CN114134231B - 一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志物及其应用 - Google Patents
一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，具体涉及一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志物及其应用。本发明将SEC61G基因、AGAP2基因、AVIL基因、FKBP9P1基因、DCTN2基因、CDK4基因、EGFR基因、TSPAN31基因同时组合作为生物标志物，以穿刺组织样本或者患者脑脊液为检测对象，采用qPCR的方法进行检测，系统的检测和分析不同时期的脑胶质瘤患者ecDNA中的相关基因的表达差异，动态监测脑胶质患者ecDNA上相关基因的变化，进行脑胶质瘤的早期诊断，准确率可达到87％，在区分早期脑胶质瘤患者的应用中具有快速、高准确度、高特异性的效果，与影像学检测相结合，可进一步提高脑胶质瘤早期诊断的敏感性，降低假阴性率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，具体涉及一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志物及其应用。
背景技术
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为Ⅰ-Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为低级别脑胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别脑胶质瘤。我国脑胶质瘤发病率为5-8/10万，5年病死率在肿瘤类疾病中仅次于胰腺癌和肺癌。在过去的几十年里，尽管在手术切除、辅助放化疗方面取得了一定进展，但胶质瘤的综合治疗仍然面临着巨大挑战。由于胶质瘤病程发展快速且易复发，在肿瘤发生发展过程中进行早期筛查和实时监测对延长患者的总生存期起着关键作用。
ecDNA(extrachromosomal DNA)是近期肿瘤学领域研究的热点。最早于上世纪70年代ecDNA就已经在癌细胞中被发现，只是受限于当初的检测技术未明确它的致癌机理。美国加州大学圣地亚哥分校Ludwig癌症研究所的Paul Mischel教授领导的研究团队发现，大量的癌基因并不在染色体上，而是会从染色体上脱落下来，变成一种小型的DNA，称为染色体外DNA(ecDNA)。这种ecDNA在肿瘤中是广泛存在的，自身能够执行中心法则，携带着大量原癌基因，ecDNA往往可以高达几十甚至几百个拷贝，大量转录癌基因产物，从而推动肿瘤的进展，与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，ecDNA可以作为一种潜在的生物标记物进行肿瘤的预测。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志组合物，包括SEC61G基因、AGAP2基因、AVIL基因、FKBP9P1基因、DCTN2基因、CDK4基因、EGFR基因、TSPAN31基因。
前期研究表明，上述八个基因均在脑胶质瘤患者的肿瘤组织以及脑脊液中呈现高表达，且其表达值与对照样本(非脑胶质瘤患者的或非脑胶质瘤的样)中的表达比值在统计学上具有显著的意义，但是ecDNA上SEC61G、AGAP2、AVIL、FKBP9P1、DCTN2、CDK4、EGFR、TSPAN31几乎不再正常组织和血液中存在，且其彼此独立，不存在连锁不平衡，因此判断其有望用于评估个体罹患脑胶质瘤的风险。进一步经过实验证实，采用上述八个基因用于脑胶质瘤的诊断，其诊断准确率可达到87％以上。
本发明的目的之二在于提供上述基因标志组合物在制备脑胶质瘤检测试剂中的应用。
本发明的目的之三在于提供上述基因标志组合物的检测试剂在制备脑胶质瘤检测试剂中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种用于检测脑胶质瘤的引物和探针，包括SEC61G基因引物探针组、AGAP2基因引物探针组、AVIL基因引物探针组、FKBP9P1基因引物探针组、DCTN2基因引物探针组、CDK4基因引物探针组、EGFR基因引物探针组、TSPAN31基因引物探针组。
具体地，SEC61G基因引物探针组：
上游引物为：TGCAGTTTGTTGAGCCA，如SEQ ID NO:1所示，
下游引物为：AGAAGCCAATGAATCCC，如SEQ ID NO:2所示，
探针序列为：CCTTTACAAACTGCCGACT，如SEQ ID NO:3所示；
AGAP2基因引物探针组：
上游引物为：CCACTCAGCTGCATCCACT，SEQ ID NO:4所示，
下游引物为：AGCTCCCGGTGACCAAC，SEQ ID NO:5所示，
探针序列为：ACTACTCTTCTTCCCTCCCGTCCT，SEQ ID NO:6所示；AVIL基因引物探针组：
上游引物为：CCCCAGCCAAGGCACA，SEQ ID NO:7所示，
下游引物为：CCCGCCACAAGTCTCC，SEQ ID NO:8所示，
探针序列为：CTGTTTTCCGCCGCAGCTTC，SEQ ID NO:9所示；
FKBP9P1基因引物探针组：
上游引物为：TCTCAGAACCGCACGTTT，SEQ ID NO:10所示，
下游引物为：ACCACAATCCTTCGCTT，SEQ ID NO:11所示，
探针序列为：CCATCCCAGGAATCACGTAGC，SEQ ID NO:12所示；
DCTN2基因引物探针组：
上游引物为：ATGAAACTAGCGACCTACCTGA，SEQ ID NO:13所示，
下游引物为：CCTTGAACTTGTCATAGGCAG，SEQ ID NO:14所示，探针序列为：CCGCATCGAACTCCGCTTG，SEQ ID NO:15所示；
CDK4基因引物探针组：
上游引物为：TTTGTGGCCCTCAAGAGTGT，SEQ ID NO:16所示，
下游引物为：TCCAGTCGCCTCAGTAAAGC，SEQ ID NO:17所示，探针序列为：CCTTCCCATCAGCACAGTTCGT，SEQ ID NO:18所示；EGFR基因引物探针组：
上游引物为：ATTCCGAGACGAAGCCAC，SEQ ID NO:19所示，
下游引物为：GACACTTCTTCACGCAGGT，SEQ ID NO:20所示，
探针序列为：CATGCTCTACAACCCCACCACGTA，SEQ ID NO:21所示；
TSPAN31基因引物探针组：
上游引物为：CATGTCTGGCTATTAACCGAA，SEQ ID NO:22所示，
下游引物为：TGTGAGGTTGAATAAGCCACAA，SEQ ID NO:23所示，
探针序列为：ATGAGCAACAAGACTCGGGAT，SEQ ID NO:24所示。
其中，探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团。
本发明的目的之五在于提供上述引物和探针在制备脑胶质瘤检测试剂中的应用。
本发明的目的之六在于提供一种脑胶质瘤检测试剂盒，其特征在于，包括上述的检测引物和探针。
本发明以穿刺组织样本或者患者脑脊液为检测对象，采用qPCR的方法进行检测，系统的检测和分析不同时期的脑胶质瘤患者ecDNA中的相关基因的表达差异，动态监测脑胶质路患者ecDNA上相关基因的变化，具有低创、高效、敏感的特点，可用于脑胶质瘤的临床辅助检测，延长脑胶质瘤患者生存期。
其具体的检测方法包括以下步骤：
(1)疑似脑胶质瘤患者样本的获取；
(2)疑似脑胶质瘤患者脑脊液或者组织穿刺样本ecDNA的提取与纯化；
该步骤中具体是采用荧光定量PCR法检测疑似脑胶质瘤患者样本与对照样本中ecDNA上SEC61G、AGAP2、AVIL、FKBP9P1、DCTN2、CDK4、EGFR、TSPAN31生物标志物(即受损染色体上线性SEC61G、AGAP2、AVIL、FKBP9P1、DCTN2、CDK4、EGFR、TSPAN31基因脱落下来的碎片随机地缝合在一起，组装形成的染色体外环状DNA)的表达量，并将疑似脑胶质瘤患者样本生物标记物的表达量与正常样本的生物标记物表达量相比较进行关联分析；该步骤中的扩增体系和扩增程序为经过大量实验优化后获得的扩增体系和扩增程序。
(3)ecDNA生物标志物SEC61G、AGAP2、AVIL、FKBP9P1、DCTN2、CDK4、EGFR、TSPAN31的组合进行表达检测和关联性分析；
(4)受检者样本进行结果：
该步骤中是将脑胶质瘤患者样本与对照样本表达量检测结果进行ROC曲线分析，获得对应每个基因的阈值，进而根据阈值进行脑胶质瘤患者样本的结果判读。
发明人经过大量的研究，最终确定将上述八个基因同时组合作为生物标志物可以准确的进行脑胶质瘤的早期诊断，准确率可达到87％，在区分早期脑胶质瘤患者的应用中具有快速、高准确度、高特异性的效果，与影像学检测相结合，可进一步提高脑胶质瘤早期诊断的敏感性，降低假阴性率。
附图说明
图1为本发明实施例1中脑胶质瘤患者与健康人样本基因检测结果；
图2为实施例1中EC61G、AGAP2、AVIL、FKBP9P1、DCTN2、CDK4、EGFR、TSPAN31基因的ROC曲线；
图3为实施例2中标志物基因在不同细胞系中的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不仅仅只用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1脑胶质瘤患者的穿刺样本或者脑脊液样本与健康人样本的检测
收集40例脑胶质瘤患者的穿刺样本或者脑脊液样本及20例非脑胶质瘤患者样本，提取ecDNA，采用所述qPCR方法进行SEC61G，AGAP2，AVIL，FKBP9P1，DCTN2，CDK4，EGFR，TSPAN31基因的检测和测定。具体方法如下所示：
(1)ecDNA样本的提取
(a)获取患者的穿刺样本或者脑脊液样本，后转移入1.5ml离心管，加入200μl细胞裂解液(10mM Tris-cl(PH8.0)，0.1mol/L EDTA，0.5％SDS、15mMNaCl)，轻轻上下颠倒混匀数次，室温静置1-5min，待细胞充分裂解，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)；
(b)加入350μl中和缓冲液(Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，轻轻上下颠倒混合数次，充分混匀，避免剧烈震荡。室温下12000g离心10min；
(c)小心吸取上清转移到插入收集管的离心吸附柱内，室温下12000g离心1min，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中；
(d)加入500μl漂洗液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，80％乙醇(Ethanol))于离心吸附柱中，室温下12000g离心30s，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中；
(e)加入500μl漂洗液于离心吸附柱中，室温下12000g离心30s，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中，将离心吸附柱开盖再次离心2min，彻底除去残余漂洗液。
(f)小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心管中，向硅胶吸附膜的中央加入100μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)；1mM EDTA(pH7.5))，室温放置1min后，12000g离心1min收集所需要的DNA；
(g)向(f)步骤中所得的收集液中加入5Units的外切酶(exoⅢ)和1mmol的ATP，涡旋震荡混匀，37℃孵育3h。
(h)向(g)混合液中加入终浓度为0.5mol/L的EDTA，70℃加热30min灭活，即获取所需的ecDNA。
(i)所获取的ecDNA存放于2-8℃，如果要长期存放，可以放置在-20℃。
(2)qPCR检测
分别将8个基因分为2组，每组4个基因，分别将4个基因的引物对以及相应的探针按照一定的浓度进行混合，将混合好的特异性引物加入ecDNA提取液，然后在ABI 7500荧光定量仪中进行扩增反应，获得每个样品的Ct值，并对结果进行分析。所述的扩增体系总体积为20μL，扩增体系的组分、浓度或含量如下：
表1各基因对应的引物及探针序列
表2 qPCR扩增反应终浓度
| 试剂 | 终浓度 |
| EPI HS taq | 0.75U/20μL |
| Buffer | ～ |
| MgCl2 | 3.5mM |
| dNTP | 10mM |
| SEC61G-F | 0.15μM |
| SEC61G-R | 0.1 5μM |
| SEC61G-Probe | 0.1μM |
| AGAP2-F | 0.2μM |
| AGAP2-R | 0.2μM |
| AGAP2-Probe | 0.15μM |
| AVIL-F | 0.15μM |
| AVIL-R | 0.15μM |
| AVIL-Probe | 0.1μM |
| FKBP9P1-F | 0.2μM |
| FKBP9P1-R | 0.2μM |
| FKBP9P1-P | 0.2μM |
| DCTN2-F | 0.15μM |
| DCTN2-R | 0.15μM |
| DCTN2-P | 0.2μM |
| CDK4-F | 0.3μM |
| CDK4-R | 0.3μM |
| CDK4-P | 0.3μM |
| EGFR-F | 0.2μM |
| EGFR-R | 0.2μM |
| EGFR-P | 0.15μM |
| TSPAN31-F | 0.25μM |
| TSPAN31-R | 0.25μM |
| TSPAN31-P | 0.2μM |
| 模板DNA | 10～100ng/20μL |
| dd H2O | ～ |
表3扩增程序
(3)样品阈值的获得：
受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curver，ROC曲线)分析目的基因的诊断价值：将脑胶质瘤患者脑脊液或者组织穿刺样本与非脑胶质瘤样本ecDNA的ct值带入计算，获得多对灵敏度及1-特异性值，绘制ROC曲线。根据约登指数(敏感度+[1-(1-特异性))计算Cut-off值，由计算得到的Cut-off值判断样品的阳/阴性。
按照脑胶质瘤患者样本和非脑胶质瘤样本的基因检测结果绘制ROC曲线，根据ROC曲线结果获得各基因的Cut-off值，为后续患者的诊断提供依据。其中脑胶质瘤患者样本与非脑胶质瘤样本基因表达结果如图1所示，各基因的ROC曲线如图2所示。
由数据分析可知，AGAP2基因的Cut-off值为35，曲线下面积AUC为0.832，说明结果可信。AVIL基因的Cut-off值为37，AUC为0.895，结果较为可信。FKBP9P1基因的Cut-off值为36，曲线下面积AUC为0.505，结果可信度较高。DCTN2基因的Cut-off值为37，曲线下面积为0.832，结果可信。CDK4基因的Cut-off值为38，曲线下面积为0.833，EGFR基因的Cut-off值为35，曲线下面积为0.849，结果可信。TSPAN31基因的Cut-off值为38，曲线下面积为0.883，SEC61G基因的Cut-off值为35，曲线下面积为0.891，结果均可信。
(4)结果判读：
研究发现，40个脑胶质瘤患者样本中大多数样本均检测到3～8个基因成阳性，少数样本检测到1-2个基因呈阳性，没有样本8个基因呈全阳性状态。非脑胶质瘤患者样本中，少数几个样本检测到0-3个基因呈阳性，有的样本均呈现8个基因全阴性。因此，将检测到3个及以上基因为阳性时则判定该样本阳性，只检测到1-2个基因为阳性的样本或所有样本均阴性时则判定该样本为阴性。
实施例2 ecDNA的生物标志物在脑胶质瘤细胞株中的验证
选用脑胶质瘤细胞株(HF3016、GBM39、HF3177、HK296、HK359等细胞株均能从ATCC购买得到)进行检测方法的可行性分析，同时设立其它的细胞系的ecDNA 293T细胞株均能从ATCC购买得到)做为阴性对照，水(H20)做为空白对照，对ecDNA上的标志物基因AGAP2，AVIL，FKBP9P1，DCTN2，CDK4，EGFR，TSPAN31，SEC61G按照实施例1中所述的方法进行检测与验证。
不同细胞系中各标志物基因检测结果如图3所示。根据每个基因的cut-off对细胞系样本进行检测，发现5个脑胶质瘤细胞系中呈现阳性的基因基本都有3-6个，对照组中293T细胞的基因成阴性，空白对照中无起峰，此细胞系验证结果表明本发明的基因组合可靠，准确性高。
实施例3 ecDNA的生物标志物基因在疑似脑胶质瘤样本中的检测
收集疑似脑胶质瘤患者的样本20例(来源于就诊广州军区武汉总医院患者的穿刺组织样本或者脑脊液)，按照上述方法检测AGAP2，AVIL，FKBP9P1，DCTN2，CDK4，EGFR，TSPAN31，SEC61G基因的表达情况，结果见下表4所示：
表4疑似脑胶质瘤患者样本检测结果
由表4可见，在20例疑似脑胶质瘤患者中，SEC61G基因的阳性率为50％(10/20)，AGAP2基因的阳性率为25％(5/20)，AVIL基因的阳性率为25％(5/20)，FKBP9P1基因的阳性率为30％(6/20)，DCTN2基因的阳性率为20％(4/20)，CDK4基因的阳性率为35％(7/20),EGFR基因的阳性率为35％(7/20)，TSPAN31基因的阳性率为20％(4/20)。
将有3个或3个以上基因检测阳性的样本定义为脑胶质瘤样本，则共有8个样本检测阳性。随后对此20例疑似患者进行随访，发现有7例病人诊断为脑胶质瘤(87.5％，7/8)，而此7例患者均含有3个及3个以上基因表达阳性。说明通过对疑似脑胶质瘤患者脑脊液或者穿刺样本ecDNA上SEC61G，AGAP2，AVIL，FKBP9P1，DCTN2，CDK4，EGFR，TSPAN31标志物基因检测可以进行脑胶质瘤的辅助判断。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志物及其应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 1
tgcagtttgt tgagcca 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 2
agaagccaat gaatccc 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 3
cctttacaaa ctgccgact 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 4
ccactcagct gcatccact 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 5
agctcccggt gaccaac 17
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 6
actactcttc ttccctcccg tcct 24
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 7
ccccagccaa ggcaca 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 8
cccgccacaa gtctcc 16
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 9
ctgttttccg ccgcagcttc 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 10
tctcagaacc gcacgttt 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 11
accacaatcc ttcgctt 17
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 12
ccatcccagg aatcacgtag c 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 13
atgaaactag cgacctacct ga 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 14
ccttgaactt gtcataggca g 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 15
ccgcatcgaa ctccgcttg 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 16
tttgtggccc tcaagagtgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 17
tccagtcgcc tcagtaaagc 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 18
ccttcccatc agcacagttc gt 22
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 19
attccgagac gaagccac 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 20
gacacttctt cacgcaggt 19
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 21
catgctctac aaccccacca cgta 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 22
catgtctggc tattaaccga a 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 23
tgtgaggttg aataagccac aa 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Synthesis)
<400> 24
atgagcaaca agactcggga t 21
Claims (7)
1.一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志组合物，其特征在于，所述基因标志组合物由SEC61G基因、AGAP2基因、AVIL基因、FKBP9P1基因、DCTN2基因、CDK4基因、EGFR基因和TSPAN31基因组成。
2.权利要求1所述的基因标志组合物在脑胶质瘤检测试剂制备中的应用。
3.权利要求1所述的基因标志组合物的检测试剂在制备脑胶质瘤检测试剂中的应用。
4.用于检测脑胶质瘤的引物探针组，其特征在于，由SEC61G基因引物探针组、AGAP2基因引物探针组、AVIL基因引物探针组、FKBP9P1基因引物探针组、DCTN2基因引物探针组、CDK4基因引物探针组、EGFR基因引物探针组和TSPAN31基因引物探针组组成。
5.根据权利要求4所述的用于检测脑胶质瘤的引物探针组，其特征在于，
SEC61G基因引物探针组：
上游引物为：TGCAGTTTGTTGAGCCA，如SEQ ID NO:1所示，
下游引物为：AGAAGCCAATGAATCCC，如SEQ ID NO:2所示，
探针序列为：CCTTTACAAACTGCCGACT，如SEQ ID NO:3所示；
AGAP2基因引物探针组：
上游引物为：CCACTCAGCTGCATCCACT，SEQ ID NO:4所示，
下游引物为：AGCTCCCGGTGACCAAC，SEQ ID NO:5所示，
探针序列为：ACTACTCTTCTTCCCTCCCGTCCT，SEQ ID NO:6所示；
AVIL基因引物探针组：
上游引物为：CCCCAGCCAAGGCACA，SEQ ID NO:7所示，
下游引物为：CCCGCCACAAGTCTCC，SEQ ID NO:8所示，
探针序列为：CTGTTTTCCGCCGCAGCTTC，SEQ ID NO:9所示；
FKBP9P1基因引物探针组：
上游引物为：TCTCAGAACCGCACGTTT，SEQ ID NO:10所示，
下游引物为：ACCACAATCCTTCGCTT，SEQ ID NO:11所示，
探针序列为：CCATCCCAGGAATCACGTAGC，SEQ ID NO:12所示；
DCTN2基因引物探针组：
上游引物为：ATGAAACTAGCGACCTACCTGA，SEQ ID NO:13所示，
下游引物为：CCTTGAACTTGTCATAGGCAG，SEQ ID NO:14所示，
探针序列为：CCGCATCGAACTCCGCTTG，SEQ ID NO:15所示；
CDK4基因引物探针组：
上游引物为：TTTGTGGCCCTCAAGAGTGT，SEQ ID NO:16所示，
下游引物为：TCCAGTCGCCTCAGTAAAGC，SEQ ID NO:17所示，
探针序列为：CCTTCCCATCAGCACAGTTCGT，SEQ ID NO:18所示；
EGFR基因引物探针组：
上游引物为：ATTCCGAGACGAAGCCAC，SEQ ID NO:19所示，
下游引物为：GACACTTCTTCACGCAGGT，SEQ ID NO:20所示，
探针序列为：CATGCTCTACAACCCCACCACGTA，SEQ ID NO:21所示；
TSPAN31基因引物探针组：
上游引物为：CATGTCTGGCTATTAACCGAA，SEQ ID NO:22所示，
下游引物为：TGTGAGGTTGAATAAGCCACAA，SEQ ID NO:23所示，
探针序列为：ATGAGCAACAAGACTCGGGAT，SEQ ID NO:24所示。
6.权利要求4~5任一项所述的引物探针组在制备脑胶质瘤检测试剂中的应用。
7.一种脑胶质瘤检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求4或5任一项所述的引物探针组。
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