CN108588230A

CN108588230A - 一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法

Info

Publication number: CN108588230A
Application number: CN201810932974.1A
Authority: CN
Inventors: 严枫
Original assignee: Jiangsu Cancer Hospital
Current assignee: Jiangsu Cancer Hospital
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: WO2020034543A1; CN108588230B

Abstract

本发明提供了一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法，属于生物技术领域，通过筛选乳腺癌患者组织标本，得到一种用于乳腺癌诊断的tRF&tiRNA标记物：5′‑tiRNA^Val，本发明提供的5′‑tiRNA^Val是一个低表达于乳腺癌的tiRNA，与乳腺癌的增殖、转移密切相关，具有早期诊断和预后判断的潜在价值。

Description

一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法。

背景技术

乳腺癌在我国女性恶性肿瘤中发病率位居第一位，死亡率位居第六位，严重危害人们的健康和生活。尽管在药物敏感性和外科技术上已有巨大的突破，但复发和转移的频繁发生，仍是晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。目前临床诊断乳腺癌的方法主要依赖于体格检查和影像学检查，但这些方法对于早期乳腺癌的发现敏感性很低，常用来诊断乳腺癌的血清标志物对早期诊断的敏感性和特异性均不理想。

因此，深入理解乳腺癌的发生和发展机制，积极筛选鉴定有效的诊断和预后标志物，对提高乳腺癌检出率和治愈率具有重要意义。

随着恶性肿瘤的研究从功能基因层面(编码蛋白质)逐渐拓展到非编码RNA领域，tRF&tiRNA(tRNA fragments&tRNA halves)引起广泛关注，tRF&tiRNA相关研究是一个全新的领域，在肿瘤方面的研究刚刚起步，具有类似于miRNA的调控功能，并能参与调控基因转录和翻译，细胞增殖以及细胞应激反应。有研究提示tiRNAs在鼠血清中稳定性表达，具有转录前抑制功能，可能是一类新型信号分子。

因此，从tRF&tiRNA角度挖掘乳腺癌新型分子靶标并探讨分子机制十分必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题时提供一种tRF&tiRNA，该tRF&tiRNA的异常表达与乳腺癌的发生相关，能够作为乳腺癌早期诊断或预后判断的标记物。

一种用于乳腺癌诊断的标记物，所述的标记物为5′-tiRNA^Val。

一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，方法如下：

A.对若干乳腺癌患者组织标本进行测序，芯片检测的原始数据进行均一化处理，初筛出差异倍数2倍以上的tRFs&tiRNAs；筛选出差异倍数＞2，并且P＜0.05的tRFs&tiRNAs；完全配对、不存在错配，删除同一个tRFs&tiRNAs的重复注释项目，剔除具有编码蛋白潜能、表达丰度过低的tRFs&tiRNAs，再进行聚类分析；进一步缩小研究范围，筛选差异倍数＞2.5、P＜0.05的tRFs&tiRNAs、并结合基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析以及与乳腺癌相关文献检索，最终选出若干个tRFs&tiRNAs；

B.将筛选出的tRFs&tiRNAs进行扩大组织样本RT-PCR检测，进一步筛选出表达差异倍数≥2、P＝0.000的tRFs&tiRNAs；

C.将进一步筛选出的tRFs&tiRNAs进行血清RT-PCR检测，得到表达差异倍数最大的tRF&tiRNA，即为目标tRF&tiRNA。

作为优选，所述的测序的工具为安捷伦生物分析仪2100、Illumina NextSeq500高通量台式二代测序系统及高通量基因表达数据库。

作为优选，所述的乳腺癌患者组织标本的例数为6。

作为优选，步骤A中，最终选出的tRFs&tiRNAs的个数为6。

作为优选，所述的RT-PCR检测工具为tRFs&tiRNA PCR芯片。

本发明采用tRFs&tiRNA PCR芯片进一步筛选出乳腺癌组织和血清中具有显著表达差异的tiRNA：5′-tiRNA^Val，5′-tiRNA^Val是一个低表达于乳腺癌的tiRNA，与乳腺癌的增殖、转移密切相关，具有早期诊断和预后判断的潜在价值。

附图说明

图1为本发明的5′-tiRNA^Val的结构图；

图2为本发明高通量测序乳腺癌患者组织中差异表达的tRFs&tiRNAs图；

图3为本发明聚类分析乳腺癌患者组织中差异表达的tRFs&tiRNAs图；

图4为本发明乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-001430的表达水平图；

图5为本发明乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-001130的表达水平图；

图6为本发明乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-000779的表达水平图；

图7为本发明乳腺癌组织(癌和癌旁)RT-PCR筛选出的AS-tDR-001430、AS-tDR-001130和AS-tDR-000779的表达水平对比图；

图8为本发明6条待验证tRFs&tiRNAs实时定量PCR引物序列图；

图9为本发明RT-PCR检测乳腺癌和癌旁组织中5′-tiRNA^Val水平图；

图10为本发明RT-PCR检测乳腺癌血清中5′-tiRNA^Val水平与正常水平对比图；

图11为本发明RT-PCR检测乳腺癌血清中5′-tiRNA^Val水平在不同时期的对比图；

图12为本发明AS-tDR-001430所在的染色体位置示意图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不限制本发明的保护范围。

实施例一

1.目标tRF&tiRNA筛选

1)从生物样本库中获取6例乳腺癌患者组织标本(癌及癌旁)，应用安捷伦生物分析仪2100(Agilent BioAnalyzer 2100)文库准备、Illumina NextSeq 500高通量台式二代测序系统测序及高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus)大数据分析筛选tRFs&tiRNAs，结果显示：组织中差异表达2倍以上的tRFs&tiRNAs共1135个(上调496个、下调639个，如图2所示)；

2)根据差异倍数FC(Fold change)＞2，P＜0.05(FC越大，说明两个样本之间的差异越大，P值(P value)当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率，是用来判定假设检验结果的一个参数,是最常用的统计指标之一，P越小，说明差异基因的可靠性越高)，完全配对，不存在错配，删除同一个tRF&tiRNA的重复注释，剔除具有编码蛋白潜能、表达丰度过低的tRFs&tiRNAs，通过聚类分析，得出符合条件指标的tRFs&tiRNAs：上调17个、下调14个(如图3所示)；

3)以FC＞2.5、P＜0.05、并结合基因本体功能富集分析(Gene Ontology功能富集分析)和京都基因与基因组百科全书通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes通路分析)以及与乳腺癌相关文献检索，最终选出6个差异表达的tRFs&tiRNAs：上调4个(AS-tDR-001356，FC＝3.66，P＝0.000；

AS-tDR-000882，FC＝2.90，P＝0.008；

AS-tDR-000014，FC＝4.89，P＝0.000；

AS-tDR-000779，FC＝6.58，P＝0.023)，

下调2个(AS-tDR-001430，FC＝-2.65，P＝0.019；

AS-tDR-001130，FC＝-4.90，P＝0.028)。

2.测序筛选的6条tRFs&tiRNAs的组织RT-PCR检测(如图8所示)

采用RT-PCR检测16对组织(乳腺癌癌及癌旁)中的上述6个tRFs&tiRNAs的表达水平(引物序列见表2)，结果发现：高表达组中AS-tDR-000779(16/16例)上调2倍，P＝0.000(如图6所示)，其他3个tRFs&tiRNAs表达差异没有统计学意义；低表达组AS-tDR-001130(15/16例)下调2.1倍，P＝0.000(如图5所示)；AS-tDR-001430(16/16例)下调倍数最大为4.6倍，P＝0.000(如图4所示)。所以选出AS-tDR-000779、AS-tDR-001430、AS-tDR-001130进一步验证。

3.组织RT-PCR筛选的3条tRFs&tiRNAs的血清RT-PCR检测

收集30例乳腺癌、20例健康对照者血清标本，采用RT-PCR分别检测血清中3条tRFs&tiRNAs的表达水平，结果显示乳腺癌患者血清AS-tDR-000779表达无差异；AS-tDR-001130下调2.32倍，P＝0.002；AS-tDR-001430下调倍数较大为2.50倍，P＝0.022(如图9所示)。AS-tDR-001430的阳性率高，且在组织和血清中差异倍数皆最大。因此，我们重点关注该分子。

实施例二

1.目标tRF&tiRNA筛选

AS-tDR-000882，FC＝2.90，P＝0.008；

AS-tDR-000014，FC＝4.89，P＝0.000；

AS-tDR-000779，FC＝6.58，P＝0.023)，

下调2个(AS-tDR-001430，FC＝-2.65，P＝0.019；

AS-tDR-001130，FC＝-4.90，P＝0.028)。

2.测序筛选的6条tRFs&tiRNAs的组织RT-PCR检测(如图8所示)

3.组织RT-PCR筛选的3条tRFs&tiRNAs的血清RT-PCR检测

4.目标tRF&tiRNA的生物学属性和命名

首先分析AS-tDR-001430生物学属性并命名。通过UCSC在线软件生物信息学分析发现：AS-tDR-001430位于染色体6p22.1，坐标为27,248,049-27,248,121，长度为73bp。MINTbase数据库显示：AS-tDR-001430在MINTbase库中ID：tRF-32-Q99P9P9NH57SJ，序列为5′-GCTTCTGTAGTGTAGTGGTTATCACGTTCGCC-3′，是由ANG在成熟tRNA-Val-CAC-2-1的反密码子环(CTCACAC)处特异性切割产生的片段，类型为5′-half，片段长度为32nt。根据上述生物信息再参照文献，把AS-tDR-001430命名为5′-tiRNA^Val(如图1所示)。

实施例三

1.目标tRF&tiRNA筛选

1)从生物样本库中获取6例乳腺癌患者组织标本(癌及癌旁)，应用安捷伦生物分析仪2100(Agilent BioAnalyzer 2100)文库准备、Illumina NextSeq500高通量台式二代测序系统测序及高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus)大数据分析筛选tRFs&tiRNAs，结果显示：组织中差异表达2倍以上的tRFs&tiRNAs共1135个(上调496个、下调639个，如图2所示)；

AS-tDR-000882，FC＝2.90，P＝0.008；

AS-tDR-000014，FC＝4.89，P＝0.000；

AS-tDR-000779，FC＝6.58，P＝0.023)，

下调2个(AS-tDR-001430，FC＝-2.65，P＝0.019；

AS-tDR-001130，FC＝-4.90，P＝0.028)。

2.测序筛选的6条tRFs&tiRNAs的组织RT-PCR检测(如图8所示)

3.组织RT-PCR筛选的3条tRFs&tiRNAs的血清RT-PCR检测

4.初步分析5′-tiRNA^Val与临床病理参数的关系

16对组织，根据癌组织中5′-tiRNA^Val表达水平的中位数将患者分为高表达和低表达两组，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中5′-tiRNA^Val的表达水平显著下降。癌组织中5′-tiRNA^Val表达上调者淋巴结转移率(1/9)明显低于表达下调者淋巴结转移率(5/7)(χ2＝5.730,P＝0.035)。分析前述30例乳腺癌患者血清5′-tiRNA^Val与临床病理参数的关系，发现其表达水平与乳腺癌患者肿瘤的TNM分期以及淋巴结转移显著负相关。提示5′-tiRNA^Val的作用机制可能贯穿了包括发生、增殖、转移在内的乳腺癌恶性进程(cancer progression)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于乳腺癌诊断的标记物，其特征在于：所述的标记物为5′-tiRNA^Val。

2.一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，其特征在于：

方法如下：

3.根据权利要求2所述的一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，其特征在于：所述的测序的工具为安捷伦生物分析仪2100、Illumina NextSeq 500高通量台式二代测序系统及高通量基因表达数据库。

4.根据权利要求2所述的一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，其特征在于：所述的乳腺癌患者组织标本的例数为6。

5.根据权利要求2所述的一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，其特征在于：步骤A中，最终选出的tRFs&tiRNAs的个数为6。

6.根据权利要求2所述的一种用于乳腺癌诊断的标记物的筛选方法，其特征在于：所述的RT-PCR检测工具为tRFs&tiRNA PCR芯片。