CN110184224A - 一株表皮葡萄球菌及其应用 - Google Patents

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    • C12R2001/45Staphylococcus epidermidis

Abstract

本发明涉及一株表皮葡萄球菌及其应用。该表皮葡萄球菌已于2019年3月20日在中国典型培养物保藏中心保藏,样品名称为Staphylococcus epidermidis SA001,保藏编号为CCTCC No:M 2019182,该菌株分离于水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)生长的NA平板上。本发明的表皮葡萄球菌SA001对水稻白叶枯病菌和水稻瘟病菌表现出抑菌作用,同时表皮葡萄球菌对水稻条斑病菌、香蕉枯萎病菌、豇豆斑疹病菌以及辣椒斑点病菌也具有抑菌效果。本发明结果表明该菌株具有广谱的抑菌能力,为防治水稻白叶枯病和稻瘟病提供了良好的生防资源,为挖掘新型的微生物菌剂打下了基础。

Description

一株表皮葡萄球菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,尤其是涉及一株表皮葡萄球菌及其应用。
背景技术
水稻是我国主要的粮食作物之一,粮食的产量和质量关系到我国国民的生活水平;但其生产量和质量会受到各种病害的影响,如水稻白叶枯病、水稻纹枯病及稻瘟病等等。近年来,水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight,BLB)成为影响水稻产量和质量的重要细菌性病害之一;BLB是由稻黄单胞菌种下的致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae,Xoo)引起的。水稻白叶枯病分布于世界水稻各个种植区,特别是在亚洲和非洲尤为流行;在我国海南、广东、江苏等南方水稻种植区广泛流行,并且在发病严重时其会造成20%-60%的水稻总产量的减产(Ou, S,H.,Rice diseases.CommonwealthAgricultural Bureau,Kew Surrey[J].1985)。稻瘟病在农业生产上是一种为害水稻的真菌性病害,它是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的。该病害在全世界水稻种植国家均有发生,在我国该病害的发生较为严重,会造成水稻减产50%左右(邢红雨.探究水稻稻瘟病的发生规律及综合防治[J].农民致富之友,2019(01):61.)。
水稻白叶枯病、稻瘟病以及水稻纹枯病被称为水稻上的“三大病害”,都能危害我国的水稻,造成水稻产量和品质的下降。在农业生产上,防治白叶枯病和稻瘟病的方法有选育抗病品种、培育无病壮秧以及化学防治等措施。其中,在防治水稻白叶枯病的过程中,培育抗性基因水稻品种应用取得了较好的防治效果,如已报道的抗性基因有xa5(Suh J P,Jeung J U,Noh T H,et al.Development of breeding lines with three pyramidedresistance genes that confer broad-spectrum bacterial blight resistance andtheir molecular analysis in rice[J].Rice,2013,6(1):5.)、Xa23(Wang C, Fan Y,Zheng C,et al.High-resolution genetic mapping of rice bacterial blightresistance gene Xa23[J].Molecular Genetics and Genomics,2014,289(5):745-753.)和Xa21(Chen S,Lin X,Xu C J,et al.Improvement of Bacterial Blight Resistanceof `Minghui 63',an Elite Restorer Line of Hybrid Rice,by Molecular Marker-Assisted Selection[M].2000:239-244.)等抗性基因。对稻瘟病具有抗性的水稻品种有苏秀 867、淮稻5号等(唐勇,胡卫伟.水稻稻瘟病发生情况及综合防治技术初探[J].农民致富之友,2019(04):58.),但防治该病害还是依赖于化学药剂的使用。为了能够更好的防治这两种病害,我国采取以植保方针为主并结合微生物防治方法的角度来解决病害发生与发展;微生物防治具有不易使病原菌产生抗性、且特异性好等优点,其对生态环境也是较为友好(李兴龙,李彦忠.土传病害生物防治研究进展[J].草业学报,2015,24(03):204-212.)。因此,寻找能够拮抗白叶枯病菌和稻瘟病菌的微生物资源是一项长期且重要的工作。目前,随着国家大力提倡和推广生物防治措施,从农业生态环境当中,筛选能够抑制水稻白叶枯病菌和稻瘟病菌的拮抗微生物,并将其研制成微生物菌剂用来防治这两种病害的发生。因此,拮抗微生物的筛选也逐渐成为病害防治的研究重点。
目前,尚无关于表皮葡萄球菌与白叶枯病菌和稻瘟病菌之间的相关性文献报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株表皮葡萄球菌及其应用。本发明提供的表皮葡萄球菌对水稻白叶枯病菌和稻瘟病菌具有拮抗活性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
一株表皮葡萄球菌,该表皮葡萄球菌已于2019年3月20日在中国典型培养物保藏中心保藏,样品名称为Staphylococcus epidermidis SA001,保藏编号为CCTCC No:M2019182。
所述表皮葡萄球菌对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo) 和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)均具有较好的拮抗作用。
所述水稻白叶枯病菌包括:PXO99A、XZ35、YC18、YC11、LYG46、YNB04-1、 JL3、AH1、JL1、JL4。
所述表皮葡萄球菌对多株水稻条斑病菌具有拮抗活性。
所述水稻条斑病菌包括:RS105、AHB3-7、ZJB01-25、HNB3-17、RS85、 HANB12-26、HNB07-3、JSB1-39。
所述表皮葡萄球菌对病原黄单胞菌具有拮抗活性。
所述病原黄单胞菌包括豇豆枯萎病菌(Xanthomonas.axonopodispv.vignicola)、香蕉细菌性枯萎病菌(Xanthomonas campestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌 (Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)。
所述表皮葡萄球菌的菌落为白色,形成圆形凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,不透明;革兰氏染色结果呈现的结果为阳性。
所述表皮葡萄球菌对碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI 磷酸水解酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、α-葡萄糖甙酶具有酶活性;能够利用甘油、核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、柳醇、麦芽糖、蔗糖、松叁糖、D-松二糖产生酸。
所述表皮葡萄球菌分离于水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的平板上。
所述表皮葡萄球菌作为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻条斑病菌以及一些病原黄单胞菌拮抗菌的应用。可以作为对水稻白叶枯病菌和稻瘟病菌具有防治效果的生防菌株。
本发明所采取的技术方案是:
(1)菌株的分离与鉴定:从水稻白叶枯病菌生长的NA平板中发现一株能够抑制白叶枯病菌生长的菌株,将该菌株在NA平板上进行划线纯化;利用细菌通用引物进行16SrRNA基因的扩增,PCR产物送测后获得的基因序列在NCBI中进行比对分析,并使用MEGA(6.0)软件该菌株的系统发育树,明确该菌株的分类地位。
(2)生理生化测定:固体平板上培养,该菌株的菌落为白色,形成圆形凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,不透明。光学显微镜下观察,该菌株的细胞呈球形或稍呈椭园形,革兰氏染色为阳性。生理生化测试结果显示,该表皮葡萄球菌对碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶等8种酶具有酶活性;能够利用甘油、核糖、葡萄糖、果糖等10种糖醇类碳源产生酸。
(3)通过牛津杯法进行检测,发现该表皮葡萄球菌SA001对9株水稻白叶枯病水稻白叶枯病菌包括:PXO99A、XZ35、YC18、YC11、LYG46、YNB04-1、JL3、 AH1、JL1、JL4。
(4)通过牛津杯法检测,发现该表皮葡萄球菌SA001对9株水稻条斑病菌和 3株其他病原黄单胞菌具有拮抗活性;水稻条斑病菌包括:RS105、AHB3-7、 ZJB01-25、HNB3-17、RS85、HANB12-26、HNB07-3、JSB1-39;3种不同病原黄单胞菌包括:豇豆枯萎病菌(Xanthomonas.axonopodis pv.vignicola)、香蕉细菌性枯萎病菌(Xanthomonascampestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)。表明菌株SA001具有广谱的抑菌活性。
(5)通过平板对歭培养方法,检测了表皮葡萄球菌SA001对3种病原真菌(稻瘟病菌和小麦赤霉病菌,灰霉病菌)的拮抗作用,发现其对稻瘟病菌具有明显的拮抗活性。
(6)本发明所述的表皮葡萄球菌SA001已于2019年3月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学),保藏名称为表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisSA001,保藏号为CCTCC No:M 2019182。
与现有技术相比,本发明的表皮葡萄球菌SA001对水稻白叶枯病菌和水稻瘟病菌表现出的抑菌作用,同时表皮葡萄球菌水稻条斑病菌、香蕉枯萎病菌、豇豆斑疹病菌以及辣椒斑点病菌也具有的抑菌效果。本发明结果表明该菌株具有广谱的抑菌能力,为防治水稻白叶枯病和稻瘟病提供了良好的生防资源,该菌在防治水稻病害上具有重要的意义,其生防潜力有待于进一步开发,为挖掘新型的微生物菌剂打下了基础。
附图说明
图1.菌株SA001的显微镜(1000X)观察照片及菌落形态。
图2.菌株SA001基于16S rRNA基因构建的系统发育树。
图3.表皮葡萄球菌SA001对8株不同的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)(A-I依次为空白对照、PXO99A、XZ35、YC18、YC11、LYG46、 YNB04-1、JL3、AH1)的拮抗效果图。
图4.表皮葡萄球菌SA001对9株水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)拮抗效果图;A-I依次为RS105、YNB01-3、ZJB01-25、HNB3-17、 RS85、HANB12-26、HNB07-3、JSB1-39。
图5.表皮葡萄球菌SA001对豇豆枯萎病菌(Xanthomonas.axonopodis pv.vignicola)的拮抗效果图。
图6.表皮葡萄球菌SA001对香蕉细菌性枯萎病菌(Xanthomonas campestris pv.musacearum)的拮抗效果图。
图7.表皮葡萄球菌SA001对辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)的拮抗效果图。
图8.表皮葡萄球菌SA001对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的拮抗效果图,其中,A:稻瘟病菌;B:表皮葡萄球菌SA001与稻瘟病菌的对歭培养效果图。
图9.表皮葡萄球菌SA001对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的拮抗效果图,其中,A:小麦赤霉病菌;B:表皮葡萄球菌SA001与赤霉病菌的对歭培养效果图。
图10.表皮葡萄球菌SA001对灰霉病菌(Botrytis cinerea)的拮抗效果图,其中,A:灰霉病菌;B:表皮葡萄球菌SA001与灰霉病菌的对歭培养效果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,而不构成对本发明的限制。
以下实施例中所用的菌种培养基如下:
牛肉膏蛋白胨培养基NA(g/L):牛肉浸膏3g,多聚蛋白胨5g,蔗糖10g,酵母粉1g,琼脂粉15g,加入水溶解,最后定容至1000mL,调节pH 7.0-7.2,分装后高压灭菌(121℃、20min)。
PDA固体培养基(g/L):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15g,加入水溶解,最后定容至1000mL,pH 7.0-7.2,高压灭菌(121℃、20min)。
实施例1、菌株SA001的分离、筛选与纯化
1、菌株来源
所使用的病原菌株均是由本实验室保存的菌株,且均是已经公开的菌株。
2、拮抗菌株的获得
(1)拮抗菌株的发现
在实验室中,涂布水稻白叶枯病菌的NA平板上长出能够抑制白叶枯病菌生长的菌株。
(2)菌株的纯化与保存
采用平板划线法:将能够抑制白叶枯病菌生长的菌落挑出,在新的NA平板上进行划线,置于28℃生化培养箱中,倒置培养12h以上,挑取单菌落,并编号为 SA001。将菌株SA001接种在NA液体培养基中,在28℃、180rpm摇床中培养 12h后,吸取1mL菌株的发酵液与1mL 50%的无菌甘油,轻轻振荡混匀,置于-80℃长期保存。
(3)拮抗实验
采用牛津检测法:以水稻白叶枯病菌PXO99A为指示病原菌,接种在NA液体培养基中,28℃、180rpm摇床中培养12h,将OD600统一调整为2.0,然后吸取 100μL菌悬液与NA固体培养基充分混匀后,倒板,然后在NA平板中央放置牛津杯(6*8*10),并接入100μL的供试菌SA001(OD600为2.0),每个处理三个重复;以接灭菌水为对照。置于28℃的生化培养箱中正置培养24h,观察抑菌圈直径大小,记录菌株SA001对PXO99A的拮抗活性,用于后续研究。
实施例2、菌株SA001的16S rRNA基因鉴定
使用细菌的通用引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’,并以菌株SA001的基因组DNA为模板;按照表1中比例配制25μL PCR反应体系,进行PCR反应:
表1Taq聚合酶链式反应体系
PCR反应基本条件设置为:95℃预变性10min;95℃变性45s,56℃退火45s, 72℃延伸90s,共32个循环;72℃预延伸5min。PCR反应结束后,将菌株SA001 扩增的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检验,并利用凝胶成像仪检测图像,之后将PCR产物原液送天一辉远生物科技有限公司(武汉)进行测序。
对获得的测序结果运用DNA Star软件进行分析,根据获得16S rRNA序列(如 SEQID NO.1所述),同时在NCBI网站上进行BLAST比对,确定近缘细菌菌株的分类地位。比对结果显示:菌株SA001与表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 具有99.85%的亲缘关系。使用MEGA6.0构建菌株SA001的系统发育树,结果见附图2。
实施例3、菌株SA001的形态牲及生理生化鉴定
本发明的菌株SA001形态观察,如图1所示,发现菌株SA001的菌落为白色,形成圆形凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,不透明;革兰氏染色结果呈现的结果为阳性。本发明的菌株SA001的生理生化测试结果显示,该表菌株对碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、α-葡萄糖甙酶等8种酶具有酶活性;能够利用甘油、核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、柳醇、麦芽糖、蔗糖、松叁糖、D-松二糖等10种糖醇类碳源产生酸(见表2和表3)。
表2菌株SA001生理生化特性–酶活
+:阳性反应;-:阴性反应;W:弱阳性反应
表3菌株SA001生理生化特性—利用碳源产酸
+:阳性反应;-:阴性反应;W:弱阳性反应
结合实施例2的系统发育树和实施例3的形态特征、生理生化的结果,最终将菌株SA001鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),并命名为表皮葡萄球菌SA001。
实施例4、表皮葡萄球菌SA001的拮抗谱测定
1)表皮葡萄球菌SA001对8株水稻白叶枯病菌的拮抗活性测定
将8株水稻白叶枯病菌和供试表皮葡萄球菌SA001分别接种于NA液体培养基中,28℃、200rpm/min摇床中培养12h后,调整发酵菌液的OD600值均为2.0 左右;各吸取100μL的病原发酵菌液与NA固体培养基充分混匀后,制成带病菌的平板(含病菌的NA平板),然后在含病菌的NA平板上中央放置一个灭菌的牛津杯,向其点接100μL的供试表皮葡萄球菌SA001,每个处理三个重复,以接灭菌水(ddH2O)的为对照。待平板晾干后,置于28℃的培养箱中培养24-48h,观察是否有抑菌圈出现,并记录抑菌圈大小(表4),效果图见附图3。
表4表皮葡萄球菌对白叶枯病菌的抑菌直径(mm)
-:代表无抑菌作用或者抑菌直径小于15mm
2)表皮葡萄球菌SA001对9株水稻条斑病菌的拮抗活性测定
在NA液体培养基中分别接种9株水稻条斑病菌和供试表皮葡萄球菌SA001, 28℃、200rpm/min的摇床中培养12h后,调整各发酵菌液的OD600值均为2.0左右;各吸取100μL的病原发酵菌液与NA固体培养基充分混匀后,制成带病菌的平板(含病菌的NA平板),然后在含菌的NA平板上中央放置一个灭菌的牛津杯,向其点接100μL的供试表皮葡萄球菌SA001,每个处理三个重复,以接灭菌水 (ddH2O)的为对照。待平板晾干后,置于28℃的培养箱中培养24-48h,观察是否有抑菌圈出现,并记录抑菌圈直径大小(表5),抑菌效果见附图4。
表5表皮葡萄球菌对条斑病菌的抑菌直径(mm)
-:代表无抑菌作用或者抑菌直径小于15mm
3)表皮葡萄球菌SA001对其它不同病原细菌的拮抗活性测定
将3种不同的病原细菌和供试表皮葡萄球菌SA001分别接种于NA液体培养基中,28℃、200rpm/min摇床中培养12h后,调整发酵菌液的OD600值均为2.0 左右;各吸取100μL的病原发酵菌液与NA固体培养基充分混匀后,倒平板,然后在NA平板上中央放置一个灭菌的牛津杯,向其点接100μL的供试表皮葡萄球菌SA001,每个处理三个重复,以接灭菌水(ddH2O)的为对照。待平板晾干后,置于28℃的培养箱中培养24-48h,观察是否有抑菌的作用,并记录有抑菌作用的抑菌效果。结果显示菌株SA001对豇豆枯萎病菌、香蕉细菌性枯萎病菌和辣椒斑点病菌具有拮抗效果,拮抗效果图如附图5、附图6、附图7。
4)表皮葡萄球菌SA001对真菌性病害的拮抗活性测定
采用平板对峙培养法,将水稻稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、灰霉病菌分别在PDA 培养基上培养,待病原菌长满平板后,用打孔器在平板边缘打取菌块备用,取其中一个菌饼,菌丝面朝下,接种到新的PDA平板中央,采用十字交叉法在菌饼四周等距离(20mm)放置无菌的牛津杯,每个牛津杯中点接100μL的供试表皮葡萄球菌SA001,每个处理3个重复,同时,以不接表皮葡萄球菌SA001只接病原真菌的平板为对照。在25℃培养箱中进行培养,5天后观察并记录抑菌现象,抑菌情况如附图8、附图9和附图10。结果显示,表皮葡萄球菌SA001对稻瘟病菌具有显著的抑制效果,抑菌率为48.8%。
由此,利用本发明提供的一株表皮葡萄球菌SA001,对稻黄单胞菌的两个致病变种:水稻条斑病菌和水稻白叶枯病菌均具有的拮抗作用,同时对稻温病菌、豇豆枯萎病菌、香蕉细菌性枯萎病菌及辣椒斑点病菌也表现较好的抑制效果,进而说明该菌株具有广谱的抑菌能力。为细菌性病害和真菌性病害的生物防治提供了新资源。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一株表皮葡萄球菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)
<400> 1
agtcgagcga acagacgagg agcttgctcc tctgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
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agtctgcaac tcgactatat gaagctggaa tcgctagtaa tcgtagatca gcatgctacg 1320
gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380
cgaagccggt ggagtaacca t 1401

Claims (10)

1.一株表皮葡萄球菌,其特征在于,该表皮葡萄球菌已于2019年3月20日在中国典型培养物保藏中心保藏,样品名称为Staphylococcus epidermidis SA001,保藏编号为CCTCCNo:M 2019182。
2.根据权利要求1所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述表皮葡萄球菌对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)均具有较好的拮抗作用。
3.根据权利要求2所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述水稻白叶枯病菌包括:PXO99A、XZ35、YC18、YC11、LYG46、YNB04-1、JL3、AH1、JL1、JL4。
4.根据权利要求1所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述表皮葡萄球菌对多株水稻条斑病菌具有拮抗活性。
5.根据权利要求4所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述水稻条斑病菌包括:RS105、AHB3-7、ZJB01-25、HNB3-17、RS85、HANB12-26、HNB07-3、JSB1-39。
6.根据权利要求1所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述表皮葡萄球菌对病原黄单胞菌具有拮抗活性。
7.根据权利要求6所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述病原黄单胞菌包括豇豆枯萎病菌(Xanthomonas.axonopodis pv.vignicola)、香蕉细菌性枯萎病菌(Xanthomonascampestris pv.musacearum)、辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)。
8.根据权利要求1所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述表皮葡萄球菌的菌落为白色,形成圆形凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,不透明;革兰氏染色结果呈现的结果为阳性。
9.根据权利要求1所述一株表皮葡萄球菌,其特征在于,所述表皮葡萄球菌对碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、α-葡萄糖甙酶具有酶活性;能够利用甘油、核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、柳醇、麦芽糖、蔗糖、松叁糖、D-松二糖产生酸。
10.如权利要求1所述表皮葡萄球菌的应用,其特征在于,所述表皮葡萄球菌作为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻条斑病菌、以及病原黄单胞菌拮抗菌的应用。
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