CN112094763A - 一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于微生物育种技术领域，提供了一株酿酒酵母，所述酿酒酵母为酿酒酵母PLBS012(Saccharomyces cerevisiae PLBS012)，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16952；本发明还提供了一株酿酒酵母在育肥猪饲料中的应用。借此，本发明的酿酒酵母PLBS012具有良好的耐受性，能够提高育肥猪对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高育肥猪的生产性能，有助于增加育肥猪养殖的经济效益。

Description

一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用。
背景技术
中国生猪存栏量常年居世界首位，同时猪肉消费量占全球的50％以上。自20世纪中叶发现抗生素在动物生产中具有促进动物生长以来，抗生素已经广泛应用到动物生产中，始终受到养殖业的欢迎。但在动物生产中长期使用抗生素会导致肉、蛋、奶等制品存在抗生素残留问题，这类制品被人类饮食后会严重危害到人类的健康，另外，长时间在动物生产中使用抗生素会促使致病菌产生耐药性，而致病菌的耐药性同时也会威胁人类公共卫生安全。研究发现，微生态制剂可作为潜在的抗生素替代物用于促进动物生长，微生态制剂能够调整或维持肠道内微生态平衡，增强免疫功能，促进营养物质的消化吸收，从而达到抗病促生长的应用效果。
目前研究表明，酿酒酵母培养物富含多肽、葡萄糖、维生素、核苷酸、醇类脂类等增味物质，可提高动物采食量和生产性能；酿酒酵母培养物还富含有机酸、氨基酸等可调节动物肠道微生物区系的功能分子，可通过降低肠道pH，抑制有害菌的生长，促进乳酸菌、纤维分解菌(酪酸杆菌、瘤胃球菌)等有益菌种增殖，达到改善胃肠道内环境和促进饲料营养成分的消化和吸收的效果。
酵母培养物作为微生态制剂在养猪生产中广泛应用，但是，目前养猪生产中使用的酵母培养物主要是传统酵母培养物(发酵底物为能量饲料或白酒发酵副产物酒糟)，缺乏专门针对养猪产业特点优化的酵母培养物。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用，酿酒酵母PLBS012具有良好的耐受性，能够提高育肥猪对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高育肥猪的生产性能，有助于增加育肥猪养殖的经济效益。
为了实现上述目的，本发明提供一株酿酒酵母，所述酿酒酵母为酿酒酵母PLBS012(Saccharomyces cerevisiae PLBS012)，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16952。
根据本发明的酿酒酵母，所述酿酒酵母取自葡萄汁酿造红酒的过程。
根据本发明的酿酒酵母，所述酿酒酵母的乙醇最大抑制浓度为8％vol。
根据本发明的酿酒酵母，所述酿酒酵母的最大抑制温度为41℃。
根据本发明的酿酒酵母，所述酿酒酵母在育肥猪的基础日粮中的添加量为2～8％。
根据本发明的酿酒酵母，本发明还提供一种筛选所述酿酒酵母的方法，包括以下步骤：
步骤一 制备稀释液
将葡萄汁在25～30℃发酵2～4天后稀释，得到稀释液；
步骤二 分离酵母菌菌株
将所述稀释液涂布于孟加拉红培养基中，在25～30℃培养2～4天后，选取具有典型酵母菌落特征的单菌落，分离纯化得到分离的酵母菌菌株；
步骤三 初筛
依次取步骤二得到的多株酵母菌菌株，稀释后接种于TTC法的下层培养基平板上，待菌落长至1～2mm，将上层培养基覆在下层培养基上；继续培养2～4h后取出，根据菌落呈色情况，挑选红色菌株分别转接至试管斜面上；
步骤四 复筛
将步骤三挑选的红色菌株接入YPD液体培养基，活化培养后接入装有已灭菌葡萄汁的锥形瓶中；
将所述锥形瓶放入恒温培养箱中发酵培养，采用蒸馏法测量各锥形瓶中葡萄汁的酒精含量。
根据本发明的筛选所述酿酒酵母的方法，所述步骤二中，所述典型酵母菌落特征的单菌落的分离纯化次数为2～3次。
根据本发明的筛选所述酿酒酵母的方法，所述步骤三中，依次取步骤二得到的多株酵母菌菌株后，稀释的浓度梯度为10-5。
根据本发明的酿酒酵母，所述酿酒酵母在育肥猪饲料中的应用。
本发明的目的在于提供一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用，酿酒酵母PLBS012的发酵性能较好，具有良好的耐受乙醇能力、耐酸能力和耐温度能力，在育肥猪日粮中添加适宜水平的酿酒酵母PLBS012，能够改善育肥猪肠道菌群的结构，促进育肥猪机体脂质代谢，提高育肥猪对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高育肥猪的生产性能，有助于增加育肥猪养殖的经济效益。
附图说明
图1是本发明酿酒酵母PLBS012的菌落形态图；
图2是本发明酿酒酵母PLBS012的生长曲线图；
图3是本发明酿酒酵母PLBS012的发酵液在波长600nm条件下的吸光度值；
图4是本发明酿酒酵母PLBS012的耐受乙醇能力曲线图；
图5是本发明酿酒酵母PLBS012的耐酸能力曲线图；
图6是本发明酿酒酵母PLBS012的耐温度能力曲线图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一株酿酒酵母，拉丁文学名：Cerevisiae；该酿酒酵母为酿酒酵母PLBS012(Saccharomyces cerevisiae PLBS012)，已于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.16952。
本发明的酿酒酵母取自葡萄汁酿造红酒的过程，本发明提供了酿酒酵母PLBS012的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一制备稀释液
将葡萄汁在25～30℃发酵2～4天后，取发酵液用无菌水进行稀释，得到稀释液。
步骤二分离菌株
将稀释液涂布于孟加拉红培养基中，在25～30℃培养2～4天后，随机选取具有典型酵母菌落特征的单菌落，分离纯化2～3次，得到分离的酵母菌菌株。
步骤三初筛
依次取上述得到的多株酵母菌菌株，用平板稀释法稀释到浓度梯度为10-5，接种于TTC法的下层培养基平板上，于25～35℃下培养45～60h，待菌落长至1～2mm，将一定量上层培养基覆在下层培养基上。于25～35℃无光条件下培养2～4h后，取出，立即观察呈色状况，根据菌落呈色情况挑选红色菌株分别转接至试管斜面上。
TTC是(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)一种显色剂，它能对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母的酶活力的大小，即酵母发酵产酒精能力的高低。在一定的培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂，TTC会显示不同的颜色，产酒精能力强的酵母会显现深红色，次之显粉红色，微红色的或不显色的为野生酵母。
步骤四复筛
将初筛得到的红色菌株接入YPD液体培养基，25～35℃活化培养20～30h，然后接入装有已灭菌葡萄汁的锥形瓶中，称量各锥形瓶的总质量并记录；
将锥形瓶放入25～35℃恒温培养箱中发酵培养5～9d，采用蒸馏法测量各锥形瓶中葡萄汁的酒精含量。
通过上述方法筛选出酵母菌菌株后，对菌株进行初步鉴定，本发明提供了酵母菌菌株的鉴定方法：
首先，根据《酵母菌分类学研究》第四版中的酵母菌鉴定标准方法，利用光学显微镜和体视镜进行观察，观察细胞的大小及形态、菌落质地、菌落颜色、菌落表面特征、菌落边缘和生殖特征等，进行形态学鉴定。
酿酒酵母PLBS012菌落形态为：表面光滑、湿润、粘稠，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落为乳白色。(参见图1)
其次，对酵母菌菌株进行分子生物学鉴定，提取酵母菌菌株的基因组DNA，根据真菌26S rDNA D1/D2区序列保守性设计通用引物：前引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，后引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，进行PCR扩增，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。5’端和3’端为基因的两端，DNA模板打开后，引物与模板结合，由5’端向3’端复制。
为了验证本发明的酿酒酵母PLBS012的菌株性质，本发明进行了菌株性质试验，包括菌株的生长曲线、发酵性能和耐受性能试验。
菌株的生长曲线
将菌株接种到灭菌的YPD液体培养基中，25～35℃恒温摇床培养，观察72h菌株的生产情况，前期间隔2h取样，后期间隔4、6h和12h取样，用可见分光光度计在560nm波长处测其吸光度，重复5次，绘制出菌株生长曲线的变化趋势(参见图2)。
由生长曲线可知，菌株在培养2～24h之间，菌量以指数级增加，24h后菌量达到稳定状态，并在较长时间(72h)内酵母菌生长较平稳。
菌株的发酵性能
将活化至对数期的菌株，按5％的接种量和100mL/250mL的装液量，接种到底物质量浓度为75～85g/L的发酵培养基中，培养72h，每隔12h取样一次，测定发酵液在波长600nm条件下的吸光度值(参见图3)。
由吸光度值曲线可知，OD600nm值在前24h内迅速增加至1.4，而后增长缓慢。OD600nm值的总体变化情况是，随发酵时间的延长不断增加，在24h时达到最大并保持大致稳定，说明酿酒酵母PLBS012的发酵性能较好。
酵母是家畜饲料中常用的发酵菌株，但是酵母菌耐受性往往成为限制其对饲料发酵效果的重要因素，因此，本发明对酿酒酵母PLBS012的耐受性进行试验，主要包括耐受乙醇能力、耐酸能力和耐温度能力。
耐受乙醇能力的测定
制备YEPD液体培养基，灭菌后加入不同含量的无水乙醇(v/v)，含量分别为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％。接种酿酒酵母PLBS012菌株于不同乙醇浓度的YEPD培养基中，培养72h后用血球计数板计数测定酵母菌落数。根据其酵母菌落数测定其乙醇的耐受性(参见图4)。
由耐受乙醇能力曲线可知，随着乙醇含量的增加，酵母活菌数量减少。酿酒酵母PLBS012菌株的乙醇最大抑制浓度为8％vol，当乙醇浓度大于8％vol时，酵母活菌数为0。
乙醇作为厌氧发酵的终产物对酵母是毒素和酶的抑制剂，高浓度底物相应地也会使酵母生成较高浓度的酒精，达到一定浓度时，它能够抑制酵母的生长、降低细胞存活率，影响细胞的活力。
耐酸能力的测定
将酿酒酵母PLBS012菌株接入至初始pH值不同(pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的液体培养基中，培养20～30h，利用分光光度计在660nm下测定菌液OD值(参见图5)。
由耐酸能力曲线可知，在pH值2～7范围内，随着pH值的升高，酵母菌株的生长状况越好，说明酿酒酵母PLBS012菌株的耐酸性能较好。
耐温度能力的测定
制备YEPD液体培养基，设置培养箱的温度梯度为28℃、30℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃，液体培养基灭菌后接种酿酒酵母PLBS012菌株，培养计算活菌数(参见图6)。
由耐温度能力曲线图可知，随着温度的升高，酵母数量逐渐减少。酿酒酵母PLBS012菌株的最大抑制值为41℃，说明酿酒酵母PLBS012菌株的耐温度性能很好。
为了验证本发明的酿酒酵母PLBS012在育肥猪饲料中的应用价值，本发明还提供一株酿酒酵母在育肥猪饲料中的应用方法。
一、试验动物及饲养管理
选择体重相近、身体健康的24头三元杂交(杜×长×大)育肥猪随机分为4组(对照组和三个试验组)。每天饲喂2次(早上8:00点，下午14:00点)，猪自由采食和饮水，每天记录采食量，试验初、末称取体重，常规免疫，保证通风良好，温度适宜。每天清理料槽，除粪便，定期消毒。
二、饲料配方
在育肥猪的基础日粮中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，添加量为2～8％。
三、测定指标
试验结束前3天，每天上午和下午从每组中收集200g左右未被饲料污染的新鲜粪样，置于-20℃冰箱冷冻保存，用于测定分析饲料和粪样中粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙以及总磷。
试验结束后每组选取一头接近平均体重的杜长大育肥猪进行屠宰，采集新鲜粪便置于灭菌的冻存管中，液氮速冻，80℃保存。提取DNA后对26SrDNA D1/D2区进行PCR扩增，经检测合格后构建文库，使用Illumina Miseq PE300进行微生物测序。肠道微生物测序委托深圳华大基因科技服务有限公司完成。
为了进一步验证本发明的酿酒酵母PLBS012在育肥猪饲料中的应用价值，本发明以上述应用方法饲养育肥猪，设置如下若干实施例，并对各实施例中育肥猪的相关指标进行测定。各实施例中育肥猪的饲养管理方法相同，仅改变实施例中酿酒酵母PLBS012的添加量，因此，各实施例中相同的内容不再列出。(各实施例中育肥猪的相关指标结果见表一、表二、表三)
对比例
在育肥猪的常规饲料中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，添加量为0。
养殖完成后，测得育肥猪的平均日增重为0.8kg、平均日采食量为2.68kg、料重比为3.35；测得育肥猪的粪样中粗蛋白质为81.39％、粗脂肪为82.38％、粗纤维为72.04％、粗灰分为40.63％、钙为63.07％、总磷为54.69％；测得育肥猪的肠道微生物中，拟杆菌门的丰富度为45.62、厚壁菌门的丰富度为42.18、螺旋体门的丰富度为5.03、变形菌门的丰富度为2.63、软壁菌门的丰富度为0.68。
实施例1
在育肥猪的常规饲料中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，添加量为2％。
养殖完成后，测得育肥猪的平均日增重为0.91kg、平均日采食量为2.63kg、料重比为2.89；测得育肥猪的粪样中粗蛋白质为82.53％、粗脂肪为81.99％、粗纤维为81.46％、粗灰分为41.23％、钙为63.41％、总磷为56.17％；测得育肥猪的肠道微生物中，拟杆菌门的丰富度为42.13、厚壁菌门的丰富度为44.99、螺旋体门的丰富度为5.54、变形菌门的丰富度为1.23、软壁菌门的丰富度为1.83。
实施例2
在育肥猪的常规饲料中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，添加量为5％。
养殖完成后，测得育肥猪的平均日增重为1.05kg、平均日采食量为2.75kg、料重比为2.62；测得育肥猪的粪样中粗蛋白质为82.06％、粗脂肪为81.71％、粗纤维为81.49％、粗灰分为42.80％、钙为64.08％、总磷为55.80％；测得育肥猪的肠道微生物中，拟杆菌门的丰富度为42.06、厚壁菌门的丰富度为45.71、螺旋体门的丰富度为5.61、变形菌门的丰富度为1.80、软壁菌门的丰富度为1.90。
实施例3
在育肥猪的常规饲料中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，添加量为8％。
养殖完成后，测得育肥猪的平均日增重为1.00kg、平均日采食量为2.69kg、料重比为2.69；测得育肥猪的粪样中粗蛋白质为81.84％、粗脂肪为82.00％、粗纤维为80.56％、粗灰分为41.52％、钙为63.22％、总磷为55.72％；测得育肥猪的肠道微生物中，拟杆菌门的丰富度为43.67、厚壁菌门的丰富度为43.62、螺旋体门的丰富度为5.46、变形菌门的丰富度为2.11、软壁菌门的丰富度为1.67。
由上述实施例可以看出，在育肥猪的基础日粮中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，能够提高育肥猪的平均日增重和平均日采食量，降低育肥猪的料重比，说明酿酒酵母PLBS012能够促进育肥猪对饲料的利用率。
在育肥猪的基础日粮中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，能够降低育肥猪粪便中粗蛋白和粗脂肪含量，也能够降低粪便中钙和总磷的含量，说明酿酒酵母PLBS012能够提高育肥猪对于饲料的消化率，充分利用饲料中的营养物质。
在育肥猪的基础日粮中添加本发明的酿酒酵母PLBS012，能够使育肥猪粪便中的拟杆菌门丰富度下降，厚壁菌门丰富上升，螺旋体门和软壁菌门的丰富上升。厚壁菌门能够促进育肥猪的脂肪代谢，促进肌内脂肪沉积；螺旋体门和软壁菌门能够影响育肥猪肠激素分泌，增加小肠对营养物质的吸收，有助于体重增加。因此，酿酒酵母PLBS012能够提高育肥猪体内微生物的丰富度，提高育肥猪对饲料的消化和利用，提高育肥猪的生产性能。
表一 育肥猪的生长性能
Figure BDA0002662350650000101
表二 育肥猪的饲料消化率％
Figure BDA0002662350650000102
表三 育肥猪肠道微生物的相对丰富度
Figure BDA0002662350650000103
综上所述，本发明提供的酿酒酵母PLBS012，发酵性能较好，具有良好的耐受乙醇能力、耐酸能力和耐温度能力，在育肥猪日粮中添加适宜水平的酿酒酵母PLBS012，能够改善育肥猪肠道菌群的结构，促进育肥猪机体脂质代谢，提高育肥猪对饲料的利用率和对营养物质的吸收率，提高育肥猪的生产性能，有助于增加育肥猪养殖的经济效益。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110>青岛普罗百世生物科技有限公司
<120>一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用
<130>WF
<160>2
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
cagagtttgatcctggct 18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
aggaggtgatccagccgca 19
序列表
<110> 青岛普罗百世生物科技有限公司
<120> 一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用
<130> WF
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
cagagtttga tcctggct 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
aggaggtgat ccagccgca 19

Claims (9)

1.一株酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母PLBS012(Saccharomycescerevisiae PLBS012)，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16952。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母取自葡萄汁酿造红酒的过程。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母的乙醇最大抑制浓度为8％vol。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母的最大抑制温度为41℃。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母在育肥猪的基础日粮中的添加量为2～8％。
6.一种筛选权利要求1所述的酿酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一制备稀释液
将葡萄汁在25～30℃发酵2～4天后稀释，得到稀释液；
步骤二分离酵母菌菌株
将所述稀释液涂布于孟加拉红培养基中，在25～30℃培养2～4天后，选取具有典型酵母菌落特征的单菌落，分离纯化得到分离的酵母菌菌株；
步骤三初筛
依次取步骤二得到的多株酵母菌菌株，稀释后接种于TTC法的下层培养基平板上，待菌落长至1～2mm，将上层培养基覆在下层培养基上；继续培养2～4h后取出，根据菌落呈色情况，挑选红色菌株分别转接至试管斜面上；
步骤四复筛
将步骤三挑选的红色菌株接入YPD液体培养基，活化培养后接入装有已灭菌葡萄汁的锥形瓶中；
将所述锥形瓶放入恒温培养箱中发酵培养，采用蒸馏法测量各锥形瓶中葡萄汁的酒精含量。
7.根据权利要求6所述的筛选所述酿酒酵母的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述典型酵母菌落特征的单菌落的分离纯化次数为2～3次。
8.根据权利要求6所述的筛选所述酿酒酵母的方法，其特征在于，所述步骤三中，依次取步骤二得到的多株酵母菌菌株后，稀释的浓度梯度为10-5。
9.一种根据权利要求1所述的酿酒酵母在育肥猪饲料中的应用。
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