CN111534587B - 分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分子标志物5‑tRF‑His、乳腺癌检测试剂盒及其应用。本发明的5‑tRF‑His可以作为检测乳腺癌的分子标志物，5‑tRF‑His与乳腺癌的增殖、凋亡密切相关，用于诊断乳腺癌和预后判断。

Description

分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用。
背景技术
乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率位居第一位，死亡率位居第六位，严重危害人们的 健康和生活。尽管在药物敏感性和外科技术上已有巨大的突破，但复发和转移的频繁发生，仍是晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。目前临床诊断乳腺癌的方法主要依赖于体格 检查和影像学检查，但这些方法对于早期乳腺癌的发现敏感性很低，常用来诊断乳腺癌 的血清标志物对早期诊断的敏感性和特异性均不理想。因此，深入理解乳腺癌的发生和 发展机制，积极筛选鉴定有效的诊断和预后标志物，对提高乳腺癌检出率和治愈率具有 重要意义。
转运RNA(tRNA)传统意义上作为转运核糖核酸至核糖体载体，是参与合成蛋白 质的重要分子，其经典的三叶草结构已有深入研究。但是tRNA在基因调控方面的功能 知之甚少。日前，以tRNA为前体，经酶剪切而成的tRF&tiRNA(tRNA fragments&tRNA halves)引起广泛关注。查阅相关文献显示，相关tRF&tiRNA在肿瘤方面的研究刚刚起 步，具有类似于miRNA的调控功能，并能参与调控基因转录和翻译，细胞增殖以及细 胞应激反应。有研究提示tiRNAs在鼠血清中稳定性表达，具有转录前抑制功能，可能 是一类新型信号分子。
tRF是在物种间高度保守的单链小RNA分子，长度在15-34个核苷酸序列之间，不具有编码蛋白质的能力。根据在前体tRNA上不同的剪切位点，将切割产物分为以下几 种：3’tRF、5’tRF、tiRNAs、tRNA halves等。因与miRNAs长度类似，tRF已在多项研 究中显示具有类似的调控靶基因mRNA的功能，可能对细胞起到关键的调节作用。因 此，从tRF&tiRNA角度挖掘乳腺癌新型分子靶标并探讨分子机制十分必要。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种用于乳腺癌的诊断或预后判断的分子标志物 5-tRF-His。本发明还提供了该5-tRF-His在诊断乳腺癌或预后判断的试剂或试剂盒中的 用途以及检测试剂或试剂盒。
技术方案：本发明第一方面提供了用于乳腺癌的诊断或预后判断的分子标志物，所 述分子标志物为5-tRF-His，所述5-tRF-His的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面提供了乳腺癌分子标志物用于制备诊断乳腺癌或预后判断试剂或试 剂盒的用途，所述乳腺癌分子标志物为5-tRF-His，所述5-tRF-His核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明第三方面提供了一种用于诊断乳腺癌或预后判断的试剂或试剂盒，所述试剂 或试剂盒用于检测血清中5-tRF-His表达水平。
上述用于诊断乳腺癌的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含如SEQ ID NO.2所示 的引物1以及如SEQ ID NO.3所示的引物2。
进一步地，检测5-tRF-His表达量的试剂盒(PCR试剂盒)。除了上述的引物探针，还包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC 水等；还可以含有标准品和/或对照品。
所述引物1为PCR正向引物：5’-CAGTCCGACGATCTGCCG-3'(SEQ ID NO.2)；所 述引物2为PCR反向引物：5’-GCTCTTCCGATCTCTAACCACTAT-3'(SEQ ID NO.3)。
本发明第四方面还提供了一种用于检测乳腺癌分子标志物的探针，所述探针包含如 SEQ ID NO.2所示的引物1以及如SEQ ID NO.3所示的引物2，所述乳腺癌分子标志物 为5-tRF-His。
本发明第五方面提供了用于检测血清中5-tRF-His的引物在制备诊断乳腺癌或预后 判断的试剂或试剂盒中的用途，所述引物包含如SEQ ID NO.2所示的引物1以及如SEQID NO.3所示的引物2。
本发明第六方面提供了5-tRF-His在制备治疗乳腺癌药物的应用。
本发明第七方面提供了5-tRF-His在制备阻碍乳腺癌细胞MDA-MB-231以及MCF7增殖药物的应用。本发明还提供了5-tRF-His在制备促进乳腺癌细胞MDA-MB-231以及 MCF7凋亡药物中的应用。
本发明第八方面提供了5-tRF-His的检测方法，该检测方法包含以下步骤：通过如SEQ ID NO.2所示的引物1以及如SEQ ID NO.3所示的引物2，检测血清中5-tRF-His。
具体地，该方法首先对样本利用实施例1.2部分进行前处理，处理后的样本通过实施例1.3部分的方法检测5-tRF-His。
本发明第九方面提供了一种用于乳腺癌的诊断的分子标志物作为筛选药物候选物或 疫苗候选物的体外或离体用途，所述分子标志物为5-tRF-His，所述5-tRF-His的核苷酸 序列如SEQ ID NO.1所示；所述药物候选物或疫苗候选物为潜在的有效预防和/或治疗乳腺癌的化合物或生物制品。
有益效果：(1)本发明证实了5-tRF-His可以作为乳腺癌诊断标志物，可通过检测血清中的5-tRF-His表达量来诊断和预示乳腺癌，取样方便、易于检测，且具有特异性 和灵敏度高等优点；(2)本发明通过检测发现，5-tRF-His在乳腺癌组织中的表达明显 低于癌旁组织，在乳腺癌患者血清中的表达明显低于健康个体，证明5-tRF-His可以作 为乳腺癌的诊断标志物；(3)本发明检测发现5-tRF-His水平在乳腺癌细胞中低于其他 细胞系，证明乳腺癌中5-tRF-His特异性低表达，诊断更加准确、快速；(4)本发明为 乳腺癌的检测及治疗提供了新思路。
附图说明
图1为5-tRF-His在乳腺癌组织和细胞中低表达，其中，A为以0.5和2.0为界将乳腺癌组织及其相应癌旁组织5-tRF-His表达的比值(T/N)分为三组；B为23对乳腺癌组织 被分为两组：其中20对T/N＜0.5，另外3对T/N在0.5-2.0之间；C为qPCR检测其中 20对乳腺癌组织中5-tRF-His的相对表达量；D为30个正常健康对照血清和60个乳腺 癌患者血清表达的散点图分析，乳腺癌组出现了显著下调，继续对60个乳腺癌患者血 清进行分析发现，相较于StageⅠ-Ⅱ组，StageⅢ-Ⅳ组患者血清中5-tRF-His下调更明显， 并且低表达5-tRF-His者淋巴结远端转移率高；E为Roc曲线分析5-tRF-His的血清学诊 断效能，曲线下面积(AUC)为0.7167，具有统计学差异；F为qPCR检测5-tRF-His 在乳腺、肝癌、结直肠癌细胞系中的表达；G为qPCR检测乳腺癌细胞中5-tRF-His表 达的核/质比，U6、GAPDH分别作为核、质中RNA提取物的内参；H为FISH检测 5-tRF-His在乳腺癌细胞中的表达和亚细胞定位，红色荧光为5-tRF-His荧光信号，蓝色 荧光为DAPI荧光信号。
图2为5-tRF-His的基本生物学特征分析结果证实5-tRF-His是tRNA来源的小分子， 与pan-ago蛋白结合发挥作用，其中，A为MINTbase数据库中5-tRF-His的生物学信息；B为5-tRF-His前体tRNAs染色体位置以及FASTA序列，其中5-tRF-His序列以粗体显 示；C为沉默Dicer基因低表达Dicer酶之后，通过Northern blot检测发现，随着成熟 tRNA的增加，5-tRF-His的表达却降低，表明5-tRF-His的产生可能由Dicer酶参与剪 切成熟tRNA而来。tRNAs三叶草结构以及5-tRF-His生成序列示意图；D为RNA免疫 沉淀表明，与miRNA的作用类似，5-tRF-His可与pan-ago蛋白结合，提示pan-ago蛋 白是5-tRF-His参与癌细胞活动的重要因子。
图3为5-tRF-His可发挥miRNA样作用，直接与CKAP2结合抑制其在乳腺癌中发 挥作用，其中，A为TCGA数据库分析CKAP2表达差异箱式图；B为TCGA数据库分 析CKAP2生存分析；C为双荧光报告实验：5-tRF-His与预测靶基因CKAP2 3′UTR的 结合位点和突变序列；D为过表达5-tRF-His，qRT-PCR检测乳腺癌细胞中CKAP2的 mRNA表达水平；E为Western Blot检测过表达5-tRF-His后下游基因蛋白表达；F-G为 组织微芯片同时染色CKAP2和5-tRF-His，对比表达发现二者呈显著负相关关系，即 5-tRF-His表达低的患者其CKAP2表达较高，反之5-tRF-His表达高的患者其CKAP2 表达较低；H为5-tRF-His低表达组(+)和高表达组(++～+++)两组间的生存分析比 较，结果发现5-tRF-His高表达组生存率明显高于低表达组，P＝0.0084差异具有统计学 意义。
图4为5-tRF-His在人乳腺癌细胞中的增殖功能研究结果；其中，A为qRT-PCR检 测结果：在两株乳腺癌细胞中过表达5-tRF-His后，与对照组比较，其mRNA表达量显 著上升；B为CCK8细胞增殖实验；C为克隆形成实验；D为EdU增殖实验；E为流式 细胞凋亡分析,图4中的增殖实验结果表明，与对照组比较，过表达5-tRF-His后乳腺癌 细胞的增殖能力明显下降，而凋亡细胞显著增加。
图5为5-tRF-His通过erk-2依赖途径介导乳腺癌增殖与凋亡，其中，A-D分别为EdU染色、CCK8增殖实验和流式细胞术实验结果，A-D结果表明，沉默CKAP2的表 达可逆转5-tRF-His的下调对乳腺癌细胞增殖以及凋亡的影响；E为Western blot检测结 果，发现CKAP2下游erk2信号通路因此发生相应蛋白表达量的变化，说明5-tRF-His 可通过介导CKAP2表达，依赖erk2信号通路途径，从而影响乳腺癌细胞的功能。
图6为5-tRF-His抑制乳腺癌增殖的体外实验结果，其中，A为小鼠体内乳腺癌组织增殖结果，具体为稳定过表达5-tRF-His的乳腺癌细胞，将其注入裸鼠体内，分为对照 组(NC/LV-control)和实验组(5-tRF-His/LV-tRF)，每组六只；B为小鼠的体重生长曲 线，测量周期为三十天，测量间隔为每五天测量一次；C为单独测量体外瘤体的重量； D-E为利用荧光原位杂交实验，根据经典增殖核抗原ki67的表达观察瘤体的增殖能力， 并作出定量分析，结果表明与对照组比较，过表达5-tRF-His裸鼠组，ki67表达下降即 增殖减弱。
具体实施方式
一、原料及试剂
1.1标本收集
2018年12月至2019年7月从南京医科大学附属肿瘤医院组织标本库收集乳腺癌病人标本。根据美国癌症划分联合委员会(American Joint Commission for CancerStaging， AJCC)的第七版乳腺癌临床分期标准，分为Stage0：TisN0M0；StageⅠ：T1N0M0；Stage ⅡA：T0N1M0，T1N1M0，T2N0M0；StageⅡB：T2N1M0，T3N0M0；StageⅢA：T0N2M0，T1N2M0，T2N2M0，T3N1-2M0；StageⅢB：T4N0-2M0；StageⅢC：任何T N3M0； StageⅣ：任何T任何N M1stage。其中Tis是原位癌，T代表原发性肿瘤，Y表示远处 转移，N表示区域淋巴结无远端转移。患者平均年龄45±5.61岁，均为女性。所有患者 均获得知情同意书,所有标本进行组织病理学分析以确认患者患有乳腺癌，距离5cm以 上收集癌旁组织，已签署知情同意书,依据其性别，年龄及标本数目将血浆乳腺癌标本 在此分组为：健康女性对照组(30人)，BC组(60人)。
1.2RNA抽提、血清中分子标记物前处理与DNA合成
加入1ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆，提取总RNA，在分光光度计 1000纳米处进行检测，取5微克总RNA用于前处理。采用Arraystar公司的rtStarTM tRF&tiRNAPretreatment Kit(Cat#AS-FS-005)对总RNA去乙酰化、去甲基化和rtStarTM First-StrandcDNASynthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003)用于cDNA合成。
1.3实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)检测分子标记物
PCR扩增，用TB GREEN Premix Ex TaqTM(Takara)试剂盒，根据其说明书操作。
反应体系：
Figure BDA0002462716030000051
PCR扩增条件：
Stage 1：95℃，30s，1Cycle
Stage 2：95℃，10s→60℃，30s，40Cycles
Stage 3：95℃，5s→60℃，60s，1Cycle
Stage 4：50℃，30s，1Cycle
PCR扩增完成后，在设备上计算分析扩增曲线、融解曲线和循环数，溶解曲线要呈现单峰。如果不符合要求，数据不可信。采用ΔΔCT法计算基因相对表达量，CT指循 环阈值。其中ΔCT＝目的基因CT值-内参基因CT值，ΔΔCT＝实验组ΔCT-对照组ΔCT， 基因相对表达量＝2-ΔΔCT。
实时荧光定量PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：
5-tRF-His的特异上游引物F：5’-CAGTCCGACGATCTGCCG-3'(引物1，SEQ ID NO.2)；特异下游引物R：5’-GCTCTTCCGATCTCTAACCACTAT-3’(引物2，SEQ ID NO.3)。
U6的特异上游引物F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；特异下游引物R： 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’
1.4细胞、siRNA准备
乳腺细胞株(HBL-100、MDA-MB-231、MCF7、BT549)、肝癌细胞株(SMMC-7721、 Bel-7402)、结直肠癌细胞株(HT-29、HCT116)购自中科院细胞库。SiCKAP2购自广 州锐博公司，根据5-tRF-His核酸序列在广州锐博公司定制inhibitor和mimics。Dicer1-sh 购自上海吉凯(基因ID 23405)。
细胞培养方法按照每株细胞的培养说明书进行，培养的仪器以及培养手段参照《细 胞培养基本知识手册》或现有文献中公开的方法进行。
细胞增殖实验：本实施例中采用CCK8细胞增殖实验，包括以下步骤：
制备细胞悬液：细胞计数；
接种到96孔板中：每孔100ul细胞悬液，细胞悬液的浓度为1×105个/ml，同样的样本做3个重复；37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁培养2-4小时；
加入10ul CCK8：加入CCK8后轻轻敲击培养板以帮助混匀后，继续培养4个小时；
测定450nm吸光度参比波长600nm。
1.5流式细胞术
用PBS洗涤细胞二次(离心1000rpm，5min)收集5×105细胞；
加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；
加入5μL Annexin V-FITC(Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，江苏凯基KGA105)
混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；
室温、避光、反应5-15min；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。
1.6免疫印迹实验(Western blot)
将细胞蛋白裂解物在SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在 封闭缓冲液(含1％吐温-20的PBS缓冲液中的5％牛奶)中封闭，然后用特异性抗体孵育。所使用的一抗是CKAP2(Abcam,Cat#ab198188)。
1.7荧光素酶分析
荧光素酶报告载体与Renila荧光素酶表达质粒共转染进乳腺癌细胞，之后进行细胞 收集，用双荧光素酶试剂检测荧光素酶活性。
1.8RNA免疫沉淀实验
RNA复合物通过石碳酸氯仿提取分离，用定量PCR分析。
1.9RNA探针5-tRF-His沉淀
生物素标记的探针：5’-ctaaccactatacgatcacggca-3’-biotin，由上海生工合成。在 MDA-MB-231、MCF7细胞中检测细胞定位和核质含量。
1.10FISH实验方法
室温将细胞爬片在的PBS中洗3次，每次5min。
室温下将标本在三倍体积的4％多聚甲醛中固定60min以上。
将爬片在室温的PBS中洗3次，每次5min；随后自然风干。
脱水：将标本分别在70％、85％、100％浓度梯度的乙醇中按顺序依次室温浸5min。
杂交液探针混合物覆盖细胞爬片，于4℃过夜。
PBS中洗3次，每次5min，封片，荧光显微镜下观察。
1.11统计分析
使用ROC曲线下面积(AUC-ROC)评估5-tRF-His预测乳腺癌的诊断价值，并通过ROC曲线确定了诊断阈值。P<0.05时被认为有显著统计学意义。
1.12本实施例中提及的其余实验方法的参见以下文献：
Mature and functional viral miRNAs transcribed from novel RNApolymerase III promoters，RNA polymerase III transcribed viral microRNAs[J]，Vol.16,No.1，176-185；
miR-889promotes proliferation of esophageal squamous cell carcinomasthrough DAB2IP，Y.Xu et al./FEBS Letters 589(2015)1127–1135。
二、实验结果
实施例1：高通量测序检测tRNA来源的小分子片段在乳腺癌组织中的表达及筛选
我们通过随机选取的6对乳腺癌组织癌和癌旁的测序结果比较，采用IlluminaNextSeq500高通量测序分析乳癌组和癌旁对照组的tRFs&tiRNAs表达量。结果显示1135 条tRFs&tiRNAs表达差异倍数(Fold Change，FC)大于2。为缩小研究范围，基于FastQCsoftware和cutadapt软件分析、与数据库MINTbase比对、FC>2、P<0.05，通过聚类分 析得出tRFs&tiRNAs上调17条，下调14条。进一步筛选确定5-tRF-His作为研究对象。 剔除表达丰度低，以FC>5、均一性好，表达量丰富为原则，筛选获得5条上调和1条 下调的tRFs&tiRNAs。而其中5-tRF-His呈现明显低表达，差异倍数最大。
对5-tRF-His的进一步研究结果如图1所示，从图1的结果可以看出，5-tRF-His在人乳腺癌组织和细胞株中表达下降，图1中A为以0.5和2.0为界将乳腺癌组织及其相 应癌旁组织5-tRF-His表达的比值(T/N)分为三组图1中B为选取的23对乳腺癌组织被 分为两组：其中20对T/N＜0.5，另外3对T/N在0.5-2.0之间；图1中C为通过1.3 部分提供的qPCR方法检测其中20对T/N＜0.5(筛去T/N高于0.5的三对)的乳腺癌 组织中5-tRF-His的相对表达量；图1中D为30个正常健康对照血清和60个乳腺癌患 者血清表达5-tRF-His的散点图分析，乳腺癌组出现了显著下调。继续对60个乳腺癌患 者血清进行分析发现，相较于StageⅠ-Ⅱ组，StageⅢ-Ⅳ组患者血清中5-tRF-His下调更 明显，并且低表达5-tRF-His者淋巴结远端转移率高。图1中E为(E)Roc曲线分析 5-tRF-His的血清学诊断效能，曲线下面积(AUC)为0.7167，具有统计学差异；图1 中F为qPCR检测5-tRF-His在乳腺细胞系HBL-100、MDA-MB-231、MCF7、BT549、 肝癌细胞系SMMC-7721(图中标记为7721)、Bel-7402(图中标记为7402)、结直肠癌 细胞系HT-29、HCT116中的表达；图1中G为qPCR检测乳腺癌细胞中5-tRF-His表达的核/质比，U6、GAPDH分别作为核、质中RNA提取物的内参；图1中H为FISH检 测5-tRF-His在乳腺癌细胞中的表达和亚细胞定位，红色荧光为5-tRF-His荧光信号，蓝 色荧光为DAPI荧光信号，表明5-tRF-His定位于细胞质，可能在转录水平发挥作用。
实施例2：5-tRF-His的基本生物学特征
我们进一步研究5-tRF-His的基本生物学特征，结果如图2所示，图2中A为MINTbase数据库中5-tRF-His的生物学信息；图2中B为5-tRF-His前体tRNAs染色体 位置以及FASTA序列，其中5-tRF-His序列以粗体显示；图2中C为Northern blot检测 结果、tRNAs三叶草结构以及5-tRF-His生成序列示意图，Northern blot的检测结果表明， 沉默Dicer基因低表达Dicer酶之后，随着成熟tRNA的增加，5-tRF-His的表达却降低， 这表明5-tRF-His的产生可能由Dicer酶参与剪切成熟tRNA而来，对qRT-PCR产物进 行琼脂糖凝胶电泳可以确定5-tRF-His长度为23nt(如SEQ ID NO.1所示: 5’-TGCCGTGATCGTATAGTGGTTAG-3’)；图2中D为RNA免疫沉淀结果，该结果表 明，与miRNA的作用类似，5-tRF-His可与pan-ago蛋白结合，提示pan-ago蛋白是 5-tRF-His参与癌细胞活动的重要因子。
实施例3：5-tRF-His与下游靶基因CKAP2具有预测结合位点
我们进一步研究5-tRF-His的结合位点，采用GO以及KEGG生物学分析，结合miRanda以及TargetScan分析软件筛选出CKAP2为可能的靶标。如图3所示，图3中 A为TCGA数据库分析CKAP2表达差异箱式图；图3中B为TCGA数据库分析CKAP2 生存分析；图3中C为双荧光报告实验：5-tRF-His与预测靶基因CKAP2 3 UTR的结合 位点和突变序列；图3中D为过表达5-tRF-His，qRT-PCR检测乳腺癌细胞中CKAP2 的mRNA表达明显降低；图3中E为WesternBlot检测过表达5-tRF-His后，CKAP2 蛋白表达量同样降低，并且其下游基因蛋白表达呈现出如下变化：PCNA和p-erk2降低， erk2表达不变；图3中F-G为组织微芯片同时染色CKAP2和5-tRF-His，对比表达利用 卡方检验发现二者呈显著负相关关系，即5-tRF-His表达低的患者其CKAP2表达较高， 反之5-tRF-His表达高的患者CKAP2表达较低，图3中H为5-tRF-His低表达组(+) 和高表达组(++～+++)两组间的生存分析比较，结果发现5-tRF-His高表达组生存率明 显高于低表达组，P＝0.0084差异具有统计学意义。结合以上qRT-PCR、Westernblot、荧 光素酶报告基因验证靶基因进一步分析，发现5-tRF-His与下游靶基因CKAP2结合位点 与预测相符。
实施例4：5-tRF-His抑制乳腺癌细胞增殖及促进乳腺癌细胞凋亡
我们对5-tRF-His在人乳腺癌细胞中的增殖功能研究，结果如图4所示，图4中A 为qRT-PCR检测在两株乳腺癌细胞中过表达5-tRF-His后，与对照组比较，其mRNA 表达量显著上升，可用于下一步实验；图4中A-C分别为CCK8细胞增殖实验、克隆形 成实验、EdU增殖实验，结果显示与对照相比，随着5-tRF-His过表达，乳腺癌细胞的 增殖能力减弱；图4中E为流式细胞凋亡分析，结果显示对于实验组5-tRF-His在乳腺 癌细胞中的过表达导致细胞凋亡增加。以上增殖实验表明，与对照组比较，过表达 5-tRF-His后乳腺癌细胞的增殖能力明显下降，而凋亡细胞显著增加。
实施例5：5-tRF-His可发挥miRNA样作用，直接与CKAP2结合抑制其在乳腺癌中 发挥作用
如图5所示，将5-tRF-His抑制剂和CKAP2抑制剂siCKAP2同时转染进乳腺癌细 胞MCF7、MDA-MB-231，发现siCKAP2可以抵消5-tRF-His抑制剂对乳腺癌细胞增殖 与凋亡的作用，表明5-tRF-His通过erk-2依赖途径介导乳腺癌增殖与凋亡。
图5中A-C分别为EdU染色、CCK8增殖实验和流式细胞术实验，结果表明，沉默CKAP2的表达可逆转5-tRF-His的下调对乳腺癌细胞增殖以及凋亡的影响，证实了图3 中5-tRF-His下游靶基因CKAP2具有结合位点，对CKAP2具有抑制作用。图5中D为 Western blot检测结果，发现CKAP2下游erk2信号通路因此发生相应蛋白表达量的变化， 再次说明5-tRF-His可通过介导CKAP2表达，依赖erk2信号通路途径，从而影响乳腺 癌细胞的功能。
实施例6：5-tRF-His抑制乳腺癌增殖的体外实验
我们进一步对5-tRF-His抑制乳腺癌的影响进行体外实验，结果如图6所示，图6中A为培养能稳定过表达5-tRF-His的乳腺癌细胞，选取八周左右无胸腺裸鼠(购自必 凯实验动物有限公司，上海)，每只皮下注射大约5×106个稳转细胞(稳定过表达 5-tRF-His的乳腺癌细胞)，分为对照组(NC/LV-control)和实验组(5-tRF-His/LV-tRF)， 每组六只，每组处理三组平行组，三十天后取皮下组织，结果表明，过表达5-tRF-His 的乳腺癌细胞注入到小鼠体内，形成的肿瘤组织增长速度明显降低；图6中B为三十天 内每五天测量每组小鼠的体重，作出生长曲线；图6中C单独测量体外瘤体的重量；图 6中D-E利用荧光原位杂交实验，根据经典分子ki67的表达观察瘤体的增殖能力，并作 出定量分析。结果表明与对照组比较，过表达5-tRF-His裸鼠组，ki67表达下降即增殖 减弱。
从以上结果可以看出，5-tRF-His可以作为乳腺癌诊断标志物，可通过检测血清中的 5-tRF-His表达量来诊断和预示乳腺癌，具有特异性和灵敏度高等优点。
序列表
<110> 江苏省肿瘤医院
<120> 分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 5-tRF-His 核苷酸序列(5-tRF-His nucleotide sequence)
<400> 1
tgccgtgatc gtatagtggt tag 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 5-tRF-His 正向引物序列(5-tRF-His forward primer)
<400> 2
cagtccgacg atctgccg 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 5-tRF-His反向引物(5-tRF-His Reverse primer)
<400> 3
gctcttccga tctctaacca ctat 24

Claims (2)

1.如SEQ ID NO.1所示的5-tRF-His在制备治疗乳腺癌药物的应用。
2.如SEQ ID NO.1所示的5-tRF-His在制备阻碍乳腺癌细胞MDA-MB-231以及MCF7增殖和促进乳腺癌细胞MDA-MB-231以及MCF7凋亡药物中的应用。
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