CN117487719A - 一种从对虾肠道中分离的具有抗弧菌活性的芽孢杆菌 - Google Patents
一种从对虾肠道中分离的具有抗弧菌活性的芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种从对虾肠道中分离的具有抗弧菌活性的芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCC NO：M20232060。本发明筛选的枯草芽孢杆菌HKYP.m‑1株能够满足益生菌株的安全性要求，可以分泌活性较高的胞外蛋白酶，对病原菌哈维氏弧菌具有抑制效果，在对虾养殖过程中可以有效抑制潜在病原菌的爆发，从而降低病害造成的损失。体外代谢结果表明HKYP.m‑1株对对虾肠道菌群的生态代谢具有促进效果，作为益生菌制剂使用可以通过调控肠道微生态达到病害防控的目的。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖益生菌筛选技术领域，具体涉及一种从对虾肠道中分离的具有抗弧菌活性的芽孢杆菌。
背景技术
近年来，随着对虾养殖业的迅速发展，高密度、集约化的养殖模式以及投入品的泛滥增加了水体生态环境负担，不科学的饲养方式不仅会导致养殖环境恶化、苗种质量不断退化、养殖产量急剧下降，而且造成机体对环境的抗逆性、机体抗病力下降，由细菌、病毒以及毒素引起的病害频繁爆发。
使用抗生素能够有效地控制疾病的发生和蔓延，但是它干扰养殖环境中和水产动物肠道中有益微生物菌群的正常生长和繁殖，导致水产动物对病原微生物的易感性，更严重的是病原菌的耐药性增强。另外，抗生素的使用还会导致其在水生动物体内的残留、富集，最终将危害人类的健康，因此使得水产品质量降低，成为了水产品销售量和出口贸易量的限制因素。目前许多国家已经明令禁止或限制抗生素的使用。在这种情况下，寻求抗生素的替代品已经刻不容缓。随着微生物学和微生态学的深入研究，利用益生菌来调节动物体内的微生态平衡，恢复机体正常生理功能、防治病害、增进健康，正逐渐成为世界范围内的热潮，由于益生菌制品无毒，没有残留，也不会产生抗药性，所以用益生菌替代抗生素有着广泛的应用前景。
益生菌作为新一代的抗生素替代品，将成为饲料产业的重要突破口。随着研究者的青睐和养殖者的认可，益生菌的应用日渐增多且深入。益生菌作用机理主要包括自身发酵代谢后富含蛋白质、维生素等营养物质；其在增殖的过程中分泌的酶类可促进宿主对营养物质的消化吸收；生长过程中通过竞争空间和营养物质而抑制致病菌的生长；自身的结构成分如肽聚糖等能刺激宿主免疫系统，进而提高动物机体免疫力等。目前国内外有很多关于益生菌应用在水产养殖中的报道，但多数为外源菌株，水产动物自身来源的菌株较少。而动物内源菌可以更好地适应肠道内环境，来增强机体免疫功能。发明内容
本发明的目的是提供一种从对虾肠道中分离的具有抗弧菌活性的芽孢杆菌，该芽孢杆菌具有抑制弧菌的功效，并能有效的促进对虾的生长，从而实现健康高效的养殖。
本发明所提供的芽孢杆菌，为枯草芽孢杆菌HKYP.m-1(Bacillus subtilisHKYP.m-1)，于2023年10月27日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232060。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌HKYP.m-1在制备用于抑制弧菌的制品中的应用；
所述的弧菌，作为实施例的具体记载，为哈维氏弧菌或副溶血弧菌。
本发明还提供所述的枯草芽孢杆菌HKYP.m-1株的另一个用途，是在制备胞外蛋白酶中的应用。
本发明所筛选的枯草芽孢杆菌HKYP.m-1株还可用于调节对虾肠道菌群的生态代谢。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌HKYP.m-1株还可以做为饲料添加剂来使用，来制备对虾养殖用的饲料。
本发明筛选的枯草芽孢杆菌HKYP.m-1株能够满足益生菌株的安全性要求，可以分泌活性较高的胞外蛋白酶，对病原菌哈维氏弧菌具有抑制效果，在对虾养殖过程中可以有效抑制潜在病原菌的爆发，从而降低病害造成的损失。体外代谢结果表明HKYP.m-1株对对虾肠道菌群的生态代谢具有促进效果，作为益生菌制剂使用可以通过调控肠道微生态达到病害防控的目的。
附图说明
图1：菌株HKYP.m-1的16S rDNA序列的系统发育树图，其中比例尺为0.05，表示遗传距离；
图2：菌株HKYP.m-1在鉴定板上的代谢指纹图谱，其中图a为菌株P.m-1的鉴定表型图；图b为Gen III鉴定板鉴定项目，图a中A-C行的结果反映细菌对碳源的利用程度，D—H行的结果反映细菌对碳源的同化程度。
图3：菌株HKYP.m-1在TSB培养基中的生长曲线图；
图4：蛋白质浓度标准曲线图，
图5：PCA分析解脱图，其中Ck:对照组，HKYP.m-1：益生菌组，In:肠道混合菌组，IPm：益生菌HKYP.m-1+肠道菌组；PC1表示第一主成分，PC2表示第二主成分分析，百分比表示主成分对样品差异的贡献值。图中每一个点表示每一个样品，同一样品的平行样品使用同一颜色表示。
图6：OPLS-DA结果图，其中Ck:对照组，HKYP.m-1：益生菌组，In:肠道混合菌组，IPm：益生菌HKYP.m-1+肠道菌组，横坐标可看出组间的差距，纵坐标表示组内差距，百分比表示成分对数据集的解释度。
图7：不同组间火山图，其中火山图中的每一个点表示一种代谢物，其中绿色的点代表下调差异代谢物，红色的点代表上调差异代谢物，灰色代表检测到但差异不显著的代谢物；横坐标表示某代谢物在两组样品中相对含量差异倍数的对数值(log2FC)，横坐标绝对值越大，说明该物质在两组样品间的相对含量差异越大。VIP+FC双重筛选条件下：纵坐标表示VIP值，纵坐标值越大，表明差异越显著，筛选得到的差异表达代谢物越可靠。VIP+FC+p-value/FDR三重筛选条件下：纵坐标表示差异显著性水平(-log10P-Value或-log10FDR)，圆点的大小代表VIP值。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：筛选对虾肠道的优势菌
基于对虾肠道菌的生理生化特性,为防控对虾急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/细菌性肠炎病提供生防菌,分离纯化健康对虾肠道中的优势菌株；以致病性哈维氏弧菌为指示菌,用牛津杯法从纯化菌株中筛选拮抗菌；并通过生理生化特征、Biolog系统及16S rDNA技术综合方法对菌株进行鉴定。
无菌条件下取成虾的全肠于离心管中，在冰浴条件下研磨匀浆。使用1％PBS溶液对研磨液进行10倍梯度稀释，取各浓度梯度菌液(包括原液)各100μL涂布于2216E固体培养基上，每个梯度3个平行，28℃恒温培养箱中倒置培养24-48h。挑取形态和颜色不相同的单菌落进行多次划线纯化，确定为纯培养物后进行保种。采用牛津杯法对肠道优势菌进行筛选，以哈维氏弧菌为指示菌，吸取0.1mL哈维氏弧菌(108cfu/mL)于2216E培养基上,涂布均匀,然后将牛津杯置于培养基中央,轻压使其不易移动,杯中分别加入0.2mL优势菌悬液(108cfu/mL)，培养箱中28℃下培养48h,进行抑菌圈直径的测定,游标卡尺测量3次取平均值。
以哈维氏弧菌为病原指示菌，从对虾肠道分离纯化的优势菌中筛选拮抗菌，其中优势菌HKYP.m-1的抑菌效果表现为“+++”，对哈维氏弧菌具有明显的抑制作用。
以副溶血弧菌为病原指示菌，从对虾肠道分离纯化的优势菌中筛选拮抗菌，其中HKYP.m-1的抑菌效果表现为“+++”。
其中拮抗标准如下：抑菌圈直径>20mm，对于弧菌的抑制效果为极敏感“+++”；15<抑菌圈直径<20mm，抑菌效果为高敏“++”；10<抑菌圈直径<15mm，抑菌效果为中敏“+”；抑菌圈直径<10mm，则抑菌效果为低敏或无效“-”。
最终确定所筛选的HKYP.m-1为目的菌株，并进行进一步的研究。
生理生化实验结果显示菌株P.m-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(表1)。经过16S rDNA技术检测，P.m-1与枯草芽孢杆菌同源性最高，相似度高达100.00％。系统发育树(图1)同样表明P.m-1与枯草芽孢杆菌具有最近的亲缘关系。Biolog系统自动读取GenⅢ鉴定板，给出4个匹配度最高的细菌种类，鉴定参数为以下含义：可能性(PROB)表示可靠性，相似性(SIM)和位距(DIST)表征准确性和精确度。Biolog系统鉴定结果显示，P.m-1为枯草芽孢杆菌的鉴定概率为95.3％(表2)。通过以上三种实验方法，最终确定P.m-1为枯草芽孢杆菌，其16S rDNA的具体序列如下：
TTTTGGGGGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTG
GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTAC
TAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGG
ATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGG
TCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCT
TAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCA
ACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGT
CCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAA
ACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTA
CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTA
GCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCT
CCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCA
TTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGAC
CCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCC
CAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTG
GCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAAC
AGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATT
GCGGAAGATTCCCTACTGCTGC(SEQ ID NO:1)。
表1：P.m-1的生化鉴定结果
表2：P.m-1的Biolog鉴定结果表
将筛选的菌株命名为枯草芽孢杆菌HKYP.m-1(Bacillus subtilis HKYP.m-1)，于2023年10月27日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232060。
实施例2：枯草芽孢杆菌HKYP.m-1的理化性质检测
1、HKYP.m-1的Biolog代谢特征分析
Biolog细菌全自动鉴定系统的GenⅢ微孔板中含有不同的底物，培养过程中发生氧化还原反应和同化反应，比对GenⅢ微孔板底物及鉴定特征项目，可以得到细菌代谢特征的指纹图谱。结果表明P.m-1代谢底物共有18种，主要包括糊精、D-麦芽糖等；同化底物种类主要包括D-山梨醇、D-甘露醇等。此外Biolog结果还提示P.m-1氨基酸代谢能力(图2)。
2、生长趋势
在96孔板中每孔加入200μL种子液(过夜培养菌液)，以空白TSB培养基为对照，每次加样设置六个复孔。打开酶标仪系统，放置96孔板，选中扫描区域，设置温度30℃，测定波长600nm的吸光度(OD值)。每隔2h读取菌体OD600，过夜培养结束实验。计算每个时间点的OD600平均值，绘制菌株的生长曲线，得出其基本生长特性。
从图3中可看出，菌株HKYP.m-1在4-10h是生长对数期，10h生长达到最旺盛期，后续生长平稳。在对数生长末期的菌体密度可达1.14×109cfu/mL，这说明HKYP.m-1具有强劲的生命力，满足作为益生菌的生长需求。
3、药敏试验结果
如表3所示，根据NCCLS最新判断标准(26种抗生素)，P.m-1对青霉素、羧苄西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、呋喃唑酮具有耐药性(R)，对氨苄西林、头孢他啶、四环素、克林霉素中度敏感(I)，对其他抗生素均表现为敏感(S)。
表3：P.m-1的药敏试验结果表
4、产酶能力评价
将过夜培养种子液离心10min(6 000r/min)，分离上清液即为粗酶液。采用Folin-酚法测定菌株P.m-1的胞外蛋白酶活性。1mL上清液在pH7.8温度28℃条件下1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个酶活力单位(U)。
测定P.m-1发酵上清液的蛋白酶活性，测得发酵上清液的OD值为0.14，根据标准曲线(图4)并结合稀释倍数计算得到枯草芽孢杆菌P.m-1的胞外蛋白酶活性可达259U。由此筛选的枯草芽孢杆菌P.m-1具有较强蛋白消化能力，可作为对虾生长的益生菌来使用，提到其饲料的代谢效率。
实施例3：HKYP.m-1菌株对虾肠道菌群的代谢影响
1、实验方法：色谱与质谱联用实现了从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程。数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Ultra PerformanceLiquid Chromatography，UPLC)(ExionLC AD，https://sciex.com.cn/)和四级杆飞行时间质谱(Quadrupole-Time of Flight)(TripleTOF 6600,AB SCIEX)。
2、样品采集：
实验对虾(初始体长3-4cm)健康养殖1月后进行样品采集，用75％酒精将对虾表皮进行消毒，用无菌解剖剪剪开，取出肠道；然后，先用75％酒精消毒肠道组织表面，再用无菌PBS缓冲液冲洗3次，无菌棉球擦拭干燥后将肠道内容物置于无菌Eppendorf管中，-80℃冰箱保存备用。
3、实验菌株的扩大培养及发酵上清液的预处理:
取无菌培养瓶，配制LB肉汤，300ml/瓶，高压湿热灭菌，按照2％接种量接种过夜活化培养的HKYP.m-1枯草芽孢杆菌菌液(Pm)、对虾肠道混合菌菌液(In)和枯草芽孢杆菌HKYP.m-1+肠道菌的混合液(IPm)；33℃，120r/min摇床培养，同时配制300ml的LB肉汤不接种菌液，其它处理相同，作为空白对照(ck)。通过代谢比较，发现HKYP.m-1菌株有益的差异代谢物以及对肠道菌群代谢的促进作用，为后期进一步对差异代谢物进行定性定量研究和开展益生菌制剂安全性风险评估奠定基础。
取24h培养物30ml于50ml离心管中，4℃条件下12000rpm离心10min，取上清，空白组采用相同处理方法，然后置于-80℃冰箱冷冻后使用真空冷冻干燥机冻干样品，保存于-20℃，待测。
4、数据结果
1)主成分分析
从图5中发现，组间主成分差异明显，组内第一主成分、第二主成分差异小。
OPLS-DA正交偏最小乘法判别分析，图6中可见，与PCA相比，PLS-DA呈现了更大化的组间差异。
2)差异代谢物分析
筛选标准如下：
2.1、选取fold change≥2和fold change≤0.5的代谢物。代谢物在对照组和实验组中差异为2倍以上或0.5以下，则认为差异显著。
2.2、若样品分组存在生物学重复，在上述的基础上，选取VIP≥1的代谢物。VIP值表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，一般认为VIP≥1的代谢物则为差异显著。
综合表4和表5所示，结果表明益生菌HKYP.m-1优化了对虾肠道菌的差异代谢物，通过Pm_vs_In组中上调和下调的前10个代谢物统计发现，L-天冬氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸、N-乙酰基光氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸明显上调，对肠道微生态平衡及菌群代谢起到促进作用。
表4：差异代谢物数目统计表
注：Pm为益生菌HKYP.m-1组，CK为对照组，In为肠道菌组，IPm为益生菌HKYP.m-1+肠道菌组
表5：上调和下调前10个代谢物的统计表
3)差异代谢物火山图
火山图(Volcano Plot)主要用于展示代谢物在两个(组)样品中的相对含量差异以及在统计学上差异的显著性。对每一个比较组中的代谢物及差异代谢物具体信息如图7所示。结果表明，益生菌菌株HKYP.m-1对肠道菌群代谢调控起到了明显的作用。
综上，本发明筛选的枯草芽孢杆菌HKYP.m-1具有高度药敏性和强劲生命力，满足作为益生菌株的安全性要求；可以分泌活性较高的胞外蛋白酶，有助于HKYP.m-1益生作用的发挥；对对虾病原菌哈维氏弧菌的抑制效果说明，在对虾养殖过程中HKYP.m-1可以有效抑制潜在病原菌的爆发，从而降低病害造成的损失；体外代谢分析说明HKYP.m-1对对虾肠道菌群的生态代谢具有促进效果，作为益生菌制剂使用可以通过调控肠道微生态达到病害防控的目的。
Claims (7)
1.一种芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M20232060。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌在制备用于抑制弧菌的制品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的弧菌为哈维氏弧菌或副溶血弧菌。
4.权利要求1所述的芽孢杆菌在制备胞外蛋白酶中的应用。
5.权利要求1所述芽孢杆菌在制备用于调节对虾肠道菌群的制品中的应用。
6.权利要求1所述的芽孢杆菌作为饲料添加剂的应用。
7.一种对虾饲料，其特征在于，所述的饲料中添加有权利要求1所述的芽孢杆菌。
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