CN108660100B - 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108660100B
CN108660100B CN201810756323.1A CN201810756323A CN108660100B CN 108660100 B CN108660100 B CN 108660100B CN 201810756323 A CN201810756323 A CN 201810756323A CN 108660100 B CN108660100 B CN 108660100B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
broiler
microbial inoculum
culture
treating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810756323.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108660100A (zh
Inventor
杨波
杨建�
郭春雨
刘川浩
赵阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinfusai Beijing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jinfusai Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinfusai Beijing Biotechnology Co ltd filed Critical Jinfusai Beijing Biotechnology Co ltd
Priority to CN201810756323.1A priority Critical patent/CN108660100B/zh
Publication of CN108660100A publication Critical patent/CN108660100A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108660100B publication Critical patent/CN108660100B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用，其中，所述枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.15940；保藏日期为：2018年6月12日；分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；所述枯草芽孢杆菌具有更强的抗致病菌的功能。本发明还公开了所述枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症菌剂中的应用，食用治疗肉鸡吐水症菌剂的肉鸡能够很好的缓解和预防肉鸡吐水症。本发明还公开了所述枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻菌剂中的应用，食用治疗肉鸡腹泻菌剂的肉鸡能够很好的缓解和预防肉鸡腹泻。本发明还公开了一种肉鸡饲料，其可加速肉鸡增重，并在一定程度上降低料肉比，节约生产成本。

Description

枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用。
背景技术
养殖业是关系国计民生的重要农业支柱性产业，然而各种传染病已经成为现代养殖业的巨大危害，而抗生素使养殖场能够限制动物的饲养空间和活动的同时，保持动物处于最佳健康状态，导致现代养殖体系逐渐陷入了依赖和滥用抗生素的困境，畜牧业一度消耗了全球一半的抗生素用量。
其中，养肉鸡业是畜牧养殖业中的一个重要板块，为人民提供了大量的蛋类和肉类。在肉鸡和蛋肉鸡养殖中，消化系统疾病是造成存活率降低和死亡率增加的重要原因，典型的疾病包括肉鸡的腹泻和吐水症等。肉鸡的吐水现象是常见多发并且危害较大的，在病理学上，吐水肉鸡的消化系统一般都发生了较严重的炎症，肌胃角质层往往有不同程度的溃烂或裂纹，嗉囔积存大量水样液体变得涨大，肠道及附近的免疫系统淋巴结通常表现出不同程度的肿大，并有时伴有出血现象。导致肉鸡吐水现象的原因包括饲料霉变等导致的霉菌毒素和呕吐毒素超标、霉菌的感染和细菌病毒的感染等，吐水导致肉鸡的免疫系统处于亚健康状态，对其它致病菌和病毒的抵抗力下降，从而导致肉鸡新城疫等传染病的抵抗力也较低。肉鸡群中一旦出现病肉鸡，往往会大面积传染并迅速传播，危害极大。现有的防治肉鸡吐水的方法非常有限，而且采用抗生素和抗病毒药物预防和治疗肉鸡吐水效果也不理想。
为了抗病和增加饲料转化率，肉鸡和蛋肉鸡养殖过程中也存在大量滥用抗生素的问题，其结果是各种耐受抗生素的超级细菌泛滥，肉蛋中抗生素大量残留，对人类健康构成了巨大危害。面对养殖业传染病高发的问题，如何减少抗生素的使用而又要确保肉鸡只的健康，已经成为热点和难点问题。
近年来，枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌等芽孢杆菌在动物保健和肠道菌群维持等方面的作用日益受到重视，而且实践中发现有些芽孢杆菌具有天然的抗致病菌作用，然而天然芽孢杆菌的抗致病菌功能非常有限，所以提供一种应用于肉鸡消化系统疾病的芽孢杆菌是很有必要的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌，具有更强的抗致病菌功能。
本发明还有一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用，通过将GF107枯草芽孢杆菌应用于制备治疗肉鸡吐水症的菌剂中，食用该菌剂的肉鸡能够很好的缓解和预防肉鸡吐水症。
本发明还有一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用，通过将GF107枯草芽孢杆菌应用于制备治疗肉鸡腹泻的菌剂中，食用该菌剂的肉鸡能够很好的缓解和预防肉鸡腹泻的症状。
本发明还有一个目的是提供一种肉鸡饲料，肉鸡通过食用添加了GF107枯草芽孢杆菌的肉鸡饲料，可加速肉鸡增重，并在一定程度上降低料肉比，节约生产成本。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号为：CGMCC NO.15940；保藏日期为：2018年6月12日；分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
一种如上述所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用。
优选的是，将所述的枯草芽孢杆菌经接种入液体发酵培养基中扩大培养后，自所述液体发酵培养基中收集所述的枯草芽孢杆菌的菌体以制备菌剂，其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的每日摄入量为2×107-2×108个。
优选的是，所述液体发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖或蔗糖1-30g/L、氮源1-40g/L、酵母提取物5-30g/L、胰蛋白胨5-50g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、硫酸镁0-0.5g/L、硫酸亚铁0-0.5g/L、氯化钠0-10g/L以及氯化铵0-5g/L。
优选的是，所述液体发酵培养基的PH值调为5-8；所述枯草芽孢杆菌接种入所述发酵培养基中的接种量为1-20％，扩大培养的发酵温度为20-38℃，扩大培养的发酵周期为24-60h。
一种如上述所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用。
优选的是，将所述的枯草芽孢杆菌经接种入液体发酵培养基中扩大培养后，自所述液体发酵培养基中收集所述的枯草芽孢杆菌的菌体以制备菌剂，其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的每日摄入量为2×107-2×108个。
优选的是，所述液体发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖或蔗糖1-30g/L、氮源1-40g/L、酵母提取物5-30g/L、胰蛋白胨5-50g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、硫酸镁0-0.5g/L、硫酸亚铁0-0.5g/L、氯化钠0-10g/L以及氯化铵0-5g/L。
优选的是，所述液体发酵培养基的PH值调为5-8；所述枯草芽孢杆菌接种入所述发酵培养基中的接种量为1-20％，扩大培养的发酵温度为20-38℃，扩大培养的发酵周期为24-60小时。
一种肉鸡饲料，1000Kg所述肉鸡饲料中添加200-300g所述的枯草芽孢杆菌。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明所述GF107枯草芽孢杆菌具有更强的抗致病菌的能力；通过将GF107枯草芽孢杆菌应用于制备治疗肉鸡吐水症的菌剂中，食用该菌剂的肉鸡能够很好的缓解和预防肉鸡吐水症；通过将GF107枯草芽孢杆菌应用于制备治疗肉鸡腹泻的菌剂中，食用该菌剂的肉鸡能够很好的缓解和预防肉鸡腹泻的症状；使养殖中肉鸡的存活率提高到了99.6％。
在同等时间内，饲喂量相同的情况下，应用本发明提供的鸡饲料饲喂肉鸡相对于应用未添加GF107枯草芽孢杆菌的普通饲料饲喂肉鸡，每只每只肉鸡平均体重增加了7.5％，料肉比下降了8.2％，加速了肉鸡增重，并在一定程度上降低料肉比，节约生产成本。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1本发明所述GF107枯草芽孢杆菌的大肠杆菌抑菌圈实验；
图2为本发明添加了所述GF107枯草芽孢杆菌的肉鸡和对照组肉鸡养殖各项指标的比较。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.15940；保藏日期为：2018年6月12日；分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的菌落特征：在固体培养基上，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GF107菌落呈现淡黄色，菌苔较薄，表面粗糙，边缘略微呈锯齿状，菌落大小不一
在上述方案中，首先从长江边土壤中分离出一微生物菌株，长江边的上的土壤因其质地肥沃，微生物种类和数量较多，利于得到想要的微生物菌株；再经Biolog菌种鉴定系统的分析，即可确定一株枯草芽孢杆菌。
菌株的具体分离过程为：从江苏某地的长江边的土壤中进行了取样，并进行了芽孢杆菌的分离。首先称取土壤1-10g倒入灭菌锥形瓶，加入50-200ml的灭菌双蒸水，用70％酒精棉擦拭过的玻璃棒搅匀后，在涡旋混匀仪上振荡1-10分钟，使土壤中的微生物充分释放到溶液中。由于芽孢杆菌可以产生抗逆性强的芽孢，能够耐受高温，因此采用高温处理的方法，杀死其它不耐热的土壤微生物，从而有选择性地筛选芽孢杆菌。将锥形瓶放入75-95℃水浴锅中煮12-20min，这个过程会杀死绝大多数不耐高温的微生物。结束后将锥形瓶放在室温自然冷却。然后用灭菌双蒸水进行1x102、1x104和1x106的梯度稀释，分别取200-300ul稀释液，涂布到LB平板或其他适合芽孢杆菌生长的平板上，28-37℃培养24-48小时，对长出的菌落进行分析。
其次，株枯草芽孢杆菌的抗致病菌功能非常有限，因此需要采取诱发突变等方法进行变异增强，采用紫外线UV物理诱变的方法对菌株进行诱变，从而改变其性状，以提高菌株的抗致病菌的功能；具体诱变过程如下：
(1)将在LB平皿培养24-48小时的枯草芽孢杆菌用1-20ml左右的灭菌PBS磷酸盐缓冲液、灭菌去离子水或其它对菌体无害的无菌溶液将菌落洗下，用无菌移液器转移到一个灭菌50ml离心管中，在涡旋混匀器上混匀10-50秒。
(2)将菌悬液在1500-6000rpm离心3-10分钟以沉淀细胞，小心吸掉上清液。
(3)用灭菌PBS缓冲溶液或其它菌体无害的无菌溶液或灭菌水将菌体沉淀小心重悬洗涤，1500-6000rpm离心3-10分钟以沉淀细胞，并重复此洗涤离心步骤1-2次。
(4)再次用灭菌PBS重悬菌体，进行合适倍数的稀释后，用可见光分光光度计检测600nm的光吸收数值。吸光度和菌体数量的对应关系是：当OD600＝1时，每毫升的菌数约为8x108个。
(5)根据测定的菌体浓度，用菌PBS磷酸盐缓冲液、灭菌去离子水或其它对菌体无害的无菌溶液将枯草芽孢杆菌稀释到约1x108/毫升。
(6)将菌液在5-30W的紫外灯下，0.1-0.5米的距离照射0.5-3分钟，立即将照射过的菌液置于暗处以防止DNA光修复。
(7)用菌PBS磷酸盐缓冲液、灭菌去离子水或其它对菌体无害的无菌溶液将UV辐照过的菌液稀释1x102-1x107倍，并将不同稀释度的菌液涂LB平板，在黑暗处37℃培养24-50小时后，将生长的单菌落分别挑出。
最后，通过采用经典的抑菌圈法(即利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价)对诱变后的菌株进行抑菌检测，成功筛选到具有抑制致病菌功能的新鲜枯草芽孢杆菌，并将其命名为GF107枯草芽孢杆菌。采用经典的抑菌圈法对诱变后的菌株进行抑菌检测具体方法为：
(1)将枯草芽孢杆菌实验菌和对照菌接种到5mLLB液体培养基中，37℃，200r/min培养36h-48h。
(2)将从病肉鸡的肉鸡粪中分离的E.coli大肠杆菌在LB固体培养基上接种划线，37℃培养过夜。
(3)用接种针挑取E.coli大肠杆菌的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12-24h。
(4)将培养好的E.coli大肠杆菌的原液用无菌水稀释10倍，在560nm处用分光光度计测菌浓度。
(5)根据测得的浓度，将原液稀释相应的倍数，吸取100-250μL涂布在LB平板上。
(6)将市售枯草芽孢杆菌对照、金福赛一代草芽孢杆菌对照、枯草芽孢杆菌GF101的发酵液12000r/min离心1min，取上清吸入一次性注射器中用已灭菌的针头滤器(0.45μm)过滤除菌，并配置卡那霉素(1000μg/mL)(正对照)溶液，并过滤灭菌。
(7)在涂布了E.coli致病菌的LB固体培养基上均匀放置四个牛津杯，并做好标记，然后将市售枯草芽孢杆菌对照、金福赛一代草芽孢杆菌对照、GF107枯草芽孢杆菌的发酵液加满牛津杯，剩余一个牛津杯中加入20μL卡那霉素(正对照)。
(8)将完成的平皿放入30-37℃恒温培养箱培养12-36小时，观察抑菌圈的大小。
结果如图1所示，经过试验检测，第107号菌对大肠杆菌有明显的抑制效果最强，其产生的抑菌圈大小与正对照卡那霉素差不多，直径约2.1cm左右(1、市售普通枯草杆菌益生菌，2、金福赛第一代的枯草杆菌，3、抗生素对照(卡那霉素)4、金福赛第二代抑菌型枯草益生菌GF107。)，将其选为做饲养添加实验的益生菌。
一种如上述所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用。
一个优选方案中，将所述的枯草芽孢杆菌经接种入液体发酵培养基中扩大培养后，自所述液体发酵培养基中收集所述的枯草芽孢杆菌的菌体以制备菌剂，其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的每日摄入量为2×107-2×108个。
一个优选方案中，所述液体发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖或蔗糖1-30g/L、氮源1-40g/L、酵母提取物5-30g/L、胰蛋白胨5-50g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、硫酸镁0-0.5g/L、硫酸亚铁0-0.5g/L、氯化钠0-10g/L以及氯化铵0-5g/L。
一个优选方案中，所述液体发酵培养基的PH值调为5-8；所述枯草芽孢杆菌接种入所述发酵培养基中的接种量为1-20％，扩大培养的发酵温度为20-38℃，扩大培养的发酵周期为24-60h。
一种如上述所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用。
一个优选方案中，将所述的枯草芽孢杆菌经接种入液体发酵培养基中扩大培养后，自所述液体发酵培养基中收集所述的枯草芽孢杆菌的菌体以制备菌剂，其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的每日摄入量为2×107-2×108个。
一个优选方案中，所述液体发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖或蔗糖1-30g/L、氮源1-40g/L、酵母提取物5-30g/L、胰蛋白胨5-50g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、硫酸镁0-0.5g/L、硫酸亚铁0-0.5g/L、氯化钠0-10g/L以及氯化铵0-5g/L。
一个优选方案中，所述液体发酵培养基的PH值调为5-8；所述枯草芽孢杆菌接种入所述发酵培养基中的接种量为1-20％，扩大培养的发酵温度为20-38℃，扩大培养的发酵周期为24-60小时。
在上述方案中，GF107枯草芽孢杆菌的高密度发酵培养具体过程为：
(1)枯草芽孢杆菌(GF107)的分离活化
从保藏的枯草芽孢杆菌(GF107)菌种中用灭菌后的接种环在菌种分离活化LB固体培养基上划线，在37℃的恒温培养箱中培养12-16h，用以分离活化出单菌落。
(2)枯草芽孢杆菌(GF107)的种子摇瓶发酵
选择LB固体培养基上出现的单菌落，用灭菌后的接种环挑取单菌落，接种在20-100mL的2×YT培养基中，并按照5μL卡那霉素(10mg/mL)/1000mL LB加入卡那霉素混匀，在37℃的摇床上200r/min培养12-16h。
(3)枯草芽孢杆菌(GF107)的高密度发酵培养
将2.85L(3L发酵液量)的枯草芽孢杆菌(GF107)发酵培养基(葡萄糖或蔗糖1-30g/L，氮源1-40g/L，Yeast extract 5-30g/L，Tryptone 5-50g/L，KH2PO40.1-1g/L，MgSO40-0.5g/L，FeSO40-0.5g/L，NaCl 0-10g/L，氯化铵0-5g/L)放入发酵罐，并按照0.5mL消泡剂/1000mL发酵液的比例，向发酵液中加入消泡剂。后将发酵罐的pH电极、溶氧电极插入发酵罐，做好发酵罐的准备工作后，将发酵罐放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min。灭菌完成后待发酵罐冷却一段时间，然后安装，完毕后，设置温度28-37℃，转速200-900r/min，溶氧15-30％，并接通流加的氨水、20％葡萄糖水、消泡剂，进行搅拌，待发酵液温度降至30-37℃，接种50mL的摇瓶种子液，然后每隔4h在560nm处用紫外分光光度计以无菌水为空白对照测量菌浓度。发酵完毕后，将发酵液以9000r/min进行离心10min，分别收集菌体和上清液。
一种肉鸡饲料，1000Kg所述肉鸡饲料中添加200-300g所述的枯草芽孢杆菌。
在上述方案中，经过试验抑菌检测，发现对大肠杆菌有明显的抑制效果最强，其产生的抑菌圈大小与正对照卡那霉素差不多的芽孢杆菌，直径约2.1cm左右，将其选为添加入饲料的GF107枯草芽孢杆菌。其中，肉鸡在食用了添加200-300g GF107枯草芽孢杆菌的饲料后，发现GF107枯草芽孢杆菌对肉鸡增重和降低料肉比起到很大的作用。
实施例1
北京某地养肉鸡场，肉鸡的吐水现象多发，一般发生在20日龄或更大的肉鸡只中，在30日龄的肉鸡中发病率最高。病肉鸡羽毛散乱无光泽、嗉囊肿大，解剖发现其中积水严重，嗉囊中大部分是液体，基本无食物，且腺胃肿大，腺胃中积存大量未消化的食物，整个消化道肌肉及粘膜松弛无弹性、易破损，死淘率也相应升高。由于吐水导致肉鸡的免疫系统处于亚健康状态，对其它致病菌和病毒的抵抗力下降，从而导致肉鸡新城疫等传染病的抵抗力也较低。且病肉鸡会往饲料槽里面吐水，造成饲料污染，进而传染肉鸡舍内其它肉鸡只，使用多种抗生素和抗病毒药物治疗，效果均不明显。
经分析后，建议停用了所有抗生素，改用GF107枯草芽孢杆菌，按照每吨添加200-300g进行饲料添加，连续使用。从第2天起，吐水现象出现减轻，连续使用7天以后，吐水症状基本消失。
其中，肉鸡饲料含有按重量比的以下组分：玉米55-60份、麸皮10-15份、豆粕15-20份、石粉5-8份、磷酸氢钙1-2份、食盐0.5-2份、蛋氨酸1-2份、复合维生素1-2份、微量元素预混剂1份、赖氨酸0.5-1份以及膨润土1-1.5份。
实施例2
河北某地养肉鸡场，发生传染性腹泻，患病肉鸡只的主要症状有：患病肉鸡只粪便为白色或黑绿色的液体或半液体状稀便，呼吸急促、体温升高、食欲减退、精神萎靡，迅速消瘦，且传染性较强，一旦有肉鸡只发病，则迅速在肉鸡舍内扩散，采用抗生素治疗不明显，未能有效控制疫情。经分析后，建议停用了所有抗生素，改用GF107枯草芽孢杆菌，按照每吨添加200-300g进行饲料添加，连续使用，三天后，大面积腹泻情况开始减轻，肉鸡群健康状况明显好转，排泄物由恶臭的不成形稀便逐渐变为固形正常粪便，且味道明显减轻。
提取粪便中的微生物进行培养，与未采用GF107枯草芽孢杆菌的肉鸡只粪便微生物菌群进行比较，发现采用GF107添加的肉鸡只，粪便中的细菌数量较少，且GF107枯草芽孢杆菌成为优势菌群，压制了致病菌的繁殖。而未采用GF107的肉鸡只粪便微生物种类和数量均较多，且以大肠杆菌、沙门氏菌和酵母菌为主。
其中，肉鸡饲料含有按重量比的以下组分：米糠10-40、玉米粉40-100、花生粕20-60、大豆粕10-30、磷酸氢钙1-4、牡丹饼粕5-15、食盐1-5、鱼骨粉2-8、植物提取物2-7、棉籽粕10-20、次粉10-20、微量元素2-7、植物油2-9、复合酶制剂1-5、硫酸亚铁1-4、硫酸锌1-4、蛋氨酸6-10、赖氨酸5-15、碘酸钙0.5-3以及黄粉虫10-40。
实施例3：GF107枯草芽孢杆菌代替抗生素对肉鸡增重、降低料肉比、增加存活率和提高欧洲指数的作用
北京某养肉鸡场，采用了GF107枯草芽孢杆菌代替抗生素，从开始养殖到出栏，周期40天，一直按照每吨添加200g进行GF107枯草芽孢杆菌的饲料添加，持续使用一直到肉鸡出栏，其中，肉鸡饲料含有按重量比的以下组分：玉米粉500-520、麦麸30-40、虾壳粉10-15、蚕蛹粉20-30、骨粉10-15、小麦面粉30-40、南瓜粉30-40、芹菜粉30-40、山楂粉15-20、鲜香椿8-10、竹笋10-15、魔芋20-30、地瓜30-40、牛大力2-4、苹果籽10-15以及碘盐3-5。
与采用抗生素添加的对照组进行体重、存活率、料肉比和欧洲指数的总和比较，结果如图2和表1所示。
欧洲效益指数是肉鸡养殖总体效益的一个综合指数，其算法为：欧洲效益指数＝[(成活率x体重(kg)/(料肉比x出栏天数)]×10000。欧洲效益指数大于300，才能维持一个较好的饲养水平和盈利水平。
表1、添加了GF107枯草芽孢杆菌的肉鸡和对照组肉鸡各项指标的比较
组别 饲养天数 末期重 料肉比 成活率 欧洲效益指数
对照组 40 2902.54 1.58 98.12 449
实验组 40 3087.32 1.45 99.37 528
由图2和表1所示，采用GF107枯草芽孢杆菌无抗养殖的肉鸡只平均体重增加了6.3％，存活率从98.12％提高到了99.37％，料肉比下降了8.2％，总体欧洲指数得到了显著提高。本实验的养殖场采用了GF107枯草杆菌芽孢杆菌以后，不但减少了抗生素的使用，使得肉和蛋的健康指标得以提高，而且还显著提升了欧洲指数约17.5％。
实施例4：GF107枯草芽孢杆菌代替抗生素对肉鸡增重、降低料肉比和增加存活率的作用
北京某养肉鸡场，采用了GF107枯草芽孢杆菌代替抗生素，从开始养殖到出栏，周期40天，一直按照每吨添加250g进行GF107枯草芽孢杆菌的饲料添加，持续使用一直到肉鸡出栏，其中，肉鸡饲料含有按重量比的以下组分：玉米粉500-520、麦麸30-40、虾壳粉10-15、蚕蛹粉20-30、骨粉10-15、小麦面粉30-40、南瓜粉30-40、芹菜粉30-40、山楂粉15-20、鲜香椿8-10、竹笋10-15、魔芋20-30、地瓜30-40、牛大力2-4、苹果籽10-15以及碘盐3-5。
与采用抗生素添加的对照组进行体重、存活率和料肉比比较，结果如表2所示。
表2、添加了GF107枯草芽孢杆菌的肉鸡和对照组肉鸡各项指标的比较
组别 饲养天数 末期重 料肉比 成活率 欧洲效益指数
对照组 40 2912.85 1.60 98.56 448
实验组 40 3098.47 1.46 99.40 527
由表2所示，采用GF107枯草芽孢杆菌无抗养殖的肉鸡只平均体重增加了6.4％，存活率从98.56％提高到了99.40％，料肉比下降了8.7％，总体欧洲指数得到了显著提高。本实验的养殖场采用了GF107枯草杆菌芽孢杆菌以后，不但减少了抗生素的使用，使得肉和蛋的健康指标得以提高，而且还显著提升了欧洲指数约17.6％。
实施例5：GF107枯草芽孢杆菌代替抗生素对肉鸡增重、降低料肉比和增加存活率的作用
北京某养肉鸡场，采用了GF107枯草芽孢杆菌代替抗生素，从开始养殖到出栏，周期40天，一直按照每吨添加300g进行GF107枯草芽孢杆菌的饲料添加，持续使用一直到肉鸡出栏，其中，肉鸡饲料含有按重量比的以下组分：玉米粉500-520、麦麸30-40、虾壳粉10-15、蚕蛹粉20-30、骨粉10-15、小麦面粉30-40、南瓜粉30-40、芹菜粉30-40、山楂粉15-20、鲜香椿8-10、竹笋10-15、魔芋20-30、地瓜30-40、牛大力2-4、苹果籽10-15以及碘盐3-5。
与采用抗生素添加的对照组进行体重、存活率、料肉比和欧洲指数的总和比较，结果如表3所示。
表3、添加了GF107枯草芽孢杆菌的肉鸡和对照组肉鸡各项指标的比较
组别 饲养天数 末期重 料肉比 成活率 欧洲效益指数
对照组 40 2930.75 1.62 98.70 446
实验组 40 3107.64 1.47 99.58 526
由表3所示，采用GF107枯草芽孢杆菌无抗养殖的肉鸡只平均体重增加了7.3％，存活率从98.70％提高到了99.58％，料肉比下降了9.2％，总体欧洲指数得到了显著提高。本实验的养殖场采用了GF107枯草杆菌芽孢杆菌以后，不但减少了抗生素的使用，使得肉和蛋的健康指标得以提高，而且还显著提升了欧洲指数约17.9％。
实施例6：
山东某养肉鸡场，采用了制备治疗肉鸡腹泻的菌剂中应用有GF107枯草芽孢杆菌的菌剂代替抗生素，从开始养殖到出栏，周期40天，一天喂养的菌剂中所述GF107枯草芽孢杆菌的含量为2x107个，持续使用一直到肉鸡出栏，肉鸡腹泻的症状消失。
实施例7：
河南某养肉鸡场，采用了制备治疗肉鸡吐水症的菌剂中应用有GF107枯草芽孢杆菌的菌剂代替抗生素，从开始养殖到出栏，周期40天，一天喂养的菌剂中所述GF107枯草芽孢杆菌的含量为2x108个，持续使用一直到肉鸡出栏，肉鸡的吐水症的症状消失。
由上述实施例1-7可见，本发明中筛选诱变得到的枯草芽孢杆菌应用于养肉鸡业，不但能够提高经济效益，还能够实现无抗养殖，产生一定的社会效益。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其中，所述枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.15940；保藏日期为：2018年6月12日；分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
2.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用，其中，将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌经接种入液体发酵培养基中扩大培养后，自所述液体发酵培养基中收集所述的枯草芽孢杆菌的菌体以制备菌剂，其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的每日摄入量为2×107-2×108个。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用，其中，所述液体发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖或蔗糖1-30g/L、氮源1-40g/L、酵母提取物5-30g/L、胰蛋白胨5-50g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、硫酸镁0-0.5g/L、硫酸亚铁0-0.5g/L、氯化钠0-10g/L以及氯化铵0-5g/L。
5.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡吐水症的菌剂中的应用，其中，所述液体发酵培养基的PH值调为5-8；所述枯草芽孢杆菌接种入所述发酵培养基中的接种量为1-20％，扩大培养的发酵温度为20-38℃，扩大培养的发酵周期为24-60h。
6.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用。
7.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用，其中，将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌经接种入液体发酵培养基中扩大培养后，自所述液体发酵培养基中收集所述的枯草芽孢杆菌的菌体以制备菌剂，其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的每日摄入量为2×107-2×108个。
8.如权利要求7所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用，其中，所述液体发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖或蔗糖1-30g/L、氮源1-40g/L、酵母提取物5-30g/L、胰蛋白胨5-50g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、硫酸镁0-0.5g/L、硫酸亚铁0-0.5g/L、氯化钠0-10g/L以及氯化铵0-5g/L。
9.如权利要求7所述的枯草芽孢杆菌在制备用于治疗肉鸡腹泻的菌剂中的应用，其中，所述液体发酵培养基的PH值调为5-8；所述枯草芽孢杆菌接种入所述发酵培养基中的接种量为1-20％，扩大培养的发酵温度为20-38℃，扩大培养的发酵周期为24-60小时。
10.一种肉鸡饲料，其中，1000Kg所述肉鸡饲料中添加200-300g如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
CN201810756323.1A 2018-07-11 2018-07-11 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用 Active CN108660100B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810756323.1A CN108660100B (zh) 2018-07-11 2018-07-11 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810756323.1A CN108660100B (zh) 2018-07-11 2018-07-11 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108660100A CN108660100A (zh) 2018-10-16
CN108660100B true CN108660100B (zh) 2021-12-21

Family

ID=63774002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810756323.1A Active CN108660100B (zh) 2018-07-11 2018-07-11 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108660100B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109744198A (zh) * 2019-03-28 2019-05-14 北部湾大学 营养强化富硒鸡的养殖方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101642198A (zh) * 2009-08-25 2010-02-10 曹君平 鸡专用生物添加剂预混合饲料及其生物活性物质载体的制备方法
CN101822321A (zh) * 2010-03-19 2010-09-08 计成 枯草芽孢杆菌ansb060的应用
CN102433283A (zh) * 2011-12-19 2012-05-02 湖南省微生物研究所 一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用
CN103087964A (zh) * 2013-02-01 2013-05-08 上海三维同力生物科技有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其微生态制剂和在动物饲料中的应用
CN103289914A (zh) * 2013-01-29 2013-09-11 广州格拉姆生物科技有限公司 枯草芽孢杆菌a16的制备方法与应用
CN103614327A (zh) * 2013-11-27 2014-03-05 北京昕大洋科技发展有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其用途
CN106190933A (zh) * 2016-09-28 2016-12-07 吉林省农业科学院 广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用
CN108251325A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 中粮营养健康研究院有限公司 菌剂、饲料或添加剂以及脱除呕吐毒素的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101642198A (zh) * 2009-08-25 2010-02-10 曹君平 鸡专用生物添加剂预混合饲料及其生物活性物质载体的制备方法
CN101822321A (zh) * 2010-03-19 2010-09-08 计成 枯草芽孢杆菌ansb060的应用
CN102433283A (zh) * 2011-12-19 2012-05-02 湖南省微生物研究所 一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用
CN103289914A (zh) * 2013-01-29 2013-09-11 广州格拉姆生物科技有限公司 枯草芽孢杆菌a16的制备方法与应用
CN103087964A (zh) * 2013-02-01 2013-05-08 上海三维同力生物科技有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其微生态制剂和在动物饲料中的应用
CN103614327A (zh) * 2013-11-27 2014-03-05 北京昕大洋科技发展有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其用途
CN106190933A (zh) * 2016-09-28 2016-12-07 吉林省农业科学院 广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用
CN108251325A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 中粮营养健康研究院有限公司 菌剂、饲料或添加剂以及脱除呕吐毒素的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108660100A (zh) 2018-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103614327B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其用途
CN101463329B (zh) 一种酿酒酵母、含有该酵母的酵母制剂、饲料、其制备方法及其用途
CN101869184B (zh) 一种微生物饲料添加剂及其制备方法
CN105062921B (zh) 一种抑制禽致病性沙门氏菌的唾液乳杆菌及其应用
CN106260540B (zh) 一种用于教槽料的生物饲料及教槽料
CN111690558B (zh) 一株枯草芽孢杆菌菌株及其在水产养殖中的应用
CN106635902B (zh) 一种凝结芽孢杆菌及其应用
CN106867933A (zh) 对凡纳滨对虾养殖中水质净化的微生态制剂及制备与应用
CN106834174A (zh) 对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂及制备与应用
WO2008023580A1 (fr) Additif pour alimentation animale
CN105029045A (zh) 一种水产饲料添加剂
CN105524855B (zh) 一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用
CN109548962B (zh) 一种包含植物乳杆菌的复合微生物菌剂及其应用
CN112136965B (zh) 一种增免促生长型发酵中草药饲料添加剂及其制备方法
CN103301409B (zh) 防治虾偷死病的组合物及其制备方法
CN104774781A (zh) 一株枯草芽孢杆菌dcu及其用途
CN108795829B (zh) 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉猪饲料中的应用
CN108660100B (zh) 枯草芽孢杆菌及其在菌剂以及肉鸡饲料中的应用
CN109943502B (zh) 益生菌、发酵剂及在中草药制剂中的应用
CN109321478A (zh) 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用
CN115637240A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN111685229B (zh) 一种微生态复合添加剂及其在水产养殖中的应用
CN114231464A (zh) 凝结芽孢杆菌及其用途
CN101294142A (zh) 粘膜发酵菌剂及其制备方法
CN112760251A (zh) 一种复合型芽孢杆菌益生菌及其制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant