CN103289914A

CN103289914A - 枯草芽孢杆菌a16的制备方法与应用

Info

Publication number: CN103289914A
Application number: CN2013100324631A
Authority: CN
Inventors: 何宏轩; 王从峰; 李本涛; 夏新界; 印遇龙; 佘锐萍; 李刚; 李爱科; 李帅伟
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明提供了枯草芽孢杆菌A16的制备方法，以及枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物在畜禽和水产养殖中的应用。主要用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊、鱼等的饲料添加剂。枯草芽孢杆菌A16能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，使猪只的生产性能得到很大提高，也可替代部分抗生素，具有良好的应用前景。

Description

枯草芽孢杆菌A16的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及益生菌领域及其增强动物健康或动物的一般身体状况的能力。

背景技术

在我国，抗生素等抗菌药物的滥用造成了药物残留以及大量耐药性细菌产生，其结果严重阻碍了畜、禽、水产养殖业的健康持续发展，为食品安全和消费者的身体健康埋下了隐患，因此寻找安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。目前的研究证实，包含益生菌的生物饲料添加剂是一种十分理想的抗生素替代品。

芽孢杆菌(Bacillus) 属包含众多在农业和动物营养等领域中具有繁多用途的内生孢子形成细菌。数种芽孢杆菌株目前在市场上用作动物饲料中的益生菌而作为抗生素的替代品。这些益生菌通过调整胃肠道菌群来增强动物健康，包括改善动物生长及饲料效率。由于对用于人类消费的动物产品中的抗生素残余物及对抗生素耐药性的发展的担忧，增加了对此类益生菌的使用。近年来已进行了工作来筛选用作益生菌的孢子形成细菌。尽管各种商业产品中含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藓样芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及凝结芽孢杆菌株(Bacillus coagulans)，此种筛选揭示出并非所有的芽孢杆菌株均是有效的饲料添加剂。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 具有多种功能，是一种可以应用于多个领域的优良菌种，例如可以作为微生物农药、微生物饲料添加剂、生物有机肥接种剂、净水剂等。它的主要功能有抑制有害细菌( 大肠杆菌、沙门氏菌) 生长，预防腹泻、下痢等疾病；分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，降解动植物性饲料中复杂的有机物，促进消化吸收，提高饲料利用率；安全高效，无药残，无毒副作用，促进动物生长，增强动物免疫力和抗病力；减少粪便中氮、磷、钙的排泄量，减少有害气体排放，降低养殖场所氨气、吲哚等有害气体的浓度，改善养殖环境；分解水体中的残饵、粪便、死藻等，维护水质，减少病害，减小换水量，提高水产动物免疫力、抗病力，提高成活率。

枯草芽孢杆菌A16（Bacillus subtilis A16），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209105。

枯草芽孢杆菌A16抑菌谱广，可抑制玉米大、小斑病，对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有较强的拮抗作用，防治效率高（CN 101698829 B）。目前尚未见枯草芽孢杆菌A16应用于畜牧领域报道，其无毒无害，环境安全性好，可增强畜禽健康，故而可应用于微生态制剂领域，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的在于提供枯草芽孢杆菌A16 的制备方法。

本发明另一个目的是提供上述枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物在畜禽和水产养殖中的应用。

本发明的枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物可用于制备饲料添加剂。

其中，本发明的枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物在用于制备饲料添加剂中，主要用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊、鱼等的饲料添加剂。

本发明还提供包含该枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于枯草芽孢杆菌的添加量为10⁸-10¹¹CFU/Kg。

优选地，枯草芽孢杆菌的添加量为10¹⁰CFU/Kg。

其中，发酵枯草芽孢杆菌A16时用的发酵培养基由如下成分组成：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉1.5g/L，硫酸锰0.0004g/L，pH7.0。

发酵条件为：发酵温度为30-35℃，发酵时间为18-24小时，pH值为6.5-7.5，转速为150-250rmp，初始接种量为5-10％。

优选地，发酵条件为：发酵温度为30℃，发酵时间为20小时，pH值为7.0，转速为200rmp，初始接种量为8％。

发酵完成后，培养液过滤，喷雾干燥即得菌粉。菌粉按10¹⁰CFU/Kg添加量添加到饲料中。

本发明涉及作为生防菌而有效促进植物生长和防治植物病害的枯草芽孢杆菌A16和/ 或其代谢物的新用途。枯草芽孢杆菌A16作为益生菌用于动物健康应用中以维持健康的肠微生物菌群，包括减少有害细菌( 例如梭状芽孢杆菌和弯曲杆菌) 及增加有益细菌(例如乳杆菌属(Lactobacillus spp.) 和双歧杆菌(Bifidobacterium))。益生菌非常适合用于维持病原性细菌和有益细菌之间的健康平衡，因为，所述益生菌不同于抗生素，不会不加区别地消灭细菌也不导致病原性细菌的抗生素耐药性株。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的枯草芽孢杆菌A16发酵方法成本低，制备工艺简单快速，操作条件温和。

（2）本发明的枯草芽孢杆菌A16可以有效抑制动物肠道常见致病菌大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，发挥益生功能。

（3）本发明的枯草芽孢杆菌A16经过培养和发酵可作为饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或饲料中，改善动物肠道健康，提升动物免疫力，增加动物的生产性能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1枯草芽孢杆菌A16 的制备

取过夜培养的枯草芽孢杆菌A16 40mL转接入500ml 发酵培养基( 初始接种量为8％ )，30℃发酵20小时，pH 值为7.0，转速为200rpm。发酵后，菌体喷雾干燥，菌粉4℃保存。

发酵培养基的组成为：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉1.5g/L，硫酸锰0.0004g/L，pH 7.0。

平板菌落计数法检测菌粉的活菌数约为10¹⁰CFU/g。

平板菌落计数法的操作方法为：待测样品经适当倍数稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样品涂布到平板上，经过培养，每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的活菌数。

枯草芽孢杆菌A16菌粉按10¹⁰CFU/Kg添加量添加到饲料中。

实施例2枯草芽孢杆菌A16 的制备抑菌效果

将LB 固体培养基融化，冷却至45℃。加入过夜培养的E.coli K88、K99和金黄色葡萄球菌（每毫升培养基加入1μL菌液），震荡混匀，倒入无菌平板，水平凝固，在每个琼脂平板上轻轻放置4只牛津杯，其间距应相等。每只牛津杯中加入200μL待测菌液（枯草芽孢杆菌A16），盖好皿盖，小心移至37℃培养箱，平皿正放静置培养。培养20小时后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径（表1）。实验结果表明枯草芽孢杆菌A16抑菌能力较强。

表1 枯草芽孢杆菌A16抑菌结果

致病菌	大肠杆菌K88	大肠杆菌K99	金黄色葡萄球菌
				枯草芽孢杆菌A16（cm）	1.1	1.2	0.8
氨苄青霉（cm）	1.6	1.8	1.0
				空白（cm）	0	0	0

实施例3枯草芽孢杆菌A16作为饲料添加剂的应用

将90头健康的28±2日龄断奶仔猪( 体重平均为7.6±0.15kg) 按公母各半的原则随机分为5组，每组3个重复，每个重复6头猪，组1是空白对照组，饲喂基础日粮，组2饲喂金霉素添加量为75mg/kg的基础日粮，组3、组4、组5分别饲喂添加10⁹CFU/kg、10¹⁰CFU/kg、10¹¹CFU/kg 枯草芽孢杆菌A16菌粉的基础日粮。自由采食和自由饮水。试验期间按猪场常规方法进行饲养管理。试验第28天晚上8 点停止喂料，照常供水，于次日早上8点对猪只空腹称重，计算试验的平均日增重，平均日采食量与饲料转化效率。

表2 枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628 对断乳仔猪生长性能的影响

	组1（空白）	组2（抗生素）	组3	组4	组5
						日增重	189.21±5.23	235.23±3.19	221.62±4.21	235.41±6.15	230.62±7.41
采食量	325.43±7.41	363.38±4.56	360.19±6.62	360.81±7.49	359.91±5.12
						料重比	1.72±0.13	1.54±0.09	1.63±0.12	1.53±0.37	1.56±0.19

结果表明：1010CFU/kg 添加量的枯草芽孢杆菌A16可以显著改善断奶乳猪的生长性能。整个试验期，添加枯草芽孢杆菌A16组的日增重和采食量显著高于空白对照组(P＜0.05)，料重比显著低于空白对照组(P＜0.05)（表2）。试验证明，在仔猪的日粮中添加本发明量的枯草芽孢杆菌A16能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，使猪只的生产性能得到很大提高，也可替代部分抗生素。

Claims

1.枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物的制备方法，其特征是：

发酵枯草芽孢杆菌A16时用的发酵培养基由如下成分组成：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸粉1.5g/L，硫酸锰0.0004g/L，pH7.0；发酵条件为：发酵温度为30-35℃，发酵时间为18-24小时，pH值为6.5-7.5，转速为150-250rmp，初始接种量为5-10％；发酵完成后，培养液过滤，喷雾干燥获得菌粉。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物，在畜禽和水产养殖中的应用。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物，用于制备饲料添加剂。

4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物，主要用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊、鱼等的饲料添加剂。

5.根据权利要求2、3、4所述的枯草芽孢杆菌A16及其代谢产物，菌粉按10^8-11CFU/Kg添加量添加到饲料中。