KR20110015013A

KR20110015013A - 결장직장암의 평가 방법 및 여기에 사용하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20110015013A
Application number: KR1020107028055A
Authority: KR
Inventors: 미치 라포니; 그렉 엠. 아른트; 레슬리 도시
Original assignee: 베리덱스, 엘엘씨
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2011-02-14
Also published as: WO2009140670A2; WO2009140670A9; MX2010012542A; EP2283161A2; JP2011520454A; BRPI0911972A2; CA2725477A1; IL209078A0; EP2283161A4

Abstract

본 명세서에는 선별된 miRNA 서열의 조절 변화를 관찰함으로써 결장직장암의 병기를 결정하는 방법이 기술된다. 이들 서열은 hsa-miR-143, hsa-miR-145, 그의 각각의 전구체 및 이들 서열의 조합을 포함할 수 있다.

Description

결장직장암의 평가 방법 및 여기에 사용하기 위한 조성물{Methods for assessing colorectal cancer and compositions for use therein}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2008년 5월 16일자로 출원된 공계류 중인 미국 가특허 출원 제61/053,760호에 대한 우선권을 주장하고 그의 이익을 청구한다.

서열목록, 표, 또는 프로그램 목록에 대한 참조

본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, "Sequence3035191.txt" (9 kb, 2008년 10월 29일자로 작성됨)로 표제된 전자 문서로 제공되는 하기에 열거된 "서열목록"을 참조한다.

기술분야

본 발명은, 일 실시 형태에서, 선별된 마이크로RNA (miRNA) 서열들에 있어서 생산의 조절 변화를 관찰함으로써 결장직장암(CRC)을 검출하고/하거나 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 특정된 서열들의 상향 조절 또는 하향 조절 변화의 관찰에 의해, 암세포의 존재뿐만 아니라 암의 병기(stage)도 결정될 수 있다.

결장직장암(CRC)은 선진국에서 가장 빈번한 암 중의 하나이고 암관련 사망의 흔한 원인이다. CRC의 전체적인 발생 빈도는 일반 집단에서 5%이고 5년 생존율은 40% 내지 60% 범위이다. 예후는 대부분 종양의 형태학 및 병리학적 특징을 이용한 기술적 병기 분류 시스템에 의존한다. 그러나, 형태학적으로 유사한 종양이라도 바탕을 이루는 분자적 변화 및 종양형성 잠재력은 다양할 수 있다. 정상적인 상피세포의 악성 암종으로의 CRC 진행은, 이러한 변경을 포함하는 세포에 선택적 이익을 부여하는 발암유전자의 일시적 활성화 및 종양 억제 유전자의 불활성화를 초래하는 유전적 및 후생적 변화 모두가 누적되는 다단계 과정을 포함한다.

내재하는 분자적 경로를 더 잘 설명하고 CRC의 상이한 병기를 더 세분하기 위해 단백질 암호화 유전자에 대한 다수의 CRC 발현 프로파일링 연구가 수행되어 왔다. 보다 최근에는, 마이크로RNA (miRNA)로 불리는, 짧은 22개 뉴클레오티드(nt)의 비암호화 RNA들의 새로 발견된 종류가 동정되었고 이들은 암 개시 및 진행에 관련된 것으로 여겨졌다. 이들 소형 RNA들의 생물발생은 RNA 폴리머라아제 II에 의한 전사 및 불완전한 머리핀 구조를 갖는 60-70-nt 전구체 miRNA들(전구-miRNA들)을 생성하는, 엔도뉴클리아제 드로샤(Drosha)에 의한 일차 전사체의 가공을 포함한다. 전구-miRNA는 엑스포틴(exportin) 5를 통해 세포질 내로 이송되고, 여기서 RNAse III 효소 다이서(Dicer)에 의해 가공되어 이후에 다단백 복합체 내로 편입되는 성숙 miRNA들을 생성한다. 이들 miRNA-함유 복합체는 내재하는 miRNA 가닥과 표적 서열 사이의 상보성을 통해 여러 mRNA들의 3' 비번역 영역(UTR)에 결합하고, 상동성의 정도에 기초하여, 번역 억제 또는 mRNA 분해를 지시하는 것으로 나타났다. 이제까지, 678가지의 인간 miRNA들이 동정되었고(miRBase 시퀀스 데이터베이스 - 11판), 컴퓨터 모델을 통해, 인간 게놈 내에 현재 알려진 유전자들의 대략 3%에 해당하는, 1000개를 초과하는 miRNA 유전자들이 존재할 수도 있다고 제안되었다. 더욱이, 생물정보학적 분석 결과 miRNA들이 인간 단백질 암호화 유전자의 무려 30%를 조절할 수도 있다고 추정되어, 이들 소형 RNA들이 복잡한 신호전달 경로들 사이의 상호작용을 조화시키도록 작용할 수도 있음을 시사한다.

몇몇 miRNA들이 정상 및 종양 조직 또는 암 세포주 사이에서 차등 발현되는 것으로 확인되었다 (문헌[Calin, G. A. and Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 6: 857-866, 2006]; 문헌[Bandres, E., Cubedo, E., Agirre, X., Malumbres, R., Zarate, R., Ramirez, N., Abajo, A., Navarro, A., Moreno, I., Monzo, M., and Garcia-Foncillas, J. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues. Mol Cancer, 5: 29, 2006]; 문헌[Cummins, J. M., He, Y., Leary, R. J., Pagliarini, R., Diaz, L. A., Jr., Sjoblom, T., Barad, O., Bentwich, Z., Szafranska, A. E., Labourier, E., Raymond, C. K., Roberts, B. S., Juhl, H., Kinzler, K. W., Vogelstein, B., and Velculescu, V. e. The colorectal microRNAome. Proc Natl Acad Sci U S A, 103: 3687-3692, 2006]; 문헌[Michael, M. Z., SM, O. C., van Holst Pellekaan, N. G., Young, G. P., and James, R. J. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol Cancer Res, 1: 882-891, 2003]; 문헌[Lanza, G., Ferracin, M., Gafa, R., Veronese, A., Spizzo, R., Pichiorri, F., Liu, C. G., Calin, G. A., Croce, C. M., and Negrini, M. mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorectal cancer. Mol Cancer, 6: 54, 2007]).

CRC에서, miRNA들의 발현 양상을 조사하는 연구들은 제한적이었다. miRNA들의 이상 조절을 보여주는 첫 번째 연구는 전구-샘종 폴립(pre-adenomatous polyp) 병기와 같은 초기에 나타나는 miR-143 및 miR-145의 하향 조절을 보고하였고, 이는 CRC의 초기에서 이들 miRNA들의 가능한 역할을 시사하였다. 이어서, CRC 종양에서 차등 발현을 보이는 13개 miRNA의 그룹이 동정되었으며, miR-31의 발현 수준이 CRC 종양 병기와 상관관계가 있는 것으로 보였다.

본 발명은, 그의 일 형태에서, 세포 시료에서 결장직장암의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 다른 형태에서, 본 발명은 세포 시료 내 결장직장암의 병기를 진단하는 방법이다. 출원인은 야생형 세포와 비교하여 결장직장암에서 차등적으로 조절되는 소정의 miRNA들을 발견하였다. 이러한 miRNA들에서 조절 변화의 정도를 측정함으로써, 조직 시료가 결장직장암 세포를 포함하고 있는지 여부를 결정할 수 있다. 출원인은 초기 (I기 및 II기) 결장직장암과 비교하여 후기 (III기 및 IV기) 결장직장암에서 차등적으로 조절되는 소정의 다른 miRNA들을 발견하였다. 이러한 miRNA들을 모니터링함으로써, 세포 형태학과 같이 덜 믿음직한 분류 요소에 의존할 필요 없이 초기 종양 시료로부터 후기 종양 시료를 구분할 수 있다.

도 1. 41가지의 차등 발현된 miRNA를 사용한 CRC 및 정상 결장직장 조직의 이원적 계층적 클러스터링(Two-way hierarchical clustering). Log2 신호 강도의 기하 평균은 유클리디안 거리 척도(Euclidean distance metric)를 완전 연관과 함께 사용하여 모든 시료에서 계산하였다. 적색 및 청색은 각각 상대적으로 높은 수준 또는 낮은 수준으로 발현되는 miRNA를 나타낸다. miR-143-145 및 miR-17-92 클러스터는 각각 수직 청색 막대 및 적색 막대로 나타내어져 있다. 시료는 3개의 주 클러스터로 분류되며, 즉, 클러스터 I은 주로 정상 결장직장 조직을 나타내며, 클러스터 II 및 클러스터 III은 CRC 시료를 나타낸다. 반복 시료는 부색인 "2"로 나타내어진다.
도 2. 미르바나(mirVana)™ 바이오어레이(Bioarray) 및 에이비아이 택맨(ABI TaqMan)(등록상표) 플랫폼을 비교함에 의한 miRNA 발현의 상관성. 둘 모두의 플랫폼에서 측정한 19가지의 mrRNA에 대하여 선형 회귀를 수행하였다. 4가지의 상이한 CRC 시료를 조사하였다. 상관도는 0.85 내지 0.92의 범위였다.
도 3. 포르말린 고정된 파라핀 포매 CRC 시료들에 대하여 신선 냉동 CRC 시료에서의 miRNA 발현. (A) 4개의 매칭되는 신선 냉동 시료 및 FFPE 시료 유래의 26가지의 miRNA에서 택맨(등록상표) miRNA 발현 분석을 수행하였다. (B) 미르바나™ 바이오어레이 분석을 이용하여 2개의 매칭되는 신선 냉동 시료 및 FFPE 시료 유래의 18가지의 miRNA의 발현의 비교.
도 4. 질환 병기에 의한 특정 miRNA의 발현 수준. (A) miR-1, miR-133a, miR-143, 및 miR-145의 점도표는 정상 결장직장 조직으로부터 초기 (I기 및 II기) 및 후기 (III기 및 IV기) CRC까지 감소된 발현을 보여준다. (B) miR-31, miR-21, miR-20a, 및 miR-106a의 점도표는 정상 결장직장 조직으로부터 초기 (I기 및 II기) 및 후기 (III기 및 IV기) CRC까지 증가된 발현을 보여준다.
도 5. 정상 결장 총 RNA 및 8가지의 CRC 세포주에서의 22가지의 miRNA의 발현. 정규화 대조군으로서 U6 snRNA를 사용하여 노던 블롯(Northern blot)을 수행하였다.
도 6. SW620 세포주에서의 miR-145의 과다발현은 세포 형태 및 증식에 영향을 준다. (A) miR-145 유전자를 둘러싸고 있는 게놈 영역을 PCR-증폭시키고, CMV 프로모터의 제어 하의 pSilencer™ 4.1 내로 클로닝하였다. 성숙 miR-145를 트랜스펙션 이후 SW620 세포의 풀링된 집단에서 노던 분석에 의해 탐지하였다. U6 snRNA를 로딩 대조군으로서 사용하였다. (B) miR-145를 과다발현하는 세포 집단의 주요한 두드러진 특징은 SW620의 둥근 단일 세포로부터 섬유아세포-유사 세포에서 전형적인 연장되는 과정들에 의해 길쭉한 세포로 세포 형태가 변화한다는 것이었다. (C) miR-145 발현 SW620 세포 집단은 혈청의 존재 하에 배양될 때 고정 비의존성 성장이 2배 증가함을 보여 주었고, 혈청의 존재 (채워진(solid) 막대) 또는 부재 (채워지지 않은 막대) 하에 배양될 때 세포 증식/대사 활성이 50%보다 많이 증가됨을 보여 주었다 - p<0.001 -. (D) SW620/miR-145 세포 및 대조 세포의 웨스턴(Western) 분석은 E-카드헤린(cadherin)의 정상 상태 수준이 성숙한 miR-145를 발현하는 SW620 세포에서 50% 더 낮았다.
도 7. miR-145의 안티센스-매개된 복귀는 증식을 유도하였다. (A) 처리된 시료 유래의 총 RNA는 miR-145가 miR-145 특이적 2'Ome 안티센스 RNA를 받은 세포에서 고갈되지만 모조물 처리된(mock treated) 또는 miR-145 센스 처리된 대조군에서는 그렇지 않음을 보여 주었다. (B) 기대되는 바와 같이, SW620/miR-145 발현 풀은 혈청의 존재 (채워진 막대) 또는 부재 (채워지지 않은 막대) 하에 벡터 대조군과 비교하여 증가된 증식을 보여 주었다. miR-145 안티센스 RNA로 처리될 때, 증식의 감소가 SW620/벡터 및 SW620miR-145 풀 둘 모두에서 보였다. 3회의 독립적인 실험을 수행하였다 - p<0.05; p<0.01; p<0.001 -.
도 8. SW620 세포주에서의 miR-143의 과다발현은 세포 형태 및 증식에 영향을 준다. (A) miR-143 게놈 DNA를 (pSilencer™ 2.1에서) U6 프로모터의 제어 하에 클로닝하고, SW620 세포를 트랜스펙션시켰다. miR-143을 발현하는 7개의 안정한 SW620 클론 (A4, B3, B5, B6, C1, C5, 및 D2)을 동정하였다. U6 snRNA를 로딩 대조군으로서 사용하였다. (B) 7개의 SW620/miR-143 클론을 벡터 대조군과 비교하여 세포 형태에 대하여 조사하였다. (C) SW620/miR-143 클론 및 대조 세포의 웨스턴 분석은 E-카드헤린의 정상 상태 수준을 보여 준다. E-카드헤린 비는 정규화 대조군으로서 β-액틴을 사용하여 계산하였다. (D) 7개의 SW620/miR-143 클론을 혈청의 부재 (채워지지 않은 막대) 또는 존재 (채워진 막대) 하에 배양할 때 벡터 대조군과 비교하여 증식/대사 활성에 대하여 분석하였다. (E) 상기 클론들을 혈청의 존재 하에 신속한 연성 한천 분석에서 고정 비의존성 세포 성장에 대하여 조사하였다. 2회의 독립적인 실험을 수행하였다 - p<0.01, p<0.001 -.
도 9. miR-143 및 miR-145 발현 사이의 상관성. 선형 회귀 분석을 수행하여 miR-143 및 miR-145 유전자에 있어서의 정규화된 발현 강도 (log2)를 비교하였다. miRNA들 사이의 상관도는 0.95였다.
도 10. miR-17-92의 상호작용 지도(interaction map)를 도시한다.
도 11. miR-17-92 클러스터 및 miR-20a 단독의 SW620 세포주에서의 과다발현은 세포 형태 및 증식에 영향을 준다. 13번 염색체 기반의 miR-17-92 클러스터를 함유하는 게놈 영역 및 miR-20a 프리(pre)-miRNA를 함유하는 게놈 영역을 PCR-증폭시키고, CMV 프로모터의 제어 하의 레트로바이러스 벡터 pQCXIN에 클로닝하고, HCT116 결장암 세포주에 전달하였다. (A) HCT116/miR-17-92 클러스터 클론 (4-1 및 4-17)을 노던 블롯 분석을 이용하여 miR-20a, miR-92, miR-18a, 및 miR-19a 과다발현에 대하여 스크리닝하였다. miR-20a만을 과다발현하는 클론 (9-3,9-9,9-12, 및 9-13)을 이들 클러스터 구성요소의 발현에 대하여 또한 스크리닝하였다. (B) 노던 블롯으로부터 계산된 miR-17-92 구성요소 miRNA 발현 수준의 막대 그래프. 발현 수준을 U6 snRNA에 대하여 정규화하였다. (C) miR-17-92 클러스터 (4-1,4-7) 또는 miR-20a를 과다발현하는 몇몇 HCT116 클론 (9-3, 9-9, 9-12, 9-13)을 혈청의 존재 (채워진 막대) 또는 부재 (채워지지 않은 막대) 하에 세포 증식/대사 활성에 대하여 조사하였다. (D) 상기 클론들을 (혈청의 존재 하에) 신속한 연성 한천 분석에서 고정 비의존성 세포 성장에 대하여 조사하였다 - p<0.05, p<0.01, P<0.001 -.

마이크로RNA(miRNA)는 다양한 기작을 통하여 단백질 발현을 제어하는 짧은 비암호화 RNA이다. 상기 RNA의 변경된 발현은 다양한 암과 관련된 것으로 밝혀졌다. CRC에서 miRNA 발현을 프로파일링하여 CRC 세포에서 특정 mrRNA의 기능을 분석하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 미르바나™ miRNA 바이오어레이를 사용하여 8개의 CRC 세포주 모델, 상이한 병기의 45개의 인간 CRC 시료, 및 4개의 정상 결장 조직 시료에서 miRNA 발현 프로파일을 결정하였다. 세포주 모델 및 임상 시료 둘 모두에서 정상 결장과 CRC 사이에서 차등 발현된 11가지의 공통 miRNA를 동정하였다. CRC에서 크게 감소되는 miR-145를 포함하는 이들 miRNA 중 다수가 CRC 종양 진행의 상이한 병기와 관련됨이 지금에 와서야 밝혀졌다. 시험관 내 데이터에 의하면, miR-143 및 miR-145는 세포 배경(cell context)에 따라 세포 증식을 억제 또는 증대시키는 정반대의 기능을 한다. 몇몇 miRNA는 또한 CRC에서 과다발현되며, 이는 miR-31 및 miR-17-92 클러스터를 포함한다. SW620 CRC 세포에서의 miR-17-92의 증대는 세포 증식을 감소시켰지만 고정 비의존성 성장을 증가시켰다. 이 miRNA 클러스터의 상세한 분석은 miR-20A가 활성 구성요소임을 시사하였다. 따라서, miRNA는 CRC 치료법에 대한 표적과 진단 및 예후 분석물이 될 수 있다.

45개의 임상 CRC 시료, 4가지의 매칭되는 정상 결장직장 조직 및 8개의 세포주 모델에서의 발현 miRNA를 프로파일링하였다. 11가지의 miRNA가 정상 결장과, 임상 시료 및 세포주 둘 모두 사이의 발현 수준에 있어서 공통적으로 변화하였다. miRNA들 중 일부는 발현 패턴이 CRC의 상이한 병기에 제한되며, 이 암에 대한 잠재적인 예후 또는 진단 마커를 제공할 수 있다. CRC 모델 세포주에서의 miR-143 또는 miR-145의 재발현은 반대되는 방식으로 세포 분화 및 증식 둘 모두에 영향을 준다. 더욱이, miR-17-92 클러스터의 발현 증가는 세포 증식을 감소시켰지만 고정 비의존성 성장을 증가시켰다. 이 클러스터의 상세한 분석은 miR-20a는 이들 세포 배경 의존성 영향의 활성 구성요소임을 보여준다.

바이오마커는 나타낸 마커 유전자의 발현 수준의 임의의 지표이다. 상기 지표는 직접적이거나 간접적일 수 있으며, 생리적 파라미터가 주어질 경우 그리고 내부 대조군, 정상 조직 또는 기타 암종과 비교하여 유전자의 과다발현 또는 과소발현의 척도가 될 수 있다. 바이오마커에는 제한 없이 핵산 (과다발현 및 과소발현 둘 모두 그리고 직접적인 것 및 간접적인 것 둘 모두)이 포함된다. 바이오마커로서 핵산을 사용하는 것은 DNA 증폭, RNA, 마이크로RNA, 이형성 손실((loss of heterozygosity, LOH), 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP), 부수체(microsatellite) DNA, DNA 저메틸화 또는 과메틸화 측정을 제한 없이 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 바이오마커로서 단백질을 사용하는 것은 양, 활성, 당화, 인산화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화 등과 같은 개질 또는 면역조직화학(IHC)을 측정하는 것을 제한 없이 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함한다. 다른 바이오마커에는 이미지화, 세포 계수 및 아폽토시스(apoptosis) 마커가 포함된다.

본 명세서에 제공된 나타낸 유전자 또는 miRNA는 특정 종양 또는 조직 유형과 관련된 것들이다. 하나 이상의 암과 관련된 많은 유전자가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명은 바람직한 마커 유전자 및 더욱 더 바람직한 마커 유전자 조합을 제공한다. 이들은 본 명세서에서 상세하게 설명된다.

마커 유전자는 서열 번호로 표기되는 서열에 대응하며, 이때 상기 서열 번호는 그 서열 또는 그의 상보체를 포함한다. 유전자 절편 또는 단편은 언급된 서열 또는 그의 상보체의 일부로서 해당 유전자의 서열인 것으로 식별하기에 충분한 일부분을 포함하는 경우 이러한 유전자의 서열에 대응한다. 유전자 발현 산물은 그러한 서열의 RNA, mRNA, miRNA 또는 cDNA가 그러한 서열 (예를 들어, 프로브)을 갖는 구성물에 혼성화될 때 또는 펩티드 또는 단백질의 경우 이것이 그러한 mRNA에 의해 암호화될 때 그러한 서열에 대응한다. 유전자 발현 산물의 절편 또는 단편은 이것이 그 유전자 또는 유전자 발현 산물의 서열인 것으로 식별되기에 충분한 언급된 유전자 발현 산물 또는 그의 상보체의 일부분을 포함하는 경우 이러한 유전자 또는 유전자 발현 산물의 서열에 대응한다. 본 명세서에 개시되고 특허 청구된 본 발명의 방법, 조성물, 용품 및 키트는 하나 이상의 마커 유전자를 포함한다. 종양 또는 조직 유형과 관련된 임의의 유전자 과다발현 또는 과소발현에 대응하는 유전자 및 유전자 발현 산물을 말하기 위하여 본 명세서 전체에 걸쳐 "마커" 또는 "마커 유전자"가 사용된다. 바람직한 마커 유전자가 본 명세서에 보다 상세하게 설명되어 있다. 본 명세서에서 논의되는 모든 서열이 본 명세서에 개시되며 서열목록에 제공되어 있다. 본 발명은 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 분석을 행하기 위한 그리고 바이오마커 검출 시약을 추가로 함유하는 키트를 추가로 제공한다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위한 마이크로어레이 또는 유전자 칩을 추가로 제공한다. 본 발명은 단리된 핵산 서열, 그의 상보체, 또는 본 명세서에 개시된 유전자들의 조합의 그 일부분을 포함하는 진단/예후 포트폴리오를 추가로 제공하며, 여기서 상기 조합은 상이한 암종 또는 정상 조직 유래의 세포와 비교하여 전이 세포를 갖는 생물 시료에서 유전자 발현을 측정 또는 특성화하기에 충분하다.

본 발명에서 개시되는 임의의 방법은 시료에서 구성적으로 발현되는 하나 이상의 유전자의 발현의 측정을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 CRC의 상태를 결정하는 단계 및 그를 위한 적절한 치료법을 확인하는 단계에 의해 치료법의 지침을 제공하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 CRC의 상태를 결정하는 단계 및 그를 위한 대응하는 예후를 확인하는 단계에 의해 예후를 제공하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 34의 서열로부터 선택되는 하나 이상의 단리된 서열을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 본 명세서에 개시되는 분석을 행하기 위한 키트, 용품, 마이크로어레이 또는 유전자 칩, 진단/예후 포트폴리오 및 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 결과를 보고하기 위한 환자 보고서를 추가로 제공한다.

조직 시료 중 특정 핵산 서열의 단순한 존재 또는 부재는 진단 또는 예후 값을 좀처럼 갖지 않는 것으로 밝혀졌을 뿐이었다. 반면에, 다양한 단백질, 펩티드, miRNA 또는 mRNA의 발현에 관한 정보는 중요한 것으로 점점 더 간주된다. 게놈 내의, 단백질, 펩티드, miRNA 또는 mRNA("유전자"라고 하는 그러한 서열)를 발현하는 잠재력을 갖는 핵산 서열의 단순한 존재는 혼자서는 단백질, 펩티드 또는 mRNA가 주어진 세포에서 발현되는지의 결정 요인이 아니다. 그러한 생성물을 발현할 수 있는 주어진 유전자가 발현을 하는지의 여부 및 적어도 발현한다면 그러한 발현이 어느 정도의 범위까지 발생하는지는 다양한 복합적인 인자에 의해 결정된다. 이들 인자의 이해 및 평가에 있어서의 어려움과는 상관 없이, 유전자 발현을 분석하면 종양형성, 전이, 아폽토시스, 및 다른 임상적으로 관련있는 현상과 같은 중요한 사건의 발생에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 유전자가 활성 또는 불활성인 정도의 상대적인 지표는 유전자 발현 프로파일에서 발견될 수 있다. 본 발명의 유전자 발현 프로파일을 사용하여 CRC에 대하여 환자를 진단 및 치료한다.

시료 제제는 환자 시료들의 수집을 필요로 한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 환자 시료는 조직의 미세침 흡인(fine needle aspirate, FNA)에서 노듈(nodule)로부터 취해지는 세포와 같은 병든 세포를 함유하는 것으로 의심되는 것이다. 생검체 또는 외과 표본 및 레이저 포획 미세절제술(laser capture microdissection, LCM)로부터 얻어진 벌크 조직 제제가 또한 사용에 적합하다. LCM 기술은 연구될 세포를 선택하는 하나의 방식으로서, 세포 유형 이질성에 의해 야기되는 변이성을 최소화한다. 그 결과로서, 정상 또는 양성 세포와 암성 세포 사이의 마커 유전자 발현의 중간 정도의 변화 또는 적은 변화가 쉽게 탐지될 수 있다. 시료는 또한, 말초 혈액으로부터 추출된, 순환하는 상피 세포를 포함할 수 있다. 이들은 많은 방법에 따라 수득될 수 있으나, 가장 바람직한 방법은 미국 특허 제6136182호에서 기술된 자기 분리 기술이다. 관심 세포를 함유하는 시료가 일단 얻어졌으면, 적절한 포트폴리오에서의 유전자에 대하여 바이오마커를 사용하여 유전자 발현 프로파일을 얻는다.

유전자 발현 프로파일을 확립하기 위한 바람직한 방법에는 유전자에 의해 생성된 RNA - mRNA 또는 miRNA 중 어느 하나 - 의 양을 결정하는 것이 포함된다. 이는 역전사효소 PCR(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 차등 표시(differential display) RT-PCR, 노던 블롯 분석 및 다른 관련된 검사에 의해 완수된다. 개별 PCR 반응을 사용하여 이들 기술을 수행하는 것이 가능한 한편, mRNA 또는 miRNA로부터 생성되는 상보성 DNA(cDNA) 또는 상보성 RNA(cRNA)를 증폭시키고, 이를 마이크로어레이 또는 기타 적합한 방법을 통해 분석하는 것이 최선이다. 다수의 상이한 어레이 구성 및 이들의 생성을 위한 방법이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5445934호, 제5532128호, 제5556752호, 제5242974호, 제5384261호, 제5405783호, 제5412087호, 제5424186호, 제5429807호, 제5436327호, 제5472672호, 제5527681호, 제5529756호, 제5545531호, 제5554501호, 제5561071호, 제5571639호, 제5593839호, 제5599695호, 제5624711호, 제5658734호, 및 제5700637호에 기술되어 있다.

마이크로어레이 기술은 동시에 수천 개 유전자들의 정상 상태(steady-state) mRNA 수준의 측정을 가능케 하여 조절되지 않는 세포 증식의 개시, 정지, 또는 조정과 같은 효과를 확인하기 위한 강력한 도구를 제공한다. 몇몇 마이크로어레이 기술, 미르바나™ 바이오어레이, cDNA 어레이 및 올리고뉴클레오티드 어레이가 현재 널리 사용 중이다. 이들 칩들의 제작에 차이점이 있기는 하나, 본질적으로 모든 하류 데이터 분석 및 출력은 동일하다. 이들 분석의 산물은 전형적으로 마이크로어레이 상에서 기지의 위치에서 핵산 서열에 혼성화하는 시료 유래의 cDNA 서열을 탐지하기 위해 사용되는 표지된 프로브로부터 입수되는 신호의 강도의 측정치이다. 전형적으로, 신호의 강도는 cDNA, 및 따라서 표본 세포에서 발현되는 mRNA 또는 miRNA의 양에 비례한다. 다수의 이러한 기술들이 이용가능하고 유용하다. 유전자 발현을 결정하는 데 바람직한 방법은 미국 특허 제6271002호, 제6218122호, 제6218114호 및 제6004755호에서 확인될 수 있다.

발현 수준의 분석은 이러한 신호 강도를 비교함으로써 수행된다. 이는 검사 시료 내 유전자의 발현 강도 대 대조군 시료 내 유전자의 발현 강도의 비율 매트릭스(ratio matrix)를 작성함으로써 가장 잘 수행된다. 예를 들어, 병든 조직으로부터의 유전자 발현 강도를 동일한 유형의 양성 또는 정상 조직으로부터 생성된 발현 강도와 비교할 수 있다. 이들 발현 강도의 비율은 검사 시료와 대조군 시료 사이의 유전자 발현의 배수 변화를 나타낸다.

종양형성에 관련된 인자들 간 각 유전자의 차등 발현에 대한 유의성의 증거와 관련된 순위가 매겨진 목록을 산출하는 통계적 검정에 근거하여 선택이 이루어질 수 있다. 이러한 검정의 예에는 아노바(ANOVA) 및 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis)가 포함된다. 순위는 컷오프까지 가중치들의 합계를 한 부류를 다른 부류보다 지지하는 증거의 우세로 해석하도록 고안된 모델에서 가중치로서 사용될 수 있다. 문헌에 기재된 기존의 증거들이 또한 가중치를 조절하는 데 사용될 수도 있다.

유전자 발현 프로파일은 다수의 방식으로 표시될 수 있다. 원 형광 강도 또는 비율 매트릭스를 세로열은 검사 시료를 나타내고 가로행은 유전자를 나타내는 도식적 계통수로 배열하는 것이 가장 보편적이다. 데이터는 유사한 발현 프로파일을 갖는 유전자들이 서로 인접하도록 배열된다. 각 유전자의 발현율은 색상으로 가시화된다. 예를 들어, 1 미만의 비율(하향 조절)은 스펙트럼의 청색 부분에 나타나는 반면 1 초과의 비율(상향 조절)은 스펙트럼의 적색 부분에 나타난다. "진스프링(GeneSpring)" (실리콘 제네틱스, 인크.(Silicon Genetics, Inc.)), "디스커버리(Discovery)" 및 "인퍼(Infer)™" (파텍, 인크.(Partek, Inc.))를 포함하는 구매가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램이 그러한 데이터를 디스플레이하는 데 이용가능하다.

독특한 RNA 종의 풍부성의 측정치는 생물 시료로부터의 일차 종양 또는 전이 종양으로부터 수집된다. 환자의 연령, 성별, 일차 종양의 발원 부위, 및 전이 부위 (적용가능할 경우)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임상 기록과 함께 이들 판독치를 사용하여 관련 데이터베이스를 생성한다. 이 데이터베이스는 CRC의 존재, 예후 또는 상태를 결정하기 위한 마커 변수로서 사용될 수 있는 임상 인자 및 miRNA 전사체를 선택하는 데 사용된다.

유전자 발현을 결정하기 위하여 단백질 수준을 측정하는 경우에는, 적절한 특이도와 감도가 얻어지는 한 당업계에 알려진 임의의 방법이 적합하다. 예를 들어, 단백질 수준은 해당 단백질에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편에의 결합 및 항체결합 단백질의 정량에 의해 측정할 수 있다. 항체는 방사성, 형광 또는 기타 탐지가능한 시약에 의해 표지되어 탐지를 촉진할 수 있다. 탐지 방법은 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 면역블롯 기술을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 사용되는 조절된 유전자들이 실시예에 기재된다. 차등적으로 발현되는 유전자는 CRC가 없는 환자에 비하여 CRC를 갖는 환자에서 또는 상이한 CRC 상태 또는 진행을 갖는 환자에서 상향 조절 또는 하향 조절된다. 상향 조절 및 하향 조절은, 일부 기준선에 비해 유전자의 발현 양에서 검출가능한 차이(발현을 측정하는데 사용되는 시스템에서 노이즈의 기여도를 넘어서는 차이)가 발견됨을 의미하는 상대적인 용어이다. 다음, 병든 세포 내 관심 유전자는 동일한 측정 방법을 사용하여 기준선 수준에 비해 상향 조절 또는 하향 조절된다. 이 맥락에서, "병든"은 세포의 조절되지 않는 증식으로 야기되는 것과 같이 신체 기능의 적절한 성능을 저지하거나 방해하고, 또는 방해할 가능성을 갖는 신체 상태의 변경을 일컫는다. 어떤 사람의 유전자형 또는 표현형의 일부 양상이 질환의 존재와 부합하는 경우 그는 질환을 가진 것으로 진단된다.

진단 또는 예후를 수행하는 행위는 재발 가능성, 치료법 유형 및 치료법 관찰을 결정하는 것과 같은 질환/상태 문제의 결정을 포함할 수도 있다. 치료법 관찰에서, 시간을 두고 유전자들의 발현을 비교하여 유전자 발현 프로파일이 정상 조직에 더욱 일치하는 양상으로 변화하였거나 변화하고 있는지 여부를 결정함으로써 정해진 치료 과정의 효과와 관련하여 임상적 판단이 이루어진다.

집단 내 유전자 세트에 대해 수득된 정보가 진단, 예후, 또는 치료 선택과 같은 임상적으로 관련있는 판단을 내리기 위한 확고한 근거를 제공하도록 유전자들을 집단으로 나눌 수 있다. 이들 유전자 세트들은 본 발명의 포트폴리오를 구성한다. 대부분의 진단 마커에 대해 그러하듯이, 정확한 의학적 판단을 내리기에 충분한 가장 적은 수의 마커들을 사용하는 것이 종종 바람직하다. 이는 시간 및 자원의 비생산적인 사용뿐만 아니라 추가의 분석을 미결정하는(pending) 치료 연기를 방지한다.

포트폴리오를 선별하는 과정은 또한 경험적 규칙의 적용을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 규칙은 생물학 및 임상 결과를 산출하기 위해 사용된 기술의 이해에 근거하여 수립된다. 더욱 바람직하게는, 이들은 최적화 방법으로부터 얻은 출력에 적용된다. 예를 들어, 포트폴리오 선발의 평균 분산 방법이 암 환자에게서 차등 발현되는 다수의 유전자들에 대한 마이크로어레이 데이터에 적용될 수 있다. 이 방법으로부터 얻어지는 출력은 병든 조직에서뿐만 아니라 말초 혈액에서 발현되는 일부 유전자들을 포함할 수 있는 최적화된 유전자 세트일 것이다. 만약 검사 방법에 사용된 시료가 말초 혈액에서 얻은 것이고 암의 사례에서 차등 발현된 특정 유전자들이 말초 혈액에서도 차등 발현될 수 있다면, 말초 혈액에서 차등 발현된 것들을 배제하는 효율적 투자경계선으로부터 포트폴리오가 선택되는 경험적 규칙이 적용될 수 있다. 물론 이 규칙은, 예를 들어 데이터 사전 선별 과정에서 규칙을 적용함으로써 효율적 투자경계선의 형성 이전에 적용될 수 있다.

유전자 발현 포트폴리오를 확립하는 하나의 방법은 주식 포트폴리오를 확립하는 데 광범위하게 사용되는 평균 분산 알고리즘과 같은 최적화 알고리즘의 사용을 통해서이다. 이 방법은 미국 특허 출원 공개 제20030194734호에 상세히 기재되어 있다. 본질적으로, 이 방법은 수익의 가변성을 최소화하면서 해당 세트를 사용함으로써 받게 되는 수익(예컨대, 발생되는 신호)을 최적화시킬 입력항목 세트(재무 분야에서는 주식, 여기서는 강도에 의해 측정된 발현)의 수립을 요구한다. 다수의 상업적 소프트웨어 프로그램이 이러한 작업을 수행하기에 이용가능하다. 본 명세서 전체에서 "와그너 소프트웨어(Wagner Software)"로 언급되는 "와그너 어소시에이츠 평균-분산 최적화 응용 프로그램(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application)"이 바람직하다. 이 소프트웨어는 효율적 투자경계선(efficient frontier)을 결정하기 위해 "와그너 어소시에이츠 평균-분산 최적화 라이브러리(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library)" 유래 함수를 사용하며 마르코위츠 (Markowitz) 방식에서의 최적 포트폴리오가 선호된다. 마르코위츠 (1952). 이러한 유형의 소프트웨어의 사용은, 소프트웨어가 본래 의도된 재무 분석 목적으로 사용되는 경우에 주식 수익률 및 위험도 측정이 사용되는 방식으로 마이크로어레이 데이터가 입력항목으로서 처리될 수 있도록 변환되는 것을 요구한다.

문제의 생물학과 반드시 관련된 것은 아닌 다른 경험적 규칙이 적용될 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자 또는 유전자군이 포트폴리오의 소정 비율만을 차지할 수 있다는 규칙이 적용될 수 있다. 와그너 소프트웨어와 같은 구매가능한 소프트웨어가 이러한 유형의 경험적 방법을 용이하게 수용한다. 이는, 예를 들어, 정확도 및 정밀도 이외의 요인들(예컨대, 예상 라이센싱료)이 어떤 하나 이상의 유전자들을 포함시키는 것이 바람직한지에 영향을 미치는 경우에 유용할 수 있다.

본 발명의 유전자 발현 프로파일은 또한 암 진단, 예후, 또는 치료 관찰에 유용한 기타 비유전적 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 상황에서는 상기에 기재된 유전자 발현 기반 방법의 진단력과 혈청 단백질 마커와 같은 통상적인 마커(예컨대, 암 항원 27.29 ("CA 27.29"))로부터 얻은 데이터를 조합하는 것이 유익하다. CA 27.29와 같은 피분석물을 포함하는 일련의 이러한 마커들이 존재한다. 하나의 이러한 방법에서는, 치료받은 환자로부터 혈액을 정기적으로 채취한 후 상기에 기재된 혈청 마커들 중 하나에 대한 효소 면역분석에 적용한다. 마커의 농도가 종양의 재발 또는 치료법 실패를 제시하는 경우, 유전자 발현 분석이 가능한 시료 공급원을 채취한다. 의심스러운 덩어리가 존재하는 경우, 미세 바늘 흡인물(FNA)을 취한 후 덩어리로부터 채취한 세포의 유전자 발현 프로파일을 상기에 기재된 바와 같이 분석한다. 대안적으로, 이전에 종양이 제거되었던 곳의 조직에 인접한 영역으로부터 조직 시료를 채취할 수도 있다. 이 접근법은 다른 검사가 모호한 결과를 산출하는 경우 특히 유용할 수 있다.

본 발명에 따라 제작된 키트는 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위한 포맷화된 분석(formatted assays)을 포함한다. 이들은 시약 및 설명서와 같이 분석을 수행하는 데 요구되는 모든 또는 일부 재료들 및 그를 통해 바이오마커가 분석되는 매체를 포함할 수 있다.

본 발명의 물품은 질환을 치료하고, 진단하고, 예측하고, 기타 평가하는 데 유용한 유전자 발현 프로파일의 표현을 포함한다. 이들 프로파일 표현은 컴퓨터 판독가능 매체(자기적, 광학적 등)와 같이 기계에 의해 자동적으로 판독될 수 있는 매체로 바꾸어진다. 물품은 또한 이러한 매체 내 유전자 발현 프로파일을 평가하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 물품은 상기에 기재된 유전자 포트폴리오의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위한 컴퓨터 설명서를 포함하는 CD ROM을 포함할 수도 있다. 물품은 또한 환자 시료로부터 얻은 유전자 발현 데이터와 비교할 수 있도록 그 안에 디지털 방식으로 기록된 유전자 발현 프로파일을 가질 수도 있다. 대안적으로, 프로파일은 상이한 표현 양식으로 기록될 수 있다. 도식적 기록은 이러한 양식의 하나이다. 상기에 언급된 파르텍, 인크(Partek, Inc.)로부터의 "디스커버리(DISCOVERY)" 및 "인퍼(INFER)" 소프트웨어에 포함된 것들과 같은 클러스터링 알고리즘은 이러한 데이터의 가시화를 최상으로 보조할 수 있다.

본 발명에 따른 상이한 유형의 제조 물품은 유전자 발현 프로파일을 드러내는 데 사용되는 매체 또는 양식화된 분석이다. 이들은, 예를 들어, 서열 상보체 또는 프로브가 매트릭스에 고정된 마이크로어레이를 포함할 수 있는데, 상기 상보체 또는 프로브에 관심 유전자를 나타내는 서열들이 화합되어 상기 관심 유전자의 존재의 판독가능한 결정자를 생성하게 된다. 대안적으로, 본 발명에 따른 물품은 혼성화, 증폭, 및 관심 유전자의 발현 수준을 나타내는 신호 생성을 수행하기 위한 시약 키트로 만들어질 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 예시하려는 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 참고로 본 명세서에 포함된다.

실시예 1

방법

세포주

SW620, SW480, HCT116 및 HT29 세포주를 ATCC로부터 입수하였다. KM20L2 및 KM12C를 NCI-프레데릭(Frederick) 암 DCT 종양 저장소(Cancer DCT Tumor Repository)로부터 제공 받은 반면, 세포주 KM20 및 KM12SM을 이사이아 제이. 피들러(Isaiah J. Fidler) 박사(텍사스대학교 MD 앤더슨 암 센터)로부터 공급 받았다. SW620 및 SW480 세포를 둘베코 변경 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)(깁코(Gibco))에서 성장시켰다. HCT116 세포를 맥코이 5A 배지(McCoys 5A Media(깁코))에서 성장시키고 KM20, KM20L2, KM12C, KM12SM 및 HT29 세포를 RPMI 배지 1640(깁코)에서 성장시켰다. 0.72 mM L-글루타민에서 배양되었던 HT29 세포를 제외하고는 모든 배지에 10% 우태아혈청(제이알에이치 바이오사이언스(JRH Biosciences)), 2 mM L-글루타민(깁코) 및 페니실린-스트렙토마이신 용액(0.1 U/mL 페니실린 및 0.1 μg/mL 스트렙토마이신)(깁코)을 보충하였다.

임상 시료

총 49개의 급속 냉동(snap-frozen) CRC 시료를 게노믹스 콜래버러티브 인크.(Genomics Collaborative Inc.) (GCI, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재) 또는 클리노믹스 바이오사이언스, 인크.(Clinomics Bioscience, Inc.) (미국 매사추세츠주 피츠필드 소재)로부터 획득하였으며, 이는 4개의 정상 결장 시료, 4개의 I기 시료, 19개의 II기 시료, 20개의 III기 시료 및 2개의 IV기 시료를 포함한다 (표 1). 또한, 8개의 매칭된(matched) 포르말린 고정된 파라핀 포매(FFPE) 시료들(3개의 II기, 4개의 III기 및 1개의 IV기)을 입수하였다. 초기 (I기 및 II기) 대 후기 (III기 및 IV기) 질환 사이에 종양 함량의 유의미한 차이 없이 모든 CRC 시료들의 정중 종양 함량은 70%였다.

287개의 인간 miRNA 프로브를 포함하는 미르바나™ 바이오어레이(앰비온(Ambion), 버전 1)를 사용하여 CRC miRNA 특이적 발현양상을 확인하였다. 문헌[Shingara et al. (2005)]. 급속 냉동 시료용 미르바나™ 단리 키트(앰비온) 및 FFPE 시료용 리커버올(RecoverAll)™ 총 핵산 단리 키트(앰비온)를 사용하여 결장직장 시료 유래의 5 ㎍의 총 RNA로부터 miRNA를 단리하였다. 이어서, 모든 시료를 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(플래쉬-페이지(flashPAGE™), 앰비온)으로 분획화하고 선형 아크릴아미드를 이용하여 에탄올 침전에 의해 소형 RNA(< 40 nt)를 회수하였다. miR-16의 정량적 RT-PCR (qPCR)을 이용하여 miRNA 어레이 분석 전에 miRNA 농축을 확인하였다.

모든 시료로부터의 소형 RNA들에 대해 아민 개질된 유리딘이 혼입되는 폴리(A) 중합 효소 반응을 수행하였다(앰비온). 이어서 테일 형성된 시료를 아민-반응성 Cy3 또는 Cy5(인비트로젠(Invitrogen))를 이용해 형광 표지하였다. 단색 또는 이색 혼성화를 각각 임상적 CRC 또는 세포주 프로파일링 실험에 대해 수행하였다. 이색 실험을 위해, 세포주 miRNA를 정상 결장 RNA(앰비온)와 직접적으로 비교하였다. 형광 표지된 RNA를 유리섬유 필터를 사용해 정제하고 용출하였다(앰비온). 이어서 각 시료를 42℃에서 14시간 동안 바이오어레이 슬라이드(앰비온)에 혼성화하였다. 이 어레이를 세척하고 애질리언트(Agilent) 2505B 동초점 레이저 마이크로어레이 스캐너(애질리언트)를 사용해 스캔한 후 데이터를 발현 분석 소프트웨어(Expression Analysis software)(코드링크(Codelink), 버전 4.2)를 사용해 수집하였다.

특정 miRNA의 노던 블롯 분석을 실시예 2에 약술한 바와 같이 수행하였다.

통계 분석

데이터를 R 소프트웨어 패키지(R software package)를 이용해 분석하였다. 차등 유전자 발현을 결정하기 전에 데이터를 변위치(quantile) 정규화하였다. 반복된 시료 및 프로브 값들을 평균을 내고 시료 그룹들 간에 변동이 현저한 유전자를 발견하기 위해 스튜던트 t-검정(Student t-test)을 수행하였다. 적어도 하나의 그룹에 대해 정중 정규화된 신호 강도가 100(정중 신호의 75번째 백분위수)보다 크면서 평균 변화가 > 1.5배이고 p-값이 < 0.05이면, 그 유전자를 선택하였다. 일원 아노바를 이용하여 miRNA 발현 수준을 평가하였다. ABI miRNA 택맨(등록상표) 시약을 사용해 정량적 QPCR을 수행하여 miRNA 발현 프로파일을 확인하였다. 문헌[Chen et al. (2005)]. 고용량 DNA 아카이브 키트(High Capacity DNA Archive kit) 및 3 ㎕의 5x RT 프라이머를 제조사(앰비온)의 지시에 따라서 사용해 십(10) ng의 총 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 15 ㎕의 반응물을 16℃에서 30분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분간 서모사이클러(thermocycler)에서 인큐베이션하고 4℃로 유지하였다. 모든 역전사효소 (RT) 반응물은 주형 대조군을 포함하고 있지 않았다. 표준 택맨(등록상표) PCR 키트 프로토콜을 이용해 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7900HT 서열 탐지 시스템 상에서 QPCR을 수행하였다. 10 ㎕ PCR 반응물은 0.66 ㎕의 RT 생성물, 1 ㎕의 택맨(등록상표) 마이크로RNA 분석 프라이머 및 프로브 믹스, 5 ㎕의 택맨(등록상표) 2x 범용 PCR 마스터 믹스 (앰퍼라아제(Amperase) UNG가 없음) 및 3.34 ㎕의 물을 포함하였다. 반응물을 95℃에서 10분간 384 웰 플레이트 내에서 인큐베이션하고, 이어서 95℃에서 15초, 및 60℃에서 2분의 주기를 40회 반복하였다. 모든 QPCR 반응물은 cDNA 무함유 대조군을 포함하였고 모든 반응은 삼중으로 수행하였다.

플라스미드 제작물

플라스미드 pSilencer™ 2.1 (앰비온)을 다중 클로닝 부위 내에서 변경시켜 독특한 제한 부위 및 RNA 폴리머라아제 III 전사 종결 염기서열(transcriptional terminator) (TTTTTT)을 도입하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 합성하고 (시그마(Sigma)), pSilencer™ 2.1에 어닐링 및 라이게이션하고, BamHI 및 HindIII로 사전 절단하여 pSilencer™ 2.1Term을 생성하였다: pSilU6upper 5'GATCCCTCGAGTCTAGATTTTTTGGAAA (서열 번호 1) 및 pSilU6lower 5'AGCTTTTCCAAAAAATCTAGACTCGAGG (서열 번호 2). DNA 암호화 pre-miR-143 또는 pre-miR-145를 프라이머 143F (5'CGGGATCCCGGAGAGGTGGAGCCCAGGTC (서열 번호 3)) 및 143R (5'GCTCTAGACAGCATCACAAGTGGCTGA (서열 번호 4))을 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 PCR-증폭시키고, BamHI 및 XbaI로 절단하고, pSilencer™ 2.1Term에 라이게이션시켜 miR-143 발현 플라스미드를 생성하였다. miR-145의 경우, 게놈 DNA를 프라이머 145F (5'CGGGATCCCAGAGCAATAAGCCACATCC (서열 번호 5)) 및 145R (5'GCTCTAGACTCTTACCTCCAGGGACAGC (서열 번호 6))을 사용하여 PCR 앰플리콘(amplicon)으로서 회수하고, BamHI 및 XbaI으로 절단하고, CMV 프로모터의 제어 하의 pSilencer™ 4.1에 라이게이션시켰다. miR-20a 또는 miR-17-92 클러스터를 암호화하는 레트로바이러스 발현 벡터의 제작을 위하여, 게놈 DNA 영역을 인간 게놈 DNA로부터 PCR-증폭시키고, BamHI 및 EcoRI으로 절단하고, pQCXIN (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 내로 클로닝하였다. miR-20a에 사용한 PCR 프라이머는 miR-20F (5'CGGGATCCCGATGGTGGCCTGCTATTTCC (서열 번호 7)) 및 miR-20aR (5'CGGAATTCTCACACAGCTGGATGCAAA (서열 번호 8))이었던 반면, miR-17-92 클러스터의 증폭에 사용한 것은 miRcF (5'CGGGATCCCGTCCCCATTAGGGATTATGC (서열 번호 9)) 및 miRcR (5'CGGAATTCCCAAATCTGACACGCAACC (서열 번호 10))이었다. 안정한 세포주의 생성 pSilencer™ 2.1 (miR-143) 및 pSilencer™ 4.1 (miR145) 플라스미드를 사용하여 안정한 클론을 생성하기 위하여, 1-5×10⁶개의 세포 (HCT116, SW480, SW620)를 6웰 플레이트의 단일 웰에 접종하였다. 80 내지 90%의 융합도(confluence)에 도달시에, 제조사의 지시에 따라 리포펙타민(Lipofectamine)™ 2000 (인비트로젠)을 사용하여 4 μg의 플라스미드 DNA로 세포를 트랜스펙션시켰다. 세포를 희석시키고, 500 μg/㎖의 하이그로마이신을 함유하는 신선 배지 내에 도말하였다. 선별 14일 후, 독립적인 클론을 수확하고, 확장시키고, 트랜스펙션된 플라스미드에 의해 암호화되는 특정 miRNA(들)의 발현에 대하여 스크리닝하였다 (실시예 2).

레트로바이러스 형질도입을 이용하여 HCT116 세포의 안정한 클론을 생성하기 위하여, 레트로바이러스 패키징 세포주 암포팩(Amphopack™) HEK 293 (비디 바이오사이언시즈) 및 PG13을 10:1의 비로 혼합한 후, 인산칼슘을 사용하여 pQCXIN-기반 벡터 10 μg으로 트랜스펙션시켰다. 형질도입한지 24시간 후, 바이러스 함유 배지를 수확하고, 이를 사용하여 HCT116 세포에 형질도입시켰다. 세포 희석 및 회수 이후, 400 μg/㎖의 G418을 배양 배지에 첨가하고, 클론을 2주 동안 선별하였다. 독립적인 클론의 특성화는 플라스미드 트랜스펙션에 대하여 상기에 설명한 바와 같았다.

안티센스 실험

비오티닐화 2'-O-메틸 안티센스 miR-145 RNA 또는 대조군을 실시예 2에 상술한 바와 같이 리포펙타민™ 2000 (인비트로젠)을 사용하여 SW620에 전달하였다. 트랜스펙션 효율은 모든 실험에서 80% 이상이었다. 모든 실험을 삼중으로 수행하였다. 셀타이터-블루(CellTiter-Blue)™ 증식 분석 SW620 세포 (3×10³개의 세포/웰) 및 HCT116 세포 (2×10³개의 세포/웰)를 혈청 함유 배지에 96웰 플레이트에 접종하였다. 세포 생육성 분석을 0일 (접종일) 및 5일에 행하였다. 총 20 μL의 셀타이터-블루™ 시약 (프로메가(Promega))을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 형광을 플루오스타 옵티마(FLUOstar OPTIMA) 마이크로플레이트 판독기 (비엠지 랩테크(BMG Labtech))를 사용하여 측정하였다. 무혈청 분석을 행하기 위하여, 배지를 1일에 무혈청 배지로 교환하였다. 신속한 연성 한천 분석 2X 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM) (깁코)에 0.6% 중탄산나트륨, 20% 우태아혈청 (제이알에이치 바이오사이언시즈), 4 mM L-글루타민 (깁코), 2X 비필수 아미노산 용액 (깁코), 2% 피루브산나트륨 (깁코) 및 페니실린-스트렙토마이신 용액 (0.1 U/mL의 페니실린 및 0.1 μg/mL의 스트렙토마이신) (깁코)을 보충하였다. 2X IMDM을 1:1의 비로 1.2% 박토 한천(Bacto Agar) (55℃)과 혼합하고, 웰 당 50 μL를 96웰 플레이트에 첨가하여 분석을 위한 프리층(pre-layer)을 생성하였다. SW620 세포 (3×10³개) 또는 HCT116 세포 (2x10³개)를 함유하는 10 μL의 세포 현탁물, 20 μL의 2X IMDM 및 30 μL의 0.8% 박토 한천 (55℃)을 혼합하고, 각각의 웰 중 고형화된 프리층에 전달하였다. 반고형 영양층을 25 μL의 2X IMDM 및 25 μL의 1.2% 박토 한천 (55℃)의 혼합에 의해 제조하고, 고형화된 세포층의 상부 상에 층화하였다. 세포를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 증식 및 세포 생육성을 셀타이터-블루(CellTiter-Blue™) 시약 (프로메가)을 사용하여 점수화하였다. 생세포 이미지화

니콘 다이아포트(Nikon Diaphot) 생물 현미경 및 니콘 E995 디지털 카메라를 사용하여 세포 형태 이미지를 포착하였다. 결과 임상 CRC 시료에서의 miRNA의 프로파일링

처음에 본 출원인은 정상 조직과 종양 조직 사이의 그리고 또한 초기 및 후기 질환 사이의 차등적 miRNA 발현에 대하여 49개의 인간 결장직장 시료 (4개의 정상 결장 시료, 4개의 I기 CRC 시료, 19개의 II기 CRC 시료, 20개의 III기 CRC 시료 및 2개의 IV기 CRC 시료)를 프로파일링하였다 (표 1). CRC 조직과 정상 결장 조직 사이에 총 37가지의 차등 발현된 miRNA를 동정하였다 (표 2).

이들 miRNA의 대부분은 CRC에서 빈번한 증가 또는 감퇴를 갖는 것으로 공지된 염색체 영역과 관련되어 있다. 문헌[Staub et al. (2006)]. 계층적 클러스터링은 각각 CRC에서 일관되게 하향 조절되거나 상향 조절되는 miR-143-145 및 miR-17-92 클러스트를 포함하는 이들 miRNA 중 다수가 대등하게 발현됨을 보여 주었다 (도 1). 흥미롭게도, 설사 miR-1-133a 클러스터 및 miR-143-145 클러스터가 상이한 염색체 상에 존재하더라도, miR-1-133a 클러스터는 miR-143-145와 강한 전사 대등성을 나타내었다. 이어서 본 출원인은 QPCR 분석을 이용하여 4개의 임상 CRC 시료에서 차등 발현된 37가지의 miRNA 중 19가지를 확인하였다 (도 2). 플랫폼들 사이의 miRNA 발현 상관도는 0.85 내지 0.92 범위였다. 계층적 클러스터링은 또한 반복 시료들이 서로에 근접함을 나타냈으며, 이는 고도로 재현가능한 결과를 추가로 나타낸다. miRNA는 또한 평균 상관도를 각각 0.92 및 0.85로 하여 앰비온 미르바나™ 어레이 또는 에이비아이 QPCR 플랫폼 중 어느 하나를 이용하여 매칭되는 FFPE CRC 시료들에서 miRNA를 재현가능하게 또한 검출할 수 있었다 (도 3). FFPE 시료 중 miRNA의 재현가능한 검출은 중요한 관찰이었으며, 그 이유는 이들 시료가 진단 검사에 널리 이용가능하기 때문이다. 특정 miRNA의 발현은 CRC 병기와 관련된다. 본 출원인은 정상과 초기 (I기 및 II기) CRC 사이에 차등 발현된 22가지의 miRNA (표 3) 및 초기 질환과 후기 (III기 및 IV기) 질환 사이에 유의한 차등 발현을 보인 6가지의 miRNA (표 4)를 동정하였다. miR-31 발현은 보다 후기의 병기에서 증가한 반면, miR-133a는 유의하게 감소하였다 (도 4A 및 도 B). 따라서 이들 miRNA는 CRC의 진행과 관련되며, CRC 병기결정에 있어서 잠재적인 바이오마커로서 작용할 수 있다.

차등적으로 발현된 miRNA의 기능적 분석을 위한 CRC 세포주를 확인하기 위해, 그리고 임상 시료와 세포주에서의 miRNA 발현 사이의 관계를 검사하기 위하여, 정상 결장 상피세포와 4개의 CRC 세포주 모델 (SW480, SW620, KM12C, KM12SM) 사이의 miRNA 발현을 미르바나™ 바이오어레이를 이용하여 비교하였다. 이 분석으로부터, 4개의 CRC 세포주 중 적어도 하나에서 43가지의 miRNA가 2배 상승 또는 2배 하향 조절되는 것으로 확인되었다 (표 5).

마이크로어레이 데이터를 확인하고 스크리닝된 CRC 세포주의 수를 확장하기 위하여, 8개의 CRC 세포주에서 이들 miRNA들 중 22가지에서 노던 블롯 분석을 실시하였다(도 5). 임상 시료에서 확인된 miRNA들 중에서, 11가지가 상기 세포주 모델에서 조절해제된 43가지와 공통으로 존재하였으며, 이는 miR-31, miR-17-92 클러스트의 구성원들, miR-1, miR-143 및 miR 145를 포함하였다 (표 6). 따라서 본 출원인은 이들 miRNA의 발현 상승이 CRC 세포 표현형에 영향을 주었는지를 결정하기 위하여 이들 miRNA의 하위세트에서 기능적 연구를 실시하였다.

CRC에서 miR-145의 기능적 역할을 조사하기 위하여, SW620 세포에서 성숙한 miR-145를 이소성적으로 발현시켰다. SW620 세포의 트랜스펙션 후, 풀링된 안정한 집단 및 클론을 선택하여 miR-145 발현에 대해 스크리닝하였다. 풀링된 집단은 높은 정상 상태 수준의 성숙한 miR-145를 발현하였으나 (SW620/miR-145로 표기됨) (도 6A), 12개의 단리된 클론 중 어느 것도 검출가능한 수준의 이 miRNA를 발현하지 않았다. 성숙한 miR-145를 발현하는 임의의 것을 생성하기 위해 독립 클론을 단리하고자 한 몇몇 시도는 실패하였다.

SW620/miR-145 세포 집단의 주요한 두드러진 특징은 SW620의 둥근 단일 세포로부터 섬유아세포-유사 세포의 전형인 연장되는 과정들에 의해 길쭉한 세포로 변화한다는 것이었다 (도 6B). SW620/miR-145 세포는 또한 각각 혈청의 존재 또는 부재 하에 배양될 때 세포 증식/대사 활성에서 50% 내지 95% 증가를 나타냈다(도 6C). 혈청의 존재 하에서 성장할 때 고정 비의존성 성장의 2배 증가가 또한 관찰되었다(도 6C). 상피 세포 마커 E-카드헤린은 또한 대조군과 비교할 때 SW620/miR-145 세포에서 50%만큼 감소되었으며(도 6D), 이것은 간엽세포-유사 세포 형태와 일치하며, SW620/miR-145 세포에 대해 관찰된 증가된 증식과 일치한다. 그러나, 시험관 내 성장 향상에서 관찰된 것과 대조적으로, SW620세포에서 miR-145의 과다발현은 생체 내 생쥐 모델에서 종양의 성장 프로파일을 변화시키지 않았다.

SW620/miR-145 세포에서의 변화가 miR-145 발현으로 인한 것임을 확인하기 위하여, 본 출원인은 miR-145-특이적 2'O-메틸 (2'Ome) 안티센스 RNA 넉다운 실험을 실시했다. miR-145-특이적 2'0me 안티센스 RNA를 받은 SW620/miR-145 세포에서는 miR-145가 고갈되었으나 센스 대조군에서는 그렇지 않았다(도 7A). 이전 실험에서 나타난 대로(도 6C), 센스 대조군 RNA의 존재 하에서 miR-145의 과다발현은 혈청에서 증가된 세포 증식을 야기하였으며, 무혈청 배지에서 더욱 현저하였다(도 7B). 그러나, 안티센스 miR-145가 SW620/miR-145에서 공동발현되면, 세포의 높은 증식 능력의 역전이 있었다(도 7B). 이들 결과는 miR-145의 특이적인 이소성 발현이 증식 능력을 증가시키면서 세포 분화의 변화를 유도하였음을 나타냈다. CRC 세포에서 miR-143의 발현은 세포 형태와 증식을 변화시킨다.

miR-145는 miR-143과 동일한 게놈 유전자좌로부터 발현되며 후자의 miRNA가 또한 CRC에서 하향 조절되었으므로, 본 출원인은 miR-143을 과다발현하는 SW620 CRC 세포의 표현형을 조사하였다(도 8). miR-143을 발현하는 7개의 안정한 클론을 단리하였으며 각각은 변화된 형태를 나타냈으며, 이것은 증가된 E-카드헤린 단백질 발현과 관련되었다(도 8A-C). 세포 증식 속도에서 어떤 차이도 관찰되지 않았지만, 모든 클론에서 고정 비의존성 성장의 감소가 입증되었다(도 8D). 이들 데이터는 miR-143의 과다발현이 miR-145를 이소성으로 발현하는 세포의 성장보다 고정 비의존성 세포 성장에 반대 효과를 가짐을 제안한다. 본 출원인은 잠재적인 miR-143-매개 성장 억제를 피하는 데 있어서 조화된 발현이 중요함을 제안한다. 사실, 49개의 프로파일링된 임상 CRC 시료에서 miR-143과 miR-145 발현 사이의 상관도는 0.95였으며, 이는 그들의 게놈 인접성과 일치한다(도 1, 도 9). 본 출원인은 miR-143-145 게놈 유전자좌를 과다발현한 안정한 세포를 생성할 수 없었으며, 따라서 두 miRNA가 모두 대등하게 과다발현될 때 CRC 세포 표현형을 조사할 수 없었다. miR-17-92 클러스터의 과다발현은 CRC 성장 프로파일에 영향을 준다. miR-17-92 클러스터 및 염색체 X와 7번 염색체에 위치한 그것의 파라로그(paralogue)로부터의 miRNA는 정상 결장 조직에 비교할 때 CRC에서 더 높은 정상 상태 수준으로 발현되었다(도 1, 표 2, 5 및 6). miR-17-92, 및 파라로그 클러스터 구성원의 차등 발현은 정상 세포에서 발암성 결장 암 세포로 전이함에 있어서 이들 miRNA의 가능한 역할을 조사하는 기초를 제공하였다. 도 10은 miR-17-92를 위한 상호작용 지도를 보여준다. 문헌[Blenkiron et al. (2007)].

13번 염색체-기반 miR-17-92 클러스터를 함유한 게놈 영역을 PCR-증폭시키고 레트로바이러스 벡터 pQCXIN에서 CMV 프로모터의 조절 하에 클로닝시키고 HCT116 결장암 세포주로 전달하였다. HCT116은 스크리닝된 다른 세포주에 비교하여 낮은 내인성 수준의 miR-17-92 클러스터 구성원을 나타냈기 때문에 선택되었다(도 5). 두 개의 HCT116/miR-17-92 클론인 4-1과 4-7을 단리하였으며 성숙한 miR-20a, miR-18a, miR-19a 및 miR-92에서 수반된 4 내지 5배 증가를 나타냈다 (도 11A 및 B).

miR-17-92 과다발현 클론인 4-1과 4-7은 무혈청 배지에서 배양될 때 세포 증식/대사 활성에서 50% 내지 60% 감소를 나타냈다(도 11C). 그러나, 혈청의 존재 하에서 배양될 때는 덜 현저한 증식 감소가 발견되었다. 세포 형태의 변화는 miR-17-92 클러스터를 과다발현하는 어느 클론에서도 발견되지 않았다. 다른 연구와 대조적으로, 상기 결과는 miR-17-92 클러스터의 발현의 추가 증가는 혈청의 부재 하에서 배양될 때 세포에서 세포 증식/대사 활성을 감소시킬 수 있음을 시사한다. miR-20a는 miR-17-92 클러스터의 활성 구성요소이다.

클러스터의 과다발현시 성장 불이익 또는 대사 활성 감소를 부여하는 miR-17-92 클러스터의 구성요소(들)를 추가로 특성화하기 위하여, miR-20a 만의 과다발현의 효과를 조사하였다. 본 출원인은 miR-20a에서 증가를 나타낸 4 HCT116/miR-20a 클론을 생성하였으며 이들 중 세 개는 벡터 대조군에 비하여 재현가능한 10 내지 12배 증가를 나타냈다(9-3, 9-9, 및 9-12). 내인성 miR-17-92 클러스터의 세 개의 다른 miRNA 구성원의 발현 변화는 발견되지 않았다(도 11A 및 B). HCT116/miR-20a 클론 중 어느 것도 변화된 세포 형태를 나타내지 않았다. 그러나, HCT116/miR-17-92 클론의 경우, 모든 miR-20a 클론이 무혈청 배지에서 세포 증식/대사 활성에서 상당한 감소를 나타냈다(도 11C). 이 표현형은 클론이 혈청-기반 성장 인자의 존재 하에서 배양될 때는 덜 주목되었다(단지 두 클론에서 유의성에 도달함).

miR-20a-발현 클론들 중 둘 그리고 miR-17-92 클러스터 클론들 중 하나가 고정 비의존성 성장을 나타내어, 세포 성장에 대한 miR-17-92 발현의 영향이 세포 배경에 의존함을 나타낸다(도 11D). 이들 결과는 또한 HCT116 증식의 조절이 miR-20a를 통해 지시되었음을 시사한다. 그러나, 클러스터의 다른 구성원에서 접종의 순서 관련성을 고려할 때, CRC 표현형에서 이들 다른 miRNA의 역할을 배제할 수 없다.

논의

본 출원인은 CRC 환자 시료와 세포주 둘 모두에서 miRNA 발현 프로파일링을 실시하였으며 정상 결장과 CRC의 상이한 단계 사이에서 차등 발현을 나타내는 특이적 miRNA의 시리즈를 발견하였다. 본 출원인은 추가로 후기 전이성 질환을 나타내는, CRC 세포주에서의 miR-143 또는 miR-145의 재발현이 상이한 방식으로 세포의 분화 상태를 변경시키고 반대되는 방식으로 세포 증식에 영향을 주었음을 입증하였다. 암에 대한 대부분의 이전의 보고서와 대조적으로, 이들 진행된 CRC 세포에서 miR-17-92의 증가된 발현은 고정 비의존성 성장의 증가와 관련되었으며 감소된 세포 증식과 관련되었다. 클러스터의 추가 정밀분석은 miR-20a가 이들 변화를 부여하는 miR-17-92의 적어도 하나의 활성 구성요소임을 제안한다.

임상 CRC 시료 중에서는, 37가지의 miRNA들이 정상 결장에 비교하여 발현이 변화되었으며 이들 miRNA 중 11가지가 CRC 세포주에서 동일한 발현 패턴을 나타냈다. 이것은 세포주가 원발성 종양에서 관찰된 miRNA 발현 패턴의 일부를 보유하며 특이적 miRNA의 기능적 분석을 위한 적합한 모델로서 작용할 수 있음을 나타냈다. miR-143과 miR-145가 CRC에서 하향 조절되었다는 본 출원인의 관찰은 이전의 보고서를 확인하였다. 문헌[Akao et al. (2006)]; 문헌[Bandres et al. (2006)]; 문헌[Cummins et al. (2006)]; 문헌[Michael et al. (2003)]; 및 문헌[Lanza et al. (2007)]. 본 출원인은 또한 이전에 보고된 miR-30a-3p (문헌[Bandres et al. (2006)]), miR-10b, miR-30c, miR-125a, miR-1, miR-133a, 및 miR-195의 하향 조절을 입증하였다. 문헌[Lu et al. (2005)].

흥미롭게도, 근육-특이적 miRNA인 miR-1과 miR-133a는 정상 결장 점막에서 높이 발현되었으나 CRC에서는 상당히 하향 조절되었다. 본 출원인은 정상 시료에서 점막내근육으로부터의 오염을 완전히 배제할 수 없지만, 본 관찰이 하기 이유로 진실이라고 생각한다. 첫째, 정상 결장 내의 점막내근육의 비율이 최소이며 이들 시료에서의 높은 수준의 miR-l-133a 발현을 설명하기 어렵다. 둘째, 후기 질환에 비교하여 초기 질환에서 더 높은 발현이 있었으며, 셋째, 이 클러스터는 CRC-특이적 miRNA 클러스터 miR-143-145와 대등하게 발현되었다. 또한, 본 발명자들이 알기로는, 근육과 정상 결장 점막 상피에서 miR-l-133a의 발현 사이의 직접적인 비교가 없었으며, 따라서 이들 miR은 근육에 완전히 특이적일 수 없다. 문헌[Chen et al. (2006)].

miR-31, miR-21 및 miR-17-92 클러스터의 구성원, 및 그 파라로그는 CRC에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. miR-31의 증가가 이전에 보고되었으나, CRC에서의 몇몇 다른 miRNA 발현 연구에서는 발견되지 않았다. 문헌[Bandres et al. (2006)]; 문헌[Cummins et al. (2006)]; 문헌[Lu et al. (2005)]; 및 문헌[Volinia et al. (2006)]. 초기 임상 시료(I기 및 II기)와 정상 결장 사이에서 총 22가지 miRNA가 조절해제된 한편, 6가지 miRNA가 초기 및 후기 시료 사이에서 상이한 발현 수준을 나타냈다. 이들 miRNA는 CRC 병기결정을 위한 새로운 바이오마커일 수 있다. 이를 위하여, 본 출원인은 또한 FFPE CRC 시료에서 miRNA의 재현가능한 검출을 입증하여, miRNA가 열등하게 보존된 이 물질에서 안정함을 나타냈다. FFPE CRC 시료에서 miRNA를 재현가능하게 검출하는 능력은 자이(Xi) 등(2007)의 최근의 결과를 확인한다.

본 연구에서는, miR-143 재발현이 콜로니 형성을 감소시키고 E-카드헤린(상피 세포 분화의 마커)을 상향 조절하였으며, 이는 miR-143이 이들 조건 하에서 CRC 세포에 대한 종양 억제 효과를 나타냈음을 시사한다. 본 관찰과 일관되게, 아카오(Akao) 등(2006)은 합성 프리-miR-143을 DLDl 또는 SW480 CRC 세포주로 전달할 때 세포 생육성에서 용량-의존성 감소를 보고하였다. 유사하게, 보랄호(Borralho) 등(2007)은 HCT116, LoVo, SW480 및 SW620 세포에서 miR-143 과다발현이 세포 생육성 감소 및 아폽토시스 증가를 야기하였음을 보고하였으며, 이는 miR-143이 정상 점막에서 프로-아폽토시스 역할을 함을 시사한다. 이 후자의 연구는 miR-143 유전자의 더 큰 전구체의 발현에 관련되었으며 본 연구에서 사용된 재발현 전략과 가장 견줄만하다. 대조적으로, miR-145는 세포 증식, 고정 비의존성 성장을 증가시키고, E-카드헤린 수준을 감소시켰다. 이들 효과는 세포가 무혈청 배지에서 배양될 때 향상되었으며, 이는 세포 성장 인자가 이들 miRNA의 활성에 영향을 줄 수 있음을 시사한다. 이들 결과는 후기 CRC 세포주에서 miR-145의 발현이 세포 증식을 촉진하고/하거나 아폽토시스를 위한 정상 신호를 차단하기 위해 작용함을 제안한다. 흥미롭게도, miR-145를 재발현하는 것에 대한 본 관찰은, 합성 프리-miR-145의 도입 후 DLDl 또는 SW480 세포에서 세포 생육성의 손실을 보고한 이 miRNA를 위한 기능적 역할을 조사하는 단일 연구와 상이하다. 문헌[Akao et al. (2006)]. miR-145를 도입하는 방법 외에, 본 연구는 또한 본 출원인이 후기 CRC 세포를 사용하였으며 높은 정상 발현 수준의 miR-145를 달성할 수 없었다는 점에서 상이하다.

높은 수준의 성숙한 miR-145를 발현하는 단일 클론을 생성하지 못한 것은 miR-145가 특정 역치 초과로 발현될 경우 세포 성장이 유지될 수 없음을 시사하였다. 그러나, miR-145를 발현하는 세포의 풀링된 집단은 일관되게 CRC 세포주에서 증가된 증식을 나타냈다. 본 실험실과 다른 실험실로부터의 데이터는 miR-143이 miR-145와 독립적으로 과다발현될 때 CRC 세포 성장을 감소시킴을 나타낸다. 두 miRNA 모두 동일한 게놈 유전자좌 (5q23)를 차지하므로, 본 출원인은 miR-143 및 miR-145가 각각 잠재적인 종양 억제자와 발암유전자로서 대등하게 반대 방식으로 작용하는 것으로 가정한다. 독립적으로 발현될 경우, 이들 miRNA의 각각은 그들의 각각의 발암유전성 및 종양 억제자 역할을 나타낸다. miR-143은 단일 클론에서 높은 수준으로 발현될 수 있지만, 생리학적 발현 수준의 miR-145를 달성하는 것은 miR-143과의 공동발현을 요구하는 것일 수 있다. 중요하게는, 본 결과는 또한 miR-143을 홀로 전달하는 것이 CRC를 위한 가능한 치료 전략일 수 있음을 강조한다.

본 연구에서 한 가지 특히 흥미로운 관찰은 miR-17-92 폴리시스트론 또는 miR-20a 단독의 추가적인 과다발현이 혈청 성장 인자의 부재 하에서 세포 증식의 감소를 야기하였다는 것이었다. 이들 결과는 miR-17-92 및 miR-20a가 급속하게 분열 중인 HCT116 세포에서 과다발현될 때 종양 억제자로서 작용할 수 있음을 시사한다. 이와는 대조적으로, 고정 비의존성 성장의 증가가 일부 miR-17-92 및 miR-20a 클론에서 보였다. 이러한 상충되는 관찰들은 암에서의 miR-17-92의 보고된 역할과 일치한다.

몇몇 연구에 의하면 miR-17-92가 발암유전자로서 연루되었다. 이 클러스터는 상이한 부류의 림프종 및 CRC에서 빈번하게 증폭되는 게놈 영역 (13q)과 관련된다. 문헌[Ota et al. (2004)]; 및 문헌[Tsafrir et al. (2006)]. 이러한 클러스터에 의해 암호화되는 miRNA는 림프종, 결장암, 폐암, 췌장암 및 전립선암에서 또한 고도로 발현된다. 문헌[Volinia et al. (2006)]; 문헌[Hayashita et al. (2005)]; 및 문헌[He et al. (2005)]. 왕(Wang) 등 (2006)은 생쥐에서 레트로바이러스 돌연변이 유발을 이용하여 잠재적인 발암유전자로서 miR-17-92를 동정하였는데, 이는 림프종의 형성으로 이어졌다. 더욱이, miR-17-92 클러스터의 과다발현은 생쥐 모델에서 B-세포 림프종을 촉진하며 시험관 내에서 폐암 세포주에서 세포 증식을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Hayashita et al. (2005)]; 및 문헌[He et al. (2005)]. 몇몇 상이한 암 유형에서 13q31-32에서의 이형성 손실이 불량한 예후에 이르게 될 수 있기 때문에 miR-17-92 클러스터는 종양 억제자로서 작용할 수 있다는 증거가 또한 있다. 문헌[Eiriksdottir et al. (1998)]; 문헌[Lin et al. (1999)]; 및 문헌[Tsang et al. (1999)]. 더욱이, 문헌[Hossain et al. (2006)]은 유방암 세포주 내로의 miR-17-5p 재도입이 세포 증식 및 고정 비의존성 성장을 감소시키며, 이는 상기 클러스터의 구성원이 종양 억제-유사 특질을 표시할 수 있음을 확인하는 것임을 보여 주었다. 임의의 특정 miRNA에 있어서의 상이한 생물학적 효과가 배경 의존적이고, 상이한 세포 유형에서 발현되는 목표 유전자의 레퍼토리에 의해 제어될 가능성이 있다. 본 출원인의 결과는 혈청 및 관련된 성장 인자의 부재 하에서의 종양 억제 효과가 CRC에서 miR-17-92, 그리고 특히 miR-20a에 대한 복잡한 양성 및 음성 피드백 조절 기작을 반영할 수 있음을 보여 준다.

요약해서 말하면, 본 출원인은 많은 세트의 임상 CRC 시료 및 매칭되는 정상 결장직장 조직을 miRNA 발현에 대하여 스크리닝하였다. 37가지의 miRNA는 정상, 초기 또는 후기 CRC 사이에 차등 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이들 miRNA 중 11가지의 조절해제가 CRC 세포주 모델의 패널에서 확인되었다. 따라서, 이들 후보 miRNA들은 이러한 질환에서 잠재적인 치료 목표이다. 구체적으로, miR-145가 아닌 miR-143의 첨가는 CRC에서 치료적 응용으로 간주될 수 있다.

실시예 2

miR-145의 안티센스-매개된 억제

리포펙타민™ 2000 (인비트로젠)을 이용하여 총 100 nM의 바이오티닐화 2'-O-메틸 안티센스 miR-145 RNA (5'AAGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC3' (서열 번호 11)) (IDT) 또는 역방향 대조군 (5'CAGGUCAAAAGGGUCCUUAGGGAA3' (서열 번호 12)) (IDT)으로 2×10⁶개의 SW620/miR-145 세포를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한지 48시간 후에, 세포를 수확하고, 제조사의 지시에 따라 트라이졸(TRIzo)(등록상표) (인비트로젠)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 250 μg의 다이나비즈(Dynabeads) M-280 스트렙타비딘 코팅 자기 비드 (인비트로젠)를 사용하여 100 μg의 총 RNA를 3회의 순차적 고갈에 처하였다. 각각의 고갈은 상기 비드를 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl 용액으로 2회, 그리고 이어서 0.1 M NaCl로 1회 세척하는 것을 포함하였다. 비드를 0.1 M NaCl에 재현탁시키고, 250 μg 비드를 RNA 시료에 첨가하였다. 시료를 4℃에서 20분 동안 교반하였다. 자기 분리 장치 (프로메가)를 사용하여 RNA 용액으로부터 비드를 분리하고, (고갈되는 RNA를 함유하는) 용액을 비드로부터 제거하였다. 고갈 RNA를 에탄올 침전시키고, 노던 분석에 의해 miR-145 및 U6 snRNA 발현에 대하여 분석하였다. FAM-표지된 2'O-메틸 안티센스 miR-145 RNA 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션 효율성에 대한 것을 고갈 실험과 동시에 행하였다. 리포펙타민™ 2000 (인비트로젠)을 이용하여 총 100 nM의 FAM-표지 2'O-메틸 안티센스 miR-145 RNA (IDT)로 miR-145를 발현하는 1.2×10⁵개의 SW620 세포를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한지 48시간 후에, 세포를 수확하고 FACS 분석을 하였다.

miRNA의 노던

총 RNA의 트라이졸 추출을 제조사의 지침(인비트로젠)에 따라 수행하였다. 간략하게는, 세포를 PBS로 세척하고, 5 mL 트라이졸 시약을 첨가하고, 세포를 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 1 mL 클로로포름을 첨가한 후, 세포를 수동으로 15초간 강력하게 진탕시켰다. 시료를 원심분리하고 수성층을 2.5 mL 아이소프로판올이 든 15 mL 팔콘(falcon) 튜브로 옮겼다. 시료를 실온에서 20분간 인큐베이션하고, 상기와 같이 원심분리하여 RNA를 펠렛으로 만들고 1 mL 75% EtOH에 재현탁하였다. RNA를 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고, 공기 건조시키고, 50 μL DEPC 물(앰비온)에 재현탁하였다.

시쿠아젤(SequaGel)(등록상표) 서열결정 시스템 (내셔널 다이아그노스틱스(National Diagnostics))을 사용하여 제조한 15% PAGE-우레아 젤을 사용하여 노던 분석을 행하였으며, 밈프로테안(MimProtean)(등록상표) II 젤 전기영동 장치 (바이오라드(BioRad))를 사용하여 전기영동을 수행하였다. 총 40 μg의 RNA를 10 ㎕ RNA 로딩 염료 (브로모페놀 블루, 자일렌 시아놀, 및 95% 포름아미드, 18 mM EDTA, 및 0.025% SDS의 2X 용액)에 첨가하고, 65℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 시료를 15% PAGE-우레아/TBE 젤 상에 로딩하고, 브로모페놀 블루 염료가 젤의 바닥에 도달할 때까지 100V에서 1X TBE에서 전기영동하였다. RNA를 80 V를 이용하여 1시간 동안 0.5X TBE 완충액에서 미니 트랜스-블롯 전기영동 이전 셀(Electrophoretic Transfer Cell) (바이오라드)을 이용하여 하이본드(Hybond)-N+ 막 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 이전시켰다. UV 스트라탄커(Stratahnker)(등록상표) 1800 (1200 J) (스트라타진(Stratagene))을 이용하여 RNA를 상기 막에 가교결합시켰다.

막을 37℃에서 10 mL의 익스프레스(Express) 혼성화 용액 (클론테크(Clontech))에서 사전 혼성화하였다. 스타파이어(Starfire)(등록상표) 올리고뉴클레오티드 프로브를 1분 동안 끓이고, 이어서 혼성화 용액에 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 혼성화한 후, 혼성화 용액을 제거하고, 막을 2X SSC/0.1% SDS로 3회 헹구고, 2X SSC/0.1% SDS 용액으로 37℃에서 15분 동안 추가로 세척하였다. 막을 스토리지 포스포르 스크린(Storage Phosphor Screen) (지이 헬스케어)에 하룻밤 노출시키고, 타이푼 트리오 기계(Typhoon Trio machine) (지이 헬스케어)를 이용하여 이미지화하였다. 끓고 있는 0.1% SDS를 막 상에 직접적으로 부음으로써 막에서 결합 프로브를 제거하고, 이어서 상기 용액을 30분의 기간에 걸쳐 서서히 냉각시켰다.

커스텀 스타파이어(Custom Starfire)(등록상표) 올리고뉴클레오티드 프로브를 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies, IDT)에 의해 합성하였다. 동결건조된 올리고뉴클레오티드 프로브를 1X TE - pH 8.0 - 에서 100 μM 원액으로 희석시켰다. 표지 반응물은 1X 엑소(exo) 반응 완충액 (NEB), 1 μL의 스타파이어(등록상표) 범용 주형 올리고뉴클레오티드 (IDT) 및 0.5 pmol의 스타파이어 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하였다. 반응 믹스를 1분 동안 끓이고, 이어서 5분 동안 실온으로 냉각시킨 후 50 μCi α-³²P-dATP (10 mCi/mL, 6000 Ci/mmol) (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)) 및 5 U 엑소 클레나우(exo Klenow) DNA 폴리머라아제 (엔이비(NEB))를 첨가하고, 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 40 μL의 10 mM EDTA를 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 미혼입 α-³²P- dATP를 제조사의 지시에 따라 마이크로스핀(MicroSpin) G-25 컬럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 반응 믹스로부터 제거하였다. 사용 전에 프로브를 1분 동안 끓였다.

사용된 스타파이어(등록상표) 프로브의 서열

20 μL의 최종 부피로 20 pmole의 올리고뉴클레오티드 프로브, 1X T4 폴리뉴클레오티드 완충액 (엔이비), 50 μCi γ-³²P-dATP (10 mCi/mL, 6000 Ci/mmol) (퍼킨 엘머) 및 10 U T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (엔이비)를 사용하여 U6 snRNA 올리고뉴클레오티드 프로브 (5' AACGCTTCACGAATTTGCGT 3' (서열 번호 34))를 말단 표지하였다. 프로브를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 40 μL의 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로스핀 G-25 컬럼 (지이 헬스케어)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 반응 믹스로부터 미혼입 γ-³²P-dATP를 제거하였다. 사용 전에, 프로브를 5분간 끓였다.

<110> Veridex, LLC <120> Methods for assessing colorectal cancer and compositions for use therein <130> VDX5052 <150> US 61/053,760 <151> 2008-05-16 <160> 111 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatccctcga gtctagattt tttggaaa 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agcttttcca aaaaatctag actcgagg 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgggatcccg gagaggtgga gcccaggtc 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gctctagaca gcatcacaag tggctga 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgggatccca gagcaataag ccacatcc 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gctctagact cttacctcca gggacagc 28 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgggatcccg atggtggcct gctatttcc 29 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cggaattctc acacagctgg atgcaaa 27 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgggatcccg tccccattag ggattatgc 29 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cggaattccc aaatctgaca cgcaacc 27 <210> 11 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 aagggauucc ugggaaaacu ggac 24 <210> 12 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 caggucaaaa ggguccuuag ggaa 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tacatacttc tttacattcc a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gcattattac tcacggtacg a 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tcagttttgc atagatttgc aca 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gaaacccagc agacaatgta gct 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gcaaaaatgt gctagtgcca aa 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tgtgagttct accattgcca aa 22 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 aagggattcc tgggaaaact ggac 24 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gctgagtgta ggatgtttac a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tccacatgga gttgctgtta ca 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 actcaccgac agcgttgaat gtt 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgagctacag tgcttcatct ca 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 agcctatcct ggattacttg aa 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ggcggaactt agccactgtg aa 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tcatagccct gtacaatgct gct 23 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 aacaaaatca ctagtcttcc a 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 aactatacaa cctactacct ca 22 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ctacctgcac tataagcact tta 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 tcagaccgag acaagtgcaa tg 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 tcacaagtta gggtctcagg ga 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 cccctatcac gattagcatt aa 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 cacaagttcg gatctacggg tt 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 aacgcttcac gaatttgcgt 20 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 41 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 42 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 agcagcauug uacagggcua uca 23 <210> 45 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 46 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 47 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 48 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 ucccugagac ccuuuaaccu guga 24 <210> 49 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 cagugcaaug augaaagggc au 22 <210> 52 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 uuuggucccc uucaaccagc ug 22 <210> 53 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 ucuacagugc acgugucucc ag 22 <210> 54 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 cagugguuuu acccuauggu ag 22 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 uaacacuguc ugguaaagau gg 22 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 57 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23 <210> 58 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 ucucccaacc cuuguaccag ug 22 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23 <210> 61 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 62 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 63 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 aacauucaac gcugucggug agu 23 <210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 aacauucauu gcugucggug ggu 23 <210> 65 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 uuuggcaaug guagaacuca cacu 24 <210> 66 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 uauggcacug guagaauuca cu 22 <210> 67 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 caaagaauuc uccuuuuggg cu 22 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 caucccuugc augguggagg g 21 <210> 69 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 uaaggugcau cuagugcaga uag 23 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 71 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 uguaacagca acuccaugug ga 22 <210> 72 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 uagcagcaca gaaauauugg c 21 <210> 73 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 74 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 75 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 76 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 uaauacugcc ugguaaugau ga 22 <210> 77 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 77 gugaaauguu uaggaccacu ag 22 <210> 78 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 78 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 79 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 79 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 80 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 80 augaccuaug aauugacaga c 21 <210> 81 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 81 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 82 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 82 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 84 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 85 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 uucaaguaau ccaggauagg cu 22 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 uucacagugg cuaaguuccg c 21 <210> 87 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 agcagaagca gggagguucu ccca 24 <210> 88 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 89 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 90 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 cuuucagucg gauguuugca gc 22 <210> 91 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 92 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 uguaaacauc cuacacucag cu 22 <210> 93 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 aggcaagaug cuggcauagc u 21 <210> 95 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 aaaagcuggg uugagagggc ga 22 <210> 96 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 97 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 cuccugacuc cagguccugu gu 22 <210> 98 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 acuggacuua gggucagaag gc 22 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 acuggacuug gagucagaag g 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 100 cagcagcaca cugugguuug u 21 <210> 101 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 101 ugcuuccuuu cagagggu 18 <210> 102 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 102 uggaagacua gugauuuugu ugu 23 <210> 103 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 103 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 104 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 104 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 105 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 105 uucaacgggu auuuauugag ca 22 <210> 106 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 106 uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23 <210> 107 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 107 aacccguaga uccgaucuug ug 22 <210> 108 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 108 cacccguaga accgaccuug cg 22 <210> 109 <211> 289 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 cggagaggtg gagcccaggt cccctctaac accccttctc ctggccaggt tggagtcccg 60 ccacaggcca ccagagcgga gcagcgcagc gccctgtctc ccagcctgag gtgcagtgct 120 gcatctctgg tcagttggga gtctgagatg aagcactgta gctcaggaag agagaagttg 180 ttctgcagcc atcagcctgg aagtggtaag tgctgggggg ttgtgggggg ccataacagg 240 aaggacagag tgtttccaga ctccatacta tcagccactt gtgatgctg 289 <210> 110 <211> 326 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 cagagcaata agccacatcc ggcgacgtgt ggcaccccac cctggctgct acagatgggg 60 ctggatgcag aagagaactc cagctggtcc ttagggacac ggcggccttg gcgctgaagg 120 ccactcgctc ccaccttgtc ctcacggtcc agttttccca ggaatccctt agatgctaag 180 atggggattc ctggaaatac tgttcttgag gtcatggttt cacagctgga tttgcctcct 240 tcccacccca cagttgcccc ccaatggggc ctcggctggc tcacaggatg agggttcaag 300 aagaaggctg tccctggagg taagag 326 <210> 111 <211> 1096 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 tccccattag ggattatgct gaatttgtat ggtttatagt tgttagagtt tgaggtgtta 60 attctaatta tctatttcaa atttagcagg aaaaaagaga acatcacctt gtaaaactga 120 agattgtgac cagtcagaat aatgtcaaag tgcttacagt gcaggtagtg atatgtgcat 180 ctactgcagt gaaggcactt gtagcattat ggtgacagct gcctcgggaa gccaagttgg 240 gctttaaagt gcagggcctg ctgatgttga gtgctttttg ttctaaggtg catctagtgc 300 agatagtgaa gtagattagc atctactgcc ctaagtgctc cttctggcat aagaagttat 360 gtattcatcc aataattcaa gccaagcaag tatataggtg ttttaatagt ttttgtttgc 420 agtcctctgt tagttttgca tagttgcact acaagaagaa tgtagttgtg caaatctatg 480 caaaactgat ggtggcctgc tatttccttc aaatgaatga tttttactaa ttttgtgtac 540 ttttattgtg tcgatgtaga atctgcctgg tctatctgat gtgacagctt ctgtagcact 600 aaagtgctta tagtgcaggt agtgtttagt tatctactgc attatgagca cttaaagtac 660 tgctagctgt agaactccag cttcggcctg tcgcccaatc aaactgtcct gttactgaac 720 actgttctat ggttagtttt gcaggtttgc atccagctgt gtgatattct gctgtgcaaa 780 tccatgcaaa actgactgtg gtagtgaaaa gtctgtagaa aagtaaggga aactcaaacc 840 cctttctaca caggttggga tcggttgcaa tgctgtgttt ctgtatggta ttgcacttgt 900 cccggcctgt tgagtttggt ggggattgtg accagaagat tttgaaaatt aaatattact 960 gaagatttcg acttccactg ttaaatgtac aagatacatg aaatattaaa gaaaatgtgt 1020 aactttttgt gtaaatacat cttgtcttgt tttcattcaa aaacatttca cttttggggt 1080 tgcgtgtcag atttgg 1096

Claims

인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법으로서,
야생형 결장직장 조직 시료 내의 동일한 마이크로RNA와 비교하여 추출된 RNA로부터의 마이크로RNA - 여기서, 상기 마이크로RNA는 서열 번호 56의 서열, 서열 번호 57의 서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 - 의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
상기 관찰된 조절 변화에 기초하여 상기 결장직장암의 병기를 결정하는 단계를 포함하는, 인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 상기 단계 전에 조직 시료로부터 RNA를 추출하는 단계를 추가로 포함하는, 인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 상기 단계가 서열 번호 56의 서열의 상향 조절을 관찰하는 것인, 인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 상기 단계가 서열 번호 56의 서열, 서열 번호 57의 서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 마이크로RNA의 하향 조절을 관찰하는 것인, 인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로RNA가 서열 번호 109의 서열을 포함하고 조절 변화를 관찰하는 상기 단계가 서열 번호 109의 서열 및 서열 번호 56의 서열 둘 모두의 상향 조절을 관찰하는 것인, 인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로RNA가 서열 번호 57의 서열을 포함하고, 만약 서열 번호 57의 서열의 2배 이상의 상향 조절이 있다면 상기 결장직장암의 병기가 III기 또는 그 이후인 것으로 결정되는, 인간에서 결장직장암의 병기를 결정하는 방법.
인간에서 결장직장암의 병기를 진단하는 방법으로서,
결장직장 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
정상 결장직장 조직 시료 내의 동일한 마이크로RNA들과 비교하여 상기 추출된 RNA로부터의 적어도 2가지의 마이크로RNA들 - 여기서, 상기 마이크로RNA들은 서열 번호 56의 서열, 서열 번호 57의 서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 - 의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
상기 관찰된 조절 변화에 기초하여 상기 결장직장암의 병기를 결정하는 단계를 포함하는, 인간에서 결장직장암의 병기를 진단하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 적어도 2가지의 마이크로RNA들이 서열 번호 109의 서열 및 서열 번호 110의 서열 둘 모두를 포함하는, 인간에서 결장직장암의 병기를 진단하는 방법.
인간에서 결장직장암의 병기를 진단하는 방법으로서,
서열 번호 56의 서열 및 서열 번호 57의 서열 둘 모두를 포함하는 적어도 2가지의 마이크로RNA들의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
상기 관찰된 조절 변화에 기초하여 상기 결장직장암의 병기를 결정하는 단계를 포함하는, 인간에서 결장직장암의 병기를 진단하는 방법.