CN105602865A - 一株枯草芽孢杆菌、发酵方法、粉剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌、发酵方法、粉剂和应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)Gv-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCC？NO：M2015766，保藏日期：2015年12月21日。本发明首次从海滨锦葵块根中分离海滨锦葵块根内生菌，并通过纯化，16S？rDNA测序以及形态生理特征分析，确定分离培养的菌株Gv-1为枯草芽孢杆菌。本发明利用枯草芽孢杆菌发酵液制备枯草芽孢杆菌粉剂，并添加到猪饲料中，结果表明，添加了枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，能够充分发挥枯草芽孢杆菌Gv-1的作用，促进仔猪的生产性能和对蛋白质、Ca、P的消化吸收，改善仔猪肠道的微生态菌群，使肠道微生态系统处于最佳的平衡状态。

Description

一株枯草芽孢杆菌、发酵方法、粉剂和应用
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆菌的发酵方法、含有该枯草芽孢杆菌的粉剂和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
海滨锦葵(Kosteletzkyavirginica)是一种耐盐、能利用盐碱地和干旱土壤的抗逆植物，原生长于美国东、南海岸，1992年以后陆续被科学家引入中国。海滨锦葵的种子含有较高的不饱和脂肪酸和较高的蛋白质，其块根含有多糖、皂苷等成分和抗癌活性成分，能提高动物的生产性能和免疫力，具有作为饲料、药等的开发潜力。
枯草芽孢杆菌是我国允作料添加的两种芽孢杆菌之一，能够产生氨基糖类、磷脂类、肽类和脂肽类等多种抗生素，已被越来越多的研制成微生物制剂(无毒、无残留、无染色的添加)。枯草芽孢杆菌具有以下优点：(1)枯草芽孢杆菌具有蛋白、脂肪和淀粉等活性，能产生抗菌素，其中脂肽类抗生素(包括伊枯草菌素、泛革素和表面活性素)是枯草芽孢杆菌最重要的抗菌物质。(2)枯草芽孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收，提高动物的饲料转化率和疾病防治都有着重要作用，从抗菌机理上看，既可以干扰病原菌的生物合成系统，也可以对病原菌的细胞壁、细胞膜、核酸和蛋白质等直接作用，从而达到促进动物生长的目的。(3)枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用。(4)枯草芽孢杆菌能够通过增强机体的谷胱甘肽过氧化物酶活性等总抗氧化能力，降低血清及肝脏中丙二醛等氧化终产物的含量，提高畜禽的抗氧化性能。但是，目前在枯草芽孢杆菌的工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆菌的发酵方法、含有该枯草芽孢杆菌的粉剂和应用，该枯草芽孢杆菌能够提高仔猪的生产性能和吸收性能，调节猪肠道微生物菌群，该枯草芽孢杆菌的发酵方法简单、活菌数多且芽孢形成率高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Gv-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCCNO：M2015766，保藏日期：2015年12月21日。
一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，恒温振荡培养，至OD600达到1.0，得到枯草芽孢杆菌菌液，再将枯草芽孢杆菌菌液以1％的接种量接种于发酵培养基，37℃发酵24-72h。
所述发酵培养基的制备方法为：将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基按照体积比4-0.5:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH，调节pH至9.0，121℃高压灭菌30min。
所述的海冰锦葵块根提取液的制备方法为：将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液即得；其中，每次加水量为海滨锦葵块根重量3倍。
一种含有枯草芽孢杆菌的粉剂，所述的粉剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，恒温振荡培养，至OD600达到1.0，得到枯草芽孢杆菌菌液，再将枯草芽孢杆菌菌液以1％的接种量接种于发酵培养基，37℃发酵24-72h；
(2)将步骤(1)的枯草芽孢杆菌发酵液以12-18％的接种量接种于扩大培养培养基中，35-39℃、150-250r/min发酵48h；
(3)将步骤(2)的发酵液加入自动排渣碟式分离机中离心，得到菌泥，将菌泥和菌泥载体按照质量比1:2混合，再送入高效沸腾干燥机中烘干，最后用粉碎机粉碎即得。
所述发酵培养基的制备方法为：将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基按照体积比4-0.5:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH，调节pH至9.0，121℃高压灭菌30min；
所述的海冰锦葵块根提取液的制备方法为：将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液即得；其中，每次加水量为海滨锦葵块根重量3倍。
所述扩大培养培养基的制备方法为：将海冰锦葵块根提取液、普通肉汤培养基和玉米粉按照体积比8:1:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH，调节pH至9.0，121℃高压灭菌30min。
所述扩大培养培养基中还可加入少许植物油作为消泡剂。
步骤(3)中发酵液加入自动排渣碟式分离机的流量为400L/h，高效沸腾干燥机的进风温度为70℃，烘干时间为3h。
一种含有枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，所述的猪饲料包括以下重量份的原料：玉米44份、豆粕45份、麦麸10份、枯草芽孢杆菌粉剂0.01-0.03份、预混料1份；所述的预混料为每10千克预混料中含有VA5512U、VD640U、VK32.2U、VE20U、VB1227.6μg、VB25.5mg、D-泛酸14.8mg、烟酸30.3mg、胆碱500mg、铜50mg、铁100mg、锌50mg、锰10mg、碘0.85mg、硒0.25mg。
一种枯草芽孢杆菌在促进植物生长和提高植物高盐浓度下抗逆性方面的应用。
一种枯草芽孢杆菌在提高猪生产性能、吸收能力和调节肠道菌群方面的应用。
本发明有益效果
1、本发明首次从海滨锦葵块根中分离海滨锦葵块根内生菌，并通过纯化，16SrDNA测序以及形态生理特征分析，确定分离培养得到的菌株Gv-1为枯草芽孢杆菌。
2、本发明的枯草芽孢杆菌Gv-1能够促进植物的生长，提高植物高盐浓度下的抗逆性。
3、本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌的发酵条件，最终确定在菌液接种量1％、发酵温度37℃的条件下，发酵培养基中海滨锦葵块根提取液和普通肉汤培养基体积为4:1，发酵时间72h，活菌数最多，达到1.64×109cfu/ml，芽孢率达到99％。
4、本发明通过正交实验，再次优化枯草芽孢杆菌在发酵罐中的发酵工艺条件，最终确定在发酵时间相同的条件下，菌种接种量15％、发酵温度37℃、培养基pH9.0、转速250r/min，发酵液中的活菌量最多，达到9.926Log(cfu/mL)。
5、本发明利用枯草芽孢杆菌发酵液制备枯草芽孢杆菌粉剂，并添加到猪饲料中，结果表明，添加了枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，能够充分发挥枯草芽孢杆菌Gv-1的作用，促进仔猪的生产性能和对蛋白质、Ca、P的消化吸收，改善仔猪肠道的微生态菌群，使肠道微生态系统处于最佳的平衡状态。
6、本发明方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。
附图说明
图1为菌株Gv-1的菌落形态图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明所用的部分培养基为常见培养基，具体如下：
PDA平板(PDA固体培养基)：马铃薯洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，过滤，滤液加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，再补足水分至1000mL，121℃高压灭菌20min，铺平板，冷却即可。
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g，补水至1L，pH7.4-7.6。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g，补水至1L，pH7.0。
实施例1海滨锦葵块根内生菌的分离、纯化、鉴定和保存
1、海滨锦葵块根内生菌的分离、纯化
海滨锦葵材料取自由美国引进的中国大陆种植的第一年生长的海滨锦葵块根。海滨锦葵种植试验区位于34°83′N、113°50′E，地处河南省郑州市惠济区黄河滩涂。种子种植的海滨锦葵，在一年生长周期后，冬季进入休眠期，整体取出地下部分块根，作为实验材料。
将田间新鲜挖去的海滨锦葵块根清洗、通风晾干，无菌条件下使用手术刀片去除植物表皮。用70％乙醇浸泡1min，无菌水清洗三次，次氯酸钠浸泡2min，70％乙醇浸泡30s，最后用无菌水冲洗五次，取最后一次无菌水涂布于PDA培养基上，置于30℃恒温培养。若3-5d内，PDA平板均无任何菌落生成，则表明海滨锦葵块根表面消毒彻底，可以切块培养。若PDA平板内产生任何菌落，表明海滨锦葵块根表面消毒不彻底，需要进一步消毒。重复以上步骤，至PDA平板上无菌落生成。用无菌手术刀，将组织切成5mm×5mm×5mm见方小块，接种在PDA平板上，每个PDA平板接种4块海滨锦葵块根切块，共接种10个平板。对照组使用冲洗小根块的无菌水涂布，所有平板置于30℃的无菌培养箱，培养3-5d。
将海滨锦葵块根附近不同形态的真菌、细菌接种到新的平板(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)上，挑去菌丝和菌落时注意不要被其他菌落污染。给新的平板编号，不断挑取不同形态的菌落转移至新的平板中，至所有平板菌落单一，筛选细菌，最终得到一株菌株Gv-1。
在15ml试管中加入10mlPDA固体培养基倾斜放置，棉花塞住试管口，接种菌株Gv-1，30℃培养3d后，封口膜封口后保存在4℃环境中。同时，向LB液体培养基中加入30％甘油，接种筛选出的细菌菌株Gv-1后，加1ml至冻存管中-20℃保存。
2、海滨锦葵块根内生菌的鉴定
2.1菌株Gv-1的菌落形态观察
菌落形态：菌落呈白色或淡黄色、不透明、圆形、表面粗糙，中间有皱起、边缘不整齐(图1)。
生理特征如下表。
2.2细菌基因组DNA的提取
将保存的细菌菌株分别接种于含有30mL的LB液体培养基的50mL三角瓶中，30℃、150r/min恒温振荡培养16至18h，至菌液OD600达到1.0。用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程有限公司)提取细菌基因组DNA，具体方法如下：
(1)从每个三角瓶取2ml菌液于离心管中，8000r/min离心1min，弃上清，收集菌体。加入180μl溶菌酶溶液(使用前将相应的溶菌酶加入到EnzymaticlysisBuffer中，配制成20mg/ml的溶菌酶溶液)重新悬浮菌体，37℃水浴30-60min，之后加入400μlBufferDigestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10min颠倒摇匀一次，促使样品完全裂解变为澄清透明。
(2)加入200μlBufferPB，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
(3)室温10,000r/min离心5min，上清液约500-550μl转移至新的1.5ml离心管中。若上清液浑浊，可加入等体积氯仿混匀，12,000r/min离心取上清。
(4)加入等体积异丙醇，颠倒混匀5到8次，室温放置2-3min。室温10,000r/min离心5min，弃上清。
(5)加入1ml体积分数75％乙醇，颠倒漂洗1-3min，10,000r/min离心2min，弃上清。注意漂洗时一定使沉淀悬浮起来。
(6)重复步骤(5)一次。
(7)开盖室温倒置5-10min，使残留的乙醇挥发完全，避免影响DNA得率和后续实验。
(8)得到的DNA沉淀使用50μlTEBuffer溶解。TEBuffer为10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。
所提取的各编号细菌的DNA样本，-20℃保存，备用。
2.3PCR扩增
本发明采用细菌16SrDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQIDNO.1)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQIDNO.2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增。50μLPCR反应体系：10×EasyTaqBuffer5μL，2.5mmol/LdNTP4μL，Taq酶0.5μL，引物各1μL，DNA模板2μL，用ddH2O定容至50μL。
PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，循环36次，最后72℃延伸3min。4℃保存。
2.4目的片段的回收和测序
2.4.1目的片段的回收
(1)PCR产物用GoldviewⅡ型核酸染色剂染色，2％琼脂糖凝胶电泳检测。出现1500bp左右单一目的条带后，将琼脂糖凝胶块切取，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
(2)转移琼脂糖凝胶块至分析天平上的1.5mL离心管中。计算凝胶重量，换算该重量为凝胶体积，100mg换算为100μL体积(如0.12g凝胶重量，则换算为120μL体积，用于后续步骤的体积添加)。
(3)加入3倍琼脂糖凝胶块体积的BufferDE-A，75℃水浴加热融化，约用时10min。
(4)再加入1.5倍琼脂糖凝胶块体积的BufferDE-B，充分混合均匀，使混合物颜色变为黄绿色，充分摇匀，保证形成均一的黄绿色溶液。
(5)吸取步骤(4)中的黄绿色混合溶液，转移到产品内置的DNA制备管中(2mL体积的具有过滤网的离心管)，12,000倍重力离心1min，弃掉废液。
(6)将制备管装回2mL离心管中，加入500μLBufferW1，12,000倍重力离心30s，弃掉废液。
(7)将制备管装回2mL离心管中，加入700μLBufferW2，12,000倍重力离心30s，弃掉废液。以同样的方法再次加入700μLBufferW2，12,000倍重力离心1min。确认在BufferW2中已经加入指定体积的无水乙醇。
(8)两次使用BufferW2冲洗能够保证盐分被完全清除，消除对后续实验的影响。将制备管放回2mL离心管中，12,000倍重力离心1min。
(9)将制备管放置于新的洁净1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25μL到30μL的已加热至65℃的Eluent或者去离子水，室温放置1min。12,000倍重力离心1min，洗脱掉制备膜中央的DNA。
2.4.2目的片段的连接转化、测序
取回收到的目的DNA片段1μL，使用NanoDrop2000C超微量分光光度计测定DNA浓度。使用pMD18-TVectorKit将目的片段DNA连接至pMD18-T载体上，将含有目的片段的载体克隆至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体步骤如下：
(1)在微量离心管中配置如下DNA、载体混合液，全量为5μL。
pMD 18-T Vector 1μL
目的基因片段 0.1pmol～0.3pmol
ddH2O Add to 5μL
(2)加入等体积5μL的SolutionI，16℃连接30min。目的片段在2,000bp以上的DNA克隆时需要延长至数小时。
(3)将全量10μL体系加入至100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min。
(4)42℃热激90s后，再次放置在冰上3-5min。
(5)加入890μL不含有抗生素的SOC或LB培养基，混匀，37℃振荡培养60min，目的是使菌体复苏。
(6)向含抗生素的SOC或LB固体培养基上加入40μLX-gal和4μLIPTG备用。
(7)吸取100-200μL已转化的大肠杆菌DH5α感受态细胞加到步骤(6)的固体培养基上，均匀的涂开，37℃培养12-16h。
(8)挑取白斑于LB液体培养基中扩大培养，封口摇菌过夜，得到大肠杆菌菌液。以菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测，合格的送到上海生工生物有限公司测序。
(9)测序结果在BLAST进行相似性的分析。
2.4.3BLAST比对
将测序公司返回的测序结果进行拼接。由于片段长度为1,500bp，单向测序最多测序1,000bp，因此采用正反双向测序，分两次将1,500bp的16SrDNA目的序列测通。将正向序列和反向序列的互补序列使用DNAman及Seqenceman软件进行序列拼接，除去中间部分的重合部分，得到完整的16SrDNA序列。将所得序列在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上BasicBLAST在线比对专区(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线进行BLAST相似性比对，确定分离菌株的系统分类学地位。结合菌株Gv-1的形态生理特性分析和测序结果，确定菌株Gv-1为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其16SrDNA序列如下：
AGCAGGCGAGTGCTATAATGCAGTCGAGCGAATCGATGGGAGCTTGCTCCCTGAGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATACGTTCTTTTCTCGCATGAGAGAAGATGGAAAGACGGTTTACGCTGTCACTTATAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCAGAGTAACTGCTGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCCCATAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTCATGGAGCCAGCCGCCTAAGTGACAGATTG(SEQIDNO.3)
实施例2枯草芽孢杆菌Gv-1对植物生长影响
以小麦为实验材料，检验枯草芽孢杆菌Gv-1对植物生长的影响。小麦的培养容器用直径、深度各8cm，底部具有直径1.2cm圆孔的黑色塑料营养钵，营养钵中装入7cm深，121℃灭菌1h的蛭石。
小麦种子消毒处理：体积分数75％乙醇中浸泡1min，用质量分数5％次氯酸钠溶液浸泡两次，每次10min。每个营养钵播种5粒小麦种子，将营养钵置于方形盘内从底部加水使蛭石充分吸水。种子发芽后对营养钵进行1/2Hoagland营养液浇灌，置于5000lux光照强度，22℃培养，光照16h，黑暗8h，交替培养。15天左右，各植株幼苗生长良好。
将枯草芽孢杆菌Gv-1接种至含有30mLLB液体培养基的50mL三角瓶中，30℃180r/min培养12h，至菌液OD600值约等于1.0，使用移液器吸取1mL菌液转移至1000mLLB培养基中(或保持1:1000比例，按需培养)，30℃180r/min培养12-18h。将所得菌液再转移至50mL离心管中，4℃12000r/min离心10min，弃上清，使用1/2Hoagland营养液重新悬浮菌体，以1/2Hoagland营养液为对照，控制OD600在1.0左右，制成菌悬液，菌悬液现用现配。
小麦营养钵分别设置无盐组和盐处理组，2个组中又分为设置处理组和对照组。其中，无盐组中，菌处理组用1/2Hoagland营养液和枯草芽孢杆菌Gv-1菌悬液交替浇灌，对照组只用1/2Hoagland营养液浇灌；盐处理组中，菌处理组用NaCl浓度为170mmol/L的1/2Hoagland营养液和枯草芽孢杆菌Gv-1菌悬液交替浇灌，对照组只用NaCl浓度为170mmol/L的1/2Hoagland营养液浇灌。以上浇灌每次每钵浇20mL，2d一次。
测定小麦生长指标：小麦的鲜重、干重、株高、根长等。鲜重测量：取培养15天后的实验材料，清水冲洗掉根部土壤和蛭石，滤纸吸干表面水分，分析天平测定整株植物重量，至少取三株重复。干重测定：将测定过鲜重的植株在105℃下杀青20min，后80℃烘干直至恒重，约8h。株高测定：在培养容器中，从土壤表面测定至植株最高点的高度。根长测定：取出植株后从茎和根的分界点(一般为绿色和白色分界位置)到最长的根尖部分记作根长。
枯草芽孢杆菌Gv-1接种根系处理15天后，在没有盐胁迫的条件下，无盐组的对照组小麦株高均值为27.53cm，菌处理组小麦株高均值为30.2cm；在170mmol/LNaCl盐处理组中,对照组小麦株高均值为24.9cm，菌处理组的Gv－1菌株使小麦在盐胁迫中恢复株高，甚至略高于至无盐对照组水平，达到28.1cm。无盐组和盐处理组的对照组小麦根长分别为11.3和9.6cm，无盐组和盐处理组的菌处理组小麦根长达到13.7cm和13.8cm；无盐组的对照组小麦幼苗鲜重均值为0.68g，菌处理组小麦幼苗鲜重均值为0.81g，盐处理组的对照组小麦鲜重均值为0.46g，菌处理组小麦的鲜重均值为0.66g，与对照组相比增长明显。无盐组的对照组小麦干重均值为0.0744g，菌处理组为0.0923g，在盐处理条件下对照组小麦干重均值为0.0542g，菌处理组为0.0712g，菌株在盐处理条件下使小麦干重恢复到了无盐对照组水平。
实验证明，本发明能够显著促进小麦的生长，提高小麦高盐浓度下的抗逆性。
实施例3枯草芽孢杆菌Gv-1的发酵培养
1、枯草芽孢杆菌的发酵培养条件的优化
1.1发酵培养基的条件优化
先将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液，每次加水量为海滨锦葵块根重量3倍，得到海冰锦葵块根提取液。
将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基分别按照体积比100:0、70:30、60:40、40:60和80:20的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH，调节pH至9.0，121℃高压灭菌30min，得到5种发酵培养基。
将保存的枯草芽孢杆菌Gv-1接种于含有30mL的LB液体培养基的50mL三角瓶中，30℃、150r/min恒温振荡培养16至18h，至菌液OD600达到1.0，再将枯草芽孢杆菌菌液以1％的接种量分别接种于5种发酵培养基，37℃振荡培养72h，每隔24h动态测定OD600值。72h以后，取枯草芽孢杆菌发酵液稀释至10-7-10-9倍，涂布于普通计数琼脂平板，37℃培养24h，测定菌落总数，结果见表1。
表1发酵培养基的条件优化结果
表1结果表明，在菌液接种量1％、发酵温度37℃的条件下，发酵培养基中海滨锦葵块根提取液和普通肉汤培养基体积为80:20(4:1)，发酵时间72h，活菌数最多，达到1.64×109cfu/ml，芽孢率达到99％。
1.2发酵罐培养的条件优化
将海冰锦葵块根提取液、普通肉汤培养基和玉米粉按照体积比8:1:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH(还可以加入少许植物油作为消泡剂)，调节pH至7.0、8.0或9.0，121℃高压灭菌30min，得到3种pH值的发酵罐扩大培养培养基。
将步骤1.1最优条件下培养的枯草芽孢杆菌发酵液以12％、15％、18％的接种量分别接种于发酵罐内的3种扩大培养培养基中，35℃、37℃、39℃条件下，150r/min、200r/min、250r/min发酵48h，检测活菌量，结果见表2。
表2发酵罐培养的条件优化结果
组合 接种量/％ pH 温度/℃ 转速/(r/min) 活菌量/Log(cfu/mL)
1 12 9.0 35 150 9.876
2 12 8.0 37 200 8.522
3 12 7.0 39 250 7.817
4 15 9.0 37 250 9.926
5 15 8.0 39 150 8.960
6 15 7.0 35 200 7.984
7 18 9.0 39 200 9.729
8 18 8.0 35 250 8.821
9 18 7.0 37 150 7.469
表2结果表明，在发酵时间相同的条件下，接种量15％、发酵温度37℃、培养基pH9.0、转速250r/min，发酵罐中发酵液的活菌量最多，达到9.926Log(cfu/mL)。
实施例4含有枯草芽孢杆菌粉剂的制备
将发酵罐中的发酵液以流量400L/h加入自动排渣碟式分离机中离心，得到菌泥，将菌泥和菌泥载体(玉米粉)按照质量比1:2混合，再送入高效沸腾干燥机中烘干，高效沸腾干燥机的进风温度为70℃，烘干时间为3h，最后用粉碎机粉碎，得到含有枯草芽孢杆菌粉剂。测定结果表明，发酵液中菌体转移到粉剂中的比例可达71.2％。
实施例5含有枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料的制备
本发明含有枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，包括以下重量份的原料：玉米44份、豆粕45份、麦麸10份、枯草芽孢杆菌粉剂0.01-0.03份、预混料1份；所述预混料为每10千克预混料中含有VA5512U、VD640U、VK32.2U、VE20U、VB1227.6μg、VB25.5mg、D-泛酸14.8mg、烟酸30.3mg、胆碱500mg、铜50mg、铁100mg、锌50mg、锰10mg、碘0.85mg、硒0.25mg。
实验例
实验动物：选取相同品种、体质良好且日龄均为28日的杂交一代断奶仔猪96头，随机分为4个组，其中3组作为实验组，分别喂食本发明枯草芽孢杆菌粉剂重量份为0.01、0.025和0.03份的猪饲料(对应Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)，另外1组作为对照组，喂食普通市售猪饲料。喂食42d后，测定实验猪各项生长指标和粪便中的有益菌、有害菌数量，以及蛋白质、Ca、P消化情况。测定指标包括：初始重、终末重、净增重、平均日增重、采食量和料重比、粪便中的细菌总数，以及蛋白质、Ca、P消化率。数据采用SPSS17.0统计分析，组间采用Duncan法进行多重比较。所有数据均以平均数±标准误表示，结果见表3、表4、表5。
表3本发明猪饲料对断奶仔猪生产性能的影响
项目 对照组 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
初始重/kg 8.78±0.22 8.71±0.35 8.79±0.37 8.73±0.14
终末重/kg 19.01±0.11 20.65±0.26 20.49±0.25 20.49.±0.21
净增重/kg 10.23±0.12 11.94±0.10 11.70±0.24 11.76±0.13
平均日增重/g 243.57±3.21a 284.28±5.01b 278.57±6.01b 280.00±4.53b
头均耗料/kg 24.11±0.06 22.70±0.05 22.78±0.12 22.68±0.41
料重比 2.35±0.02a 1.90±0.02b 1.94±0.01b 1.92±0.04b
表3结果表明，实验组的仔猪和对照组的仔猪相比，平均日增重和料重比显著提高，差异明显。
表4本发明猪饲料对断奶仔猪肠道微生物的影响
表4结果表明，实验组的实验猪在试验期间内无死亡，对照组的仔猪病死率为8.33％。实验组仔猪粪便中有害微生物大肠杆菌数目和沙门氏菌数目都显著少于对照组(P<0.05)，而有益微生物乳酸杆菌和双歧杆菌均多于对照组，且差异性显著(P<0.05)。
表5本发明猪饲料对断奶仔猪消化率的影响
项目 对照组 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
蛋白质消化率 67.01±3.22a 69.12±2.97a 68.90±0.47a 70.85±1.22b
Ca消化率 37.98±2.90a 39.39±1.35 39.93±3.01 39.59±0.02
P消化率 96.22±3.01a 97.89±0.23 98.06±0.08 97.98±0.14
表5结果表明，实验Ⅰ组和Ⅱ组间均差异不显著但高于对照组。第Ⅲ组蛋白质消化率显著高于对照组(P<0.05)。实验组仔猪钙和磷的消化率各组间均无显著差异但高于对照组。
综上所述，本发明含有枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料能够充分发挥枯草芽孢杆菌Gv-1的作用，促进仔猪的生产性能和对蛋白质、Ca、P的消化吸收，改善仔猪肠道的微生态菌群，使肠道微生态系统处于最佳的平衡状态。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Gv-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCCNO：M2015766，保藏日期：2015年12月21日。
2.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，恒温振荡培养，至OD600达到1.0，得到枯草芽孢杆菌菌液，再将枯草芽孢杆菌菌液以1％的接种量接种于发酵培养基，37℃发酵24-72h。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的制备方法为：将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基按照体积比4-0.5:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH，调节pH至9.0，121℃高压灭菌30min。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述的海冰锦葵块根提取液的制备方法为：将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液即得；其中，每次加水量为海滨锦葵块根重量3倍。
5.一种含有如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的粉剂，其特征在于，所述的粉剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，恒温振荡培养，至OD600达到1.0，得到枯草芽孢杆菌菌液，再将枯草芽孢杆菌菌液以1％的接种量接种于发酵培养基，37℃发酵24-72h；
(2)将步骤(1)的枯草芽孢杆菌发酵液以12-18％的接种量接种于扩大培养培养基中，35-39℃、150-250r/min发酵48h；
(3)将步骤(2)的发酵液加入自动排渣碟式分离机中离心，得到菌泥，将菌泥和菌泥载体按照质量比1:2混合，再送入高效沸腾干燥机中烘干，最后用粉碎机粉碎即得。
6.根据权利要求5所述的含有枯草芽孢杆菌的粉剂，其特征在于，所述发酵培养基的制备方法为：将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基按照体积比4-0.5:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02％的(NH4)2SO4和0.04％的NaOH，调节pH至9.0，121℃高压灭菌30min；
所述的海冰锦葵块根提取液的制备方法为：将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液即得；其中，每次加水量为海滨锦葵块根重量3倍。
7.根据权利要求5或6所述的含有枯草芽孢杆菌的粉剂，其特征在于，步骤(3)中发酵液加入自动排渣碟式分离机的流量为400L/h，高效沸腾干燥机的进风温度为70℃，烘干时间为3h。
8.一种含有权利要求5所述的枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，其特征在于，所述的猪饲料包括以下重量份的原料：玉米44份、豆粕45份、麦麸10份、枯草芽孢杆菌粉剂0.01-0.03份、预混料1份；所述的预混料为每10千克预混料中含有VA5512U、VD640U、VK32.2U、VE20U、VB1227.6μg、VB25.5mg、D-泛酸14.8mg、烟酸30.3mg、胆碱500mg、铜50mg、铁100mg、锌50mg、锰10mg、碘0.85mg、硒0.25mg。
9.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在促进植物生长和提高植物高盐浓度下抗逆性方面的应用。
10.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在提高猪生产性能、吸收能力和调节肠道菌群方面的应用。
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