CN105557756B

CN105557756B - 利用甲基营养型芽孢杆菌nkg‑1实施的植物抑菌方法

Info

Publication number: CN105557756B
Application number: CN201610082878.3A
Authority: CN
Inventors: 葛蓓孛; 张克诚; 刘炳花; 刘艳; 赵文珺; 辛辛诺
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-02-05
Also published as: CN105557756A

Abstract

本发明公开了一种利用甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG‑1）实施的植物抑菌方法，使用所述甲基营养型芽孢杆菌NKG‑1的菌液制备成药剂，使用制得的甲基营养型芽孢杆菌药剂在植物生长期进行施药处理，抑制植物所患的病菌。利用该菌株实施的植物抑菌方法，能够抑制多种病原真菌和细菌，具有很好的防治效果，因此具有良好的应用前景。

Description

利用甲基营养型芽孢杆菌NKG-1实施的植物抑菌方法

技术领域

本发明涉及一种利用甲基营养型芽孢杆菌NKG-1实施的植物抑菌方法，具体涉及一种利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物抑菌方法，能够有效抑制病原菌的侵染。

背景技术

植物病害会给农业生产造成严重的经济损失，目前通常会对植物各个生长阶段施加农药防治病虫害，其中施加的主要是化学农药，具有施肥方便、见效快等特点。但是长期大量施用化学农药导致农药残留及环境污染，最终危害人类健康并破坏生态平衡，同时也使病原菌对各种化学杀菌剂产生了严重的抗药性。利用活体微生物进行生物防治因其对环境、生态及人类健康安全、无毒等优点得到了世界各国的广泛重视并发挥着越来越重要的作用。

芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称。芽孢杆菌属的细菌具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性；利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。此外，还具有在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用方便等优势而备受瞩目。不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供了保障。芽孢杆菌作为一种理想的生防微生物，逐渐成为近年来研究的热点并越来越引起人们重视。目前，用于防治植物病害的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus 1aterosporus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。

由于芽孢杆菌既具有广阔的开发应用前景，开发新筛选的未定种的芽孢杆菌及对新菌株的拮抗功能和抑菌作用进行鉴定是具有非常重要的意义的。

发明内容

针对现有技术中存在的需求，本发明的目的在于提供一种利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物抑菌方法，能够抑制多种病原真菌和细菌的侵染，具有很好的防治效果，因此具有良好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所利用的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strainNKG-1)，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC12055，保藏日期是2016年1月15日。

利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物抑菌方法，使用所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液制备成生物杀菌剂，使用制得的甲基营养型芽孢杆菌NKG-1生物杀菌剂在植物生长期进行施药处理，抑制病原菌的侵染。

进一步，所述病原菌引起的植物病害为番茄灰霉病、苹果轮纹病、苹果腐烂病、葡萄黑腐病、稻瘟病、辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、桃根霉软腐病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、棉花枯萎病、番茄叶霉病、芦笋茎腐病、玉米小斑病、烟草赤星病、棉苗疫病、花生青枯病或棉花角斑病。

进一步，所述病原菌为灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、黑腐皮壳菌、葡萄球座菌、稻巨座壳菌、辣椒炭疽菌、葫芦科刺盘孢菌、匍枝根霉菌、禾谷镰孢菌、禾谷丝核菌、尖镰孢菌、褐孢霉菌、天门冬拟茎点霉菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、链格孢菌、卵菌门疫霉菌、青枯假单胞杆菌或地毯草单胞菌锦葵变种。

进一步，所述植物为葡萄，所述病原菌为葡萄球座菌，在葡萄树新芽长出6-10英寸、开花前3-5d、开花后、开花后10-14d施药1次，之后每隔15d施药1次，共计9-10次。

进一步，所述植物为芦笋，所述病原菌为天门冬拟茎点霉菌，在芦笋抽芽前期、芦笋抽生期、正常生长期内间隔5-10d施药1次，共计施药8次；对初发少量轻病株，采用幼茎涂药浆的方法。

进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1生物杀菌剂是将菌液稀释制得的液剂，或将菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得的液剂，或将菌液制备成的药浆。

进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液稀释倍数为400、500、600或800倍，稀释倍数为稀释剂与甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液的体积比；

所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的可湿性粉剂稀释倍数为400、500、600或800倍，稀释倍数为稀释剂与甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的质量比；

所述药浆为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液100-200倍液混合面粉制得，稀释倍数为稀释剂与甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液的体积比，所述面粉与菌液100-200倍液的混合比例为质量比1：3-4。

进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×(10⁶-10⁹)cfu/mL。

进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×10⁷cfu/mL。

本发明利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物抑菌方法具有以下优点：

利用甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液制得的生物杀菌剂对灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、黑腐皮壳菌、葡萄球座菌、稻巨座壳菌、辣椒炭疽菌、葫芦科刺盘孢菌、匍枝根霉菌、禾谷镰孢菌、禾谷丝核菌、尖镰孢菌、褐孢霉菌、天门冬拟茎点霉菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、链格孢菌、卵菌门疫霉菌、青枯假单胞杆菌、地毯草单胞菌锦葵变种等都有明显的抑制作用，能够有效治疗这些病原菌引起的相应病害。

本发明属于生物防治，对环境无污染，没有农药残留，不会破坏生态平衡。

附图说明

图1为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(10μm级别)；

图2为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(2μm级别)；

图3为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(1μm级别)；

图4为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对禾谷丝核菌的抑菌实验效果照片；

图5为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对辣椒炭疽菌的抑菌实验效果照片；

图6为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对黑腐皮壳菌的抑菌实验效果照片；

图7为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对尖镰孢菌的抑菌实验效果照片；

图8为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对稻巨座壳菌的抑菌实验效果照片；

图9为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对禾谷镰孢菌的抑菌实验效果照片；

图10为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对葡萄球座菌的抑菌实验效果照片；

图11为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对葫芦科刺盘孢菌的抑菌实验效果照片；

图12为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对卵菌门疫霉菌的抑菌实验效果照片；

图13为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对葡萄座腔菌的抑菌实验效果照片；

图14为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对链格孢菌的抑菌实验效果照片；

图15为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对灰葡萄孢菌的抑菌实验效果照片；

图16为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对玉蜀黍平脐蠕孢菌的抑菌实验效果照片；

图17为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对天门冬拟茎点霉菌的抑菌实验效果照片；

图18为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对匍枝根霉菌的抑菌实验效果照片；

图19为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对褐孢霉菌的抑菌实验效果照片；

图20为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对地毯草单胞菌锦葵变种的抑菌实验效果照片；

图21为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对青枯假单胞杆菌的抑菌实验效果照片；

图22为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的系统发育分析图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达到预定技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图和较佳实施例，对本发明的结构、特征以及功效详细说明如下。

本发明所利用的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicusstrain NKG-1),是从吉林长白山地区分离获得的，已于2016年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为No.12055。

(一)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的分离与纯化

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)是从吉林长白山土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

从土壤中分离：称取土样1g，放入盛有99ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀30min，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混和均匀，以此类推分别制成10^-2、10^-3、10^-4不同稀释度的土壤溶液。取100μL土壤溶液涂布于TSA培养基平板上，每个稀释度做3个重复,28℃培养2-3d。挑取单菌落于TSA培养基平板上划线，定时观察菌落生长情况，然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别制作斜面标号保存于4℃冰箱。胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)配方：(g/L)胰蛋白胨15.0；大豆蛋白胨5.0；氯化钠5.0；琼脂15.0；pH值7.3±0.2；称取后，加热搅拌溶解于蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌，倒平板。

(二)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的形态观察

采用梯度稀释法制备strain NKG-1菌悬液，吸取30μL适宜浓度的菌悬液涂布于LB、NA、PDA培养基平板上进行单孢培养，24h-48h后对长出的单菌落的大小、形状、表面、边缘、颜色及透明度等培养特性进行观察。

在LB培养基上培养strain NKG-1菌株，采用插片培养法(阎逊初，1984)在光学显微镜下观察芽孢生长情况及形态特征，光学显微镜镜检时用镊子小心拔出盖玻片，有菌的一面朝下放在载玻片上直接观察即可；电子显微镜镜检时先将盖玻片放入2-4％戊二醛固定液中固定1-2天，0.1M pH7.2PBS缓冲液洗，用1％OsO4固定后1-2小时，再用重蒸水冲洗30分钟，随后用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇梯度脱水，每级15-20分钟，样品脱水后用醋酸异戊酯处理，CO₂临界点干燥，干燥好的样品粘贴在样品台上，用离子溅射仪表面喷金，喷金后样品在扫描电镜下扫描，观察芽孢形态拍照并记录。

通过培养和观察发现菌体呈短杆状，芽孢椭圆形，位于菌体中央或稍偏，芽孢大小在1.5μm-2.2μm范围内。菌落为圆形，LB培养基表面和边缘均光滑，NA、PDA培养基表面有褶皱(NA固体培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂17.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。)，不透明，呈白色。革兰氏染色阳性。(电子显微镜扫描图片见图1、图2、图3)

(三)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的生理生化特性分析

挑取单菌落进行形态观察及生理生化测定，生理生化测定参照东秀珠等方法，分别设计吲哚试验、淀粉水解试验、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、尿素试验、产H₂S试验、葡萄糖产气试验及乳糖利用试验，充分验证其菌株的生理生化特征。生理生化特性测定，吲哚试验和甲基红试验为阴性，能利用柠檬酸盐和尿素，有淀粉水解反应发生，能产生H₂S，能利用乳糖产酸产气。

(四)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的16srRNA基因序列鉴定

将单菌落接种于LB培养基中，培养经过24h小时后，取1μL进行菌落PCR验证。用于菌液PCR扩增的引物如下：正向引物F：5'-GCAGTCGAGCGGACAGAT-3'；反向引物R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系如下:2×TaqPCRmastermix12.5μL，正向F引物10.5μL，反向R引物0.5μL，菌液模板DNA 1μL，ddH₂O 10.5μL，总体系25μL。PCR扩增条件为:94℃5min；94℃1min；51℃30s；72℃1min，35个循环；72℃10min。电泳采用琼脂糖凝胶电泳，核酸染料为EB，Maker为DL2000。最后将PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。所得序列NCBI GeneBank核酸数据库中相关序列进行比对分析。用正向引物F和反向引物R进行16SrRNA进行PCR扩增，得到1397kb的片段。通过比对该序列与甲基营养型芽孢杆菌16S rRNA基因在相应区域核苷酸序列相似性均为100％。

将获得的芽孢杆菌strain NKG-116s rRNA序列同GenBank中已有的18条不同种的芽孢杆菌16s rRNA序列进行比较，其中选择差异较大的组外序列为根瘤菌(Rhizobiumsp)。通过DNAMAN version 6.0(LynnonBiosoft)对核苷酸和相应氨基酸序列进行分析对比，用Bioedit对全长核苷酸序列进行编辑整理。MEGA(version 5.0)进行Clustal W多序列比对和系统进化分析；通过neighbour-joining的方法构建进化树，bootstrap设置为1000次重复。结果表明，获得的芽孢杆菌strain NKG-1其系统发育分析与甲基营养型芽孢杆菌strainR1B和strain MER处于同一分支，说明其亲缘关系较近，结合形态结构和生理生化特性，我们将该菌株鉴定为甲基营养性芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)，命名为Bacillus methylotrophicus strain NKG-1。

芽孢杆菌strain NKG-1系统发育如图22所示，图中：

Bacillus methylotrophicus甲基营养型芽孢杆菌strain NKG-1；

Bacillus methylotrophicus甲基营养型芽孢杆菌strainR1B；

Bacillus methylotrophicus甲基营养型芽孢杆菌strainMER；

Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌；

Bacillus inaquosus缓病芽孢杆菌；

Bacillus popilliae日本金龟子芽孢杆菌；

Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌；

Bacillus pumilus短小芽孢杆菌；

Bacillus cirulans环状芽胞杆菌；

Bacillus coagulans凝结芽孢杆菌；

Bacillus firmus坚强芽孢杆菌；

Bacillus cereus蜡状芽胞杆菌；

Bacillus megaterium巨大芽胞杆菌；

Bacillus A52009芽孢杆菌A52009；

Bacillus sphaericus球形芽孢杆菌；

Bacillus larvae幼虫芽孢杆菌；

Bacillus macerans浸麻芽孢杆菌；

Bacillus polymyxa多粘芽孢杆菌；

Rhizobium sp.根瘤菌。

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的基因序列见序列表。

(五)甲基营养型芽孢杆菌菌株(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)发酵过程

LB液体培养基培养基，配方为：蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，酵母膏10.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2。

大量液体发酵培养基配方(质量百分含量)：黄豆粉2.5％，玉米粉3.5％，NaCl0.1％，CaCO₃0.2％，其余为水。

大量固体发酵过程：

(1)将甲基营养型芽孢杆菌菌株NKG-1的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养18h得到种子液；

(2)按1.0％比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28-30℃，培养时间24h，通风比1：0.9。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达10⁶-10⁹cfu/ml。

(3)将甲基营养型芽孢杆菌菌株发酵液与微粉碳酸钙基质进行混合均匀，干燥，经干燥后发酵液菌数>10⁸cfu/ml。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1。

本发明所应用的甲基营养型芽孢杆菌的菌液浓度为1×(10⁶-10⁹)cfu/mL。以下实施例优选采用甲基营养型芽孢杆菌的菌液浓度为1×10⁷cfu/mL。

(六)甲基营养型芽孢杆菌菌株(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)抑菌活性测定

对真菌的抑制作用

平板对峙试验

将已培养7d的病原真菌(灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、黑腐皮壳菌、葡萄球座菌、稻巨座壳菌、辣椒炭疽菌、葫芦科刺盘孢菌、匍枝根霉菌、禾谷镰孢菌、禾谷丝核菌、尖镰孢菌、褐孢霉菌、天门冬拟茎点霉菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、链格孢菌、卵菌门疫霉菌)用5mm打孔器打孔，将菌饼移到PDA培养基中央，在离病原菌等距离的2侧分别放入浸有甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液(已在37℃培养24h)和无菌水的滤纸片，24℃培养养7d，观察NKG-1菌液对病原真菌生长的抑制效果。

结论：甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对上述病原真菌都有良好的拮抗作用，其中对苹果腐烂病原菌、葡萄黑腐病原菌、苹果腐烂病原菌及番茄灰霉病原菌的拮抗作用尤为明显。

对菌丝生长的影响

甲基营养型芽孢杆菌发酵培养滤液的制备将甲基营养型芽孢杆菌按1:100的比例接种于LB培养基中，37℃、220r/min震荡24h。收集发酵液，离心(10000r/min，4℃)，将上清液用0.22μm滤膜过滤除菌得到无菌发酵液。

采用菌丝生长速率法，检测拮抗芽孢杆菌对番茄灰霉病、番茄叶霉病、稻瘟病、辣椒炭疽病、苹果轮纹病、苹果腐烂病、黄瓜炭疽病、小麦纹枯病、小麦赤霉病、芦笋茎腐病、玉米小斑病、棉花枯萎病、葡萄黑腐病、烟草赤星病、桃根霉软腐病、棉苗疫病供试病原真菌菌丝生长的影响。

在无菌条件下，取制备好的芽孢杆菌无菌发酵液10mL和融化的PDA培养基90mL混匀，在无菌培养皿中制成含发酵液的平板培养基，以不加发酵液的培养基为对照，在每个培养基表面放入1个直径5mm的供试病原真菌菌饼，每处理3次重复，24℃恒温培养3-4d后，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率：菌丝生长抑制率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。

表1.甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对病原真菌菌丝生长抑制率％

结论：由上表可以看出，甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌株无菌发酵液对供试的番茄灰霉病原菌、番茄叶霉病原菌、稻瘟病原菌、辣椒炭疽病原菌、苹果轮纹病原菌、苹果腐烂病原菌、黄瓜炭疽病原菌、小麦纹枯病原菌、小麦赤霉病原菌、芦笋茎腐病原菌、玉米小斑病原菌、棉花枯萎病原菌、葡萄黑腐病原菌、烟草赤星病原菌、桃根霉软腐病原菌、棉苗疫病原菌菌丝生长都有明显的抑制作用，其中对苹果轮纹病原菌、葡萄黑腐病原菌、苹果腐烂病原菌以及番茄灰霉病原菌抑制效果较好，抑制率分别为93.33％、92.74％、92.00％、81.67％。

对细菌的抑制作用

花生青枯病是由青枯假单胞杆菌侵染引起的病害，棉花角斑病是由地毯草单胞菌锦葵变种侵染引起的病害。

将青枯假单胞杆菌和地毯草单胞菌锦葵变种用LB培养基37℃,220r/min，震荡24h。将菌液配成1×10⁷cfu/mL的菌悬液并转接到新的LB培养基平板，制成含病原菌的培养基。待吹干菌液后，在平板两侧对称放置两个牛津杯，试验组放入200uL甲基营养型芽孢杆菌菌液，对照组放入200uL无菌水，重复3组。将平板置于28℃恒温培养箱，培养24小时，测量抑菌圈直径。

结论：甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液对青枯假单胞杆菌和地毯草单胞菌锦葵变种都有明显的抑制作用，抑菌圈清晰且透明，其对青枯假单胞杆菌的抑菌圈平均直径达25mm,对地毯草单胞菌锦葵变种的抑制直径为21mm。

甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对地毯草单胞菌锦葵变种的抑菌实验效果如图20所示；甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对青枯假单胞杆菌的抑菌实验效果如图21所示。

实施例1：葡萄黑腐病抑菌方法

挑取对峙培养的边缘菌丝，显微观察发现，NKG-1对葡萄黑腐病的抑菌作用主要表现为对菌丝和孢子的影响。NKG-1的各种代谢产物(包括抗菌蛋白、细菌素、抗生素、各种细胞壁降解酶等物质)破坏病原菌菌丝壁结构，引起菌丝膨大、畸变、扭曲、菌丝壁消解等，致使分生孢子中间缢缩，细胞壁溶解，原生质外泄。

甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对葡萄黑腐病菌的抑菌实验效果如图10所示。

表2.甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对葡萄黑腐的菌丝抑制作用

(一)甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌株发酵液离体防治葡萄黑腐病效果的测定结果

先将健康无病的葡萄果实进行表面消毒处理，用灭过菌的解剖刀在葡萄表面做“T”形伤口处理，然后按以下4种处理方法进行试验：

方法1，先接种病原菌后喷NKG-1菌液；

方法2，先喷NKG-1菌液后接种病原菌；

方法3，不接种病原菌；

方法4即对照，接种病原菌喷清水。

每个处理选取40个NKG-1果实，重复3次。处理后将NKG-1置于灭过菌的烧杯中，用保鲜膜覆盖，保持一定的湿度，置于27℃的恒温培养箱中，4d后检查核桃发病情况，按如下公式计算发病率及防治效果：

4d后调查发现，先接种甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液，后接种病原菌，病果数为3个，发病率仅为7.5％，防治效果达92.5％。先接种病原菌，后接种甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液，病果数为6个，病果率为15％，防治效果为85％。不接种病原菌的无发病，接种病原菌喷施清水的全部发病。结果说明甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌株发酵液对葡萄黑腐病的离体防治具有良好的效果，具有预防保护和病害治疗的双重作用。

表3.甲基营养型芽孢杆菌NKG-1发酵液离体防治葡萄黑腐病效果的观测

(二)甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌株对葡萄黑腐病田间防治效果的测定结果

在葡萄种植园开展了田间防治葡萄黑腐病的防效试验。种植园的土壤为砂土，品种为5年生无核白，树势中等偏弱，葡萄黑腐病病害发生严重。试验共设4个处理，即分别用10亿cfu/g甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂400、600和800倍和清水(对照)处理，每个处理重复3次。在葡萄树新芽长出6-10英寸、开花前3-5天、开花后、开花后10-14天、之后每隔15d施药1次，共计9-10次。于采收前第5天进行调查，每个处理随机调查300个果实，计算病果率和防治效果。整个试验过程中开展1次调查。

采果前第5天调查结果显示，对照的病果率为52.12％，其果实发病率明显高于各处理。用10亿cfu/g甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂400、600、800倍处理(即处理1、处理2、处理3)的病果率分别为7.76％、9.8％、14.2％，防治效果分别为85.5％、81.79％、73.62％。方差分析结果表明：处理1与处理2的效果最好，在P＜0.05水平上无显著差异，与处理3之间在P＜0.05水平上都具有显著性差异。因此，在葡萄的整个生长季节施药9-10次，可有效控制葡萄黑腐病的发生。

甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的制备方法为：将甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的发酵液过滤并浓缩，在浓缩液中添加微粉碳酸钙基质并混合均匀，干燥，经喷雾制成粉末。干燥后的混合物中菌数>10⁸cfu/ml，发酵液与微粉碳酸钙基质的质量比为1:1。

表4.不同10亿cfu/g甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂处理下葡萄黑腐病的田间药效试验结果

实施例2：芦笋茎腐病抑菌方法

甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对芦笋茎腐病菌的抑菌实验效果如图17所示。

表5.甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对芦笋茎腐的菌丝抑制作用

甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌株对芦笋茎腐病的温室盆栽防治效果测定

田间试验共设3个处理:A.生防菌剂NKG-1500倍液；B.25％甲霜灵可湿粉600倍液；C.空白对照。每个小区14m²，小区间设3行隔离区，各处理按完全随机区组排列，重复3次，全试验共9个小区。试验前按试验方案分好小区，开好隔离沟，每公顷使用量为15000mL的1×10⁷cfu/mL的生防菌剂NKG-1。生防菌剂NKG-1500倍液，在芦笋抽芽前期、芦笋抽生期、正常生长期内间隔5-10天1次，共计喷施8次左右。(另外，对初发少量轻病株,还可采用幼茎涂药浆的办法控制病害蔓延，药浆是上述生防菌剂NKG-1的100-200倍液混合面粉制得，面粉与生防菌剂NKG-1的100-200倍液的混合比例为质量比1：3-4。)25％甲霜灵可湿粉600-800倍液共喷3-4次,隔5-10天1次。生长后期进行调查，分别统计病害的病害严重度，并且计算防效。

通过田间药效试验结果说明菌剂NKG-1防治芦笋茎腐的田间药效结果与化学药剂25％甲霜灵可湿粉剂相当，与清水对照CK相比均体现了良好的防治效果。

表6.甲基营养型芽孢杆菌剂NKG-1对芦笋茎腐田间药效试验结果

上面所述只是为了说明本发明，应该理解为本发明并不局限于以上实施例，符合本发明思想的各种变通形式均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 利用甲基营养型芽孢杆菌NKG-1实施的植物抑菌方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1）

<221> 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1）的16S rRNA基因序列

<400> 1

gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60

acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120

ggttgtctga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180

acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc 240

gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360

tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420

gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540

tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600

cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660

gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720

gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780

tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840

gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900

tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960

ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc1080

agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca1200

aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc1260

agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc1380

cgaagtcggt gaggtaa 1397

Claims

1.利用甲基营养型芽孢杆菌NKG-1（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1）实施的植物抑菌方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码是CGMCC12055，使用所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液制备成生物杀菌剂，使用制得的甲基营养型芽孢杆菌NKG-1生物杀菌剂在植物生长期进行施药处理，抑制病原菌的侵染，所述病原菌引起的植物病害为番茄灰霉病、苹果轮纹病、苹果腐烂病、葡萄黑腐病、稻瘟病、辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、桃根霉软腐病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、棉花枯萎病、番茄叶霉病、芦笋茎腐病、玉米小斑病、烟草赤星病、棉苗疫病、花生青枯病或棉花角斑病，所述病原菌为灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、黑腐皮壳菌、葡萄球座菌、稻巨座壳菌、辣椒炭疽菌、葫芦科刺盘孢菌、匍枝根霉菌、禾谷镰孢菌、禾谷丝核菌、尖镰孢菌、褐孢霉菌、天门冬拟茎点霉菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、链格孢菌、卵菌门疫霉菌、青枯假单胞杆菌或地毯草单胞菌锦葵变种。

2.如权利要求1所述的植物抑菌方法，其特征在于，所述植物为葡萄，所述病原菌为葡萄球座菌，在葡萄树新芽长出6-10英寸、开花前3-5d、开花后、开花后10-14d施药1 次，之后每隔15 d 施药1 次，共计9-10 次。

3.如权利要求1所述的植物抑菌方法，其特征在于，所述植物为芦笋，所述病原菌为天门冬拟茎点霉菌，在芦笋抽芽前期、芦笋抽生期、正常生长期内间隔5-10d施药1次，共计施药8次；对初发少量轻病株，采用幼茎涂药浆的方法。

4.如权利要求1所述的植物抑菌方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1生物杀菌剂是将菌液稀释制得的液剂，或将菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得的液剂，或将菌液制备成的药浆。

5.如权利要求4所述的植物抑菌方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液稀释倍数为400、500、600或800倍，稀释倍数为稀释剂与甲基营养型芽孢杆菌NKG-1菌液的体积比；

6.如权利要求1所述的植物抑菌方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×（10⁶-10⁹）cfu/mL。

7.如权利要求6所述的植物抑菌方法，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为1×10⁷cfu/mL。