CN113957160A - 检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用。所述标志物为包含如SEQ ID NO:1～5所示核苷酸序列的一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)的16S rDNA序列。所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。所述引物对可用于制备检测膀胱癌的试剂盒。本发明可用于膀胱癌筛查，从而实现无创低成本的膀胱癌诊断和监测，操作简单、灵敏度高、检测周期快，灵敏度和特异性分别达到75％和93.8％。

Description

检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测领域，具体地，涉及一种检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用。

背景技术

膀胱癌是男性中第四大常见的癌症(占男性实性恶性肿瘤的7％)，近10年来，伴随烟草消费增加、工业化水平提高以及人口老龄化，中国人膀胱癌的发病率不论是男性还是女性，都呈增长趋势。现有的膀胱癌诊断和监测的技术主要是膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查，膀胱镜检查具有侵入性，脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。

膀胱癌监测的金标准是白光内镜，然而，这个方法具有侵入性且较为昂贵，可导致病人显著不适，同时还由于需要在监测过程中反复的进行内镜检测，导致昂贵的费用支出。这些因素会导致膀胱癌病人的依从性降低。因此，应用方便准确的生物标记能够极大推动膀胱癌诊断和复发进展的监测过程。

尿液肿瘤标记物在概念上是非常适合进行监测的，因为尿液是直接与肿瘤相接触的，并且肿瘤会将代谢物释放到尿中。在低危膀胱癌中，生物标记物能够协助减少内镜的检测频率。而对于高危患者，生物标记能够更加及时地发现肿瘤的早期复发及进展。

目前针对膀胱癌尿液的研究主要集中在脱落细胞、尿上清cfDNA、microRNA、外泌体等生物标志物的筛查，而尿液菌群在泌尿系统肿瘤的作用是一个新兴的研究领域，尿液及膀胱在过去被认为是无菌的，但通过16S rDNA测序发现，尿液中有细菌存在。目前有限的通过尿液菌群筛查膀胱癌的文献报道中，提到的筛查方法都是基于测序，检测成本高，灵敏度和特异性低，例如张桂豪在《基于高通量测序技术膀胱癌的尿液菌群特征分析》(南方医科大学，硕士学位论文，2019年)发现葡萄球菌科在膀胱癌组与对照组中的丰度分别为12.2％与10.2％，但并未公开尿液中葡萄球菌的种属、检测其的目的基因及相应的引物对。

发明内容

为解决现有技术中缺少高灵敏度和高特异性的膀胱癌强相关性的尿液菌群检测标记物的技术问题，本发明提供了一种检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用。发明人通过qPCR技术对膀胱癌病人的尿液菌群DNA进行定量检测，筛选得到新的膀胱癌检测标志物，该标志物能够用于膀胱癌筛查，从而实现无创低成本的膀胱癌诊断和监测。

本发明的第一方面提供一种检测膀胱癌的标志物，所述标志物为包含如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)的16S rDNA序列。

优选地，所述的16S rDNA序列为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

所述的葡萄球菌属例如：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.a)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus.e)和腐生葡萄球菌(Staphylococcus.s)等。

本发明的第二方面提供一种检测如第一方面所述的标志物的引物对，包括正向引物和反向引物。

所述的正向引物的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示，所述的反向引物的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。

优选地，所述的正向引物的序列如SEQ ID NO:8所示，反向引物的序列如SEQ IDNO:9所示。

本发明的第三方面提供一种葡萄球菌属(Staphylococcus)微生物的鉴定方法，包括以下步骤：

以已提取的DNA为模板，使用本发明第二方面所述的引物对进行扩增，当扩增结果为阳性时，则判定所述样品具有葡萄球菌属的微生物。

可选地，上述步骤之前还包括从样品中提取DNA的步骤。

优选地，所述扩增采用PCR、实时荧光定量PCR，所述实时荧光定量PCR优选包括使用SYBRGreen或探针。

使用所述的SYBRGreen进行实时荧光定量PCR的反应液体系包括SYBR Premix ExTaq II、ROX Reference Dye、上游引物、下游引物、DNA模板和纯水。

其中，所述的上游引物的浓度为0.2～1.2μmol，下游引物的浓度为0.2～1.2μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

优选地，所述的上游引物的浓度为1μmol，下游引物的浓度为1μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

使用所述的SYBRGreen进行实时荧光定量PCR的反应条件可为本领域常规；优选地，所述反应条件可为95℃变性30秒，95℃退火5秒，60℃延伸30秒，循环数为30～50次，例如循环40次。

本发明的第四方面提供一种检测膀胱癌的试剂盒，其包括本发明第二方面所述的引物对。

所述试剂盒还包括探针或SYBRGreen、基因芯片；所述探针为可与所述引物对配合，从而可对所述16S rDNA序列进行定量分析的探针例如TaqMan探针。

其中，所述的上游引物的浓度为0.2～1.2μmol，下游引物的浓度为0.2～1.2μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

优选地，所述的上游引物的浓度为1μmol，下游引物的浓度为1μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

所述的试剂盒可用于实验室检测、尿液中葡萄球菌属微生物含量异常升高的疾病检测。

所述试剂盒通过检测待测样本中的葡萄球菌属的微生物评估受检者的膀胱癌患病风险。

所述待测样本为尿液；优选地，所述尿液来自哺乳动物受检者，例如人类。

所述的膀胱癌包括非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润膀胱癌，即根据TNM分期的原发肿瘤(T)、区域性淋巴结(N)和远处转移(M)。

本发明的第五方面提供一种检测本发明第一方面的标志物的水平的试剂在制备检测膀胱癌的诊断剂中的应用。当标志物的水平可检测时，该标志物来源的受试者患有膀胱癌的风险较高；当标志物的水平不可测得时，该标志物来源的受试者患有膀胱癌的风险较低。

本发明的第六方面还提供了本发明第二方面所述的引物对、第四方面所述的试剂盒在制备检测膀胱癌的诊断剂中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明将不同生理状况下微生物组成分的改变作为一种新的用于癌症诊断及预后监测的手段，通过尿液菌群检测实现癌症的检测和监测，无创、成本低、操作简单、灵敏度高、检测周期快，灵敏度和特异性分别达到75％和93.8％，相较于膀胱癌临床现有筛查方法(尿脱落细胞学筛查)更为准确方便，为广大人群提供快速简便的膀胱癌诊断的有效措施。

附图说明

图1为实施例1中SEQ ID NO:1引物对Sta2检测结果的boxplot和ROC曲线；

图中：(a)为boxplot图，(b)为ROC曲线。

图2为实施例1中SEQ ID NO:1引物对Sta1检测结果的boxplot和ROC曲线；

图中：(a)为boxplot图，(b)为ROC曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

本实施例基于以下研究结果：采用16S rDNA扩增子测序对46例膀胱癌患者和47健康个体的尿液菌群分析显示，菌群多样性和整体组成在两组间有显著性差异，而现有文章中尿液菌群多样性和整体组成在两组间无显著差异，这可能与现有文章中所用样本量少有关。通过对两组间存在显著丰度差异的菌属的鉴定，发现葡萄球菌属(Staphylococcus)与膀胱癌有很强的相关性。

根据前期研究得到的膀胱癌相关的微生物(即葡萄球菌属)制定特异序列筛选方案，挑选丰度最高的葡萄球菌属16S基因序列作为特异性序列，得到的特异性序列如表1的SEQ ID NO:1～5所示。

表1尿液中葡萄球菌属的16SrDNA测序获得的特异性序列

以下在有case-control的人群中对葡萄球菌的特异性基因进行定量PCR(qPCR)检测，确定基因的量，分析并验证这些基因预测膀胱癌的概率，采用膀胱癌患者和正常人来验证筛选出的16S rDNA特异性序列。对于Sta1引物对，采集24例膀胱癌患者和23例正常人的尿液样本；对于Sta2引物对，采集16例膀胱癌患者和16例正常人的尿液样本。

包括以下步骤：

1、引物设计：采用oligo7软件对筛选得到的葡萄球菌属特异性序列进行引物设计，在尽可能满足引物设计重要原则的基础上，要求上下引物扩增产物在70bp～200bp，每个基因设计各2～6套引物。

2、引物测试：采用普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测其条带，若目的条带大小与预期一致且条带单一，说明引物具有良好的特异性。

下表2为通过引物测试得到的特异性序列SEQ ID NO:1的两套引物(Sta1和Sta2)。

表2用于扩增本发明特异性序列的引物信息

3、质控品的订购：质控品为由商业公司进行合成的基因序列(南京金斯瑞，标准载体pUC57)，收到质控品后采用Q-bit定量，-20度保存；使用时进一步等梯度稀释到工作液浓度。

4、qPCR检测：根据本领域常规流程进行试剂配制及上机操作。

4.1试剂：SYBR Premix Ex Taq^TM II(Perfect Real Time)(货号：DRR081A)；

ROX Reference Dye(TAKARA，RR820A)。

4.2仪器：qPCR仪(Applied Biosystem)

4.3配制反应液：将引物、DNA模板、ROX Reference Dye、SYBR Premix Ex Taq II配制成10μL反应液，加入到96孔反应板上，具体如下：

所述的上游引物的浓度为1μmol，下游引物的浓度为1μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

以SEQ ID NO:1特异性序列为例，上游引物为如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的序列，下游引物为如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的序列。

4.4qPCR扩增：将96孔板放在qPCR仪上，进行扩增检测，反应条件如下：

5、分析评估：计算所述的葡萄球菌属16S基因标志物预测膀胱癌的灵敏度和特异性，具体方法如下：

本方法采用标准曲线法，以SEQ ID NO:1特异性序列为例，阳性标准品即为将SEQID NO:1特异性序列克隆到载体上的质粒。将收到的质粒标准品干粉离心后稀释，测定其浓度后换算为对应的拷贝数，然后进行梯度稀释，稀释6个梯度作为标准曲线(标准曲线的横坐标为拷贝数，纵坐标为CT值)。

使用qPCR软件(StepOne Software v2.1)导出结果,根据qPCR的定量结果使用R语言对数据进行分析作图，按照膀胱癌患者样本、健康人样本制作box plot和ROC曲线。

如图1的(a)所示，该图为引物对Sta2的箱形图，显示两组样本数据的分散情况；图中横坐标代表膀胱癌患者和健康人两组样本，纵坐标代表富集度，每个点代表qPCR检测结果经过进一步计算对应的值。

图中每个箱的最下方的一条线代表下四分位数；中间的一条线代表中位数；最上方的一条线代表上四分位数；两个人群样本的中位数差距越大，代表两个人群样本区分的越开，该检测标志物的检测效率越高。图中癌症患者的中位数与下四分位数重合，可以看出两个人群样本的中位数差距比较大，区分效果比较好。

如图1的(b)所示，该图1为引物对Sta2的接收者操作特征曲线(ROC曲线)；图中横坐标代表特异性，纵坐标代表敏感性；中间的对角线代表AUC＝0.5的情况，图中得到的AUC为0.836，说明该检测标志物检测效果较好。图中圈起来的点即为灵敏度和特异性最佳的点，对应的灵敏度和特异性分别为75％和93.8％，对应的qPCR的cut off值为3.018(qPCR得到的quantity值小于等于该值即可判断为膀胱癌病人，大于该值可判断为正常，此处qPCR所得的quantity值，即为根据标准曲线得出的绝对值)。

如图1所示，为引物对Sta2的box plot和ROC曲线，该引物对的AUC为0.836，灵敏度75％，特异性93.8％。

如图2所示，为引物对Sta1的box plot和ROC曲线，该引物对的AUC为0.491，灵敏度47.8％，特异性75％。

特异性序列的qPCR检测具体数据见表3和表4：

表3 16例正常人和16例病人的Sta2-qPCR检测结果

表4 24例正常人和23例病人的Sta1-qPCR检测结果

注：表中“-”代表检测结果高于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果低于cut off值，判断结果为膀胱癌肿瘤患者。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 检测膀胱癌的标志物及检测该标志物的引物对及其应用

<130> P20012507C

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 320

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgta ggcggttttt 60

taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggaaaactt 120

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gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cgctgatgtg cgaaagcgtg 240

gggatcaaac aggattagaa accccagtag tccaagtcgg agcggtctta ggaagacaat 300

gtcataaatc aactccttgg 320

<210> 2

<211> 320

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 2

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taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggaaaactt 120

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actccatgga acaactcctt 320

<210> 3

<211> 320

<212> DNA

<213> Staphylococcus epidermidis

<400> 3

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taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggaaaactt 120

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gggatcaaac aggattagat accccagtag tccaagtcgg aggcggtctt aggaagacaa 300

tccttttgta caactccttg 320

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 4

tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgta ggcggttttt 60

taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggaaaactt 120

gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgcag agatatggag 180

gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cgctgatgtg cgaaagcgtg 240

gggatcaaac aggattagaa accccagtag tccaagtcgg agcggtctta ggaagacaat 300

gtaagagctc aactccttgg 320

<210> 5

<211> 320

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 5

tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgta ggcggttttt 60

taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tggaaaactt 120

gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgcag agatatggag 180

gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cgctgatgtg cgaaagcgtg 240

gggatcaaac aggattagaa accccagtag tccaagtcgg aggccggtct taggaagaca 300

agagaagaac acaactcctt 320

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sta-F1

<400> 6

aactggaaaa cttgagtgca ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sta-R1

<400> 7

catcagcgtc agttacagac ca 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sta-F2

<400> 8

aattccatgt gtagcggtga 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sta-R2

<400> 9

actactgggg tttctaatcc tg 22

Claims (10)

1.一种检测膀胱癌的标志物，其特征是，所述标志物为包含如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)的16S rDNA序列。

2.如权利要求1所述的标志物，其特征是，所述的16S rDNA序列为如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

3.一种检测如权利要求1或2所述的标志物的引物对，其特征是，所述的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示；

优选地，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:8所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:9所示。

4.一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括如权利要求3所述的引物对。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括探针或SYBRGreen、基因芯片；所述探针为可与所述引物对配合，从而对所述16S rDNA序列进行定量分析的探针例如TaqMan探针。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA polymerase、镁离子或钙离子溶液中的一种或多种，所述试剂盒优选可用于实时荧光定量PCR。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征是，用于所述的实时荧光定量PCR的上游引物的浓度为0.2～1.2μmol，下游引物的浓度为0.2～1.2μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征是，所述上游引物的浓度为1μmol，下游引物的浓度为1μmol，DNA模板的浓度为0.8ng/μl。

9.如权利要求4～8中任一项所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒通过检测待测样本中的葡萄球菌属的微生物评估受检者的膀胱癌患病风险。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征是，所述待测样本为尿液；优选地，所述尿液来自哺乳动物，例如人类。

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