CN114231464A - 凝结芽孢杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，具体涉及一株分离自咖啡发酵物的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY4及其用途。本发明公开了一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY‑4，其保藏编号为CGMCC NO.19413。本发明还同时公开了上述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY‑4的用途：促进鱼类生长发育、用于水质改良。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株分离自咖啡发酵物的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY4及其用途。
背景技术
益生菌一般是指通过定殖在宿主体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。目前针对水产的水产用益生菌在养殖业领域同样具有极高的应用价值，能广泛应用于功能性动物保健品的开发。水产用益生菌可作为微生物发酵饲料，既无药残、无污染，又可改善水产动物的健康状况，净化水质，改善养殖环境，最终可使养殖动物生长发育更快更好，抗病能力更强。目前，虽然对于益生菌促进鱼类生长发育方面有较多的研究，然而目前可利用的益生菌菌种资源依旧很少，研究开发新型益生菌具有重要意义。
乳酸菌是一类能发酵产生大量乳酸的细菌统称，是重要的功能性菌群，在鱼类养殖中的研究较多，且具有良好效果。但目前的乳酸菌在水体中的竞争优势较弱。
Bacillus coagulans目前已知的用途是预防胃肠道疾病，治疗腹泻，也经常应用于养殖中猪、蛋禽提高生长性能与肠道健康等领域，但在水产中的应用相对较少。目前使用于水产中的菌多为枯草等不产酸类的芽孢杆菌或普通乳酸菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4，其保藏编号为CGMCC NO.19413。
本发明还同时提供了上述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4的用途：制备促进鱼类(幼鱼)生长发育的益生菌体。
作为上述用途的改进：促进鱼类(幼鱼)体重增重、体长增长。
本发明还同时提供了上述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4的另一种用途：用于水质改良。
作为上述用途的改进：降低水环境中镉对斑马鱼产生的毒性，从而降低斑马鱼的死亡率。
本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4是从发酵咖啡中分离的具有耐高温特性的益生菌，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏信息如下：
菌株XY-4，保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.19413，保藏时间2020年01月19日。
该菌株的菌落特征如下：为杆菌，产芽孢，革兰氏阳性，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、粗糙，边缘完整，呈白色，不透明。
菌株鉴定：分离纯化的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4，根据16S rDNA测序鉴定方法初步鉴定该菌株为凝结芽孢杆菌。之后根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列等试验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，鉴定结果为：Bacillus coagulans。其微生物学特性如表1所示。
表1、凝结芽孢杆菌XY-4的生理生化特性
注：+阳性反应；-阴性反应.
本申请还提供了凝结芽孢杆菌XY-4活性益生菌体的制备方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以植物性食品源发酵物——咖啡中分离的菌为目标菌群，根据安全性及耐热性效果筛选出具有潜在益生功能的Bacillus coagulans XY-4，并通过动物实验验证了其具有促进鱼类生长发育的功能，可作为绿色生物资源促进幼鱼的体长和体重增长。本发明为益生菌在水产上的应用症提供了新的菌株以及技术基础，应用前景广阔。
本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4，可兼具芽孢杆菌与乳酸菌的优势，不仅具有较高的抗逆性(耐高温利于工业化发酵)，还可发酵产生包括乳酸在内的有机酸，促进机体的消化吸收。这使得本发明的菌株具有极高的生产应用价值。
综上所述，本发明经筛选获得了一株用于提高鱼类生长发育的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4，其制备的活性菌体具有显著提高鱼类体长体重增长，尤其是体重增重的作用。
该菌发酵的酸性物质或促进鱼类进食，对其肠道功能也具有积极作用。由于国内大部分水产养殖都是露天场地，环境极为简易，因此该菌的耐高温特性，使其在炎热的夏季也具有良好的保藏和普通工人即可进行二次发酵的优势，酸性高温环境亦不容易造成杂菌的污染。
本发明的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4还具有水质改良作用，具有对水环境中镉对斑马鱼毒性的消减作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为不同浓度的活性菌体对斑马鱼幼鱼长时间体长增长影响结果；
图2为不同浓度的活性菌体对斑马鱼幼鱼长时间体重增重影响结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
MRS液体培养基：每升水中加入：蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏8g；葡萄糖20g；磷酸氢二钾(3水)2g；乙酸钠(3水)5.0g；硫酸镁(7水)0.2g；硫酸锰(1水)0.04g；吐温80 1.0ml；柠檬酸氢铵2g；pH6.2-6.6；
MRS琼脂培养基在MRS液体培养基的基础上添加15g/L的琼脂糖。
培养基于115℃中灭菌25min，琼脂培养基倒板处理，液体培养基冷却至室温后使用。
MRS-CaCO3琼脂培养基即MRS琼脂培养基中添加了1％(1g/100mL)的CaCO3，作为分离培养基。
实施例1、益生菌株的分离与筛选
将5g咖啡粉置于200ml水中，80℃加热10min，过滤得到咖啡渣。
将上述5g咖啡粉对应所得的咖啡渣，加入50毫升纯净水，于50℃发酵24小时，取上层清液。
用带有灭菌吸头的移液器吸取5ml上层清液至10ml灭菌一次性移液管中封盖。在超净台中稀释至合适的浓度(将5ml上层清液利用纯净水稀释成50ml)，用200μl移液枪吸取100μl的稀释液至MRS-CaCO3琼脂培养皿中，于50℃下培养24-48h。待菌落形成后，用接种环挑取菌落，接种于MRS液体培养基中，50℃下培养24h。待菌株生长良好后，再次划线接种于MRS琼脂培养基中，同样置于50℃条件下，培养24h-48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，进一步纯化培养，并采用冷藏、-80℃冷藏保存。
将从咖啡中分离的乳酸菌菌株，分别进行体内和体外的安全性测试。体外安全性测试为溶血性测试(参照常规的临床微生物学及检验测试法)，将纯化的各乳酸菌株划线接种于含5％羊鲜血的LB(蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)平板上，在50℃下培养12-24h。排除掉不是γ溶血性的菌株，选取溶血性安全的乳酸菌菌株。体内安全性测试为鱼类急性毒理实验(参照国标GBT 27861-2011鱼类急性毒性试验)，将成年斑马鱼放置于终浓度为1×106cfu/mL的菌液中，测试96h后鱼的存活情况，选取没有明显毒性作用的菌株。
对测试为体内体外安全的菌株，经耐热性实验，对菌株的耐热情况进行筛选。分别在30、35、40、35、50、55、60℃这7种不同温度下培养24小时，通过平板涂布法(参考常规的平板涂布法)检测菌种耐热前后后的活菌浓度，得出存活率(存活率＝耐热后活菌浓度/耐热前活菌浓度)，从而对菌株的耐热情况进行筛选。评价后获得一株最适宜于高温发酵，具有较高耐热温度的，适宜商业化发酵的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4。
综上，从咖啡样品中分离鉴定得到约40株乳酸菌种，经过安全性评价以及耐高温工业化筛选，得到了一株适合与高温发酵的乳酸菌，即凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XY-4。
实施例2、益生菌株的鉴定
分离纯化的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4，根据16S rDNA测序鉴定方法初步鉴定该菌株为凝结芽孢杆菌。之后根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等试验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，鉴定结果为：Bacilluscoagulans凝结芽孢杆菌。其微生物学特性如上表1所示。
本发明菌株的保藏信息如下：
菌株XY-4，保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.19413，保藏时间2020年01月19日。
实施例3、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4有效菌体的制备：
将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4从-80℃中取出，于MRS琼脂培养基中50℃条件下放置18h活化一代，并挑取一接种环的单菌落于5ml的MRS液体培养基中50℃静置培养18h再次活化，取第二次活化的液态培养物以2％(体积％)的添加量加入最终液态培养基(即，新的MRS液体培养基)中，继续50℃静置培养18h。将最终培养物置于灭菌离心管中离心(12000RPM的转速下离心1分钟)。弃去上清液，用养鱼水洗涤2次后，得到纯净菌体，纯净菌体需重溶于养鱼水中并稀释至最适浓度后使用。
养鱼水是满足国家斑马鱼资源中心(CZRC)推荐条件的水。
实验例4、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4菌体施用浓度、次数及其提高斑马鱼幼鱼的体长、体重作用
将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4纯净菌体重溶于养鱼水，制成终浓度为102～105CFU/ml的XY-4菌为含益生菌养鱼水，将4日龄(4dpf)的斑马鱼幼鱼饲养在上述含有不同浓度的XY-4菌的养鱼水中，培养至21日龄(21dpf)，除首次添加菌液外，不再添加益生菌液。幼鱼的饲养参考国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center)推荐流程饲养。分别于首日(4dpf)，一周后(10dpf)，以及17天后(21dpf)检测幼鱼的体长变化，同时检测幼鱼(21dpf)的体重变化。
如图1结果显示对于4日龄的小鱼，104cfu/ml的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XY-4菌液是促进幼鱼体长的最适浓度。在小鱼年幼时期添加一次凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4即可在长达17日的时间内都起到促进小鱼体长生长的效果，在一周内组间差异最为明显。4日龄小鱼的体长为3.83±0.08mm，在一周内养殖于104cfu/ml凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4菌液的小鱼体长增长至5.62±0.08mm，增长了46.7％。相较于不加菌的对照组4.81±0.11mm只增长了25.6％而言，加菌组额外增长了21.1％的体长。而根据放大效应，17日后养殖于104cfu/ml凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XY-4菌液的效果则相较于不加菌对照而言，则可额外增长17％。
如图2结果显示对于4日龄的小鱼，104cfu/ml终浓度的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XY-4菌体是促进幼鱼体重的最适浓度。在小鱼年幼时期添加一次凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4即可在长达17日的时间内都起到促进小鱼体重增重的效果。4日龄小鱼在17日内施加104cfu/ml凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4菌体的小鱼体重可至4.33±0.33mg。相较于不加菌的对照组2.17±0.38mg而言，加菌组额外增重了99.5％的体长。
实施例5：凝结芽孢杆菌在鲥鱼幼鱼养殖的应用
一、
1养殖条件：工厂化养殖(参照常规的美国鲥鱼规模化养殖技术)；
2养殖品种：美洲鲥鱼；
3养殖处理：共设4个处理，每个处理300尾鲥鱼(鲥鱼幼鱼苗)；
4菌剂处理：(1)直接水面泼洒(2)拌饲料(3)直接水面泼洒+拌饲料(4)对照；
将实施例3所得的纯净菌体制备成菌体溶液，浓度为108cfu/mL；
直接水面泼洒处理组的用量是：每次为200mL/90㎡，每天1次；
拌饲料处理组的用量是：每次为200mL/90㎡，每天1次；
直接水面泼洒+拌饲料处理组：直接水面泼洒的用量是：每次为200mL/90㎡，每天1次，拌饲料的用量是：每次为200mL/90㎡，每天1次；
二、试验数据统计如下：
鲥鱼幼鱼苗的初始体重约为16.08g，经过30天的养殖后，所得结果如下：
表2
| 对照组 | 水面泼 | 拌饲料 | 水面泼+拌饲料 | |
| 体重(克) | 20.28 | 21.78 | 24.05 | 24.93 |
| 饲料系数 | 1.79 | 1.68 | 1.52 | 1.49 |
结果表明：直接水面泼洒或拌饲料均能促进鲥鱼的生长，其中以水面泼+拌饲料的联合处理效果最好。直接水面泼洒或拌饲料均能促进鲥鱼饲料系数，其中以水面泼+拌饲料的联合处理效果最好，即可节约饲料成本。使用有机益生菌菌剂还能显著降低病死率，改善水质。
实施例6、凝结芽孢杆菌对水环境中镉对斑马鱼毒性的消减作用；
控制水体中XY-4菌的终浓度为104CFU/ml作为实验组，且，设立相应的空白组。加入硫酸镉至浓度为50PPM，24～48小时后，测定斑马鱼(21dpf)的死亡率。结果如下表3：
表3
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4，其特征在于:保藏编号为CGMCCNO.19413。
2.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4的用途，其特征在于：制备促进鱼类生长发育的益生菌体。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：促进鱼类体重增重、体长增长。
4.根据权利要求2或3所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XY-4的用途，其特征在于：用于水质改良。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：降低水环境中镉对斑马鱼产生的毒性，从而降低斑马鱼的死亡率。
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