CN111020032A - miRNA-196b在作为非小细胞肺癌分子标志物和治疗靶点中的应用 - Google Patents
miRNA-196b在作为非小细胞肺癌分子标志物和治疗靶点中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了miRNA‑196b在作为非小细胞肺癌分子标志物中的应用。本发明首次发现抑癌基因QKI‑5基因沉默能够促进miRNA‑196b在肺癌细胞中的表达，并且miR‑196b的表达能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和细胞周期进程通过抑制其靶基因GATA6和TSPAN12，从而提高动物体内肿瘤繁殖能力。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤防治技术领域，尤其涉及miRNA-196b在作为非小细胞肺癌分子标志物和治疗靶点中的应用。
背景技术
在我国，肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中长期居于首位，其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最为普遍，占发病总数的80％以上。随着新的化疗药物，靶向药物的问世和手术治疗技术的不断改进提高了部分肺癌患者的治疗效果，但5年生存率仍然仅为15％左右。其主要原因是肺癌的生物学特性十分复杂，恶性程度高，且由于早期症状的隐匿性，多数肺癌患者在确诊时已经属于晚期。因此，迫切需要找出敏感及特异性的早期肺癌生物标志物和有效的治疗靶点。
RNA结合蛋白QKI在许多恶性肿瘤中被认为是抑癌基因。QKI是一个保守的STAR(signal transduction and activation of RNA)家族蛋白、有4个蛋白亚型(QKI-5,QKI-6,QKI-7和QKI-7b)，主要差别在于它们的C末端不同。
非小细胞肺癌(NSCLC)中QKI-5是显性亚型，QKI-5的下调与早期肺癌患者的生存时间缩短密切相关，但其对于NSCLC的抑癌作用机制仍有待阐明。微小RNA(miRNA)在肿瘤中的表达具有组织特异性，不仅可以做为肿瘤标志物，还可以成为治疗靶点。这些具有组织特异性的miRNA表达在肿瘤的发展和转移过程中起至关重要的作用，调控这些具有致癌或抑癌功能的特异性miRNA表达可能可以成为治疗肺癌的新的辅助手段。
基于此，本发明拟系统研究NSCLC中QKI-5相关的miRNA，并分析QKI-5与miRNA的相互作用在NSCLC发展和转移过程中的作用机制。同时深入研究QKI-5调控miRNA的分子机制和miRNA及其靶基因在肺癌发展和转移过程中的作用模式。本发明为NSCLC的早期诊断提供新的生物标志物，并为治疗提供有效的靶点。
发明内容
本发明提供了抑癌基因QKI-5调控的miRNA-196b和其靶基因在作为非小细胞肺癌分子标志物、治疗靶点以及制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用，首次发现QKI-5基因沉默能够促进miR-196b在肺癌细胞中的表达。miRNA-196b的表达能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和细胞周期进程，通过抑制其靶基因GATA6和TSPAN12，从而提高动物体内肿瘤繁殖能力。
具体技术方案如下：
本发明提供了miRNA-196b在作为非小细胞肺癌分子标志物和治疗靶点中的应用。
进一步地，所述miRNA-196b的检测试剂用于制备非小细胞肺癌早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
本发明提供了miRNA-196b在制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
进一步地，所述治疗非小细胞肺癌药物为miRNA-196b的抑制剂，用于抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和/或非小细胞肺癌细胞G1期向S期转换。
本发明还提供了转录因子GATA6在作为非小细胞肺癌分子标志物、治疗靶点以及制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
进一步地，所述转录因子GATA6的检测试剂用于制备非小细胞肺癌早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
本发明还提供了抑癌基因TSPAN12在作为非小细胞肺癌分子标志物、治疗靶点以及制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
进一步地，所述抑癌基因TSPAN12的检测试剂用于制备非小细胞肺癌早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
进一步地，所述非小细胞肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。
miRNA-196b的RefSeq为MIMAT0001080；GATA6的RefSeq为NM_005257.5；TSPAN12的RefSeq为NM_012338.3。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次发现基因沉默抑癌基因QKI-5能够促进miR-196b在肺癌细胞中的表达，并且miR-196b的表达能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和细胞周期进程，从而提高动物体内肿瘤繁殖能力。
(2)本发明还发现转录因子GATA6和TSPAN12是miR-196b的靶基因，GATA6和TSPAN12在非小细胞肺癌组织中的表达显著下调，并与miR-196b的表达水平呈负相关；基因沉默GATA6更倾向于促进非小细胞肺癌的细胞迁移，而基因沉默TSPAN12更倾向于提高细胞增殖以及促进细胞周期进程；动物实验显示，基因沉默TSPAN12显著促进动物体内肿瘤增殖，但基因沉默GATA6不影响动物体内肿瘤增殖。
(3)本发明还发现miR-196b启动子领域的低甲基化涉及miR-196b在非小细胞肺癌的高表达。
附图说明
图1.A.实时荧光定量PCR检测肺癌组织和正常肺组织中QKI-5信使RNA的表达。配对的肺癌组织和正常肺组织各30例中提取总RNA，合成cDNA，然后采用Taqman基因表达分析试剂盒进行实时荧光定量PCR。用wilcoxon秩和检验比较肺癌组织和正常肺组织中QKI-5的表达水平。B.Kaplan Meier法分析QKI表达水平与1882例非小细胞肺癌患者生存期间之间的关系。C.实时荧光定量PCR检测肺癌细胞株和正常肺细胞株中QKI-5信使RNA的表达。D.QKI-5基因沉默48小时后蛋白质印迹法检测QKI-5蛋白表达水平；siQKI1和siQKI2表示靶向QKI-5的不同的siRNA，siCTL表示不靶向任何基因的对照siRNA。QKI-5基因沉默对H1299肺癌细胞增殖活性(E)的影响；siQKI1和siQKI2表示靶向QKI-5的不同的siRNA，siCTL表示不靶向任何基因的对照siRNA。QKI-5基因沉默对H1299肺癌细胞集落形成能力的影响(F)；siQKI1和siQKI2表示靶向QKI-5的不同的siRNA，siCTL表示不靶向任何基因的对照siRNA。
图2.A.从NanoString miRNA表达谱芯片实验中发现的10个显著差异表达miRNA；siCTL表示不靶向任何基因的对照siRNA，siQKI5表示靶向QKI-5的siRNA，相同于上述的siQKI1；B.实时荧光定量PCR检测H1299 QKI5基因沉默细胞和对照组细胞的miR-196表达水平；H1299/siQKI5表示转染siQKI5的H1299细胞，H1299/siCont表示转染siCTL的H1299细胞。t检验比较实验组和对照组之间的表达差异。C-D.皮尔逊相关分析分析肺腺癌(C)和肺鳞癌(D)中QKI5与miR-196b表达相关。基因表达原始数据来自TCGA数据库。
图3.A-B.分析miR-196b在468肺腺癌组织和46邻近正常肺组织(A)，和198肺鳞癌和40邻近正常肺组织(B)的表达水平；lungADC表示肺腺癌，lungSSC表示肺鳞癌，NAT表示邻近正常肺组织。miRNA表达原始数据来自TCGA数据库。t检验比较肺癌组织与邻近正常肺组织之间miR-196b的表达差异。C.miR-196b在70对NSCLC组织及其配对的NATs中的表达水平。从35例NSCLC组织和35例相应的NATs中提取RNA。用miR-196b探针对RNA进行实时荧光定量PCR,U6B对其表达进行归一化。D.实时荧光定量PCR检测不同肺癌细胞株中miR-196b的表达水平，U6B对其表达进行归一化。E.实时荧光定量PCR检测miR-196b过表达H1299和A549细胞的miR-196b表达水平。F.miR-196b过表达4天后采用Cell Counting Kit-8检测对H1299和A549细胞增殖能的影响；H1299/premiR196b表示转染premiR196b的H1299细胞，H1299/premiRCont表示转染对照premiR的H1299细胞，A549/premiR196b表示转染premiR196b的A549细胞，A549/premiRCont表示转染对照premiR的A549细胞。G.miR-196b过表达48小时后分析比较对迁移能的影响；H1299/premiR196b表示premiR196b的H1299细胞，H1299/premiRCont表示转染对照premiR的H1299细胞，A549/premiR196b表示转染premiR196b的A549细胞，A549/premiRCont表示转染对照premiR的A549细胞。H.通过流式细胞术检测过表达miR-196b的H1299细胞和对照组细胞中G1周期阶段的细胞比例；H1299/premiR196b表示转染premiR196b的H1299细胞，H1299/premiRCont表示转染对照premiR的H1299细胞。I.蛋白质印迹法分析G1期相关蛋白(Cyclin D1,Cyclin D3,CDK4,CDK6,P18,P21)在过表达miR-196b的H1299细胞和对照细胞中的表达水平。J.裸小鼠皮下注射H1299/miR196b或H1299/miRCont后的肿瘤生长曲线。数据以五次重复试验的均数±标准差表示。
图4.A.分析肺鳞癌中miR-196b表达水平与其可能的靶基因之间的表达相关性。基因表达原始数据来自TCGA数据库。B-C.利用TCGA RNA-seq数据中的GATA6表达和miR-seq数据中的miR-196b表达来分析肺腺癌(n＝306)(B)和肺鳞癌(n＝289)(C)中miR-196b和GATA6的表达相关性。D-E.利用TCGA RNA-seq数据中的TSPAN12表达以及miR-seq数据中的miR-196b表达来分析肺腺癌(n＝306)(D)和肺鳞癌(n＝289)(E)中miR-196b和TSPAN12的表达相关性。F-G.实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测转染了pre-miR-196b或对照的肺癌细胞中GATA6的mRNA和蛋白水平。H-I.实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测转染了pre-miR-196b或对照的肺癌细胞中TSPAN12的mRNA和蛋白水平。J-K.包含野生型或突变的GATA6(J)和TSPAN12(K)3’UTRs的荧光素酶报告基因与miR-196mimic共同转染到293T细胞；Emptyvector表示空载体，WT表示野生型3’UTR载体，Mut表示突变型3’UTR载体。数据以三次重复试验的均数±标准差表示。
图5.A.实时荧光定量PCR检测转染shGATA6或shTSPAN12质粒的肺癌细胞中GATA6和TSPAN12的mRNA水平；H1299/shGATA6表示转染靶向GATA6的shRNA的H1299细胞，H1299/shTSPAN12表示转染靶向TSPAN12的shRNA的H1299细胞，H1299/shCTL表示转染对照shRNA的H1299细胞。B.蛋白质印迹法检测转染shGATA6或shTSPAN12质粒的肺癌细胞中GATA6和TSPAN12的蛋白水平；shGATA6表示靶向GATA6的shRNA，shTSPAN12表示靶向TSPAN12的shRNA，shCTL表示不靶向任何基因的shRNA，Vinculin作为内参照蛋白。C.GATA6或TSPAN12基因下调的H1299肺癌细胞的增殖实验；shGATA6表示靶向GATA6的shRNA，shTSPAN12表示靶向TSPAN12的shRNA，shCont表示不靶向任何基因的shRNA。用CCK8测定细胞生长速度。数据以五次重复试验的平均值±标准差显示。D.利用Transwell Membranes对GATA6或TSPAN12下调的H1299细胞进行细胞迁移实验；shGATA6表示靶向GATA6的shRNA，shTSPAN12表示靶向TSPAN12的shRNA，shCont表示不靶向任何基因的shRNA。平均计数来自6个随机的视野。E.流式细胞术检测H1299/shGATA6、H1299/shTSPAN12、H1299/shCont在每个周期阶段的细胞比例。F.H1299/shTSPAN12细胞和对照细胞中G1期相关蛋白(Cyclin D1,Cyclin D3,CDK4,CDK6,P18,P21)的蛋白质印迹法分析结果。G-H.60对NSCLC组织及其配对的NATs中GATA6(G)和TSPAN12(H)的表达水平。从30例NSCLC组织和30例相应的NATs中提取RNA。用GATA6或TSPAN12探针对RNA进行实时荧光定量PCR,GAPDH对其表达进行归一化。I-J.Kaplan Meier法分析GATA6(I)或TSPAN2(J)表达水平与3021例非小细胞肺癌患者生存期间之间的关系。
图6.A.miR196b/HOXA10-AS/HOXA10基因组位点示意图(未按比例)。miR-196b位于HOXA10-AS的exon2中。TSS表示转录起始位点，绿色方框表示CpG岛。CpG51位于HOXA10-AS的exon2附近,CpG172位于HOXA10的exon1附近。B.TCGA数据库中miR-196b的表达与来源于TCGA Illumina Infinium人DNA甲基化450k微珠芯片的miR-196b启动子区(CpG51)甲基化探针之间的相关性。C.皮尔逊相关分析分析非小细胞肺癌中HOXA10与miR-196b表达相关。基因表达原始数据来自TCGA数据库。D.TCGA数据库中miR-196b的表达与来源于TCGAIllumina Infinium人DNA甲基化450k微珠芯片的miR-196b启动子区(CpG172)甲基化探针之间的相关性。E-F.利用7.5μM 5-aza-CdR处理3天后，用实时荧光定量PCR检测miR-196b(E)和primiR-196b(F)在肺癌细胞系A549和H1299中的表达；A549/5Aza+表示5-aza-CdR处理过的A549细胞，A549/5Aza-表示5-aza-CdR没处理过的A549细胞，H1299/5Aza+表示5-aza-CdR处理过的H1299细胞，H1299/5Aza-表示5-aza-CdR没处理过的H1299细胞。数据以三次重复试验的平均值±标准差表示。
图7.A-B.对QKI-5下调的293T细胞或对照细胞裂解液进行RIP分析；siCont Input表示无抗体下拉的阳性对照组，siCont IgG表示无抗体下拉的阴性对照组，siCont表示不靶向任何基因的对照siRNA，siQKI表示靶向QKI-5的siRNA，。用IgG或QKI-5抗体对细胞提取物进行IP处理。用特异性的miR-196b探针(A)或U6B探针(B)对下拉的RNA进行实时荧光定量PCR分析。数据以三次重复试验的均数±标准差表示。C.从用20ug/mL的RNA聚合酶II抑制剂，α-amanitin处理9小时的QKI-5下调的293T细胞或对照细胞中提取RNA，然后用miR-196b探针进行实时荧光定量PCR。使用U6B探针进行归一化；H1299/siQKI表示转染siQKI5的H1299细胞，H1299/siCont表示转染siCTL的H1299细胞。数据以三次重复试验的均数±标准差表示。
图8.A-B.裸小鼠皮下注射H1299/shTSPAN12(A)，H1299/shGATA6(B)或H1299/shCont细胞后的肿瘤生长曲线。数据以六次重复试验的均数±标准差表示。(C)来源于H1299/shTSPAN12或H1299/shCont细胞的肿瘤组织中TSPAN12、CD31和Ki67的阳性细胞。用TSPAN12、CD31和Ki67抗体对裸鼠肿瘤组织石蜡切片进行染色。TSPAN12阳性细胞、CD31阳性微血管细胞、Ki67阳性肿瘤细胞在8个与抗体反应活性最高的肿瘤区域分别以×100和×400计数，数据以8个区域的均数±标准差表示。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中涉及的材料与方法如下：
1、质粒构建，细胞系和试剂
人pre-miRNA表达构建体Lenti-miR-196b载体购自System biosciences。pLightSwtich empty，GATA6-3’UTR和TSPAN12-3’UTR载体是从Active Motif订购的。使用QuickChange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)产生突变。该研究中使用的引物示于表S3中。siRNA阴性对照，siQKI-5，shRNA对照(SHC001)，shGATA6(TRCN0000010938)和shTSPAN12(TRCN0000127026)购自Sigma。本研究中使用的细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将人肺癌细胞H1299，U2020和A549培养在含有10％FBS和100U/ml青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中。在补充有10％FBS和100U/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养293T细胞。抗QKI5抗体(ab232502)，抗TSPAN12抗体(ab93179)，抗CD31抗体(ab28364)和抗Ki67(ab16667)抗体购自Abcam。从细胞信号技术购买了针对GATA6(D61E4)，GAPDH(D16H11)和细胞周期调节抗体采样试剂盒(9932T)的抗体。抗vinculin抗体购自Sigma-Aldrich。
2、NanoString nCounter分析和数据分析
使用NanoString nCounterhuman v3 miRNA表达测定法，按照制造商的说明(NanoString Technologies)对从QKI5敲除的H1299细胞和对照细胞中提取的总RNA进行microRNA分析。
该测定法允许每个样品同时检测和测量多达800种不同的microRNA的表达水平。简而言之，将3μl RNA与多重DNA标签(miR-tag)退火，并桥接特异的靶标。使用连接酶将成熟的microRNA结合到特定的miR-tags上，然后通过酶清除步骤去除所有多余的标签。然后将标记的microRNA产物稀释(比例为1：5)，将5μl与20μl杂交缓冲液中的报告探针和5μl捕获探针合并。在65℃的过夜杂交(16至20小时)可以使靶标特异的探针序列复杂化。然后在自动流体处理系统(nCounter Prep Station)上使用基于两步磁珠的纯化技术去除多余的探针，并将目标/探针复合物固定在cartridge上进行数据收集。The nCounter DigitalAnalyzer使用CCD摄像机通过显微镜物镜拍摄固定在样品盒中的荧光记录器的图像来收集数据。对于每个样品盒，都执行了涵盖600个视野的高密度扫描。对于每个墨盒，都执行了涵盖600个视野的高密度扫描。
3、病毒感染和转染
将pre-miR196b表达构建体和对照载体与pPACKH1 Lentivector PackagingPlasmid mix(System Biosciences)一起转染到293T包装细胞系中。使用Transdux试剂(System Bioscience)进行病毒转导，感染细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)分析(FACSCalibur，BD Bioscience)选择。按照制造商的说明(Invitrogen)，用Lipofectamine3000进行针对GATA6，TSPAN12和对照载体的shRNA转染，并用嘌呤霉素选择转染的细胞。根据制造商的说明(Invitrogen)，使用Lipofectamine RNAiMAX将QKI-5siRNA转染到细胞中。
4、实时荧光定量PCR
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。通过使用TaqManmiRNA逆转录试剂盒和Taqman miRNA表达测定试剂盒(Applied Biosystems)进行实时荧光定量PCR对miRNA的表达进行定量。小内源性核仁U6 snRNA用作miRNA标准化的对照。从Applied Biosystems购买了primiR-196b,GATA6和TSPAN12的TaqMan基因表达测定试剂盒，以确定它们的表达。GAPDH用作基因表达标准化的对照。使用RT-PCR的高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher)，将2μg总RNA合成cDNA。所有反应重复三遍。
5、细胞迁移和增值试验
如前所述，Boyden chambers(BD生物科学公司)使用不含基质凝胶的8毫米微孔膜进行体外细胞迁移(1)。迁移测定是根据制造商的说明进行的。如前所述(2)，通过CellCounting Kit8(Dojindo)评估了体外细胞的生长速率。简而言之，将在2％RPMI 1640培养基中的2000个细胞添加到48孔板中的每个孔，每个细胞株重复5个孔，并在37℃下培养4天。使用CCK8定量细胞数量。
6、流式细胞仪分析
为了进行细胞周期分析，将细胞用70％乙醇在-20℃固定过夜，用PBS洗涤并重悬于含有50ug/ml碘化丙啶，100ug/ml RNase A，0.05％Triton X-100的PBS中。将细胞在37℃下孵育40分钟，并通过FACS CaliburFlow Cytometer(BD Biosciences)进行分析。
7、蛋白质印迹法分析
用补充了蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Cell Signaling Technology)的RIPA缓冲液(25mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl，1％NP-40、1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)裂解细胞，并分离在4-20％的微型蛋白质TGX凝胶上(Bio-Rad)。SDS-PAGE后，将蛋白质电转移到Immuno-Blot PVDF膜(Bio-Rad)上。然后，在具有Tween 20的Tris缓冲盐水(TBST)中用5％BSA封闭膜，并在含有2％BSA的TBST中与一抗一起孵育，然后与偶联辣根过氧化物酶(HRP)的二抗一起孵育。使用增强的化学发光系统(GE Healthcare)检测特定蛋白。
8、TCGA数据集
2013年7月31日下载了具有临床信息的TCGA miRNA-seq，RNA-seq和InfiniumHuman DNA甲基化450k微珠芯片数据。仅使用经log-2转化的3级数据进行分析。分析TCGA数据集，进行了Welch t检验，以确定有无癌症的患者之间miR-196b与靶基因表达是否不同。为了进行miR-196b表达与启动子甲基化状态之间的相关分析，计算了Pearson相关系数。
9、患者和组织样本
该研究得到温州医科大学机构研究人类伦理委员会的批准，可用于临床活检标本，并在开始前已征得患者的知情同意。从温州医科大学附属舟山医院获得了成对的60例NSCLC患者冷冻组织标本。在手术切除后的两个小时内，使用液氮对组织样品进行快速冷冻，并在-80℃下保存直至进行分析。对于miRNA表达，已证实的35例NSCLC1期病例样品进行福尔马林固定，石蜡包埋，做成组织切片送至俄亥俄州立大学病理学核心设施场所，对癌组织及其邻近的正常组织使用RecoverALL总核酸分离试剂盒(Ambion)分离组织中的总RNA。根据俄亥俄州立大学批准的机构审查委员会规程获得组织，并在样品分析之前从患者获得书面知情同意。
10、荧光素酶报告测定
为了确定miR-196b是否直接靶向GATA6和TSPAN12的3'UTR，将5×104 293T细胞接种在24孔板中过夜，然后用miR-196b mimic(Thermo Scientific)加empty 3'UTR载体或包含WT或mut-3'UTR的载体转染。36小时后，将细胞裂解，并根据制造商的说明使用双荧光素酶检测(Promega)进行分析。
11、5-aza-CdR脱甲基
将H1299和A549细胞接种到10cm组织培养皿中，在有或没有7.5μM 5-aza-CdR的条件下培养3天。每24小时更换一次含试剂的培养基。分离RNA并进行定量实时PCR以评估5-aza-CdR处理后miR-196b表达的恢复。
12、RNA结合蛋白免疫共沉淀
根据制造商的说明使用Magna RIP试剂盒(Millipore)进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)分析。简而言之，将QKI-5敲低的293T细胞和对照细胞刮入含有蛋白酶抑制剂的PBS中，然后重悬于含有蛋白酶和RNase抑制剂的RIP裂解缓冲液(Millipore)中。将磁珠蛋白A/G与5μg兔单克隆抗QKI5抗体(ab232502)或正常兔IgG(Millipore)孵育过夜作为阴性对照。孵育后，将样品加入抗体-珠复合物中并孵育过夜。洗涤后，洗脱免疫复合物和输入物并用蛋白酶K处理，并在55℃加热30分钟以消化蛋白质。用苯酚/氯仿萃取纯化RNA，然后用乙醇沉淀。使用特定的Taqman探针对取自RIP样品的RNA进行实时荧光定量PCR检测。
13、目标分析
使用以下特定程序进行了生物信息学分析：Targetscan(http://www.targetscan.org/),Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/),miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)and RNAhybrid(http://www.bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/)。
14、动物研究
所有动物实验程序均符合温州医科大学的实验动物护理和使用政策。六周大的无胸腺BALB/c nu/nu雌性小鼠(19-23g)从Vital River Laboratories(中国北京)购买。通过胰蛋白酶收集稳定过表达miR-196b的H1299细胞(H1299/miR196b)，GATA6敲低的H1299细胞(H1299/shGATA6)或TSPAN12敲低的H1299细胞(H1299/shTSPAN12)，用PBS洗涤并重悬于Matrigel/RPMI培养基(1：1)。将五百万个H1299/miR-196b，H1299/shGATA6或H1299/shTSPAN12和相应的对照细胞分别皮下注射到裸鼠的侧腹。在每只小鼠的两个侧面进行注射。使用以下公式从长度(a)和宽度(b)计算肿瘤体积：体积(mm3)＝ab2/2。
15、免疫组织化学染色
组织切片固定在10％福尔马林中，处理后包埋在石蜡中。将5微米厚的切片放在带正电的载玻片上。使用常规的免疫组织化学技术对组织切片进行染色，并与TSPAN12(1：200)，CD31(1：200)或Ki-67(1：100)的抗体孵育过夜。结合二抗和二氨基联苯胺(DAB)进行检测。当使用同种型匹配的免疫球蛋白作为对照时，没有染色。为了分析NSCLC组织样本，根据五个区域平均值中阳性细胞的百分比，对TSPAN12的免疫组化反应性评分如下：0–5％(-)，5％–25(1+)，25％–50％(2+)，50％–100％(3+)。等级为3+的TSPAN12表达定义为强，2+被定义为中等，1+被定义为弱。
16、统计分析
使用R程序(版本3.0.2)进行统计分析。数据表示为具有标准偏差(SD)的平均值，除非另有说明，否则统计显著性是通过非配对的Student t检验确定的。P值小于0.05被认为具有统计学意义。进行了Pearson相关分析，以确定miR-196b的表达与其靶基因之间的相关性。
下列实施例中未详细说明的其他方法均为现有常规技术手段。
实施例1 QKI-5在非小细胞肺癌中表达下调并与肺癌细胞的生长相关
(1)在TCGA RNA-seq数据库中，分析334例肺腺癌病人的肿瘤组织及其配对的57例正常癌旁组织中的QKI表达，还分析349例肺鳞癌病人的肿瘤组织及其配对的51例正常癌旁组织中的QKI表达；观察到QKI在肺腺癌(p<2.2e-16)和肺鳞癌(p<2.2e-16)中的表达都显著下调。
(2)在30对来源于温州医科大学附属舟山医院的非小细胞肺癌(NSCLC)组织及其对应的癌旁组织(NATs)中，分析QKI-5的表达；在配对的肺癌组织和正常肺组织各30例中提取总RNA，合成cDNA，然后采用Taqman基因表达分析试剂盒进行实时荧光定量PCR，用wilcoxon秩和检验比较肺癌组织和正常肺组织中QKI-5的表达水平。结果发现，在NSCLC中QKI-5的表达比较于NATs显著下调(图1A)。
(3)利用来源于Kaplan Meier Plotter的1882例NSCLC病例做Kaplan-Meier生存分析。结果显示，高水平的QKI和NSCLC的良好预后显著相关(图1B)。
(4)采用实时荧光定量PCR检测肺癌细胞株和正常肺细胞株中QKI-5信使RNA的表达。结果表明，比较于正常肺细胞系，大多数肺癌细胞系表现出QKI-5的表达降低(图1C)。
(5)因为QKI-5在NSCLC中表达明显下调而且与NSCLC患者的生存率相关，进一步研究QKI-5在肺癌细胞生长和克隆形成中的作用。选择QKI-5相对表达量较高的H1299细胞进行QKI-5的下调；下调之后的QKI-5的表达水平通过蛋白质印迹法分析进行确认(图1D)，即：QKI-5基因沉默48小时后蛋白质印迹法检测QKI-5蛋白表达水平。结果表明：在H1299细胞中蛋白质印迹法分析清楚的显示单一的QKI-5条带，这支持了QKI-5在肺癌中的主导作用。QKI-5基因下调以后，H1299细胞的增殖和克隆形成能力都显著提高。(图1E-F)
总体来说，这些结果表明，在非小细胞肺癌中QKI-5确实是一个肿瘤抑制基因。
实施例2 QKI-5下调促进miR-196b表达
用QKI-5下调的H1299细胞(H1299/siQKI)和对照的H1299(H1299/siCont)细胞进行了Nanostring nCounter miRNA expression分析。
分析方法如下：
使用NanoString nCounterhuman v3 miRNA表达测定法，按照制造商的说明(NanoString Technologies)对从QKI5敲除的H1299细胞和对照细胞中提取的总RNA进行microRNA分析。该测定法允许每个样品同时检测和测量多达800种不同的microRNA的表达水平。简而言之，将3μl RNA与多重DNA标签(miR-tag)退火，并桥接特异的靶标。使用连接酶将成熟的microRNA结合到特定的miR-tags上，然后通过酶清除步骤去除所有多余的标签。然后将标记的microRNA产物稀释(比例为1：5)，将5μl与20μl杂交缓冲液中的报告探针和5μl捕获探针合并。在65℃的过夜杂交(16至20小时)可以使靶标特异的探针序列复杂化。然后在自动流体处理系统(nCounter Prep Station)上使用基于两步磁珠的纯化技术去除多余的探针，并将目标/探针复合物固定在cartridge上进行数据收集。The nCounter DigitalAnalyzer使用CCD摄像机通过显微镜物镜拍摄固定在样品盒中的荧光记录器的图像来收集数据。对于每个样品盒，都执行了涵盖600个视野的高密度扫描。对于每个墨盒，都执行了涵盖600个视野的高密度扫描。
Nanostring nCounter miRNA expression分析后，选择10个差异表达(p值小于0.05且改变倍数大于1.5)的miRNAs(图2A)，在这10个差异表达的miRNAs中，8个miRNAs上调，2个miRNAs下调。
选择miR-196b做进一步研究，实时荧光定量PCR分析确认miR-196b在H1299/siQKI细胞中确实上调(图2B)。
此外，用TCGA的306例肺腺癌和289例肺鳞癌样品(包含QKI-5和miR-196b表达数据)进行了皮尔逊相关性分析，结果表示miR-196b和QKI-5在肺腺癌(r＝-0.13,P＝0.02)和肺鳞癌(r＝-0.5,P<2.2e-16)中都存在显著的负相关(图2C-D)。
上述结果表明：在非小细胞肺癌中QKI-5能够负向调控miR-196b的表达。
实施例3 miR-196b在体内和体外都促进肺癌细胞的生长
在TCGA miRNA-seq数据库中，分析468例肺腺癌，198例肺鳞癌和86例NATs中miR-196b的表达，发现比较于NATs，miR-196b在肺腺癌(图3A)和肺鳞癌(图3B)中显著上调。
再次分析来源于OSUCCC组织获取共享资源的70对NSCLC和NATs，确认比较于对应的NATs，miR-196b表达在NSCLC中显著上调(图3C)。鉴于miR-196b在NSCLC组织中的高表达，我们推测miR-196b在NSCLC的发病进程中发挥着重要作用。
为了探讨miR-196b在肺癌细胞中的功能，在H1299和A549两株NSCLC细胞中瞬时过表达Pre-miR-196bPrecursor miRNA，因为比较于其他肺癌细胞系这两株细胞有相对较低的miR-196b表达(图3D)。
具体方法为：用miR-196b探针对RNA进行实时荧光定量PCR,U6B对其表达进行归一化。miR-196b过表达4天后采用Cell Counting Kit-8检测对H1299和A549细胞增殖能。.miR-196b过表达48小时后分析比较对侵袭能。通过流式细胞术检测过表达miR-196b的H1299细胞和对照组细胞中G1周期阶段的细胞比例。蛋白质印迹法分析G1期相关蛋白(Cyclin D1,Cyclin D3,CDK4,CDK6,P18,P21)在过表达miR-196b的H1299细胞和对照细胞中的表达。
结果：通过实时荧光定量PCR确认过表达之后的miR-196b表达情况，如图3E；miR-196b过表达以后，H1299和A549的细胞增殖和迁移能力都显著提高(图3F-G)；此外，在H1299细胞中的miR-196b过表达促进了细胞周期由G1期向S期转换(图3H)，这说明miR-196b可能通过促进细胞周期进程从而引起肺癌细胞的增值能力提高。在H1299细胞中的miR-196b过表达诱导了G1期相关蛋白的表达变化，其中包括cyclin D1,cyclin D3,CDK4,CDK6,和CDKinhibitor 1A(P21)and 2C(P18)(图3I)。类似的结果在miR-196b过表达的A549中也被观察到。
为了探讨miR-196b在肿瘤的体内生长中的功能，将稳定过表达miR-196b的H1299细胞及其对应的对照细胞分别皮下注射到裸鼠后背两侧；比较于对照组，H1299中miR-196b的过表达显著促进了肿瘤的体内生长，这说明了miR-196b作为一个致癌miRNA在体内的肺癌中发挥作用(图3J)。
实施例4 GATA6和TSPAN12基因是miR-196b的直接靶点
为了更好的理解miR-196b在NSCLC中的潜在机制，采用生物信息学分析去确定miR-196b可能的靶基因。
首先，使用7个生物信息学网站分析了miR-196b的靶基因，筛选了预测分数≥5的43个可能的靶基因。其次，对于miR-196b的43个可能的靶基因，执行皮尔逊相关分析使用TCGA数据库的289例肺鳞癌样本。结果显示，12个基因有意的负相关与miR-196b表达(图4A)包括已知的miR-196b靶基因FAS和AQP4。由于GATA6和TSPAN12显示最强的负相关，且两个转录本的3’末端非翻译区(3’UTRs)包含与miR-196b种子序列互补的保守序列，所以选择GATA6和TSPAN12进行进一步的分析。
在TCGA数据库中，选择包含miR-196b和GATA6或者TSPAN12表达数据的306例肺腺癌和289肺鳞癌样品进一步进行皮尔逊相关分析。结果显示，miR-196b分别与GATA6(r＝-0.19,P＝0.0008in lung ADC；r＝-0.56,P＝1.66e-25in lung SCC)和TSPAN12(r＝-0.25,P＝1.05e-05in lung ADC；r＝-0.51,P＝2.23e-20in lung SCC)存在显著的负相关(图4B-E)。
为了探讨miR-196b对靶基因的mRNA和蛋白的影响，进行过表达分析。在H1299中，miR-196b的过表达显著降低了GATA6和TSPAN12的mRNA和蛋白表达(图4F-I)。
为了确定GATA6和TSPAN12是miR-196b的直接靶点，进行萤光素酶报告基因测定。在293T细胞中，GATA6以及TSPAN12的3’UTRs分别和miR-196b模拟物(mimic)共转染后，观察到miR-196b降低了包含GATA6和TSPAN12的3’UTRs的萤光素酶活性的一致降低。
为了进一步确认miR-196b的靶向特异性，利用QuickChange Mutagenesis kit对3’UTRs的miR-196b结合位点进行了变异。GATA6和TSPAN12的3’UTRs都有一个非常保守的miR-196b的结合位点。用于3’UTRs突变发生的引物序列展示在Table S3。miR-196b和突变的3’UTRs(GATA6 mut 3’UTR and TSPAN12 mut 3’UTR)的共同转染对miR-196b引起的野生型3’UTRs荧光素酶活性的降低有明显的抑制作用(图4J-K)，这说明了miR-196b和其靶基因的3’UTRs的特异性结合。结果显示，NSCLC中，GATA6和TSPAN12是miR-196b的直接靶点，并且GATA6和TSPAN12低表达可能与miR-196b的上调有关。
实施例5 GATA6和TSPAN12在miR-196b介导的肺癌进展中发挥重要作用
研究GATA6和TSPAN12在肺癌细胞增殖和迁移中的功能。在H1299肺癌细胞中利用shRNA分别下调了GATA6和TSPAN12。下调之后，GATA6和TSPAN12的mRNA(图5A)和蛋白(图5B)的表达水平分别用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分析得到确认。GATA6和TSPAN12的下调都显著促进了H1299细胞的增殖(图5C)和迁移(图5D)能力。有趣的是，比较于TSPAN12的下调，GATA6的下调能更有效率地促进肺癌细胞迁移。
此外，细胞周期分析结果显示，GATA6下调不影响各个细胞周期占比，但是TSPAN12下调能够大幅度促进G1期向S期转变(图5E)。因此，G1期相关蛋白在TSPAN12下调以后也大幅度改变(图5F)，并且这些改变和miR-196b过表达以后的改变完全相符。
这些结果说明，GATA6和TSPAN12与miR-196b介导的细胞增殖和迁移相关，而且GATA6更倾向于miR-196b介导的细胞迁移，TSPAN12更倾向于调节G1期向S期转变以调节细胞增殖。
然后，评价60对来源于温州医科大学附属舟山医院的NSCLC组织和NATs，并发现比较于正常癌旁组织GATA6和TSPAN12表达在NSCLC组织中都是显著下调的(图5G-H)。利用来源于Kaplan Meier Plotter 3021例可用的NSCLC病例得出的Kaplan-Meier生存分析显示高水平的GATA6和TSPAN12与NSCLC病人的良好预后显著相关(图5I-J)，这说明GATA6和TSPAN12在NSCLC的进展中发挥着重要作用。
实施例6 CpG172的甲基化水平调控miR-196b的表达
据报道，启动子区域的表观遗传改变和转录激活与miRNA表达密切相关。miR-196b位于长非编码RNA，HOXA10-AS的exon2区域。miR-196b的转录方向相反与HOXA10-AS。HOX10A位于miR-196b基因组区域附近而且和miR-196b的转录方向一致。miR-196b在CpG51岛上，而HOXA10的启动子区域存在另一个CpG，CpG172(图6A)。
首先确认在NSCLC中上调的miR-196b表达是否和CpG51的低甲基化有关。从TCGAIllumina Infinium人类DNA甲基化450k微珠芯片数据中选择位于CpG51的11个甲基化探针，评估了miR-196b表达与CpG51甲基化水平的相关性。221例同时拥有甲基化和miR-196b表达数据的TCGA非小细胞肺癌样品被提取出来用于皮尔逊相关性分析。在CpG51的11个探针中，只有一个探针显示出与miR-196b表达有显著负相关(图6B)，这说明在非小细胞肺癌中，CpG51的甲基化水平可能与miR-196b不存在相关性。
为了研究miR-196b和HOXA10是否受同一启动子转录调控，我们利用TCGA数据库评价了这两基因的表达模式，并发现miR-196b和HOXA10存在显著的正相关(r＝0.69,P＝2.2e-16)，这说明miR-196b和HOXA10可能共享同一启动子(图6C)。
检测非小细胞肺癌中上调的miR-196b是否与其启动子区域的CpG岛(CpG172)的低甲基化水平有关。利用拥有甲基化和miR-196b表达水平数据的TCGA非小细胞肺癌样品得出的皮尔逊相关性分析结果显示CpG172的11个甲基化探针和miR-196b的表达水平显著负相关(图6D)，这进一步说明启动子的甲基化可能参与了miR-196b转录的抑制。用去甲基化试剂(5-aza-CdR)处理3天的肺癌细胞中的miR-196b(图6E)和pri-miR-196b(图6F)表达都显著增加。
总得来说，这些结果表明NSCLC中miR-196b启动子相关的CpG岛至少在一定程度上导致了非小细胞肺癌中高水平的miR-196b表达。
实施例7 QKI-5与miR-196b相互作用并负向调控其表达
Nanostring nCounter miRNA expression分析显示在肺癌细胞中QKI5的下调促进了miR-196b的表达。
为了进一步探讨QKI-5调控miR-196b的潜在机制，首先通过利用QKI-5抗体进行的RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)分析去检测了QKI-5和miR-196b的相互作用。发现比较于利用IgG得到的RIP样品，miR-196b(图7A)在利用QKI-5抗体得到的RIP样品中被富集。有趣的是，与使用QKI-5抗体的对照RIP样品相比，QKI-5的下调显著降低了RIP样品中miR-196b的富集。值得注意的是，使用QKI-5抗体的RIP样本中miR-196b的富集比IgG高约20倍。
使用IgG和QKI-5抗体的RIP样品中未发现内部对照U6B富集的差异(图7B)，这说明了QKI-5和miR-196b的特异性结合。为了探讨QKI-5对于miR-196b稳定性的功能，我们用RNA聚合酶Ⅱ抑制剂(α-amanitin)对QKI-5下调的H1299细胞和对照细胞进行处理。在α-amanitin处理9小时以后，发现比较于对照细胞，miR-196b(图7C)在QKI-5下调的H1299细胞中更加富集。这些结果说明QKI-5至少在一定程度上与miR-196b相互作用并减少其稳定性从而调控miR-196b。
实施例8 GATA6和TSPAN12对体内肿瘤生长的影响
体外分析显示，GATA6和TSPAN12都参与了NSCLC细胞的增殖和迁移。
为了理解GATA6和TSPAN12下调在体内肿瘤生长中的作用，稳定下调GATA6的H1299/shGATA6或者稳定下调TSPAN12的H1299/shTSPAN12和其对应的对照细胞分别被皮下注射到了裸鼠后背两侧。比较于对照细胞，H1299中TSPAN12的下调显著促进了肿瘤的体内生长(图8A)，而H1299中GATA6的下调并没有影响肿瘤的体内生长(图8B)，这说明，在体内miR-196b诱导的肿瘤生长促进主要归因于TSPAN12的表达下调。对于TSPAN12，Ki67和鼠源的CD31蛋白的免疫组化分析结果显示，在来源于H1299/shTSPAN12注射小鼠的肿瘤组织中，Ki67和CD31的阳性细胞显著增加(图8C)，这说明TSPAN12的下调可能在体内促进细胞增殖和血管生成。这些结果说明，TSPAN12的表达水平在NSCLC组织中显著下调，并且TSPAN12在NSCLC的发生过程中发挥着重要作用。
Claims (9)
1.miRNA-196b在作为非小细胞肺癌分子标志物和治疗靶点中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-196b的检测试剂用于制备非小细胞肺癌早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
3.miRNA-196b在制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗非小细胞肺癌药物为miRNA-196b的抑制剂，用于抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和/或非小细胞肺癌细胞G1期向S期转换。
5.转录因子GATA6在作为非小细胞肺癌分子标志物、治疗靶点以及制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转录因子GATA6的检测试剂用于制备非小细胞肺癌早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
7.抑癌基因TSPAN12在作为非小细胞肺癌分子标志物、治疗靶点以及制备或筛选治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑癌基因TSPAN12的检测试剂用于制备非小细胞肺癌早期诊断和预后诊断的体外诊断产品。
9.如权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。
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