CN106906169A

CN106906169A - 一种枯草芽孢杆菌hainup40及其应用

Info

Publication number: CN106906169A
Application number: CN201710297256.7A
Authority: CN
Inventors: 王世锋; 刘树彬; 周永灿; 蔡岩; 张永政; 郑玉; 王新锐; 刘海天
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2017-06-30

Abstract

本发明属于鱼类养殖技术领域，公开了一种枯草芽孢杆菌HAINUP40及其应用，在NCBI上序列号为KY244143.1。具有很强的胞外蛋白酶和胞外淀粉酶活性，且耐酸耐胆盐，对罗非鱼源致病性无乳链球菌、海豚链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、珊瑚肠弧菌、溶藻弧菌，黑海弧菌等病原菌具有明显的拮抗作用；拌饲料投喂罗非鱼，促进罗非鱼的生长，提高肠道淀粉酶和蛋白酶活性，降低饵料系数，预防罗非鱼无乳链球菌疾病；对亚硝酸盐在12h降解率达到94.12％，优于目前国内外所报道的枯草芽孢杆菌的亚硝酸盐去除率，氨氮去除率4d内可以达到57.58％，COD在72h内去除率达到72.13％。

Description

一种枯草芽孢杆菌HAINUP40及其应用

技术领域

本发明属于鱼类养殖技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌HAINUP40及其应用。

背景技术

在鱼类集约化养殖条件下，高密度饲养容易在养殖池内蓄积较高浓度的氨氮和亚硝酸盐等有害物质，导致有害菌和条件致病菌大量滋生，从而降低鱼体抗病力，极易诱发疾病。微生态调控是从生态学角度对养殖水环境进行修复的一种安全、无污染、无残留的水质调控技术，其原理主要是通过益生菌改善养殖水环境及养殖鱼类肠道中的菌群结构，降低养殖水体中有害物质的浓度或者抑制病原菌的繁生，增强鱼类免疫力和提高鱼类抵抗病原菌侵染的能力，降低疾病的发生，达到有效避免因大量使用抗生素带来的安全隐患。目前，微生态制剂已越来越广泛地应用于水产养殖环境调控和养殖物种的生长促进等方面，如芽孢杆菌在水产养殖水质调控(刘卫东等,2001；王彦波等,2003；李健等,2001)、养殖鱼类生长促进(华雪铭等,2001)、养殖虾类肠道菌群调控(Dalmin et al,2001)等方面都起到了较好的效果。无乳链球菌(Streptococus agalactiae)为革兰氏阳性菌，是唯一的B群特异性抗原链球菌(group B streptococcus，GBS)。GBS可广泛地感染宿主，是人、畜、鱼共患的条件致病菌。GBS最初被确定为牛乳腺炎病原，之后因其能感染新生儿、婴儿、妇女和老人等，并引起他们患脑膜炎、脑水肿、脓毒血症和心内膜炎等疾病而广受关注(崔静雯等，2015；PereiraU P et al，2010；Evans J J et al，2009)。19世纪80年代以来，人们陆续发现GBS还是危害严重的水生动物的病原，它可广泛感染淡、海水养殖动物，包括鲮鱼、卵形鲳鲹、虎纹蛙、红鳍东方纯、石斑鱼、美国红鱼和罗非鱼等，对水产养殖业造成严重危害(刘礼辉等，2015；周素明等，2007；黄婷等，2014)。近年来发生的感染无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)引起的罗非鱼链球菌病害已成为阻碍我国罗非鱼养殖业可持续发展的最主要因素之一(ZHANG D et al，2013)。国内外已有较多针对罗非鱼疾病防治益生菌的研究报道，但未见关于防治罗非鱼链球菌病的拮抗菌研究报道。

综上所述，现有技术存在的问题是：暂时没有报道芽孢杆菌具有较强的胞外酶活性对养殖动物促进生长的同时，又可以调控养殖水体环境，同时对某一种病原菌或者条件致病菌具有明显的拮抗作用，原因目前很多益生菌大都是植物源或者土壤中分离得来，因此只具有较强的酶活性对养殖动物有促进生长的作用，很少有效对养殖水环境进行调控，更难有对导致养殖动物疾病爆发的病原菌具有很强的拮抗作用。所以对于既可以促进养殖动物生长，对某种病原菌具有强效的、专一的拮抗作用以及对养殖水体的净化具有明显效果的益生菌目前未见报道。所以，筛选出一株具有促进养殖动物生长，增强免疫力，对某种或多种病原菌具有较强的拮抗作用，以及对养殖水环境进行有效调控的益生菌的意义重大。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌HAINUP40及其应用。

本发明是这样实现的，一种枯草芽孢杆菌HAINUP40，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HAINUP40在NCBI上序列号为KY244143.1，具有较强的蛋白酶和淀粉酶活性，对水产动物病原菌具有较强的拮抗作用，拌料投喂可促进水产动物生长，增强免疫力，且同时对养殖水环境进行有效调控。

本发明的另一目的在于提供一种所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法，所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法包括以下步骤：

步骤一，枯草芽孢杆菌HAINUP40是从海南省海口市海南大学西池塘分离得到，利用BHI固体培养基，以罗非鱼源无乳链球菌为指示菌筛选得到，抑菌圈直径达到28.4±0.2mm；

步骤二，CR反应体系(25μL)为ddH₂O 18.8μL 10×PCR buffer 2.5μL，10mmol·L^- ¹dNTP 0.5μL，引物各1μL，2.5U·μL^-1的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1μL；PCR反应条件:94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环扩增30次，72℃10min。

进一步，上游Pf:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

下游Pr:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

进一步，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，再转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，将测序结果在GenBank数据库中进行相似性比对，获得菌株分子鉴定结果，利用MEGA5软件构建进化树分析菌种同源性。

本发明的另一目的在于提供一种培养有所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的淡水培养基。

本发明的另一目的在于提供一种培养有所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的鱼类养殖池。

本发明的优点及积极效果为：具有很强的胞外淀粉酶和胞外蛋白酶，且耐酸耐胆盐，可以明显促进罗非鱼的生长以及提高肠道淀粉酶和蛋白酶，同时对罗非鱼源无乳链球菌，海豚链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、珊瑚肠弧菌、溶藻弧菌，黑海弧菌等病原菌具有明显的拮抗作用，对养殖水体的亚硝酸盐、COD具有显著的去除效果，亚硝酸盐在12h降解率达到94.12％，优于目前国内外所报道的枯草芽孢杆菌的亚硝酸盐去除率，氨氮去除率4d内可以达到57.58％，COD在72h内去除率达到72.13％。此外还可以明显抑制水中的桡足类并与藻类形成紧密的共生关系。

附图说明

图1是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌HAINUP40在NCBI上序列号为KY244143.1。

如图1所示，本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法包括以下步骤：

S101：枯草芽孢杆菌HAINUP40是从海南省海口市海南大学西池塘分离得到，利用BHI固体培养基，以罗非鱼源无乳链球菌为指示菌筛选得到，抑菌圈直径达到28.4±0.2mm；

S102：PCR反应体系(25μL)为ddH₂O 18.8μL 10×PCR buffer 2.5μL，10mmol·L^- ¹dNTP 0.5μL，引物各1μL，2.5U·μL^-1的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1μL。PCR反应条件:94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环扩增30次，72℃10min。

本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌HAINUP40是从海南省海口市海南大学西池塘分离得到，利用BHI固体培养基，以罗非鱼源无乳链球菌为指示菌筛选得到，抑菌圈直径达到28.4±0.2mm，上游Pf:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游Pr:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系(25μL)为ddH₂O 18.8μL 10×PCRbuffer 2.5μL，10mmol·L^-1dNTP 0.5μL，引物各1μL，2.5U·μL^-1的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1μL。PCR反应条件:94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环扩增30次，72℃10min。PCR产物按照DNA凝胶回收试剂盒(Takara)说明书回收和纯化，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，再转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，将测序结果在GenBank数据库中进行相似性比对，获得菌株分子鉴定结果，利用MEGA5软件构建进化树分析菌种同源性。通过分析确定HAINUP40为芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌。以腹腔注射检测对罗非鱼安全性，死亡率为0，证明HAINUP40对罗非鱼安全。同时HAINUP40在NCBI上序列号为KY244143.1。HAINUP40最适宜的生长培养基为普通淡水培养基。

下面结合检测对本发明商务应用效果作详细的描述。

本发明实施例提供的HAINUP40能够耐受低的pH，在pH2.0，3.0，4.0的人工胃液当中，4h后菌落数几乎不变。人工肠液耐受结果表明：在0.3％的胆盐环境下，当pH在6.8时HAINUP40能够存活并呈现出生长趋势；当pH在8.0时，HAINUP40虽然有少量死亡，然而在经过4h时后存活率仍能超过90％以上。HAINUP40在经过3h的室温孵育后，具有极强的自凝集作用(34.56％-56.60％)，在经过24h孵育后高达87.02％。HAINUP40在二甲苯疏水百分率为28.81％，氯仿疏水百分率为41.33％。

HAINUP40的蛋白酶水解圈直径可达到26.13±0.1mm，淀粉酶水解圈直径可以达到21.03±0.4mm。HAINUP40对大多数水产上重要的抗生素敏感包括：依诺沙星等34种检测的抗生素敏感，对多粘菌素B、利福平、卡那霉素、四环素、新生霉素等5种抗生素处于具有一定的抗性，而对氨曲南、呋喃妥因、诺氟沙星、链霉素、万古霉素等5种抗生素有抗性。证明HAINUP40对水产常用抗生素具有抗性，不易被杀死。将HAINUP40拌饲料投喂罗非鱼，在8周时间内特定生长率为2.13±0.27％，饵料系数为1.20±0.27，体重体长都显著增长。血清免疫学指标中，溶菌酶、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、总蛋白及呼吸爆发活性具有显著的增强效果，增强养殖动物非特异性免疫能力，有利于养殖动物抵抗疾病。此外肠道淀粉酶和蛋白酶活性显著增强，有利于促进养殖动物的生长。

在水质调控方面，HAINUP40在实验室条件下，在水温为26℃时，蛋白酶活力最大为409.39U/ml，淀粉酶活力最大为188.02U/ml，对COD初始值469.33mg/L的模拟养殖废水的COD去除率在7天内可以达到90.37％，对氨氮初始值26.4mg/L的模拟养殖废水的氨氮去除率在4天内可以达到57.58％。在养殖条件下，对亚硝酸盐初始值0.17mg/L的养殖废水的亚硝酸盐去除率在12h内可以达到94.12％，对COD初始值488mg/L的养殖废水的COD去除率在72h内可以达到72.13％，并且可以明显降低养殖废水的pH值，使其维持在pH＝7.5左右。

通过对HAINUP40的检测，可以确定其具有较强的胞外蛋白酶和胞外淀粉酶活性，可以明显促进养殖动物的生长，可以有效抑制无乳链球菌对罗非鱼的侵染，同时对养殖水体的COD，亚硝酸盐和氨氮含量可以起到明显的降低效果，有利于水产养殖的水质调控。为研制预防无乳链球菌疾病的微生态制剂和水质改良剂奠定基础，也为水产养殖高效微生态制剂的研制和开发提供优良的菌种资源。由于HAINUP40的降亚硝酸盐和COD效果显著，还有降氨氮效果，同时对养殖动物的生长起到促进作用并且可以使水产养殖动物有效抵抗无乳链球菌的侵染，为淡水水产养殖业提供有效的保障，避免不必要的经济损失。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌HAINUP40，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HAINUP40在NCBI上序列号为KY244143.1，具有较强的蛋白酶和淀粉酶活性，对水产动物病原菌具有较强的拮抗作用，拌料投喂可促进水产动物生长，增强免疫力，且同时对养殖水环境进行有效调控。

2.一种如权利要求1所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法包括以下步骤：

步骤二，PCR反应体系(25μL)为ddH₂O 18.8μL 10×PCR buffer 2.5μL，10mmol·L^-1dNTP 0.5μL，引物各1μL，2.5U·μL^-1的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1μL；PCR反应条件:94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环扩增30次，72℃10min。

3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法，其特征在于，上游Pf:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

下游Pr:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

4.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌HAINUP40的分离方法，其特征在于，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，再转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，将测序结果在GenBank数据库中进行相似性比对，获得菌株分子鉴定结果，利用MEGA5软件构建进化树分析菌种同源性。

5.一种培养有权利要求1所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的淡水培养基。

6.一种培养有权利要求1所述枯草芽孢杆菌HAINUP40的鱼类养殖池。