CN111424085B

CN111424085B - tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用

Info

Publication number: CN111424085B
Application number: CN202010188239.1A
Authority: CN
Inventors: 王水; 夏添松; 马哿; 王竞翊; 梁梦迪; 韩旭
Original assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2040-03-17
Also published as: CN111424085A

Abstract

本发明公开了tRF‑Arg‑CCT‑017、tRF‑Gly‑CCC‑001和tiRNA‑Phe‑GAA‑003中的一种或多种tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。本发明研究结果显示血浆tRFs和tiRNAs可以作为新型的生物标志物用于乳腺癌辅助诊断，并证实了其作为诊断乳腺癌的无创标记物的可靠性以及可重复性。以此研究成果制得的诊断试剂或试剂盒具有稳定性好、无创、易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。

Description

tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于医学生物诊断领域，具体涉及tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用以及一种乳腺癌辅助诊断试剂或试剂盒。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。我国每年约有16万多女性被新诊断为患有乳腺癌，而每年有近12万人死于该疾病。目前，由于经济条件和人群接受水平的提高，我国已逐步建立起以超声及钼靶筛查为主的早期乳腺癌筛查项目。但影像学手段筛查对于操作人员有一定的要求，且存在一定的滞后性，对于部分早期病例及非肿块性病例存在漏检的可能。因此，需要其他诊断手段进行补充。液体活检技术针对外周血内存在的肿瘤细胞、肿瘤相关因子进行检测，具有样本易得、重复性强等优势。然而，目前临床应用最为广泛的肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)和糖类抗原15-3(CA15-3)等筛查乳腺癌，均缺乏敏感性和特异性。发现新的用于早期诊断乳腺癌的标记物将促进乳腺癌早期干预和治疗，延长病人的生存期。

随着基因组学、蛋白组学以及代谢组学等生物技术的发展，越来越多的核酸类生物标志物已被发现或研究。循环肿瘤DNA(ctDNA)可以大幅度提高灵敏度，但其检出率低、来源复杂、特异性差，且易出现假阳性。高通量测序以及片段分析过程中，人们发现了tRNA来源的小片段RNA(tRNA-derived fragments)，tRFs和tiRNA。tRFs来源于保守的tRNA，属于非编码小分子RNA。研究者根据它们与初始tRNA或者成熟的tRNA所匹配的不同区域，又进一步将其分为不同的亚型，形成相应的tRFs和tiRNA数据库，每一个特定的tRF和tiRNA都有其对应的编码。研究表明，与正常细胞相比，肿瘤细胞中许多tRFs都有表达差异。最新研究发现，人体外周循环中可以检测到tRFs的存在，在肿瘤诊断中显示出潜在的巨大价值。

中国专利文献CN 110373471A公开了一种血浆外泌体tRFs标志物tRF-Ser-AGA-018及其在乳腺癌诊断中的应用。该技术方案通过采集乳腺癌病例和健康人的血浆样本，以及乳腺癌组织和癌旁组织，提取外泌体，进行tRFs和tiRNA测序，筛选出差异表达的tRFs。对已筛选的差异表达tRFs在大样本人群中进行qRT-PCR定量分析。然而，外周血中外泌体相关标志物的检测存在一些无法回避且尚未解决的问题。在进行外泌体提纯时，若采用试剂盒提纯的方式，现有的试剂盒提纯效能不高，可能会混入除外泌体外的其他杂质，这无疑会导致诊断效能的降低。若采用超速离心法提取外泌体，又对实验室平台提出了极高的要求。因此，现有技术下，无论何种方式，外泌体提纯的成本高，操作繁琐，对于肿瘤诊断工具的推广是不利的。

有研究认为肿瘤患者血清中tRFs和tiRNAs存在差异，但由于血清在纤维蛋白原被去除的过程中可能会带来部分tRFs和tiRNAs表达谱的改变，存在一定的争议。与血清不同，血浆内tRFs和tiRNAs的表达更接近生理状态，更有利于作为肿瘤诊断工具。但目前血浆内游离tRFs和tiRNAs的研究尚处于起步阶段，少数研究的研究方法、纳入人群以及研究结果也并不一致，并且由于血浆内tRFs和tiRNAs的来源不明确导致检测的敏感性和特异性不能得到保障。

发明内容

本发明针对现有技术不足，利用高通量测序手段对乳腺癌患者血浆中游离tRFs和tiRNAs进行检测，并以方法学诊断指标运用细胞研究工具进行二次筛选，而后经过临床大样本验证，最终筛选得到对乳腺癌具有较高敏感性及特异性的血浆tRFs和tiRNAs。

本发明具体技术方案如下：

tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用，所述tRNA来源片段选自tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种，其核苷酸序列如下所示：tRF-Arg-CCT-017：5’-UCGAGAGGGGCUGUGCUCGCAAGGUUUCUU-3’(SEQ ID No:1)；

tRF-Gly-CCC-001：5’-AGAGGGUCUUUUUCACCCCGCUGUUGCUCUUU-3’(SEQ ID No:2)；

tiRNA-Phe-GAA-003：5’-GCCGAAAUAGCUCAGUUGGGAGAGCGUUAGACUG-3’(SEQ ID No:3)。

优选的，采用tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的两种或两种以上的组合，更优选tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003所组成的组合。

具体的，本发明以血浆tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种为检测靶标。

本发明另一目的在于提供一种乳腺癌诊断试剂或试剂盒，含有扩增tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种tRNA来源片段的引物。

优选的，所述引物为tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种的特异性qRT-PCR的上下游引物。

本发明所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒可定量检测血浆tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种。

优选的，所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂或试剂盒。

所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，包括RNA抽提体系、RNA反转录反应体系和PCR反应体系。

优选的，所述RNA抽提体系包括RNA抽提试剂，例如PARIS Kit AM1556(Invitrogen,Lithuania)；RNA逆转录反应体系包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；PCR反应体系包括扩增系统和引物系统，所述扩增系统包括SYBR Green荧光染料试剂；所述引物系统包括RNA反转录随机引物和tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种的特异性的qRT-PCR的引物。

优选的，上述乳腺癌诊断试剂或试剂盒，还包括内参引物。优选内参为RNU6，一个具体的示例为：上游引物核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNo:5所示。

本发明所述乳腺癌诊断试剂或试剂盒所用试剂为本领域常用的试剂或试剂盒，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水和Taq酶等。还可以含有标准品和/或对照品。

本发明所涉及的各类引物以及tRFs和tiRNAs的扩增引物均可通过市售获得。本发明实施例中使用的血浆tRFs和tiRNAs的引物购自于广州市锐博生物科技有限公司所合成生产的特异性tRFs和tiRNAs茎环RT-PCR引物。

本发明通过如下方法筛选获得本发明所述tRFs和tiRNAs，并确定其可作为标志物用于乳腺癌诊断。包括：

(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。

(2)血浆tRFs和tiRNAs差异表达谱分析：分析乳腺癌和正常对照人群中差异表达的血浆tRFs和tiRNAs，并以方法学诊断指标运用细胞研究工具对差异表达tRFs和tiRNAs进行二次筛选，再进一步进行大样本多阶段验证。

(3)通过多阶段的验证，明确这些tRFs和tiRNAs诊断乳腺癌的能力。

根据上述研究结果制备相应的血浆tRFs和tiRNAs诊断试剂或试剂盒，可实现对乳腺癌患者的无创辅助诊断。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本选择：初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为乳腺癌的患者。正常对照为在医院进行体检的正常人群。

2.tRFs和tiRNAs测序：选择8例乳腺癌患者及4例正常人群血浆样本，利用TRIZOL-LS试剂对血浆样本进行RNA提取，用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，同时取适量总RNA测定其OD260、OD280、浓度，RNA溶液分装后-80℃保存备用，使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)测定总RNA样品的纯度和浓度；使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)测定总RNA样品的纯度和浓度。

对RNA进行3’末端脱酰基反应、去除3’-cP and 5’-P加尾和去甲基化预处理，去除干扰cDNA文库构建的修饰。tRNA的高通量测序：将转录好的cDNA委托上海康成生物有限公司(http://www.aksomics.com)进行cDNA文库的质检以及在Illumina NextSeq 500测序仪进行测序。

3.利用试剂盒PARIS Kit AM1556(Invitrogen,Lithuania)提取乳腺癌细胞株培养上清和正常乳腺上皮细胞培养上清中的RNA，利用TRIZOL试剂对乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞的RNA进行提取，通过qRT-PCR的方法，检测上一步中筛选出的tRFs和tiRNAs在乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中的表达差异，进一步筛选出与乳腺癌直接相关的差异表达指标。

4.训练集、测试集：利用试剂盒PARIS Kit AM1556(Invitrogen,Lithuania)进行大样本验证，对所有血浆样本进行RNA提取，通过逆转录反应得到cDNA样品，加入PCR引物和SYBR Green荧光染料进行PCR反应。通过比对标准品的Ct值，得出样本中的tRFs和tiRNAs含量。

5.统计分析：运用独立样本t检验以及非参数秩和检验比较tRFs和tiRNAs表达水平在不同研究组中的差异。通过绘制ROC曲线分析证实血浆tRFs和tiRNAs的诊断价值。

本发明研究组目前通过对乳腺癌病人的外周血浆中的tRFs和tiRNAs进行系统的表达分析，获得3个具有临床诊断潜能的乳腺癌血浆tRFs和tiRNAs标记物(tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003)。

本发明的有益效果：

1.相较于传统的肿瘤标志物，血浆tRFs和tiRNAs作为新型的生物标志物，具有稳定性好、无创、易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。

2.本发明通过tRFs和tiRNAs测序以及基于qRT-PCR的绝对定量法，对乳腺癌和正常对照人群血浆中的差异表达tRFs和tiRNAs进行严密、多阶段的验证和评价。证实了这组tRFs和tiRNAs作为诊断乳腺癌的无创标记物的可靠性以及可重复性。

3.本发明以血浆tRFs和tiRNAs作为新型的生物标志物，使临床操作更为简便，检测成本降低，提高了诊断效能。

附图说明

图1为本发明所述tRFs和tiRNAs筛选流程图。

图2为乳腺癌血浆中高表达的109个tRFs和tiRNAs。

图3为乳腺癌细胞株及细胞上清中验证15个tRFs和tiRNAs的表达水平。(A:乳腺癌细胞株培养上清；B：乳腺癌细胞株；C：两者中同时高表达的指标共6个。)

图4为训练集与测试集共同分析时，乳腺癌患者血浆中3个tRFs和tiRNAs表达水平。

图5为tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003ROC曲线分析结果。

图6为不同内参稳定性检测结果，GeNormversion 3.5评估显示miR-1228及RNU6作为内参时稳定性最高。

具体实施方式

本发明于2013年至2015年从南京医科大学第一附属医院收集了大量的乳腺癌患者和正常体检人群的静脉血浆样品，通过对样品资料的整理，从中选择了120例乳腺癌和112例正常对照的样本作为tRFs和tiRNAs测序初筛和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品。所选择的患者血浆样本均来自于初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为乳腺癌的病人。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。

实施例1

参照流程图(图1)，从乳腺癌以及正常对照血浆样本中随机选择了8例乳腺癌样本以及4例正常对照，对这12例样本进行tRFs和tiRNAs测序初筛和分析，具体步骤参照tRFs和tiRNAs测序的说明书：

1.血浆抽提

取出血浆样品，样品化冻后3000×g离心5min去除一些碎片及一些不溶成分。转移上清至新的1.5ml管中，加入750μl TRIZOL-LS后，剧烈震荡5s。

2.两相分离

匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟。每1ml的TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下13,000g离心15分钟。

3.RNA沉淀

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为：每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL-LS试剂的同时加0.5ml的异丙醇和5μl的糖元。4℃静置半小时，让RNA尽可能的析出。于4℃13,000g离心15分钟。

4.RNA清洗

移去上清液，每1ml TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。静置10分钟，然后4℃下10000g离心5分钟。

5.重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。

6.测量浓度：

通常能得到～5μg RNA/50ml血浆。

7.tRFs和tiRNAs测序

用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，同时取适量总RNA测定其OD260、OD280、浓度，RNA溶液分装后-80℃保存备用，使用NanoDrop ND-1000(NanoDropTechnologies,Wilmington,DE,USA)测定总RNA样品的纯度和浓度；使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)测定总RNA样品的纯度和浓度；

对RNA进行3’末端脱酰基反应、去除3’-cP and 5’-P加尾和去甲基化预处理，去除干扰cDNA文库构建的修饰；tRNA的高通量测序：将转录好的cDNA委托上海康成生物有限公司(http://www.aksomics.com)进行cDNA文库的质检以及在Illumina NextSeq 500测序仪进行测序。

经测序初筛后，得到了共109条差异表达的tRFs和tiRNAs，如图2所示，这109个表达指标在8个乳腺癌血浆中的表达相对于4个正常样本都超过了1.5倍差异，对照组和乳腺癌患者血浆差异tRFs和tiRNAs的相对表达量如表1所示。

表1

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实施例2

对于实施例1初筛得到的109个表达tRFs和tiRNAs按log2 FC>3,p<0.05的标准，选择15个高表达的tRFs指标：tRF-Gly-CCC-001，tiRNA-Ala-CGC-002，tRF-Arg-CCT-017，tiRNA-Phe-GAA-003，tiRNA-Lys-CTT-001，tRF-Lys-CTT-005，tRF-Ser-TGA-053，tRF-iMet-CAT-003，tRF-Pro-AGG-006，tiRNA-Lys-TTT-002，tRF-Ala-AGG-064，tRF-Gln-CTG-003，tRF-Lys-CTT-007，tRF-Glu-TTC-024，tRF-Ser-AGA-018，检测乳腺上皮细胞MCF-10A(对照)，乳腺癌细胞株ZR-75-1、MCF-7、T47D、SUM-1315、MDA-MB-231、SK-BR-3、MDA-MB-453及相应的培养基上清的表达水平进一步对比，筛选在乳腺癌细胞株及相应的培养基上清中与对照细胞中差异表达的tRFs和tiRNAs。

采用基于qRT-PCR的绝对定量法进行验证，具体步骤为：

1.细胞上清RNA提取：选用RNA提取试剂盒PARIS Kit AM1556(Invitrogen,Lithuania)，参照试剂盒说明，每个样本吸取200μl进行提取RNA，并最后用100μl DEPC水进行溶解。

2.cDNA的制备：

1)采用50μL反应体系进行逆转录实验

反应物	50μL逆转录反应体系(μL)
		RNA模板或者标准品(2μg)	15
特异RT引物(锐博，500nM)	4

以上反应体系混匀，瞬时离心后，以下列程序进行反应：

步骤时间	温度
		10min	70℃
2min	4℃

2)上述反应之后再反应体系中再加入如下反应物

反应物	50μL RT反应体系(μL)
		缓冲液(Promega)	10
dNTPs Mixture(Takara)	4
		RNA酶抑制剂，40U/μL(Takara)	1
逆转录酶，200U/μL(Promega)	1
		DEPC水	15

3.qPCR1)采用5μL反应体系，按以下比例进行试验

反应物	5μL反应体系(μL)
		SYBR Green荧光染料(Takara)	2.25
cDNA	0.5
		PCR前引物工作液(锐博)	0.5
PCR后引物工作液(锐博)	0.5
		DEPC水	1.25

反应体系混匀，瞬时离心后，放置于实时定量PCR仪中，以下列程序进行反应：

数据分析

采用ΔΔCt方法

使用PCR仪器附带的软件进行初步数据分析，获得原始的Cq值(Cp或Ct，依仪器不同名称可能不同)。

a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt。

ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HKgenes’Ct for group 1array

ΔCt(group 2)＝average Ct–average of HKgenes’Ct for group 2array

b.计算2个PCR Array(或两组)中每个基因的ΔΔCt。

ΔΔCt＝ΔCt(组2)-ΔCt(组1)

备注：通常组1是对照，组2是实验组。

c.通过2-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。

数据分析后，得到6个在乳腺肿瘤细胞密切相关的tRFs和tiRNAs：tRF-Gly-CCC-001，tiRNA-Ala-CGC-002，tRF-Arg-CCT-017，tiRNA-Phe-GAA-003，tiRNA-Lys-CTT-001，tiRNA-Lys-TTT-002，结果如图3所示。

实施例3

对上述6个与乳腺癌细胞直接相关的高表达tRFs和tiRNAs进行后续验证，后续验证主要包括训练集和测试集两个阶段，训练集样本为24例乳腺癌，24例正常对照。测试集样本为96例乳腺癌，88例正常对照。

参照实施例2采用qRT-PCR的绝对定量法进行验证，PCR反应结束后添加溶解曲线。

数据分析：通过比对不同浓度的标准品的Ct值，汇成标准曲线后可以计算获得每个样本中的tRFs和tiRNAs的绝对浓度。利用SPSS 22.0软件进行统计分析，得到了一组在训练集、测试集中乳腺癌血浆中均一致高表达的3个tRFs和tiRNAs：tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003(在训练集和测试集中P值都小于0.05，图4)。通过这3个tRFs和tiRNAs，计算每个样本的ROC曲线。如图5所示，这3个tRFs和tiRNAs组成的分子标志物能够很好的区分乳腺癌患者和正常人群。

实施例4

本发明所述试剂盒包括血浆tRFs和tiRNAs qRT-PCR引物，以及相应PCR技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，荧光探针，RNA酶抑制剂，Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。

此外，由于各项研究在血浆内参选择时仍存在一定争议，本发明选择了5种常见的血浆内参作为候选，包括miR-16-5p、miR-191-5p、miR-103a-3p、miR-1228及RNU6，并考察了本发明所述诊断试剂在检测时采用何种引物更具科学性及实用性。不同内参的选择会直接影响tRFs和tiRNAs的检测结果，因此对于内参的选择需要经过严谨的科学论证。具体的，诊断试剂包括如下组成：

RNA抽提试剂：PARIS Kit AM1556(Invitrogen,Lithuania)；

RNA逆转录反应体系：

1)RNA模板或者标准品(2μg)

2)特异RT引物(广州市锐博生物科技有限公司提供，500nM)；

3)逆转录酶，200U/μL；

4)dNTPs Mixture；

5)RNA酶抑制剂，40U/μL(Takara)

6)DEPC水

7)缓冲液(Promega)

PCR体系：

1)SYBR Green荧光染料；

2)buffer 100μL；

3)tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种的特异性的qRT-PCR上游引物(广州市锐博生物科技有限公司提供)，1管，10μM，100μL/管；

tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种的特异性的qRT-PCR下游引物(广州市锐博生物科技有限公司提供)，1管，10μM，100μL/管；

RNU6定量PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ IDNo:4)；

RNU6定量PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQID No:5)。

考察不同内参miR-16-5p、miR-191-5p、miR-103A-3p、miR-1228及RNU6时，本研究分析了所有血浆样本中不同的内参候选指标表达水平，采用GeNormversion 3.5评估内参的稳定性，计算稳定性值(M)，M值越高，稳定性越差，变异越大，M值越低，稳定性越好，变异越小。表达最稳定的内参指标被认为在作为诊断试剂时具备更高的科学性。

结果如图6所示，miR-1228及RNU6的稳定性最高，考虑到RNU6作为内参的普适性更强，应用更为广泛，最终选择RNU6作为血浆tRFs和tiRNAs差异表达的内参使用。

本发明所述试剂盒的价值在于只需要血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光法检测血浆样本中tRFs和tiRNAs的表达含量，来辅助诊断该样本来源患者的罹患乳腺癌的可能性。血浆tRFs和tiRNAs检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。

序列表

<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

<120> tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> RNA

<213> 人(human)

<400> 1

ucgagagggg cugugcucgc aagguuucuu 30

<210> 2

<211> 32

<212> RNA

<213> 人(human)

<400> 2

agagggucuu uuucaccccg cuguugcucu uu 32

<210> 3

<211> 34

<212> RNA

<213> 人(human)

<400> 3

gccgaaauag cucaguuggg agagcguuag acug 34

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.针对tRNA 来源片段检测的试剂在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于所述 tRNA 来源片段选自 tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种，所述 tRF-Arg-CCT-017核苷酸序列如 SEQ ID No:1 所示，tRF-Gly-CCC-001核苷酸序列如 SEQ ID No:2 所示，tiRNA-Phe-GAA-003 核苷酸序列如 SEQ ID No:3 所示。

2.如权利要求 1 所述的应用，其特征在于以血浆 tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001 和 tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种为检测靶标。

3. 一种乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于含有扩增 tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001 和 tiRNA-Phe-GAA-003 中的一种或多种 tRNA 来源片段的引物，所述 tRF-Arg-CCT-017核苷酸序列如SEQ ID No:1 所示，tRF-Gly-CCC-001 核苷酸序列如 SEQ ID No:2所示，tiRNA-Phe-GAA-003 核苷酸序列如 SEQ ID No:3 所示。

4.如权利要求 3 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于所述引物为 tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和 tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种的特异性 qRT-PCR 的上下游引物。

5.如权利要求 3 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于所述诊断试剂定量检测血浆tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001 和 tiRNA-Phe-GAA-003 中的一种或多种。

6.如权利要求 3 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于所述诊断试剂或试剂盒为实时荧光定量 PCR 检测试剂或试剂盒。

7.如权利要求 6 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于包括 RNA 抽提体系、RNA 反转录反应体系和 PCR 反应体系。

8.如权利要求 7 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于所述 RNA 抽提体系包括 RNA 抽提试剂；RNA 逆转录反应体系包括反转录酶、反转录体系缓冲液和 RNA 酶抑制剂；PCR 反应体系包括扩增系统和引物系统，所述扩增系统包括 SYBR Green 荧光染料试剂；所述引物系统包括 RNA 反转录随机引物和tRF-Arg-CCT-017、tRF-Gly-CCC-001和tiRNA-Phe-GAA-003中的一种或多种的特异性的qRT-PCR 的引物。

9.如权利要求 8 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于还包括内参引物。

10.如权利要求 9 所述的乳腺癌诊断试剂或试剂盒，其特征在于所述内参为RNU6。