CN108165634B - 一种胃癌新型分子标记物tRF-5026a的检测及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于胃癌诊断的tRF分子标志物，其特征在于：该tRF为tRF‑5026a，本发明还提供一种检测胃癌tRF分子标志物的方法，包括如下步骤:(1)收集胃癌组织；(2)获得浓度纯度较高的RNA；(3)前处理并逆转录成cDNA；(4)进行荧光染料法qRT‑PCR检测；(5)tRF和外参基因采用特异性上下游扩增引物；(6)通过统计出胃癌组织中目的tRF和外参基因的Cq值；(7)采用ΔCq＝Cq_{(target tRF)}‑Cq_(reference)的计算方法对tRF进行相对定量，与现有技术相比，本发明的优点在于在胃癌组织中的特异性表达下调tRF‑5026a可作为胃癌诊断的新型分子标记物。

Description

一种胃癌新型分子标记物tRF-5026a的检测及应用

技术领域

本发明涉及一种胃癌组织中tRNA衍生片段的检测方法，尤其涉及一种荧光染料法实时定量逆转录-聚合酶链式反应检测胃癌组织中tRF的方法及其应用。

背景技术

全球癌症统计中，胃癌发病率列居前位，中国又是胃癌高发大国。尽管诊断技术在不断提高，以手术治疗为主的综合治疗手段越来越丰富，但胃癌依旧是全球主要癌症致死性疾病之一，每年约有100万个新发病例，死亡人数达到72万余人【赵倩，杨晓燕，甘润良.胃癌的分子分型研究进展.中华病理学杂志,2016,45(10):737-741】。中国是胃癌的高发国，每年我国新增约40万例胃癌患者，约占世界胃癌发病人数的42％。由于胃癌早期症状不明显，并且又缺乏特异的早期胃癌诊断方法【Liu X,Meltzer SJ.Gastric Cancer in theEra of Precision Medicine.Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2017,3(3):348-358】，已有的肿瘤标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)等在胃癌中的检出率均不高。绝大多数胃癌患者在诊断时已处于晚期，使得患者的生存期较短【Chia NY,Tan P.Molecular classificationof gastric cancer.Ann Oncol,2016,27(5):763-9.】。因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是肿瘤研究的热点。随着分子生物学和分子诊断研究的深入，科学家逐渐将目光转向tRF，因其在抑癌与致癌途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点。它们由成熟tRNA或前体tRNA在不同位点特异性剪切产生，是一类广泛存在于真核生物细胞中的非编码小RNA分子。tRF主要有tRF-5、tRF-3和tRF-1等3亚类，分别来自成熟tRNA的D环至反密码子环茎区间切割至5'端、T环开始至3'端和前体tRNA的3'端尾部，长度为14～30个核苷酸(nucleotide，nt)。tRF具有多种生物学功能，既可以在应激反应中作为信号分子，又可以作为基因表达的调节者。这些特点使得tRF在疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是，针对上述现有技术现状而提供一种tRF-5026a作为胃癌检测中的分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种在胃癌组织中检测tRF-5026a的方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种tRF-5026a在胃癌诊断中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该用于胃癌检测的tRF分子标记物，其特征在于：该tRF为tRF-5026a，其基因在基因组上的定位为：chr6-26538282-26538354，对应的tRNA为chr6.trna9-ValCAC，该tRF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，为GTTTCCGTAGTGTAGTGG。

进一步地，所述tRF-5026a在胃癌患者癌组织中特异性表达水平下调。

本发明还提供一种检测tRF分子标记物的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：

(1)采集胃癌组织，称取组织，提取组织中的总RNA；

(2)将总RNA前处理并逆转录成cDNA；

(3)将cDNA进行荧光染料法qRT-PCR检测，反应结束后检测样品中tRF-5026a和外参基因RNU6-2的Cq值；

(4)根据Cq值，通过外参基因RNU6-2的表达水平来均一化tRF的水平，计算得到tRF-5026a的相对表达水平，并使用2^-ΔΔCq公式来计算tRF-5026a的PCR相对定量值，式中ΔCq＝Cq_(tRF-5026a)-Cq_(RNU6-2)；

(5)当样本中的tRF-5026a生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于14.03时，则认为是非胃癌样本；大于14.03时，则认为是胃癌样本。

进一步地，所述步骤(3)中tRF-5026a的特异性扩增上下游引物为：

F1：5’-TCGGCCGACGATCGTTTCC-3’；

R1：5’-CCGCGTCCGATCTCCACTA-3’。

进一步地，所述步骤(3)中的看家基因RNU6-2的特异性扩增上下游引物为：

F2：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；

R2：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

其中，上述步骤(1)中提取胃癌组织中总RNA的过程如下：

步骤a、收集胃癌组织样本：取10～20mg的胃癌组织，浸泡在1～2mL的RNA保存液的无核酸酶离心管中；若不立即使用则应存放在-80℃超低温冰箱中保存；

步骤b、裂解组织：在步骤a中的离心管中加入1～2mL的总RNA提取试剂TRIzol，将胃癌组织充分研磨匀浆成匀浆液，室温静置5～8分钟，使组织中的RNA充分释放至匀浆液中；

步骤c、三氯甲烷提取：加入200～300μL三氯甲烷，通过涡旋震荡，室温静置3分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，此时液体会分层，其中RNA在上层水相中富集，小心吸取上层水相约0.5mL～1.5mL至无核酸酶离心管中；

步骤d、异丙醇沉淀：异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，在冰上静置10分钟后12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清得RNA沉淀；

步骤e、乙醇洗涤并沉淀：倾倒上清并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，晾干后加入适量无核酸酶RNase水来溶解沉淀，即为组织中的总RNA提取液，于-80℃保存备用。

进一步地，所述步骤(3)中荧光定量PCR反应条件如下：先95℃预变性5分钟；然后95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，50个循环；最后95℃变性1分钟，55℃退火30秒，95℃酶变性30秒，4℃保温。

本发明还提供一种tRF分子标记物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。该试剂盒包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、荧光试剂、PCR缓冲液、焦碳酸二乙酯(DEPC)水。

与现有技术相比，本发明的优点在于在胃癌患者组织中的特异性表达下调的tRF-5026a可作为胃癌诊断的新型分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断，通过使用TRIzol、异丙醇等试剂，采用混匀离心等方法，能提取出浓度、纯度较好的RNA，仅需收集20mg左右的胃癌组织即可检测tRF，成为胃癌诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景，而采取的实时定量PCR仪器是一种常见仪器，SYBR Green荧光染料法并不需要另行设计探针即可同时检测目的tRF和外参基因，具有经济、方便等特点，本发明提供的方法，对进一步研究胃癌相关tRF的生物学功能具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例二中两个组织标本中RNU6-2的扩增曲线图(样本1为胃癌组织标本，样本2为健康胃组织标本)；

图2为本发明实施例二中两个组织标本中tRF-5026a的扩增曲线图(样本1为胃癌组织标本，样本2为健康胃组织标本)；

图3为本发明实施例三中tRF-5026a在胃癌组织中显著低表达；

图4为本发明实施例三中tRF-5026a的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一：检测tRF-5026a在胃癌组织和正常胃组织中的表达情况：

1、测序检测：采用美国Arraystar公司的tRF单端测序试剂检测胃癌组织和正常组织中tRF的水平。

2、结果分析：tRF-5026a在胃癌组织和正常组织中差异达4.83倍，提示tRF-5026a在胃癌中可能作为一个抑癌基因发挥作用。

实施例二：采集正常胃组织作为正常对照组，按照如下步骤进行tRF的检测，包括以下步骤：

步骤a、收集胃癌组织样本：取10～20mg的胃癌组织，浸泡在1～2mL的RNA保存液的无核酸酶离心管中；

步骤b、裂解组织：在步骤a中的离心管中加入1～2mL的总RNA提取试剂TRIzol，将胃癌组织充分研磨匀浆成匀浆液，室温静置5～8分钟，使组织中的RNA充分释放至匀浆液中；

步骤c、三氯甲烷提取：加入200～300μL三氯甲烷，通过涡旋震荡，室温静置3分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，此时液体会分层，其中RNA在上层水相中富集，小心吸取上层水相约0.5mL～1.5mL至无核酸酶离心管中；

步骤d、异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，在冰上静置10分钟后12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清得RNA沉淀；

步骤e、乙醇洗涤并沉淀：倾倒上清并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，晾干后加入适量无核酸酶RNase水来溶解沉淀，即为组织中的总RNA提取液，于-80℃保存备用。

步骤f、RNA的前处理和逆转录：使用前处理和逆转录试剂盒对上述步骤e提取出的RNA进行前处理和逆转录，得到cDNA，保存于-20℃备用；

步骤g、SYBR Green荧光染料法qRT-PCR检测：将上述步骤f获得的cDNA按照表1的配比加入反应体系中，并按照表2的程序设定进行PCR参数；

所用的外参基因RNU6-2的特异性扩增上下游引物为：

F2：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；

R2：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；

所用的tRF-5026a的特异性扩增上下游引物为：

F1：5’-TCGGCCGACGATCGTTTCC-3’；

R1：5’-CCGCGTCCGATCTCCACTA-3’。

表1.PCR体系

表2.PCR参数

从图1和图2可以看出，正常组织和胃癌组织中tRF-5026a和RNU6-2均得到有效扩增，并可以得到组织样本中RNU6-2和tRF-5026a表达水平的扩增曲线，其中，从RNU6-2的扩增曲线可以得到所检测的胃癌组织和健康胃组织标本的Cq值分别为19.46和19.19，如图1所示；同理从tRF-5026a的扩增曲线可以得到所检测的胃癌组织和健康胃组织标本的Cq值分别为29和27.21，如图2所示；并从图1和图2可以得出正常组织与胃癌组织中tRF-5026a表达量的对比，与实施例一中的基因测序的结果是一致的。

同时利用同一标本中RNU6-2和tRF-5026a的Cq值，根据计算公式ΔCq＝Cq_(tRF-5026a)-Cq_(RNU6-2)计算出该tRF-5026a的ΔCq值，根据ΔCq值的大小就可以判断该tRF-5026a的相对表达水平；ΔCq值越小，其对应tRF-5026a的表达水平越高，而ΔCq值越大，其对应tRF-5026a的表达水平越低；

从图1和图2可得出正常组织的ΔCq＝8.02；胃癌组织的ΔCq＝9.54，明显大于正常组织的ΔCq值，说明tRF-5026a在胃癌组织中是低表达的。

实施例三

应用tRF-5026a生物标志物进行胃癌检测的方法

步骤包括：

1、收集组织样本；

2、胃癌组织中RNA的提取(提取方法如同实施例二)；

3、前处理逆转录和荧光定量PCR反应如同按照实施例二中的“前处理逆转录和荧光定量反应”进行操作；

4、以tRF-5026a作为胃癌检测的生物标志物，分析86例胃癌患者癌组织与其癌旁组织中tRF-5026a的表达水平。胃癌患者组tRF-5026a的ΔCq明显高于正常组，P<0.0001，证明其tRF-5026a的表达水平明显低于正常组，如图3所示。tRF-5026a作为胃癌标志物的截断值为14.03，当样本中的tRF-5026a生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于14.03时，则认为是非胃癌样本；大于14.03时，则认为是胃癌样本。

检测86例胃癌患者胃癌组织及其癌旁组织tRF-5026a水平，制作ROC曲线，如图4所示，AUC值为0.630，P<0.001。表4为tRF-5026a为生物标志物进行胃癌诊断的结果，可得出tRF-5026a作为胃癌标记物的灵敏度为0.512，特异度为0.721。

表4.tRF-5026a为生物标志物进行胃癌诊断的结果

实施例四检测试剂盒及应用

本实施例中的用于胃癌检测的tRF-5026a生物标志物检测试剂盒，除含有常规实时定量PCR试剂之外，还包括外参的检测引物和tRF-5026a的检测引物。其中，常规实时定量PCR试剂包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水(RNasefree water)。

利用上述检测试剂盒进行检测时，其具体的操作方法可参照实施例二的操作方法进行样本的检测和胃癌的判断。

应用本实施例中的检测试剂盒可以简单、快速、便利地进行tRF-5026a生物标志物的检测，以判断胃癌情况，便于治疗。

序列表

<110> 宁波大学

<120>一种检测组织中tRF-5026a表达的引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 18

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220> 人工序列

<400> 1

GTTTCCGTAG TGTAGTGG 18

Claims (2)

1.一种检测组织中tRF-5026a表达的引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：该tRF-5026a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF-5026a在胃癌患者癌组织中的特异性表达水平下调；

所述引物为：

F1：5’-TCGGCCGACGATCGTTTCC-3’；

R1：5’-CCGCGTCCGATCTCCACTA-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括有外参基因RNU6-2的特异性扩增上下游引物：

F2：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；

R2：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

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