KR20100093539A - 대장암을 모니터링하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는 선별된 miRNA 서열의 조절 변화를 관찰함으로써 대장암의 병기를 결정하는 방법이 기술된다. 이들 서열에는 hsa-miR-31, hsa-miR-7, hsa-miR-99b, hsa-miR-378*, hsa-miR-133a, hsa-miR-125a, 및 이들 서열의 조합이 포함될 수도 있다.
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본 발명은, 일 실시 형태에서, 선별된 마이크로 RNA (miRNA) 서열들에 있어서 생산의 조절 변화를 관찰함으로써 대장암(CRC)을 검출하고/하거나 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 특정된 서열들의 상향 조절 또는 하향 조절 변화의 관찰에 의해, 암세포의 존재뿐만 아니라 암의 병기(stage)도 결정될 수 있다.
대장암(CRC)은 선진국에서 가장 빈번한 암 중의 하나이고 암관련 사망의 흔한 원인이다. CRC의 전체적인 발생 빈도는 일반 집단에서 5%이고 5년 생존율은 40% 내지 60% 범위이다. 예후는 대부분 종양의 형태학 및 병리학적 특징을 이용한 기술적 병기 분류 시스템에 의존한다. 그러나, 형태학적으로 유사한 종양이라도 바탕을 이루는 분자적 변화 및 종양형성 잠재력은 다양할 수 있다. 정상적인 상피세포의 악성 암종으로의 CRC 진행은, 이러한 변경을 포함하는 세포에 선택적 이익을 부여하는 발암유전자의 일시적 활성화 및 종양 억제 유전자의 불활성화를 초래하는 유전적 및 후생적 변화 모두가 누적되는 다단계 과정을 포함한다.
내재하는 분자적 경로를 더 잘 설명하고 CRC의 상이한 병기를 더 세분하기 위해 단백질 암호화 유전자에 대한 다수의 CRC 발현 프로파일링 연구가 수행되어 왔다. 보다 최근에는, 마이크로 RNA (miRNA)로 불리는, 짧은 22개 뉴클레오티드(nt)의 비암호화 RNA들의 새로 발견된 종류가 동정되었고 이들은 암 개시 및 진행에 관련된 것으로 여겨졌다. 이들 소형 RNA들의 생물발생은 RNA 중합효소 II에 의한 전사 및 불완전한 머리핀 구조를 갖는 60-70-nt 전구체 miRNA들(전구-miRNA들)을 생성하는, 엔도뉴클리아제 드로샤(Drosha)에 의한 일차 전사체의 가공을 포함한다. 전구-miRNA는 엑스포틴(exportin) 5를 통해 세포질 내로 이송되고, 여기서 RNAse III 효소 다이서(Dicer)에 의해 가공되어 이후에 다단백 복합체 내로 편입되는 성숙 miRNA들을 생성한다. 이들 miRNA-함유 복합체는 내재하는 miRNA 가닥과 표적 서열 사이의 상보성을 통해 여러 mRNA들의 3' 비번역 영역(UTR)에 결합하고, 상동성의 정도에 기초하여, 번역 억제 또는 mRNA 분해를 지시하는 것으로 나타났다. 이제까지, 678개의 인간 miRNA들이 동정되었고(miRBase 시퀀스 데이터베이스 - 11판), 컴퓨터 모델을 통해, 인간 게놈 내에 현재 알려진 유전자들의 대략 3%에 해당하는, 1000개를 초과하는 miRNA 유전자들이 존재할 수도 있다고 제안되었다. 더욱이, 생물정보학적 분석 결과 miRNA들이 인간 단백질 암호화 유전자의 무려 30%를 조절할 수도 있다고 추정되어, 이들 소형 RNA들이 복잡한 신호전달 경로들 사이의 상호작용을 조화시키도록 작용할 수도 있음을 시사한다.
수 개의 miRNA들이 정상 및 종양 조직 또는 암 세포주 사이에서 차등 발현되는 것으로 확인되었다 (문헌[Calin, G. a. and Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 6: 857-866, 2006]; 문헌[Bandres, E., Cubedo, E., Agirre, X., Malumbres, R., Zarate, R., Ramirez, N., Abajo, A., Navarro, A., Moreno, I., Monzo, M., and Garcia-Foncillas, J. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues. Mol Cancer, 5: 29, 2006]; 문헌[Cummins, J. M., He, Y., Leary, R. J., Pagliarini, R., Diaz, L. A., Jr., Sjoblom, T., Barad, O., Bentwich, Z., Szafranska, A. E., Labourier, E., Raymond, C. K., Roberts, B. S., Juhl, H., Kinzler, K. W., Vogelstein, B., and Velculescu, V. e. The colorectal microRNAome. Proc Natl Acad Sci U S A, 103: 3687-3692, 2006]; 문헌[Michael, M. Z., SM, O. C., van Holst Pellekaan, N. G., Young, G. P., and James, R. J. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol Cancer Res, 1: 882-891, 2003]; 문헌[Lanza, G., Ferracin, M., Gafa, R., Veronese, A., Spizzo, R., Pichiorri, F., Liu, C. G., Calin, G. A., Croce, C. M., and Negrini, M. mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorectal cancer. Mol Cancer, 6: 54, 2007]).
CRC에서, miRNA들의 발현 양상을 조사하는 연구들은 제한적이었다. miRNA들의 이상 조절을 보여주는 첫 번째 연구는 전구-샘종 폴립(pre-adenomatous polyp) 병기와 같은 초기에 나타나는 miR-143 및 miR-145의 하향 조절을 보고하였고, 이는 CRC의 초기에서 이들 miRNA들의 가능한 역할을 시사하였다. 이어서, CRC 종양에서 차등 발현을 보이는 13개 miRNA의 그룹이 동정되었으며, miR-31의 발현 수준이 CRC 종양 병기와 상관관계가 있는 것으로 보였다.
본 발명은, 그의 일 형태에서, 세포 시료에서 대장암의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 다른 형태에서, 본 발명은 세포 시료 내 대장암의 병기를 진단하는 방법이다. 출원인은 야생형 세포와 비교하여 대장암에서 차등적으로 조절되는 소정의 miRNA들을 발견하였다. 이러한 miRNA들에서 조절 변화의 정도를 측정함으로써, 조직 시료가 대장암 세포를 포함하고 있는지 여부를 결정할 수 있다. 출원인은 초기 (I기 및 II기) 대장암과 비교하여 후기 (III기 및 IV기) 대장암에서 차등적으로 조절되는 소정의 다른 miRNA들을 발견하였다. 이러한 miRNA들을 모니터링함으로써, 세포 형태학과 같이 덜 믿음직한 분류 요소에 의존할 필요 없이 초기 종양 시료로부터 후기 종양 시료를 구분할 수 있다.
정의
"조절 변화"라는 어구는 야생형 세포 내 동일한 세포 성분과 비교하여 어느 세포 성분, 예컨대 miRNA의 존재량에 있어서의 변화를 지칭한다. "하향 조절"이라는 어구는 문제의 세포 성분의 존재량에 있어서의 감소를 지칭하는 반면, "상향 조절"이라는 어구는 이 성분의 존재량에 있어서의 증가를 지칭한다.
차등 miRNA 조절에 의한 대장암 세포의 동정
대장암 조직에서의 수준을 야생형 조직과 비교하여 37개의 차등 발현된 miRNA들을 동정하였다(표 1). 세포주 및 임상 시료를 모두 포함하는 세포 시료를 상업적 공급원으로부터 입수하였다. 총 RNA를 통상적인 기술에 따라 세포 시료로부터 추출하였다. 예를 들어, 스냅-냉동(snap-frozen) 시료용 mirVana 단리 키트(앰비온(Ambion)) 및 FFPE 시료용 리커버올(RecoverAll)(상표명) 총 핵산 단리 키트(앰비온)가 사용될 수도 있다. 다른 통상적인 RNA 추출 방법들이 또한 사용될 수도 있다. 일단 총 RNA가 추출되면, 소형 (뉴클레오티드 40개 미만) RNA를 젤 전기영동에 의해 단리할 수도 있다. 시료들을 분석하여 특정 miRNA 서열들의 동정 및 존재량을 결정한다. 제한적인 것은 아니지만, 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)과 같은 임의의 적합한 기술이 동정 및 존재량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 야생형 대장 시료와 비교하여 현저히 달라진 발현을 보이는 37개의 차등 발현된 miRNA들을 대장암 세포에서 동정하였다.
계층적 군집 분석(hierarchical clustering) 결과, CRC 시료에서 일관되게 하향 조절되는 miR-143 내지 miR-145 및 miR17-92 군집들을 포함하여 상기에 동정된 miRNA 서열들 중 다수가 협조적으로 발현되는 것으로 나타났다. miR-143 및 miR-145 모두의 하향 조절이 분명하고 이들의 하향 조절이 광범위한 세포주 및 임상 시료에 대해 일관된 것으로 관찰되었다. 따라서, 이들 2개의 miRNA 서열들의 조절 변화를 관찰하는 것은 대장암의 존재를 검출하는 지표 구실을 한다. 선행 기술은 miR-145가 종양 억제 효과를 가지고 있고(문헌[Akao et al. Oncology Reports 16: 845-850, 2006]; 및 문헌[Schepeler et al. Cancer Res. 68 (15), 2008]), CRC 세포에서 하향 조절됨을 나타낸다. 그러나, 출원인은 miR-145가 비전이 세포에서만 종양 억제 효과를 갖고 실제로 전이 환경에서는 발암성인 것을 발견하였다. 따라서, hsa-miR-145의 부가 없이, 종양 억제 hsa-miR-143의 전달은 CRC를 위한 치료 전략이다.
발명의 일 실시 형태에서, 표 1로부터의 miRNA들을 생물학적 시료에서 관찰하고 야생형(비암성) 시료와 비교한다. 존재량에 있어 예측하지 못한 변화(상향 조절 또는 하향 조절)는 암의 지표일 수 있다. 시료는 조직 시료로부터 수득될 수도 있고, 대안적으로, 비조직 시료로부터 비침습적으로 수득될 수도 있다. 예를 들어, 혈액, 대변, 또는 소변 시료가 유리(free) miRNA들에 대해 검사될 수도 있다. 이러한 방식으로, CRC에 대한 스크리닝이 더욱 편리하게 이루어진다. 표 2는 야생형 조직과 비교하여 초기 CRC 시료에서 차등 조절되는 것으로 밝혀진 miRNA 서열들을 나타낸다. 이러한 miRNA들은 CRC의 조기 발병을 검출하기 위해 수행되는 스크리닝에 적합하다.
대장 종양의 병기 결정
초기 (I기 및 II기) 대장 종양과 비교하여 후기 (III기 및 IV기) 종양에 특징적인 추가의 miRNA 서열들을 발견하였다. 6개의 miRNA 서열들이 후기 및 초기 대장 종양에서 차등 조절되는 것으로 확인되었다. 이들 서열들이 표 3에 나타나 있다.
발명의 일 실시 형태에서, 총 RNA를 세포 시료로부터 추출한다. 예를 들어, 조직 시료는 외과적 처치 중에 환자로부터 수거될 수도 있다. 총 RNA를 통상적인 기술에 따라서 조직으로부터 추출한다. 소형 RNA를 총 RNA로부터 단리하고, 그 후에, 야생형 시료와 비교하여 하나 이상의 miRNA 서열들의 존재량을 관찰한다. 존재량은, 이로 제한되는 것은 아니지만, QPCR과 같은 통상적인 기술을 이용해 측정될 수도 있다. 조절 변화(즉, 야생형 시료와 비교하여 상향 조절 또는 하향 조절)에 기초하여, 암의 병기에 대해 결정이 이루어진다. 예를 들어, 병기는 초기 (I기 또는 II기) 또는 후기 (III기 또는 IV기) 암으로 결정될 수 있다. 표 2를 참고로 하여, 하기 miRNA들 중 하나 이상에서 조절 변화가 관찰된다면, 후기 CRC라는 판정이 이루어질 수도 있다: hsa-miR-31, hsa-miR-7, hsa-miR-99b, hsa-miR-378, hsa-miR-133a, hsa-miR-125a, 또는 앞서 언급된 서열들의 임의의 조합.
제한이 아니라 실례로서, hsa-miR-31의 조절 변화가 관찰될 수도 있다. 만약 상당한 상향 조절이 관찰된다면, 검사된 시료는 후기 대장암 시료인 것으로 결정될 수도 있다. 소정의 실시 형태에서, 조절 변화의 규모(상향 조절 또는 하향 조절) 및 정도(변화 배수)가 특정된 문턱값을 초과하는 경우에만 이러한 결정이 이루어진다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, hsa-miR-31에서 적어도 7배의 상향 조절이 있는 경우에만 양성 진단이 이루어진다. 다른 실시 형태에서, hsa-miR-7에서 적어도 2배의 상향 조절이 있는 경우에만 양성 진단이 이루어진다. 다른 실시 형태에서, hsa-miR-99b, hsa-miR-378, hsa-miR-133a, hsa-miR-125a, 및 이들의 조합과 같은 선별된 서열들이 하향 조절에 대해 관찰된다. 이러한 서열들의 하향 조절의 예상 수준이 표 2에 나타나 있다. 이러한 서열들은 개별적으로 또는 임의의 조합으로 관찰될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 1개보다 많은 miRNA가 특정된 조절 변화를 나타내는 경우에 CRC의 병기가 결정된다. 예를 들어, (1) hsa-miR-31이 적어도 7배의 상향 조절을 보이는 것과 함께 (2) hsa-miR-7이 적어도 2배의 상향 조절을 보이는 경우에 후기 CRC의 판정이 이루어질 수 있다. 다른 실시 형태에서, hsa-miR-31, hsa-miR-7, 또는 이들 모두의 상향 조절이 있고 이러한 상향 조절이 hsa-miR-99b, hsa-miR-378, hsa-miR-133a, hsa-miR-125a, 또는 이들의 조합에서의 하향 조절을 수반하는 경우에 후기 CRC가 존재하는 것으로 결정된다. 문턱값 기준, 예컨대 7-배 상향 조절이 이들 miRNA 서열들 각각에 대해 확립될 수 있다. 예를 들어, has-amiR-133a에 대해 0.6 하향 조절의 문턱값 기준이 확립될 수도 있다. 상기 예들은 단지 예시적인 것이다. miRNA 서열들의 임의의 조합이 조절 변화에 대해 모니터링될 수 있다.
miRNA는, 앞서 기술된 바와 같이, 조직 시료로부터 추출될 수도 있다. 대안적으로, miRNA는 비조직 시료로부터 단리될 수도 있다. 예를 들어, miRNA는 혈액, 대변, 소변 또는 다른 생물학적 시료로부터 단리될 수도 있다. 시료에서 발견된 특정 miRNA의 존재량을 정상 시료와 비교한다. 상향 조절되거나 또는 하향 조절된 miRNA 존재량은 암을 나타내는 것일 수 있다.
첨부된 서열목록 내 miRNA 서열들은 통상적으로 단리되는 miRNA 서열들을 나타낸다. 열거된 서열들의 말단에서의 변경은 당해 분야에 공지되어 있으며 만일 잔기들이 95% 이상 상동성이라면 본 발명의 범주 내에 속한다.
발명이 특정 실시 형태를 참고로 설명되었다고 하더라도, 다양한 변화가 이루어질 수도 있고 등가물이 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 특정 상황에 적합하도록 발명의 구성요소에 대해 치환될 수도 있음을 당해 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 따라서, 발명은 설명된 특정 실시 형태 또는 이 발명을 수행하기 위해 고려된 특정 방식에 제한되는 것이 아니라, 첨부된 특허청구범위의 범주 및 사상 내에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
방법
세포주
SW620, SW480, HCT116 및 HT29 세포주를 ATCC로부터 입수하였다. KM20L2 및 KM12C를 NCI-프레데릭(Frederick) 암 DCT 종양 저장소(Cancer DCT Tumor Repository)로부터 제공 받은 반면, 세포주 KM20 및 KM12SM을 이사이아 제이. 피들러(Isaiah J. Fidler) 박사(텍사스대학교 MD 앤더슨 암 센터)로부터 공급 받았다. SW620 및 SW480 세포를 둘베코 변경 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)(지브코(Gibco))에서 성장시켰다. HCT116 세포를 맥코이 5A 배지(McCoys 5A Media(지브코))에서 성장시키고 KM20, KM20L2, KM12C, KM12SM 및 HT29 세포를 RPMI 배지 1640(지브코)에서 성장시켰다. 0.72 mM L-글루타민에서 배양되었던 HT29 세포를 제외하고는 모든 배지에 10% 우태아혈청(제이알에이치 바이오사이언스(JRH Biosciences)), 2 mM L-글루타민(지브코) 및 페니실린-스트렙토마이신 용액(0.1 U/㎖ 페니실린 및 0.1 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)(지브코)을 보충하였다.
임상 시료
전체로, 4개의 정상 결장, 4개의 I기, 19개의 II기, 20개의 III기 및 2개의 IV기 (보충 표 1) 시료를 포함하여 49개의 스냅-냉동 인간 조직 시료를 제노믹스 콜라보레이티브 인크.(Genomics Collaborative Inc.,(GCI: 미국 메사추세츠주 캠브리지(Cambridge MA) 소재) 또는 클리노믹스 바이오사이언스 인크(Clinomics Bioscience, Inc., 미국 메사추세츠주 피츠필드(Pittsfield, MA) 소재)로부터 입수하였다. 또한, 8개의 매칭된(matched) 포르말린 고정된 파라핀 포매(FFPE) 시료들(3개의 II기, 4개의 III기 및 1개의 IV기)을 입수하였다. 초기 (I기 및 II기) 대 후기 (III기 및 IV기) 질환 사이에 종양 함량의 유의미한 차이 없이, 모든 CRC 시료들의 정중 종양 함량은 70%였다.
miRNA
프로파일링
287개의 인간 miRNA 탐침을 포함하는 mirVana 바이오어레이(Bioarray)(앰비온(Ambion), 버전 1)를 사용하여 대장암 miRNA 특이적 발현양상을 동정하였다. 스냅-냉동 시료용 mirVana 단리 키트(앰비온) 및 FFPE 시료용 리커버올(RecoverAll)(상표명) 총 핵산 단리 키트(앰비온)를 사용하여 대장 시료에서 얻은 5 ug의 총 RNA로부터 miRNA를 단리하였다. 이어서, 모든 시료를 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(플래쉬-페이지 앰비온(Flash-Page Ambion))으로 분획화하고 선형 아크릴아미드를 이용한 에탄올 침전에 의해 소형 RNA(< 40 nt)를 회수하였다. miR-16의 정량적 RT-PCR (qPCR)을 이용하여 miRNA 어레이 분석 전에 miRNA 농축을 확인하였다.
모든 시료로부터의 소형 RNA들에 대해 아민 개질된 유리딘이 도입되는 폴리(A) 중합 효소 반응(앰비온)을 수행하였다. 이어서 테일 형성된 시료를 아민-반응성 Cy3 또는 Cy5(인비트로젠(Invitrogen))를 이용해 형광 표지하였다. 단색 또는 이색 혼성화를 각각 임상적 CRC 또는 세포주 프로파일링 실험에 대해 수행하였다. 이색 실험을 위해, 세포주 miRNA를 정상 결장 RNA(앰비온)와 직접적으로 비교하였다. 형광 표지된 RNA를 유리섬유 필터를 사용해 정제하고 용출하였다(앰비온). 이어서 각 시료를 42℃에서 14시간 동안 바이오어레이 슬라이드(앰비온)에 혼성화하였다. 이 어레이를 세척하고 애질리언트(Agilent) 2505B 동초점 레이저 마이크로어레이 스캐너(애질리언트)를 사용해 스캔한 후 데이터를 발현 분석 소프트웨어(Expression Analysis software)(코드링크(Codelink), 버전 4.2)를 사용해 수집하였다.
특정 miRNA들의 노던 블롯 분석을 하기와 같이 수행하였다. 총 RNA의 트리졸(TRIzol) 추출을 제조사의 지침(인비트로젠)에 따라 수행하였다. 간략히 설명하면, 세포를 PBS로 세척하고 5 ㎖ 트리졸 시약을 첨가한 후 세포를 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 1 ㎖ 클로로포름을 첨가한 후, 세포를 손으로 15초간 강력하게 흔들어 주었다. 시료를 원심분리하고 수성층을 2.5 ㎖ 아이소프로판올이 든 15 ㎖ 팔콘(falcon) 튜브로 옮겼다. 시료를 실온에서 20분간 인큐베이션하고, 상기와 같이 원심분리하여 RNA를 펠렛으로 만들고 1 ㎖ 75% EtOH에 재현탁하였다. RNA를 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고, 대기 건조시킨 후 50 ㎕ DEPC 물(앰비온)에 재현탁하였다.
노던 블롯 분석을 세쿠아젤 시퀀싱 시스템(SequaGel Sequencing System, 내쇼날 다이어그노스틱스(National Diagnostics))을 이용해 제조된 15% PAGE-우레아 젤을 사용해 수행하였고, 전기영동을 미니프로테안(MiniProtean) II 젤 전기영동 장치(바이오라드(BioRad))를 사용해 수행하였다. 총 40 ㎍의 RNA를 10 ㎕ RNA 로우딩 염료(loading dye)(95% 포름아마이드, 18 mM EDTA, 및 0.025% SDS, 자일렌 시아놀(Xylene Cyanol), 및 브로모페놀 블루(Bromophenol Blue)의 2X 용액)에 첨가하고 10분간 65℃에서 인큐베이션하였다. 시료를 15% PAGE-우레아/TBE 젤 위에 로우딩하고 브로모페놀 블루 염료가 젤의 바닥에 도달할 때까지 100 V로 1X TBE에서 전기영동하였다. 1시간 동안 80 V로 0.5X TBE 완충액에서 미니 트랜스-블롯 전기영동 전사 셀(Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, 바이오라드)을 사용해 RNA를 하이본드(Hybond)-N+ 막(지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 위로 전사하였다. UV 스트라타링커(Stratalinker) 1800(1200 주울) (스트라타젠(Stratagene))을 사용해 RNA를 막에 가교결합시켰다.
막을 37℃에서 10 ㎖ 익스프레스 혼성화 용액(Express hybridization solution, 클론테크(Clontech))에서 사전-혼성화하였다. 스타파이어(Starfire) 올리고뉴클레오티드 탐침을 1분간 끓인 후 혼성화 용액에 첨가하였다. 37℃에서 밤새 혼성화한 후, 혼성화 용액을 제거하고 막을 2X SSC/0.1% SDS로 3회 세척하고 37℃에서 15분간 2X SSC/0.1% SDS 용액으로 추가 세척하였다. 막을 밤새 스토리지 포스포르 스크린(Storage Phosphor Screen, 지이 헬쓰케어)에 노출시키고 타이푼 트리오 기계(Typhoon Trio machine, 지이 헬쓰케어)를 사용해 영상화하였다. 끓는 0.1% SDS를 직접 막 위에 부어서 막으로부터 결합된 탐침을 떼어버린 후 용액이 30분 기간에 걸쳐서 서서히 냉각되게 하였다.
주문형 스타파이어 올리고뉴클레오티드 탐침은 인테그레이티드 DNA 테코놀러지스(Integrated DNA Technologies, IDT)에서 합성하였다. 동결건조된 올리고뉴클레오티드 탐침을 1X TE(pH 8.0)를 이용해 100 μM 스톡 용액으로 희석하였다. 표지 반응액은 1X exo- 반응 완충액(NEB), 1 ㎕ 스타파이어 유니버셜 주형(Starfire Universal template) 올리고뉴클레오티드(IDT) 및 0.5 pmol 스타파이어 올리고뉴클레오티드 탐침을 포함하고 있다. 반응 믹스를 1분간 끓인 후 5분간 실온으로 냉각시킨 다음에 50 μCi α-32P-dATP(10 mCi/㎖, 6000 Ci/mmol)(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)) 및 5 U exo- 클레노우 DNA 중합효소(Klenow DNA polymerase, NEB)를 첨가하고 90분간 실온에서 인큐베이션하였다. 40 ㎕의 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로스핀 G-25 칼럼(MicroSpin G-25 columns, 지이 헬쓰케어)을 제조사의 지침에 따라 사용해 반응 믹스로부터 미도입 α-32P-dATP를 제거하였다. 사용 전에, 탐침을 1분간 끓였다.
U6 snRNA 올리고뉴클레오티드 탐침(5' AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT 3', 서열번호: 61)을, 20 ㎕의 최종 부피로 20 pmole 올리고뉴클레오티드 탐침, 1X T4 폴리뉴클레오티드 완충액(NEB), 50 μCi γ-32P-dATP(10 mCi/㎖, 6000 Ci/mmol)(퍼킨 엘머) 및 10 U T4 폴리뉴클레오티드 키나제(NEB)를 사용해 말단 표지하였다. 탐침을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 40 ㎕의 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 마이크로스핀 G-25 칼럼(지이 헬쓰케어)을 제조사의 지침에 따라 사용해 반응 믹스로부터 미도입 γ-32P-dATP를 제거하였다. 사용 전에, 탐침을 5분간 끓였다.
통계적 분석
데이터를 R 소프트웨어 패키지(R software package)를 이용해 분석하였다. 차등 유전자 발현을 결정하기 전에 데이터를 변위치(quantile) 정규화하였다. 반복된 시료 및 탐침 값들을 평균을 내고 시료 그룹들 간에 변동이 현저한 유전자를 발견하기 위해 스튜던트 t-검정(Student t-test)을 수행하였다. 적어도 하나의 그룹에 대해 정중 정규화된 신호 강도가 100(정중 신호의 75번째 백분위수)보다 크면서 평균 변화가 > 1.5배이고 p-값이 < 0.05이면, 그 유전자를 선택하였다. 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 정상 및 상이한 암 병기들 사이의 miRNA 발현 수준을 평가하였다. 탐침 수준 및 유전자 수준 데이터 분석 모두를 모든 그룹 비교를 위해 수행하였다.
miRNA QPCR
ABI miRNA 택맨 시약(Taqman reagents)을 사용해 QPCR을 수행하여 miRNA 발현 프로파일을 확인하였다(문헌[Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., Lao, K. Q., Livak, K. J., and Guegler, K. J. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res, 33: e179, 2005]). 고용량 DNA 아카이브 키트(High Capacity DNA Archive kit) 및 3 ul의 5x RT 프라이머를 제조사(앰비온)의 지침에 따라서 사용해 10 ng의 총 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 15 ㎕의 반응물을 16℃에서 30분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분간 열 순환기(thermocycler)에서 인큐베이션하고 4℃로 유지하였다. 모든 역전사효소 (RT) 반응물은 주형 대조군을 포함하고 있지 않았다. 표준 택맨(®) PCR 키트 프로토콜을 이용해 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7900HT 서열 검출 시스템 상에서 QPCR을 수행하였다. 10 ㎕의 PCR 반응물은 0.66 ㎕ RT 생성물 1 ㎕ 택맨 마이크로RNA 분석 프라이머 및 탐침 믹스, 5 ㎕ 택맨 2x 유니버셜 PCR 마스터 믹스(앰퍼라제(Amperase) UNG 무함유) 및 3.34 ㎕ 물을 포함하였다. 반응물을 95℃에서 10분간 384 웰 플레이트 내에서 인큐베이션하고, 이어서 95℃에서 15초, 및 60℃에서 2분의 주기를 40회 반복하였다. 모든 QPCR 반응은 cDNA 무함유 대조군을 포함하였고 모든 반응은 3회 병렬 수행하였다.
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<120> Process for monitoring colorectal cancer
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ugcuuccuuu cagagggu 18
Claims (17)
- 야생형 대장 조직 시료 내의 동일한 마이크로RNA와 비교하여 추출된 RNA로부터의 마이크로RNA - 여기서, 마이크로RNA는 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 25, 서열번호: 33, 서열번호: 31, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 - 의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
관찰된 조절 변화에 기초하여 대장암의 병기를 결정하는 단계를 포함하는, 인간에서 대장암의 병기를 결정하는 방법. - 제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계 전에 조직 시료로부터 RNA를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 38의 상향 조절을 관찰하는 방법.
- 제1항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 39, 서열번호: 25, 서열번호: 33, 서열번호: 31 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 마이크로RNA의 하향 조절을 관찰하는 방법.
- 제4항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 39의 하향 조절을 관찰하는 방법.
- 제4항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 25의 하향 조절을 관찰하는 방법.
- 제4항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 33의 하향 조절을 관찰하는 방법.
- 제4항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 31의 하향 조절을 관찰하는 방법.
- 제1항에 있어서, 마이크로RNA가 서열번호: 20을 포함하고 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 20 및 서열번호: 38 둘 모두의 상향 조절을 관찰하는 방법.
- 제9항에 있어서, 조절 변화를 관찰하는 단계가 서열번호: 20의 적어도 7배 상향 조절 및 서열번호: 38의 적어도 2배 상향 조절을 관찰하는 방법.
- 제9항에 있어서, 서열번호: 20의 7배 이상의 상향 조절이 있는 방법.
- 제1항에 있어서, 마이크로RNA가 서열번호: 38을 포함하고, 만약 서열번호: 38의 2배 이상의 상향 조절이 있다면 대장암의 병기가 III기 또는 그 이후인 것으로 결정되는 방법.
- 대장 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
정상 대장 조직 시료 내의 동일한 마이크로RNA들과 비교하여 추출된 RNA로부터 적어도 2개의 마이크로RNA들 - 여기서 마이크로RNA는 서열번호: 20, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 25, 서열번호: 33, 서열번호: 31, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 - 의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
관찰된 조절 변화를 기초로 대장암의 병기를 결정하는 단계를 포함하는, 인간에서 대장암의 병기를 진단하는 방법. - 제13항에 있어서, 상기 적어도 2개의 마이크로RNA들이 서열번호: 20 및 서열번호: 33 둘 모두를 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 만약 정상 대장 조직 시료와 비교하여 대장 종양 내 서열번호: 20의 농도에 7배 이상의 상향 조절이 있고;
정상 대장 조직 시료와 비교하여 대장 종양 내 서열번호: 33의 0.6배 이상의 하향 조절이 있다면,
대장암의 병기가 III기 또는 그 이후인 것으로 결정되는 방법. - 서열번호: 20 및 서열번호: 38 둘 모두를 포함하는 적어도 2개의 마이크로RNA들의 조절 변화를 관찰하는 단계; 및
관찰된 조절 변화를 기초로 대장암의 병기를 결정하는 단계를 포함하는, 인간에서 대장암의 병기를 진단하는 방법. - 제16항에 있어서, 만약 정상 대장 조직 시료와 비교하여 대장 종양 내 서열번호: 20의 농도에 7배 이상의 상향 조절이 있고;
정상 대장 조직 시료와 비교하여 대장 종양 내 서열번호: 33의 0.6배 이상의 하향 조절이 있다면,
대장암의 병기가 III기 또는 그 이후인 것으로 결정되는 방법.
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| EP2450454A4 (en) * | 2009-06-30 | 2012-11-14 | Fujirebio Kk | METHOD FOR ASSESSING THE CULTIVATED CELLS, AND METHOD FOR EXAMINING A BIOMARKER |
| WO2011012136A1 (en) * | 2009-07-28 | 2011-02-03 | Exiqon A/S | A method for classifying a human cell sample as cancerous |
| TW201118178A (en) * | 2009-10-09 | 2011-06-01 | Baylor Res Inst | Identification of micrornas (miRNAs) in fecal samples as biomarkers for gastroenterological cancers |
| CN102933719B (zh) * | 2009-12-24 | 2015-05-06 | 复旦大学 | 用于结直肠癌血浆中的微rna表达谱分析的组合物和方法 |
| AU2011311881A1 (en) * | 2010-10-08 | 2013-05-02 | Baylor Research Institute | MicroRNAs (miRNA) as biomakers for the identification of familial and non-familial colorectal cancer |
| CN102140471B (zh) * | 2011-01-10 | 2013-11-20 | 清华大学深圳研究生院 | 一种抑制肿瘤生长的寡聚核酸及其应用 |
| AU2015201072B2 (en) * | 2011-10-21 | 2017-08-24 | Centro De Investigacion Biomedica En Red De Enfermedades Hepaticas Y Digestivas | Plasma microRNAs for the detection of early colorectal cancer |
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| CA2907377A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Baylor Research Institute | Tissue and blood-based mirna biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer |
| JP2016169158A (ja) * | 2013-06-14 | 2016-09-23 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | 大腸癌を治療および／または診断するための組成物ならびにその利用 |
| CN105985953B (zh) * | 2015-01-27 | 2018-12-21 | 中国医学科学院肿瘤医院 | microRNA 100的应用 |
| WO2018165532A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | Baylor Research Institute | Methods for diagnosing and treating gastric cancer using mirna expression |
| CN108004323B (zh) * | 2017-12-27 | 2021-03-30 | 广西壮族自治区肿瘤防治研究所 | 组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用 |
| CN107881238A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-04-06 | 广西壮族自治区肿瘤防治研究所 | 与结直肠癌预后相关的miRNA标志物及其应用 |
Family Cites Families (2)
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