CN110029074A - 一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用，所述枯草芽孢杆菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.17305。该菌株具有较强的抗逆性，可以耐受模拟鱼虾胃酸、胆盐环境；具有显著的益生性，可有效抑制水产病原菌河流弧菌、哈维氏弧菌、杀鱼爱德华菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌的生长繁殖，降低鱼虾养殖的疾病风险；其胞外水解能力可以帮助鱼虾对饲料的消化和吸收，促进鱼虾生长。该菌用于鱼虾养殖能够减少抗生素的使用，保护水资源环境，保证水产品的安全质量。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体地，涉及一种枯草芽孢杆菌及其在鱼虾养殖疾病防治中的应用。

背景技术

环境污染、抗生素过度使用，严重影响到水质，人们对生活的过高追求，海鲜已经是餐桌必备品。水产品养殖规模急剧扩大，疾病频发发生，抗生素加大量使用，难以保证餐桌上的水产品药物含量是否安全，水产养殖行业急需抗生素的替代品，能够抑制疾病的发生，净化水质。

由于芽孢杆菌能够将营养细胞转化为具有良好抗逆性的芽孢体，使其对高温、酸碱等不良环境抵抗力增强，这种耐受性增加了它作为益生菌的潜力。枯草芽孢杆菌既具有芽孢杆菌的特点，还能够产酶抑菌，所产生的酶类可以降解饲料中的脂肪、粗纤维、蛋白以及淀粉类物质。枯草芽孢杆菌抑菌的特性主要靠细菌素，细菌素是由基因编码的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点，使其作为鱼虾饲料的绿色添加剂在水产品养殖中备受关注。因此开发具有良好稳定性、能够产酶抑菌的微生物产品具有重大意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌能够产生脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶以及纤维素酶，并能够抑制鱼虾常见的病原菌，是一种产酶抑菌且具有良好益生作用的微生物；目的二在于提供上述枯草芽孢杆菌在鱼虾养殖疾病防治中的应用，利用所述枯草芽孢杆菌解决鱼虾养殖过程中疾病频发、抗生素过量使用的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17305，保藏日期为2019年03月05日。

本发明还请求保护所得的枯草芽孢杆菌在鱼虾养殖疾病防治中的应用。进一步地，所述应用是指所述枯草芽孢杆菌能抑制鱼虾养殖中的病原菌。更近一步地，所述病原菌包括但不限于副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、杀鱼爱德华氏菌、河流弧菌和哈维氏弧菌。

有益效果：

(1)本发明所述枯草芽孢杆菌具有良好的益生性，能显著抑制河流弧菌、哈维氏弧菌、杀鱼爱德华菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖，减少疾病的发生、抗生素的使用，生产出安全健康的水产品。此外，能够产生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶，应用于鱼虾的养殖中，降解饲料中的淀粉、脂肪、蛋白以及纤维素。

（2）本发明所述枯草芽孢杆菌具有良好的黏附性，为更好地发挥益生特性提供基础；具有较强的耐受性，能够耐受模拟鱼虾胃酸及模拟胆盐环境，在pH 5时存活率为90.7±2.1％。由此可见枯草芽孢杆菌能够很好适应鱼虾肠胃环境。在胆盐浓度为0.03％时存活率为100%，在胆盐最高浓度为0.9％时存活率仍有46％以上，因此枯草芽孢杆菌能够在鱼虾胃肠道内极速繁殖，产生益生性。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌S0562系统发育树；

图2是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌以河流弧菌作为指示菌的抑菌结果图；

图3是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌以溶藻弧菌作为指示菌的抑菌结果图；

图4是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌以副溶血弧菌作为指示菌的抑菌结果图；

图5是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌以哈维氏弧菌作为指示菌的抑菌效果图；

图6是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌以嗜水气单胞菌作为指示菌的抑菌效果图；

图7是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌以杀鱼爱德华菌作为指示菌的抑菌效果图；

图8是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌淀粉水解能力结果图；

图9是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌蛋白酶水解能力结果图；

图10是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌脂肪酶水解能力结果图；

图11是本发明实施例提供枯草芽孢杆菌纤维素降解能力结果图；

图12是枯草芽孢杆菌生长曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1枯草芽孢杆菌的分离和鉴定

1、芽孢杆菌的分离纯化：在无菌条件下采集鱼塘土壤30份，分别称取1g样品添加到9mL无菌生理盐水中，充分震荡混匀，于80℃水浴锅中水浴10min除去非芽孢细菌体，按照2％的接种量接种于改良LB培养基中，37℃培养12h后于改良碳酸钙鉴定平板上进行稀释涂布；挑选有溶钙圈且生长良好的单菌落，用接种环转接于营养琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，置于4℃冰箱保存备用。

2、菌落形态的观察：将步骤1保存的斜面菌种，经2-3次活化，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的产芽孢杆菌作为备用。

3、对经步骤二活化的菌株进行生理生化鉴定，结果如表1所示。

表1：生理生化鉴定结果表

注：表1中：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。

4、将纯化得到的菌株（实验室编号S0562），刮取单菌落菌体，进行液体培养基中培养，37℃，恒温，摇床设置为230r/min，培养12h。再接种于15ml液体培养基中，每两个小时测其OD₆₀₀吸光值，每组测三个，求其平均值绘制生长曲线。如图12所示，菌株在2h以后进入指数期，6h以后进入稳定期，一直到24h保持良好的稳定性。

5、分离纯化出单菌落平板交由上海生物工程有限公司测序。测序结果提交到ncbi数据库进行比对，结果显示，菌株与Bacillus subtilis IAM12118的全部基因序列相似性为99%。采用MEGA 5.0软件构建出菌株S0562的系统发育树，如图1所示，从进化距离分析发现菌株S0562与Bacillus subtilis KCTC13429标准模式菌株接近。通过菌株的形态特征、生理生化特征、16SrDNA（碱基序列如SEQ ID NO：01）特征，确定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

6、菌株保藏：将上述经分离、纯化、筛选得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2019年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.17305，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。

实施例2 枯草芽孢杆菌S0562在模拟鱼虾肠胃环境的耐受试验

1、模拟鱼虾胃酸的耐受试验：将枯草芽孢杆菌CGMCC接种于LB培养基中37℃培养12h，菌液待用。将菌液等量加入到pH为1，2，3，4，5，6的15mL无菌PBS缓冲液中作为试验组；将菌体加入到pH 7.0的15mL 无菌PBS缓冲液中作为对照组。上述处理样品于37℃静置培养2h，平板计数。存活率为实验组与对照组活菌数之比乘以100%。结果表明pH 5时存活率为90.7±2.1％。鱼虾肠胃环境为弱碱性，由此可见枯草芽孢杆菌S0562能够很好适应鱼虾肠胃环境。

2、模拟胆盐的耐受实验：将枯草芽孢杆菌S0562接种于LB培养基中37℃培养12h，菌液5000rpm离心10min收集菌体。将菌体等量加入到10mL胆盐浓度为0.03％、0.1％、0.3％、0.5％、0.7％及0.9%（w/v）的无菌PBS缓冲液（pH 7.0）中作为试验组；将菌体加入到无胆盐的15mL无菌PBS缓冲液（pH 7.0）中作为对照组。上述处理样品于37℃静置培养2h，平板计数。存活率为实验组与对照组活菌数之比乘以100%。结果表明在胆盐浓度为0.03％时存活率为100%，在胆盐浓度为0.9％时存活率达到46％以上，因此枯草芽孢杆菌S0562具有良好的耐胆盐能力。

实施例3 枯草芽孢杆菌S0562抑菌能力验证

抑菌试验采用牛津杯法，具体操作：①将已灭菌的未凝固的LB固体培养基倒在培养皿内，每皿30mL，待其凝固。②用移液枪吸取200µL由指示菌(河流弧菌、哈维氏弧菌、杀鱼爱德华菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)制备的最佳指示浓度的菌液，用无菌涂布棒涂布均匀。③在无菌条件下，将已灭菌的牛津杯(牛津杯的尺寸：内径6mm、外径8mm、高10mm)垂直放在LB固体培养基的表面。④在牛津杯中加入200μL待测样品(枯草芽孢杆菌S0562发酵上清液)，于37℃培养12h。对应的拟菌效果分别如图2-7所示。每个试验三个重复，测量抑菌圈直径，取平均值。结果见表2.

表2：枯草芽孢杆菌S0562对鱼虾常见病原菌的抑菌效果

实施例4 枯草芽孢杆菌S0562的胞外水解酶能力试验验证

水解酶能力试验验证是采用点种和牛津杯法。将筛选的芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，37℃恒温条件震荡培养12h，用点种针将菌种点种在加入可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、大豆油选择性平板上；蛋白酶平板培养基中加入脱脂奶粉，用牛津杯打孔，吸取150µl菌液于牛津杯孔中。37℃恒温培养12h，取出平板。纤维素平板和蛋白酶平板均能观察到明显的透明圈，分别如图11和图9所示，证明枯草芽孢杆菌S0562能够产生胞外纤维素酶和蛋白酶；在淀粉酶平板上滴加卢氏碘液（5mmol/L I₂、5mmol/L KI），晃动平板，使碘液均匀铺平在平板中，片刻之后，菌落周围呈现出透明圈，如图8所示，说明菌株周围的淀粉已经被菌株水解；在脂肪酶选择性平板中加入了中性红，脂肪酶平板中菌落周围呈现红色斑状圆圈，如图10所示，证明该菌株能够产生脂肪酶降解培养基中的脂肪。

实施例5枯草芽孢杆菌对药物的敏感性试验

为避免菌株过量富集，破坏优质水资源，对枯草芽孢杆菌S0562进行药物敏感的试验。

药敏试验选用了十种水产养殖业常用的抗生素。采用牛津杯法，进行敏感性验证。将筛选的芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，37℃恒温条件震荡培养12h，吸取200µl菌液在固体平板上涂布，放置灭菌过的牛津杯，在牛津杯中加入水产常用药物每种药物做三个平行。正放入37℃恒温箱中过夜培养以后，取出观察牛津杯周围的透明圈，枯草芽孢杆菌S0562对抗生素的敏感性取决于透明圈直径，如下表3（注：抗生素浓度根据NCCLS所公布的标准进行稀释，部分药物NCCLS没有公布标准）。

表3：枯草芽孢杆菌S0562对水产常用抗生素的敏感程度试验结果。

实施例6 枯草芽孢杆菌S0562在鱼肠道内的黏附率

黏附性在益生菌的益生特性中处于至关重要的地位。当益生菌进入肠道后定植在肠道中，通过竞争营养和生物夺氧而抑制致病菌的生存，并与肠道粘膜细胞构成生物屏障，改善肠道微生态环境，抵御外来微生物的入侵。

选取新鲜活鱼解剖，取其肠，挤出肠内容物，PBS冲洗两到三次，剪开鱼肠，用载玻片刮取肠道粘液。用PBS缓缓冲洗三次。调整枯草芽孢杆菌S0562的菌液浓度为10⁸CFU/mL，吸取200µl菌悬液与肠黏液暴露在平板中，2h后再次用PBS缓缓冲洗三次，收集肠黏液进行平板涂布，放置37℃恒温培养箱过夜培养，平板计数，做三个平行。结果显示，枯草芽孢杆菌S0562对肠粘液的黏附能力达42.05±3.13％，良好的黏附性保证其发挥更好的益生作用。

上述实施例中，若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

所述用于菌株培养的培养基组成成分：氯化钠10g/L，工业蛋白胨10g/L，工业酵母粉5g/L；]摇瓶发酵条件：接种量2%，初始pH 7.0-7.8，转速230rpm，培养温度37℃，培养时间12h。

本发明提供了一种能够抑制水产病原菌并有显著胞外水解酶能力的枯草芽孢杆菌，该菌不仅能够抑制鱼虾常见的病原菌，减少鱼虾疾病，降低抗生素等药物的使用，保护水资源；还能够产生脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶及淀粉酶，有助于鱼虾的消化和吸收，促进鱼虾生长。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.17305，保藏日期为2019年03月05日。

2.如权利要求1所得的枯草芽孢杆菌在鱼虾养殖疾病防治中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌能抑制鱼虾养殖中的病原菌。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述病原菌包括但不限于副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、杀鱼爱德华氏菌、河流弧菌和哈维氏弧菌。