CN117265112B - 一种前列腺癌的数字微液滴rna扩增检测系统及pca3基因在该系统中的应用 - Google Patents
一种前列腺癌的数字微液滴rna扩增检测系统及pca3基因在该系统中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统及PCA3基因在该系统中的应用，属于肿瘤诊断技术领域。提供的前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下基因的试剂：PCA3和SPDEF，和数字PCR系统。本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统相比于现有试剂盒产品可以在保证较高的检测灵敏度和准确度的基础上大大降低检测成本。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤诊断技术领域，具体涉及一种前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统及PCA3基因在该系统中的应用。
背景技术
据统计，截止到2020年，前列腺癌(prostate cancer,PCa)在我国发病人数高达11.5万，虽然其发病率在男性恶性肿瘤排名第六，但却是近年来男性恶性肿瘤中发病增长速率最快的。随着我国社会老龄化、生活方式结构改变等因素的影响，前列腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，尤其是在北京、上海、广州、深圳这些大城市，男性人群、老年人群的前列腺癌发病率相对更高。此外，我国前列腺癌确诊患者大多是中晚期患者，已经错过了最佳的前列腺手术治疗的黄金时期，导致了我国前列腺癌的死亡率居高不下。因此，对于前列腺癌的早期诊断显得格外重要。
目前国内外常用的前列腺癌的诊断方法主要包括直肠指检(DRE)；前列腺B超、CT、多参数核磁共振检查(mp-MRI)等影像学检测；以前列腺特异性抗原(Prostate SpecificAntigen,PSA)及其衍生物为代表的蛋白水平的检测，和公认的诊断金标准前列腺穿刺活检。
传统的直肠指检灵敏度低且受人为因素影响较大。前列腺B超、CT等影像学检测仅对晚期前列腺癌患者具有较准确的判断。近年，虽然多参数核磁共振检查在指导前列腺癌穿刺应用较广，但其对早期前列腺患者的诊断依旧存在局限性，尤其是多参数核磁PI-RADS评分为3的患者，没有明确的穿刺靶点，依旧沿用传统的系统穿刺，使得很多患者经历了不必要的穿刺活检。2022年，PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen,PSMA)结合PET-CT对前列腺癌的诊断效果有明显提高，甚至有学者认为PSMA结合PET-CT可以代替金标准前列腺穿刺活检。但目前该方法费用高，对硬件设备要求较高，目前仍在探究完善阶段。
血PSA检测是目前国内外认可度最高的前列腺癌筛查及诊断方法，虽然血PSA检测具有极高的灵敏度，但特异性差，假阳性率高，尤其在血PSA灰区(4-10ng/mL)范围内，导致75％的人群经历了过度诊治。此外，大多数在血PSA灰区范围内患者在影像学检查中也没有较明确的诊断效果，因此造成了这部分人群在临床诊断中的痛点存在。此外，血PSA与病理Gleason评分的相关性不高，无法为医生提供手术或后续治疗相应参考。
在血PSA基础上，fPSA(free PSA)、P2 PSA(Prostate Specific Antigenisoform)等PSA衍生物检测的出现，组成了PHI(Prostate Heath Index)和4Kscore(AFour-Kallikrein Panel)检测模型，虽然可以一定程度上提升血PSA的特异性，但需要专业的医疗人员进行抽血及特定机器检测，影响了临床的广泛推广。前列腺穿刺活检虽是前列腺癌诊断的金标准，但属于侵入性检测，患者需要承担并发症的风险、增加了心理负担及医疗成本。因此，临床上需要一种敏感性好、特异性高、快速无创的检测技术辅助前列腺癌的早期诊断。
本申请人已经提供了一种通过检测尿液样品中9个基因(包括PCA3、ERG、DLX1、HOXC6、HOXC4、TDRD1、AMACR和MALAT，以及检测内参基因SPDEF或KLK3)的相对表达水平来进行前列腺癌诊断的方法(参见专利文献CN115851926A，以下称文献1)，具有92.86％的诊断灵敏度及96.4％的阴性预测值，准确率为88％，实现了较为理想的诊断效果。但该文献1公开的方法中检测的基因较多，这势必会增加检测成本。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统，其包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下基因的试剂：PCA3和SPDEF基因，和用于对以上基因进行绝对定量的数字PCR系统；
其中所述SPDEF基因作为检测内参基因。
在一些实施方式中，在所述前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统中，针对每一种基因的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物，所述捕获探针用于捕获基因序列；
(2)扩增检测液：其包含第一引物、第二引物和靶标检测探针，其中所述第一引物与所述第一引物配合，用于扩增基因序列中的靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合。
在一些实施方式中，所述数字微液滴RNA扩增检测系统还包括：
(3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示：PCA3和SPDEF。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3-4或SEQ ID NO:9-10所示：PCA3和SPDEF。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5-6或SEQ ID NO:11-12所示：PCA3和SPDEF。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示：PCA3和SPDEF，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
在一些实施方式中，所述数字微液滴RNA扩增检测系统还包括：
(4)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地含有5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％ SDS、1-10mM EDTA；和/或
(5)阳性对照：分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：PCA3和SPDEF；和/或
(6)阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：PCA3和SPDEF。
在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂、1-50μΜ所述的特异性捕获探针、50-500mg/L磁珠。
在一些实施方式中，所述扩增检测液的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％ PVP40、10-250pmol/mL所述的第一引物、10-250pmol/mL所述的第二引物、10-250pmol/mL所述的靶标检测探针。
在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
在一些实施方式中，所述数字PCR系统为芯片式数字PCR系统。
本发明另一方面还提供一种根据上述的数字微液滴RNA扩增检测系统的前列腺癌的实时荧光核酸恒温扩增检测的寡核苷酸组合，其包括：
核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示的特异性捕获探针，核苷酸序列分别如SEQID NO:3-4所示的第一引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示的第二引物，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示的靶标检测探针。
基于实时荧光核酸恒温扩增检测原理检测以下生物标志物基因PCA3和SPDEF的试剂联合数字PCR系统在制备前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统中的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案提供的前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统可对尿液样本中PCA3及SPDEF的RNA水平分别进行绝对定量检测，并以SPDEF的RNA水平作为内参计算PCA3评分，根据该PCA3评分结果可对前列腺癌进行检测诊断。结果表明，该数字微液滴RNA扩增检测系统能够高灵敏度(可达96.55％)和高准确度(84.5％)(95％CI：0.767-0.905)地对年龄大于50岁，血PSA处于灰区：4-10ng/mL的患者进行检测，并且阴性预测值可高达94.7％以上。因此本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统可以筛查出96.55％的阳性患者，且在实际阴性对象中有高达94.7％的检测对象被判定为真阴性，这与上述文献1基于9个基因的检测效果相当，甚至相对于该文献1，本发明的数字微液滴RNA扩增检测系统在针对前列腺癌检测时具有更高的检测灵敏度。更为重要的是，本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统只需要针对PCA3和SPDEF这两个基因进行检测即可，因此相对于上述文献1，本发明可以显著降低检测成本，并且由于检测基因的数量大大降低，还可以明显缩短检测时长，提高检测效率，降低劳动强度。
另外，本发明的数字微液滴RNA扩增检测系统的检测样本可以为尿液(例如检测对象的随机尿液)，因此使用本发明的数字微液滴RNA扩增检测系统对前列腺癌患者进行筛查时可以采用无创采样的方式，而无需进行前列腺穿刺活检，进而可以避免对患者造成穿刺痛苦或感染风险。
具体实施方式
以下结合具体实施例详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，实施例的描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物、探针和体外转录RNA产物用已有技术合成。
实施例1：基于数字微液滴RNA扩增检测原理的用于检测前列腺癌的生物标志物的确定
在该实施例中，本发明人收集了大量的临床病例，并从大量的与前列腺癌检测可能相关的生物标志物(例如DLX1、SChLAP1、TDRD1、TTTY15-USP9Y、SPON2、PCAT14、PCA3、OR51E2、ERG、RPL7P16、PIP5K1A、CCND1、GSTP1、CST1、CST3、CST4、HOXC6、HOXC4、CCNA1、LMTK2、MYO6、HPN、CDK1、PSCA、PTEN、GOLM1、PMP22、EZH2、FGFR1、FN1、VEGFA、TMPRSS2、ANXA3、CRISP3、BIRC5、AMACR、HIF1A、KLK3、KLK2、MSMB、FLT1、MMP9、AR、TERT、PGC、SPINK1、STAT3、STAT5、TFF3、RELA、NDUFB4、EHD3、PFKL、RAN、ACSM1、PLXNA1、ID1、APC、RASSF1、PCDH9、SPOP等)中筛选出适用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系的、并以尿液作为样本检测前列腺癌的生物标志物，进而确定一组可以高准确度和高灵敏度地检出前列腺癌，且具有极高的阴性预测值的生物标志物，如上述文献1所述，最终确定以PCA3、ERG、HOXC6、HOXC4、DLX1、TDRD1、AMACR、MALAT1共8个基因为检测基因(以下也称靶标)，并利用SPDEF和/或KLK3作为检测内参基因。
然而，该文献1公开的方法要至少检测9个基因(包括以上8个靶标和至少1个检测内参基因)才能对前列腺癌作出高准确度和高灵敏度的诊断结果，因此检测成本较高，且由于检测的基因数量较多会导致检测时间较长。在本实施例中，发明人创造性地结合利用实时荧光恒温扩增检测技术和数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术(是一种基于PCR(聚合酶链反应)的基因检测技术，其将反应体系分割成数万个微小反应单元，并计算反应单元扩增结束后的阴阳性数量，使用泊松分布算法进行分析计算，进而实现对目标核酸分子的绝对定量，常使用的仪器为微液滴数字PCR系统)(本发明中将以上两种技术的结合称为“数字微液滴RNA扩增检测技术”)，分别对上述9个基因(包括以上8个靶标和内参基因SPDEF)在尿液中的水平进行绝对定量，最终确定以PCA3这1个基因为检测基因，并利用SPDEF作为检测内参基因，也可以高灵敏度和高准确度地检出前列腺癌，并具有极高的阴性预测值，与上述文献1基本相当，甚至在检测灵敏度方面表现出更好的效果。更为重要的是，相对于上述文献1需要检测至少9个基因，本发明只需要检测2个基因即可对前列腺癌作出高准确度和高灵敏度的诊断结果，因此检测成本大大降低，且由于检测的基因数量较少而大大缩短检测时长。
本实施例基于数字微液滴RNA扩增检测技术对待测尿液样本中的以上8个基因(PCA3、ERG、HOXC6、HOXC4、DLX1、TDRD1、AMACR、MALAT1)和1个检测内参基因(SPDEF)的水平分别进行绝对定量检测，具体步骤如下所示：
1.1、待测样本(检测对象的随机尿前段尿液)的收集
取经血PSA检测的118例检测对象(其中包括58例前列腺癌阳性和60例前列腺癌阴性)的50mL随机尿前段尿液，以1:1比例加入样本保存液(其含有高浓度去垢剂，为上海仁度生物科技股份有限公司市售商品)，混匀作为待测样本，-70℃冷冻保藏。
1.2、检测样准备
分别取6mL PCA3、ERG、SPDEF、DLX1、HOXC6、HOXC4、TDRD1、AMACR、MALAT1基因阳性对照(为上述文献1中实施例1制备获得)(每个检测基因取1管)、6mL阴性对照(样本保存液)(针对每个基因各取1管)、和6mL待测样本(每个检测对象取9管)分别置于样品处理管中，共1080管(阳性对照9管，阴性对照9管，待测样本1062管)检测样备用。
1.3、核酸提取
针对1.2备用的每个样品处理管，分别进行以下操作：
(1)在样品处理管中加入1.5mL核酸提取液：HEPES 500mM、LLS 8％、与检测基因对应的特异性捕获探针25μΜ、磁珠150mg/L，加入待测样本/阳性对照/阴性对照混匀。60℃保温10分钟，室温放置10分钟；
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES25mM、NaCl150mM、1％SDS、EDTA 2.5mM)振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μL洗涤液，振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠；
(3)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，加入100μl DEPC水洗脱，重复混匀后，将磁珠-核酸复合物的管子60℃保温10分钟，放置磁珠分离装置上，吸磁3分钟，取全部洗脱液，至于无核酸酶的1.5mL离心管中备用。
1.4、数字微液滴RNA扩增检测
针对1.3备用的每个样品处理管，分别进行以下操作：
(1)将臻准生物芯片式数字PCR系统(包括样品前处理系统、PCR扩增仪、生物芯片阅读仪)开机调试，放置好相应耗材(芯片、封盖、刮片(单排)、密封油)；
(2)向1.3备用的1.5ml离心管中加入15μL检测液：Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、与检测基因对应的第一引物10pmol/mL、第二引物10pmol/mL、检测基因对应的靶标检测探针10pmol/mL，HEX染料10pmol/mL。加入17μl的1.3(3)中的洗脱液，充分混匀；
(3)将上述(2)充分混匀的混合液置60℃装置中加热10分钟，42℃孵育5分钟。立即加入10μL SAT酶液(事先42℃条件下预热，含有M-MLV反转录酶60000U/mL、T7 RNA聚合酶40000U/mL、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mMzinc acetate(乙酸锌)、20mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)Triton X-100和30％(v/v)glycerol(甘油))，迅速充分震荡混匀，取20μl混合液，加入刮片(单排)中，立即启动样品前处理系统，进行芯片制备；
(4)将制备完成的芯片放置PCR扩增仪中，42℃反应40分钟。将扩增后芯片放置生物芯片阅读仪中，荧光通道例如选择FAM通道、参考通道选择HEX通道。
上述步骤1.3和1.4中涉及的分别针对各基因的特异性捕获探针、第一引物、第二引物和靶标检测探针为上述文献1中实施例2确定的组1的引物和探针。
1.5、结果判定
1.5.1、阳性对照和阴性对照的测定
将PCA3、ERG、HOXC6、HOXC4、DLX1、TDRD1、AMACR、MALAT1、SPDEF的阳性对照和相应的阴性对照芯片进行读数，阳性对照在定量范围内(±25％准确性)，阴性对照无定量数值，说明质控品指控通过，可以进行样本测试。
1.5.2、待测样本中各个检测基因的测定
分别读取待测样本中PCA3、ERG、HOXC6、HOXC4、DLX1、TDRD1、AMACR、MALAT1和SPDEF的定量值，并以SPDEF为内参基因，计算其他8个基因的评分(计算方法如下所示)，以用于对前列腺癌进行检测和诊断。PCA3评分＝PCA3拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；AMACR评分＝AMACR拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；ERG评分＝ERG拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；MALAT1评分＝MALAT1拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；TDRD1评分＝DRD1拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；HOXC6评分＝HOXC6拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；HOXC4评分＝HOXC4拷贝数/SPDEF拷贝数*1000；DLX1评分＝DLX1拷贝数/SPDEF拷贝数*1000。
利用SPSS(版本21.0)对上述计算结果进行统计分析。将临床金标准前列腺穿刺活检结果和以上8个基因的评分值通过受试者工作特征(ROC)曲线用来分别评估以上8个基因的综合评分的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和准确度，确定最终cutoff值。cutoff值能作为前列腺癌患者的诊断数值。其中：
敏感度(SE)＝肿瘤患者中高于截断值的样本例数/患者样本例数；
特异度(SP)＝肿瘤患者中低于截断值的样本例数/对照样本例数；
阳性预测值(PPV)＝肿瘤患者中高于截断值的样本例数/高于截断值的所有样本例数；
阴性预测值(NPV)＝肿瘤患者中低于截断值的样本例数/低于截断值的所有样本例数；
准确度＝(肿瘤患者中高于截断值的样本例数+肿瘤患者中低于截断值的样本例数)/所有样本例数。
结果如下表1所示，示出了以上8个基因在数字微液滴RNA扩增检测技术原理的基础上，并以SPDEF为检测内参对前列腺癌诊断的相关性分析结果。
表1：8个基因对前列腺癌诊断的相关性分析结果
| SPDEF内参 | SE | SP | PPV | NPV | AUC(95％CI) |
| MALAT1 | 74.14 | 58.33 | 63.2 | 70.0 | 0.734(0.645-0.812) |
| HOXC6 | 91.38 | 51.67 | 64.6 | 86.1 | 0.795(0.711-0.864) |
| ERG | 53.45 | 86.67 | 79.5 | 65.8 | 0.756(0.669-0.831) |
| PCA3 | 96.43 | 60.00 | 69.2 | 94.7 | 0.840(0.760-0.901) |
| HOXC4 | 91.38 | 36.67 | 58.2 | 81.5 | 0.741(0.652-0.817) |
| DLX1 | 89.66 | 41.67 | 59.8 | 80.6 | 0.768(0.681-0.841) |
| TDRD1 | 89.66 | 43.33 | 60.5 | 81.2 | 0.767(0.681-0.840) |
| AMACR | 86.21 | 46.67 | 61.0 | 77.8 | 0.768(0.681-0.841) |
由上表1的相关性分析结果可知，在数字微液滴RNA扩增检测技术原理的基础上，相对于其他7个基因(ERG、HOXC6、HOXC4、DLX1、TDRD1、AMACR、MALAT1)对前列腺癌的诊断效果，PCA3的诊断效果最为突出，其具有96.43％的灵敏度、94.7％的阴性预测值和84％的准确度，其诊断效果与上述文献1使用8个基因联合模型的诊断效果(具有92.86％的灵敏度、96.4％的阴性预测值和88％的准确度)基本相当，甚至在检测灵敏度方面有所提高。而其他7个基因对前列腺癌的诊断效果均不理想，表现为检测灵敏度、和/或阴性预测值、和/或准确度等较低。因此，本发明确定使用PCA3基因作为检测靶标，使用SPDEF作为检测内参基因，并基于数字微液滴RNA扩增检测技术原理对前列腺癌进行诊断，其相对于上述文献1不仅仅省去了标准曲线的制作，大大缩短了检测时间，而且还极大降低了检测成本。
实施例2：用于数字微液滴RNA扩增检测前列腺癌的专用引物和探针的设计
基于以上实施例1确定的用于在数字微液滴RNA扩增检测系统中检测前列腺癌的生物标志物(包括PCA3，以及作为检测内参基因的SPDEF)，该实施例进一步优化设计并确定了针对以上这些生物标志物基因的且适用于数字微液滴RNA扩增检测体系的引物和探针。其中针对以上每个基因共设计了多组引物和探针组合，并分别以PCA3和SPDEF的mRNA阳性标准品(每个基因的核酸体外转录RNA标准品，由上述文献1中实施例1制备获得)为模板验证设计的多组引物探针的检测灵敏度效果，从中确定分别用于检测以上2个基因的对应的最佳引物和探针组合。作为示例，以下表2和表3针对每个基因列出了其中的2组，组-1罗列的是各基因的最佳组合(其中使用了上述文献1的实施例2中组1公开的分别针对PCA3和SPDEF的特异性捕获探针和靶标检测探针)，组-2显示各基因的对照组合(其使用的是上述文献1的实施例2中组1公开的分别针对PCA3和SPDEF的引物和探针组合)，并分别以PCA3和SPDEF的mRNA的阳性标准品(浓度分别为：1、10、100、200拷贝/反应)为模板验证这2组引物探针的检测灵敏度效果。
表2：组-1针对不同检测前列腺癌的生物标志物的引物和探针
表3：组-2针对不同检测前列腺癌的生物标志物的引物和探针
利用上述表2和表3的两组引物和探针(组-1和组-2)分别对各个基因的阳性标准品(浓度分别为：1、10、100、200拷贝/反应)进行进行数字微液滴RNA扩增检测(具体检测方法如以上实施例1所述)。
结果下表4所示，可见阳性标准品在浓度为100-200拷贝/反应之间时，组-1和组-2引物探针组合的检测灵敏度一致，然而当阳性标准品的浓度降低至10拷贝/反应以下时，组-1引物探针的检测灵敏度要明显优于组-2引物探针的检测灵敏度。因此针对PCA3及SPDEF基因，均确定组-1所示的引物和探针分别用于对PCA3及SPDEF基因进行数字微液滴RNA扩增检测。以下实施例中均使用组-1的引物和探针。
表4：组-1和组-2引物探针组合对各个基因的阳性标准品的灵敏度检测结果
| 基因片段 | 200拷贝/反应 | 100拷贝/反应 | 10拷贝/反应 | 1拷贝/反应 | 阴性对照 |
| PCA3组-1 | 10/10 | 10/10 | 9/10 | 6/10 | 0/10 |
| PCA3组-2 | 10/10 | 10/10 | 6/10 | 3/10 | 0/10 |
| SPDEF组-1 | 10/10 | 10/10 | 9/10 | 5/10 | 0/10 |
| SPDEF组-2 | 10/10 | 10/10 | 5/10 | 2/10 | 0/10 |
实施例3：联合PCA3和SPDEF基因，并基于数字微液滴RNA扩增检测方法对前列腺癌进行诊断的模型的建立
该实施例利用上述实施例1确定的用于检测前列腺癌的生物标志物基因(PCA3和SPDEF)和实施例2确定的分别针对每一生物标志物基因的引物和探针(组-1的引物和探针)对前列腺癌临床尿液样本(实施例1中所述118例患者样本)进行数字RNA恒温扩增绝对定量检测，获得每个生物标志物基因在临床尿液样本中的表达量(拷贝数)。按照以下方法计算PCA3的评分值：
PCA3评分＝PCA3拷贝数/SPDEF拷贝数*1000
随后利用SPSS(版本21.0)进行统计分析。将临床金标准前列腺穿刺活检结果和PCA3评分值通过受试者工作特征(ROC)曲线用来评估PCA3评分的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和准确度，确定最终cutoff值。cutoff值能作为前列腺癌患者的诊断数值。其中敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和准确度的计算方法同实施例1。
临床金标准前列腺穿刺活检结果和PCA3评分结果的相关性分析结果如下表5所示，最终确定的PCA3评分对前列腺癌诊断的cutoff值为102.47(检测值当大于102.47时代表阳性样本，当小于或等于102.47时代表阴性样本)，即当cutoff为102.47时，PCA3评分具有96.55％的灵敏度、60％的特异度、70％的阳性预测值、94.7％的阴性预测值及84.5％的准确度(如下表6所示)。并且根据表6可知，当采用上述实施例2确定的组-1的引物和探针分别对PCA3和SPDEF基因进行检测时，相对于使用上述实施例2中组-2的引物和探针，能够进一步提高PCA3评分的灵敏度、阳性预测值和准确度。
表5：临床金标准前列腺穿刺活检结果和PCA3评分结果的相关性
表6：PCA3评分对前列腺癌诊断的相关性分析结果
| SPDEF内参 | SE | SP | PPV | NPV | AUC(95％CI) |
| PCA3 | 96.55 | 60.00 | 70.0 | 94.7 | 0.845(0.767-0.905) |
在该实施例建立的联合PCA3和SPDEF基因，并基于数字微液滴RNA扩增检测方法对前列腺癌进行诊断的模型中，若将cutoff值设定为280.32对患者进行分层分析，如下表7所示，该模型具有44.83％的灵敏度，96.67％的特异度、92.95％的阳性预测值和64.4％的阴性预测值，即当检测对象的PCA3评分超过280.32时，可判定该检测对象患有前列腺癌的概率为92.95％，可以为临床医生提供前列腺癌诊断的依据，以辅助前列腺癌的临床诊断。
表7：cutoff值设定为280.32时PCA3评分对前列腺癌诊断的相关性分析结果
| SPDEF内参 | SE | SP | PPV | NPV | AUC(95％CI) |
| PCA3 | 44.83 | 96.67 | 92.9 | 64.4 | 0.845(0.767-0.905) |
实施例4：前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统
根据以上实施例1、2和3的结果可知，以PCA3和SPDEF的组合模型在数字微液滴RNA扩增检测系统中具有较高的灵敏度及阴性预测值，并且联合应用以上这两种生物标志物检测前列腺癌时，可以使用尿液(例如随机尿液前段尿)作为检测样本，而无需对患者进行前列腺穿刺活检，从而便于大规模人群体检。基于此，该实施例提供了一种基于实时荧光核酸恒温扩增检测和数字PCR定量检测系统的前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统，其可包括：
(4.1)基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下基因的试剂：PCA3和SPDEF的试剂，所述SPDEF基因作为检测内参基因，以及用于对上述基因进行绝对定量的数字PCR系统(例如芯片式数字PCR系统)；
具体地，针对以上每一种基因的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物，所述捕获探针用于捕获基因序列；
(2)扩增检测液：其包含第一引物、第二引物和靶标检测探针，其中所述第一引物与所述第一引物配合，用于扩增基因序列中的靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
还可包括：
(3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶。
更具体地，特异性检测PCA3和PDEF基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示，第一引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4或SEQ ID NO:9-10所示，其中优选SEQ ID NO:3-4，第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6或SEQ ID NO:11-12所示，其中优选SEQ ID NO:5-6，靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示，且在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；
更进一步具体地，该实施例提供的针对以上每一种基因的特异性检测试剂包括：
(1)核酸提取液，其组分包括：250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂、1-50μΜ所述的特异性捕获探针、50-500mg/L磁珠；
(2)扩增检测液，其组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mMNTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％ PVP40、10-250pmol/mL所述的第一引物、10-250pmol/mL所述的第二引物、10-250pmol/mL所述的靶标检测探针；
(3)SAT酶液，其组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
为了检测方便和/或准确，该实施例提供的数字微液滴RNA扩增检测系统还包括以下成分(4.2)-(4.5)中的一种或多种：
(4.2)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地含有5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％ SDS、1-10mM EDTA。
(4.3)阳性对照：含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：PCA3和SPDEF，如上述文献1的实施例1中制备。
(4.4)阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：PCA3和SPDEF，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
(4.5)结果判定说明书
当使用本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统检测临床尿液样本获得的PCA3评分大于102.47时，判定为前列腺癌阳性样本；评分小于等于102.47时，判定为前列腺癌阴性样本；
当使用本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统检测临床尿液样本获得的PCA3评分大于280.32时，则判定检测对象患有前列腺癌的概率超过92％。
实施例5：临床样本验证
利用上述实施例4提供的前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统和判定标准，对来源于173例(83例前列腺癌阳性，90例前列腺癌阴性，编号为：样本1-173)血PSA灰区患者的临床尿液样本进行数字微液滴RNA扩增检测，以验证本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统的可靠性。具体检测方法参见实施例1，每个尿液样本分成2份，对每一生物标志物基因(PCA3和SPDEF)分别进行检测，检测结果如下表8所示，表9为对表8检测结果的统计结果，表10为根据表9计算的相关性结果。可见本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统对以上173例样本的前列腺癌检测的灵敏度为92.77％，特异度为63.33％，阴性预测值为90.5％，阳性预测值为70％，准确度为83.6％，也证明本发明提供的数字微液滴RNA扩增检测系统在检测前列腺癌方面具有极高的灵敏度和阴性预测值，可以大大降低前列腺癌阴性对象不必要的穿刺活检。另外，如下表11所示，当检测的173例临床样本的PCA3评分超过280.32时，实施例4提供的前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统对前列腺癌检测的阳性预测值高达92.1％，再次证明了本发明提供的前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统可以辅助前列腺癌的临床诊断。
表8：173份血PSA灰区患者临床尿液样本的检测结果
表9：临床样本验证结果
表10：临床样本的PCA3评分对前列腺癌诊断的相关性分析结果
| SPDEF内参 | SE | SP | PPV | NPV | AUC(95％CI) |
| PCA3 | 92.77 | 63.33 | 70.0 | 90.5 | 0.836(0.772-0.888) |
表11：临床样本的PCA3评分超过280.32时对前列腺癌诊断的相关性分析结果
| SPDEF内参 | SE | SP | PPV | NPV | AUC(95％CI) |
| PCA3 | 42.17 | 96.67 | 92.1 | 64.4 | 0.836(0.772-0.888) |
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，所述数字微液滴RNA扩增检测系统包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下基因的试剂：PCA3和SPDEF基因，和用于对以上基因进行绝对定量的数字PCR系统；
其中所述SPDEF基因作为检测内参基因；
其中针对每一种基因的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
（1）核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物，所述捕获探针用于捕获基因序列；
（2）扩增检测液：其包含第一引物、第二引物和靶标检测探针，其中所述第一引物与所述第二引物配合，用于扩增基因序列中的靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；其中：
特异性检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示：PCA3和SPDEF；
特异性检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示：PCA3和SPDEF；
特异性检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示：PCA3和SPDEF；
特异性检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示：PCA3和SPDEF，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，所述数字微液滴RNA扩增检测系统还包括：
（3）SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶。
3.根据权利要求1或2所述的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，所述数字微液滴RNA扩增检测系统还包括：
（4）洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或
（5）阳性对照：分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：PCA3和SPDEF；和/或
（6）阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：PCA3和SPDEF。
4.根据权利要求3所述的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，所述洗涤液含有5-50 mM HEPES、50-500 mM NaCl、0.5-1.5% SDS、1-10 mM EDTA。
5.根据权利要求1或2所述的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，
所述核酸提取液的组分包括：250-800 mM HEPES、4-10% 十二烷基硫酸锂、1-50 μΜ所述的特异性捕获探针、50-500 mg/L磁珠；
所述扩增检测液的组分包括：10-50 mM Tris、5-40 mM KCl、10-40 mM MgCl2、1-20 mMNTP、0.1-10 mM dNTPs、1-10% PVP40、10-250 pmol/mL所述的第一引物、10-250 pmol/mL所述的第二引物、10-250 pmol/mL所述的靶标检测探针。
6.根据权利要求2所述的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，所述SAT酶液的组分包括：16000-160000 U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000 U/mL的RNA聚合酶、2-10 mMHEPES pH7.5、10-100 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4 mM乙酸锌、10-100 mM海藻糖、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200 mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、v/v 为0.1-1%的TritonX-100和v/v为20-50%的甘油。
7.根据权利要求1或2所述的数字微液滴RNA扩增检测系统，其特征在于，所述数字PCR系统为芯片式数字PCR系统。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述的数字微液滴RNA扩增检测系统的前列腺癌的实时荧光核酸恒温扩增检测的寡核苷酸组合，其包括：
核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示的特异性捕获探针，核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3-4所示的第一引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 5-6所示的第二引物，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示的靶标检测探针。
9.基于实时荧光核酸恒温扩增检测原理检测以下生物标志物基因的试剂联合数字PCR系统在制备前列腺癌的数字微液滴RNA扩增检测系统中的应用：PCA3和SPDEF；
其中针对每一种基因的检测试剂包括与该种基因对应的：
（1）核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物，所述捕获探针用于捕获基因序列；
（2）扩增检测液：其包含第一引物、第二引物和靶标检测探针，其中所述第一引物与所述第二引物配合，用于扩增基因序列中的靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；其中：
检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示：PCA3和SPDEF；
检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示：PCA3和SPDEF；
检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示：PCA3和SPDEF；
检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示：PCA3和SPDEF，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
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| CN109762905A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-17 | 天津脉络医学检验有限公司 | 一种用于辅助检测前列腺癌的ddPCR引物组合物及其应用 |
| CN115851926A (zh) * | 2022-08-04 | 2023-03-28 | 上海仁度生物科技股份有限公司 | 前列腺癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 基于微流控芯片的数字等温扩增检测技术研究与实现;杨文博;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20230215(第2期);摘要、第五章 实验验证与性能分析 * |
| 尿PCA3评分对血清总PSA灰区前列腺癌患者的早期诊断价值;张振奇等;《山东医药》;20171231;第57卷(第45期);摘要、1.4尿PCA3评分的测算、2.2 尿PCA3评分对前列腺癌的诊断价值 * |
Also Published As
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