,Cellular,andEnvironmental Control Methods in Aquaculture.Mol.Cells.41(6):495-505
序列表
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<120> 具有降解无机氮化合物能力的芽孢杆菌菌株
<130> 202000003
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1457
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
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gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 180
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<211> 1197
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
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gcatctgcag acgttgaacg cgatgtagta acaaaagaat aa 3582
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<211> 1632
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
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ttcggctccg atcaagagat tcttgatctc ataggagaaa acgaatacct gcgaaatacg 660
cttgataaag ataacacaga aaacagtgac aaagcgttgc tggaaattta cgagcgtctc 720
cgtcctggag agccgcctac agtagaaaat gcgaaaagct tgcttgattc tcgtttcttt 780
gatccgaaac gatacgatct tgccaatgta ggacgctata aaattaataa aaaacttcat 840
attaagaatc gcctcttcaa tcagagactt gctgaaacgc ttgttgatcc tgaaacagga 900
gaaatccttg ctgaaaaagg ccagattctt gatagaagaa cacttgataa agtactgcca 960
tacttagaaa acggaatcgg ttttagaaag ctgtatccga atggcggcgt tgttgaagat 1020
gaagtgactc ttcaatcaat taaaatcttt gctccgactg atcaagaagg agaacaggtt 1080
attaatgtaa tcggcaatgc ttacatcgaa gaagagatta aaaacatcac gcctgctgat 1140
attatttctt caatcagcta cttcttcaac ttgctgcacg gagtaggcga tacagatgat 1200
atcgatcatc ttggaaaccg ccgtttacgc tctgtaggcg agcttctcca gaaccaattc 1260
cgtatcggtt taagccgtat ggaacgtgtg gttcgtgaga gaatgtcaat tcaagatacg 1320
aatacaatta cgcctcagca gctgatcaat attcgtcctg ttattgcgtc cattaaagag 1380
ttctttggaa gctcacagct ttctcaattc atggatcaga cgaacccgct tgctgaatta 1440
acgcacaagc gtcgtctgtc agcattagga ccgggcggat tgacacgtga gcgtgccgga 1500
atggaagtgc gtgacgttca ctactcccac tatggccgta tgtgtccgat tgaaacgcct 1560
gagggcccga acatcggttt gatcaactca ctatcatctt atgcaaaagt aaaccgtttt 1620
ggctttattg aaacgccata tcgccgcgtt gaccctgaaa cagggaaggt aacgggcaga 1680
atcgattact taactgctga tgaagaggat aactatgttg tcgctcaagc gaatgctcgt 1740
cttgatgacg aaggcgcctt tattgatgac agcatcgtag ctcgtttccg cggggagaac 1800
actgttgttt ccagaaaccg tgtagactac atggatgtat cgcctaagca ggttgtatct 1860
gctgcgacag catgtatccc gttcttagaa aacgatgact cgaaccgtgc cctcatggga 1920
gcgaacatgc agcgccaggc tgtgcctttg atgcagccgg aagctccatt tgttggaact 1980
ggtatggaat acgtatcagg aaaagactct ggtgccgctg ttatttgtaa acaccctggt 2040
atcgttgaac gcgtagaagc gaaaaacgtt tgggttcgcc gttatgaaga agtagacggt 2100
caaaaagtaa aaggaaacct ggataaatac agcctgctga aatttgtccg ctctaaccaa 2160
ggtacgtgct acaaccagcg tccgatcgta agtgtcggcg atgaagtggt aaaaggagaa 2220
atccttgctg acggtccttc tatggagctt ggtgaacttg cacttggccg taacgtaatg 2280
gtcggcttca tgacatggga tggctacaac tatgaggatg ccatcatcat gagtgaacgc 2340
ctagtgaagg atgatgttta tacatctatc cacattgaag aatacgaatc agaagcacgt 2400
gatacgaaac ttggacctga agaaatcact cgcgatattc caaacgtcgg tgaagatgcg 2460
cttcgcaatc ttgatgaccg tggaatcatc cgtattgggg cagaagtaaa agacggagat 2520
cttcttgttg gtaaagtaac gcctaaaggc gtaactgaac tgactgcaga agaacgcctt 2580
cttcacgcca tttttggcga gaaagcccgc gaggttcgtg atacttctct tcgtgtgcct 2640
cacggcggcg gcggaattat ccatgacgtt aaagtcttca accgtgaaga cggagacgaa 2700
cttcctccag gtgttaacca gttagtacgc gtatatatcg ttcagaaacg taagatttct 2760
gaaggggata aaatggccgg tcgtcacggt aacaaaggtg ttatctctaa gattcttcct 2820
gaagaggata tgccttacct tcctgacggc acaccaattg atatcatgct taacccgctg 2880
ggcgtaccat cacgtatgaa catcgggcag gtattggaac ttcacatggg tatggccgct 2940
cgttaccttg gcattcacat tgcatctcct gtatttgacg gagcgcgaga agaggatgtc 3000
tgggaaacac ttgaagaagc cggcatgtct cgtgacgcca aaacagtgct ttacgacgga 3060
cgtactggag agccgtttga taaccgtgta tctgtcggta tcatgtacat gatcaaacta 3120
gctcacatgg ttgacgataa acttcatgca cgctctacag gtccttactc acttgttacg 3180
cagcagcctc ttggcggtaa agcgcaattt ggcggacagc gttttggtga gatggaggtt 3240
tgggcacttg aagcttacgg tgcggcttat actcttcaag aaattctgac tgttaagtct 3300
gatgacgtgg ttggacgtgt gaaaacatac gaagccatcg ttaaaggcga caatgttcct 3360
gaaccaggtg ttccggaatc attcaaagta ttaatcaaag aacttcaaag cttaggtatg 3420
gatgtcaaaa tcctttctgg tgatgaagaa gaaatagaaa tgagagattt agaagacgaa 3480
gaagatgcga aacaagctga cggcctggca ttatcaggtg atgaagagcc ggaagaaaca 3540
gcatctgcag acgttgaacg cgatgtagta acaaaagaat aa 3582
<210> 20
<211> 1632
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 20
atggcaaaag aaattaagtt tagtgaagaa gctcgccgcg caatgcttcg cggtgtcgat 60
gcacttgctg atgctgttaa agtaacttta ggaccaaaag gacgcaacgt ggttctagag 120
aaaaaattcg gttctccgtt aatcacaaat gacggtgtaa caatcgctaa agaaatcgag 180
ctagaagacg cttttgaaaa catgggtgct aagcttgttg ctgaagtagc cagcaaaaca 240
aacgacgttg ccggtgacgg tacaacaact gcaacagttc ttgcgcaagc aatgatccgt 300
gaaggcctta aaaacgtaac agcaggcgct aaccctgtag gcgtgcgtaa agggatggaa 360
caagctgtag cggttgcgat cgaaaactta aaagaaattt ctaagccaat cgaaggcaaa 420
gagtctatcg ctcaggttgc tgcgatctct gctgctgacg aggaagtcgg aagccttatc 480
gctgaagcaa tggagcgcgt aggaaacgac ggcgttatca caatcgaaga gtctaaaggc 540
ttcacaactg agcttgaagt tgttgaaggt atgcaattcg accgcggata tgcgtctcct 600
tacatggtaa ctgactctga taagatggaa gcggttcttg acaatcctta catcttaatc 660
acagacaaaa aaatcacaaa cattcaagaa atccttcctg tgcttgagca ggttgttcag 720
caaggcaaac cattgcttct gatcgctgag gatgttgaag gcgaagcact tgcaacactt 780
gttgtgaaca aacttcgcgg cacattcaac gcagttgctg ttaaagctcc tggcttcggt 840
gaccgccgta aagcaatgct tgaagacatc gctgtcctta ctggcggaga agtcatcaca 900
gaagatcttg gccttgacct gaaatctact caaatcgctc aattgggacg cgcttctaaa 960
gttgtcgtta ctaaagaaaa cacaacaatc gttgaaggcg ctggcgaaac agacaaaatt 1020
tctgcccgcg tgactcaaat ccgcgctcaa gtggaagaaa caacttctga gttcgacaga 1080
gaaaaattac aagagcgtct tgcgaaactt gctggcggcg tagctgtcat caaagtcggc 1140
gctgcgactg aaactgagct gaaagagcgt aaacttcgca tcgaagacgc cttgaactca 1200
actcgcgcag ctgttgaaga aggcatcgta tccggtggtg gtacagcgct tgtaaacgta 1260
tataacaaag tcgctgcagt tgaagctgaa ggcgatgctc aaacaggtat caacatcgtg 1320
cttcgcgcgc ttgaagagcc aatccgtcaa atcgcacaca acgctggcct tgaaggatct 1380
gtcatcgttg agcgcctcaa aaacgaagaa atcggcgtag gcttcaacgc tgcaactggc 1440
gaatgggtaa acatgatcga aaaaggtatc gttgacccaa cgaaagttac acgctcagct 1500
cttcaaaacg ctgcgtctgt agctgcaatg ttcttaacta ctgaagctgt tgtcgctgac 1560
aagccagaag aaaacgctgg cggcggaatg cctgacatgg gcggcatggg cggtatgggc 1620
ggcatgatgt aa 1632
<210> 21
<211> 843
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 21
atggctacaa atcaaacgct taaaaacagc attcagaaga aacaaaacag tgccccagga 60
caacagcagg gaacaacgat gaagggccta ctttcttctc cggcagtcat gaatcgattc 120
gaagaagttc tgggaaaaag agcgtctcaa ttcacagcgt caattctgag cctgtacaac 180
agtgaaaata cgcttcaaaa ggcagaccct atgagtgtaa tttcatcggc tatggtggcg 240
gcaacgctcg atttgccagt ggataagaac ttaggttatg cctggatcgt tccgtataaa 300
ggccgtgcgc aatttcagct tggttacaaa ggatacattc agcttgcttt gcggacgggc 360
caatataaat ctatcaattg cataccggtt catgaaggag aattgcaaaa gtggaatccg 420
ttgaccgagg aaattgatat tgattttgca aagcgggaat cggagtcggt tattggttat 480
gctgcttatt tcgaactttt aaatggattc cgaaaaactg tctattggac aaaggcgcaa 540
gttgagaaac acaaaaagaa atttagtaag tcggacttcg gttggggcaa ggactgggat 600
gcgatggcac tcaaaaccgt tctaaaatcc atgctcagca agtgggggat tctctccgtt 660
gaaatgcaaa aggcagtcat tgaggataac gaggaacgcg agcgaattga cattactgac 720
gaaatgtctg agccagaaat cattgatgcc gaaccatctg aggaaaaacc aagcgcgcag 780
gatgctgatc cttttgacgg caagcctgta gacatcagcg acgatgacct cccatttgat 840
taa 843
<210> 22
<211> 825
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 22
ttgttgaagt ttaaaaacag aatagaagaa aaagaggtta agggggcaga gaaggcgagc 60
tttggcgggc ctaaccttct ccacctgaca cttcgcaagg ttacgaagct atataagtat 120
atcacagaca agaagtcttt tccaatccta gttacctcat tgtttgcatt gtttaatccc 180
aattcagttc tagctgcaga taagtatagt aattttgaag aattgaaagc aaatgagtca 240
cctttgagct ataacatttt aactaccgat gttgataggt gtgtgcttat tttggctcct 300
catgggggag gtattgaagg agggactagt gagcttgcaa gagaactaag taagtcttac 360
tctacctatc tatttgaagg tttaagaata ccaggagctt ctgagttgca tattacaagt 420
acgaattttg atgagcctaa agctttagat ttattaagta agcatgattt aacaatctca 480
attcatgggt atgcatcaag taagaaacac actttagttg gtgggacaga cagagaaaaa 540
gcagcaaaga ttacatcatt acttaccgat gcaggttttt ctgcagaatt gctgtctgaa 600
gattcccgtt tagccggcac aaatgggcag aacattgcta ataaaaatag tactggtatg 660
agcattcaac ttgaaataag cacagaacaa cggagagaaa tgttcaataa ttttacactt 720
gatggacgga atggaacgca gagtcaagtt ttttatgatt atattgctgt tctaactaaa 780
ttcattaatg aaaatgtgta ttgtatggcc ggtgtagcac catga 825
<210> 23
<211> 189
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 23
atgaaaagaa tcgaaaaccc aaaacttaat gatgtaaaaa ttttaaaaaa ggatgttagc 60
agttttgcag tcgagttaga aaaaggtgat aaagttcaaa ttatcggtat tggtgaaaga 120
ggttatgatt tgaagtatgt tgacagtgga gaagtcgtaa aagaatgtgg atgggatttg 180
tttgaataa 189
<210> 24
<211> 2802
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 24
atggcaagtg ttggagagtt aacagctaga ataaccttag gtggcatgga tgctgtagaa 60
agacagctca agaactttag ctctgctatg gacaaagctt cacaaaaagc aggtgatatg 120
ggcaggactc tcagggaagc aggtgagggc ttcaatgagt taggggaaaa cattgctcct 180
ttatcagcag gtttagtagc tattggtggg gcatctctag tagcctcaga taacatcaat 240
caggcaatgg ctaactttca aactaagtta ggcgcatcag gatctgagtt agcaaactat 300
cagcaggtac taaatgatgt ggctagcaca ggagtaggct cttttgaaga ggtctcagat 360
ggtatcataa ctgtttcaca aaacatgaaa ggcttatcta ctggggagtt aacaactctg 420
tcagaacagg caatgcagtt aggtaaggtc atgggaactg atgtagggga tgtctcaaaa 480
gtagcaggac agttaatgac tcagtttggt gtatcaggct cagaagctat ggacttgatt 540
gctaagggtt atcagaatgg tatggattat gcaggggatt atatggacac tctgaatgag 600
tactctgtct acttcaagac actaggattc agtggagagg acatgtttaa cacccttata 660
tcaggagcaa aagcaggggc tttcaactta gataaagtgg gagatgctgt taaggaattt 720
ggtatcaggt ctaaggatgg ctcagagtca actaaagagg catttaaggc gcttggatta 780
gatgctgaca aaatgactca gactttcgca aaaggtggcg aaggggctaa gaaagggtat 840
gctcaggtag ttcaagcctt atcaggtgtt aaagatcagg ctgacaggaa tgctataggg 900
gtagccttgt ttggtactca gtatgaggac atggaaaagg atgttattgc ttccacaggt 960
agcattgtag accacatggg caatgttaaa ggtgcgagtg ctgatgtagc taagaataac 1020
aagacctttg cacaggaaat gcagggagca tggaatcaga ttcagattgc cattaagcct 1080
gtaggagatg tgctgagggg agctattgta gatgtaatgc ctactatagt atctgcaatc 1140
caaagcatgt ctaatgcctt tatggggcta tcacctacaa tgcaaaaagt tgtattaggt 1200
gtaggcgctt ttgtagctat gatgcctgta atgcttgcag gtattggagg tatcttgtct 1260
gtagtgggta ctatggctac aggttgggga gcattggcaa gaggctttag cttagttgct 1320
acaggtggta caaagcttgt atctgcattc aagctcatag gcactgcctt tagagctttg 1380
tctgcaatct tcatggctaa cccattcatg ctgattgtaa caggtattgt agttgtagct 1440
gtattgatct acaagtactg ggatgaaatc tcagcttaca ctatatctgc gtggaatgct 1500
attaaggcat ggtttgctcc tttttgggag tttttgaaat cattagtaag tgcttttgtt 1560
actgccttca tgacttacat tcaggctgta gttgcctttt ggacttctgt ttggaatggc 1620
attaagactg tattcatggc aatatggtca ggactttctt cctttttttt ctcaatttgg 1680
tcaggattga cagcagtagt gtctactgta ttcaatgcta tcaaagatgt catccaaact 1740
gcatggaatg ttataaagac tgtgttcctt attgccattg ggattttagt tacactgcta 1800
gctcctttat ggaatgcctt tgctactggg tggaatgcct tagtgggaat tgtaaaggca 1860
gtaatgaata aggttaagtc atgggttaag acagcaatca atttcatagt cactgcttgg 1920
aaaaactatg taaatgctgt taaaactgtg tggaatgcaa tctatagcaa tgtcattaag 1980
cctgtcattt caaagattaa gagcattgtt accactttga ttgctaaggt taaaggggtt 2040
atgaatgctg ttaaaacagg gtttaaagtg gcttgggatg ctatctacaa tgctgtaata 2100
aaacctattc tcaattacat catcaatggc attaaaaatc ttattagagc cgcaaaatct 2160
gtaatgtcag cagtgaaatc tgccttttct acagcttgga atgctattaa gtctgtggtg 2220
acaaaggtta tctcagtaat caaaaatgta atccaaggaa ttacttctaa agtgtcctca 2280
gtgacaggga aagtaaaatc cttctttgtg aatgcattta atgctgtgaa atctaaggta 2340
tcctcagcta tctcaagtgt gaaagataag attagcagta tctggaatac agcaaagtct 2400
atagcaggaa aaatcaaggg tgcttttggt aacatcttca agagcattaa aatccctcac 2460
ttttcaatgg gtgggtggac tgttaaggac ttaccaaaac tgcctaagat gtcaattagt 2520
tggcacgcaa aagggggtat cttggacagc tctactctca ttggtgcagg tgagaaaggt 2580
gctgaggcaa ttgtacctct gtcctctcaa agaaggatga agccatttgc tcaagcagtg 2640
tctaagttta tgcctgattc tgcaaaaggt agctctaata cttccattca tgtaggacag 2700
ttggtagtaa gagaggaagc agatattcag aggattgcac aagagctgaa tagattgcaa 2760
gacaagaagg agagggctaa aggtaggctc tcctttgctt aa 2802
<210> 25
<211> 216
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 25
atgaaagact ttacaactat gggctgtcta gcaatcattt ttattggctt gcttgtagca 60
gtgggtatag gtgtcaactt tttgctgatg ccttacctac taatgattgc tctaggagct 120
tttggagtcc acttctctta cctagtatgt attgcattat ggatagtagt aacagtattg 180
ctaagaaagc tattgccaag cagaaaagct gaatag 216

Claims (17)

1.一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株或其制剂，其中所述菌株或制剂能够降解至少一种无机氮化合物并且还能够抑制至少一种病原体的生长。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌菌株或其制剂，其中所述至少一种病原体是水生动物的病原体，且优选选自哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和/或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，特别优选抑制无乳链球菌。
3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌菌株或其制剂，其中所述至少一种无机氮化合物选自氨、亚硝酸盐和硝酸盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的芽孢杆菌菌株或其制剂，其中所述芽孢杆菌菌株或其制剂选自以下组：
a)以下列编号之一保藏于DSMZ的芽孢杆菌菌株：DSM 33349、DSM 33350、DSM 33351和DSM 33352；
b)(a)中所列的芽孢杆菌菌株的突变体，其与(a)中所列的菌株具有至少95％，优选至少98％，99％或99.5％序列同一性；
c)根据(a)或(b)的菌株的制剂；
d)包含如(a)或(b)所列的菌株中所含的化合物的有效混合物或包含如(c)的制剂中所含的化合物的有效混合物的制剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的芽孢杆菌菌株或其制剂，其中所述芽孢杆菌菌株或其突变体具有与根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：16的序列具有至少99％，优选至少99.5或99.8％，特别是100％的序列同一性的16S rDNA序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的芽孢杆菌菌株，其中所述菌株的特征在于以下特征中的至少一种，优选地至少两种或三种：
a)能够厌氧生长，特别是能够在厌氧条件下降解水不溶性纤维素和蛋白质；
b)能够在高盐条件下，特别是在1重量％的NaCl存在下，更优选在1.5重量％或2重量％的NaCl存在下，特别是在2.5重量％或3重量％的NaCl存在下，生长至少一天；
c)能够在C基本培养基中萌发和/或降解无机氮化合物；
d)表现出酶活性，特别是以下酶活性中的至少一种、两种或三种：纤维素酶活性；木聚糖酶活性；蛋白酶活性；过氧化氢酶活性；超氧化物歧化酶活性；
e)能够在2mM胆汁存在下，优选在4mM胆汁存在下，和/或在0.3重量％猪胆汁存在下和/或在0.3重量％鸡胆汁存在下生长。
7.一种组合物，其含有至少两种根据权利要求1至6中任一项所述的芽孢杆菌菌株或其制剂，其中所述芽孢杆菌菌株及其制剂优选选自下组：
a)以下列编号之一保藏于DSMZ的芽孢杆菌菌株：DSM 33349、DSM 33350、DSM 33351和DSM 33352；
b)(a)中所列的芽孢杆菌菌株的突变体，其与(a)中所列的菌株具有至少95％，优选至少98％、99％或99.5％序列同一性；
c)根据(a)或(b)的菌株的制剂；
d)包含如(a)或(b)所列的菌株中所含的化合物的有效混合物或如(c)的制剂中所含的化合物的有效混合物的制剂。
8.根据权利要求1-6中任一项的芽孢杆菌菌株或制剂或根据权利要求7的组合物用于降低水系统中无机氮化合物的量的用途，其中所述无机氮化合物选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐及其组合。
9.根据权利要求1-6中任一项的芽孢杆菌菌株或制剂或根据权利要求7的组合物作为饲料或食品产品中的益生菌成分(DFM)的用途。
10.一种饲料组合物或食物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项的芽孢杆菌菌株或其制剂或根据权利要求7的组合物和至少一种另外的饲料或食品成分，所述另外的饲料或食品成分优选选自：蛋白质、碳水化合物、脂肪、其它益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节剂、代乳品、矿物质、氨基酸、球虫抑制剂、基于酸的产品、药物及其组合。
11.一种药物组合物，其含有权利要求1-6中任一项的芽孢杆菌菌株或其制剂或权利要求7的组合物和药学上可接受的载体。
12.一种降低水系统中无机氮化合物的量和/或控制水系统中无机氮化合物的量的方法，所述方法包括向所述水系统供应根据权利要求1至6中任一项的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种根据权利要求7、10或11中任一项的组合物，其中所述无机氮化合物优选选自铵、亚硝酸盐和硝酸盐，并且其中所述水系统优选为饲养水。
13.一种喂养动物，特别是水生动物，优选甲壳类动物或有鳍鱼的方法，其特征在于向所述动物施用根据权利要求1-6中任一项的芽孢杆菌菌株或其制剂和/或根据权利要求7的组合物和/或根据权利要求10的饲料组合物和/或根据权利要求11的药物组合物。
14.一种增强动物的健康和/或改善动物的总体身体状况和/或提高动物的饲料转化率和/或降低动物的死亡率和/或提高动物的存活率和/或改善动物的体重增加和/或提高动物的抗病能力和/或调节动物的免疫应答和/或在动物中建立或维持健康的肠道微生物群落和/或改善动物的肉质和/或减少病原体通过动物粪便排出的方法，其中将根据权利要求1至6中任一项的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种根据权利要求7、10或11中任一项的组合物施用于所述动物，其中所述动物优选为水生动物，特别是有鳍鱼或甲壳类动物，优选罗非鱼或虾。
15.一种控制和/或改善水或水溶液特别是饮用水、饲养水、循环用水或废水的质量的方法，所述方法包含将根据权利要求1至6中任一项的至少一种菌株和/或至少一种制剂和/或至少一种根据权利要求7、10或11中任一项的组合物应用于水或水溶液的步骤。
16.一种控制和/或避免粪肥或受污染液体的有害环境影响的方法，所述方法包含将根据权利要求1-6中任一项的至少一种菌株和/或其至少一种突变体和/或其至少一种制剂和/或至少一种根据权利要求7、10或11中任一项的组合物应用于粪肥、受污染液体、垫料、坑或粪肥池的步骤。
17.一种治疗和/或预防栽培植物的微生物病害的方法，所述方法包括将根据权利要求1至6中任一项的至少一种菌株和/或至少一种制剂应用于栽培植物的步骤。
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