KR20100084619A - 마이크로―ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ 의 감별 검출을 이용한 특정 암에 대한 진단 및 예후 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 암의 식별 및 진단에 사용되는 핵산 서열을 제공한다. 상기 핵산 서열은 또한 생물학적 시료의 발현 프로필에 기초한 대상의 예후 평가에도 사용가능하다.

Description

마이크로―ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ 의 감별 검출을 이용한 특정 암에 대한 진단 및 예후 {DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF SPECIFIC CANCERS BY MEANS OF DIFFERENTIAL DETECTION OF MICRO-RNAS/MIRNAS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2007 년 10 월 31 일 제출한 U.S. 가출원 제 60/983,944 호, 및 2008 년 7 월 24 일 제출한 U.S. 가출원 제 61/083,181 호에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 우선권을 주장하며, 이들의 전문은 참조로서 본원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 전반적으로 특정 유형의 암에 관련된 마이크로RNA 분자, 및 그에 관련된 또는 그로부터 유래한 각종 핵산 분자에 관한 것이다.

최근 수년 동안, 폭넓은 생물학적 과정들에 대해 깊은 영향을 주는 조절성 RNA 의 중요한 신규한 부류로서 마이크로RNA (miR, miRNA) 가 대두되었다. 이들 소형 (전형적으로 18-24 개 뉴클레오티드 길이) 비(非)암호화 RNA 분자는 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해, 및 또한 유전자 전사에의 영향을 통해 단백질 발현 패턴을 조절할 수 있다. miR 은 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사작용 등의 다양한 과정에서 중심적 역할을 한다. 현재 약 850 개의 인간 miR 가 알려져 있다. 다수의 miR 의 발현이 수많은 유형의 인간 암에서 변화된 상태로 발견되었으며, 일부 경우 그러한 변화가 종양 진행에서 원인적 역할을 할 수 있다는 추측을 지지하는 강력한 증거가 제시되었다. 마이크로RNA 발현은 고도로 조직 특이적이어서, 종양 조직 기원의 규명에 유익하다.

중피종은, 폐 및 심장 등의 흉강의 장기, 및 소화관 및 간 등의 복부 장기를 각각 둘러싸는 흉막, 심막 및 복막의 표면을 덮고 있는 중피에서 발생하는 종양이다. 미만성 흉막 중피종의 경우, 흉벽 흉막 측에 늑간 신경이 침범함으로써 흉통이 유발되고, 흉막의 장기 측에서의 종양 성장 및 흉수의 축적으로 인해 호흡기 및 순환 장애가 발생할 수 있다. 종국에는 인접한 종격 장기들 내로 증식하여, 심장으로 직접 침범하거나 또는 횡경막을 이용해 복강 내로 발달하는 것으로 진행되거나, 또는 부가적인 림프절 또는 순환기계로의 전이의 결과로 흉강 외부에서의 발달이 있을 수 있다.

중피종에 있어서 임상적 병기 (disease stage) 에 대한 수많은 상이한 분류가 사용되어 왔으며, 사용된 병기 분류 방법들이 상이하여, 중피종에 대한 이전의 치료 보고서들은 치료 결과를 비교할 때 곤란함에 직면했다(Nakano, Respiration, Vol. 18, No. 9, pp. 916-925, 1999). 또한, 악성 중피종의 원인은 석면에의 노출과 관련성이 있으며, 이는 또한 동물 실험에서도 증명되었다(Tada, Journal of Clinical and Experimental Medicine (March Supplement), "Respiratory Diseases", pp. 406-408, 1999). 기도 내로 흡입된 석면은 흉막 바로 아래의 위치에 도달하는데, 거기서 적어도 약 20 년간의 만성적 자극으로 인해 종국에는 종양이 발달하게 되며, 상기 종양은 흉막의 전체 표면에 걸쳐 얇은 막으로 퍼지게 된다. 결과적으로, 악성 중피종이 석면-관련 질환으로 분류되긴 하지만, 모든 악성 중피종이 석면으로 인해 유발되는 것은 아니며, 자료에 의해 충분히 입증된 노출은 전체 환자의 약 절반에서만 관찰된다. 악성 흉막 중피종은 치료에 잘 반응하지 않는데, 심히 좋지 않은 예후를 수반하며, 즉각적인 조치를 필요로 한다(Nakano, Respiration, Vol. 18, No. 9, pp. 916-925, 1999).

악성 중피종에 대한 예후는 질병의 단계에 영향을 받는다. 수술 및 보조적인 면역학적 치료 (예컨대, 인터페론 또는 인터루킨) 가 효과적인 치료가 될 수 있으나, 이것도 초기 단계 진단이라는 드문 사례에서만 해당되는 것이다.

흉막 또는 복막에서의 중피종의 가능성을 다룰 때에는 몇몇 구별적 징후들을 고려하여야 한다. 흉막 및 복막 모두 원발성 종양에 의한 이차 종양을 상이한 비율로 가질 수 있으며, 따라서 중피종 및 상이한 원천으로부터의 이차 종양 또는 또 다른 원발성 종양을 구별하는 것이 중요하다. 병리학적 진단은 관찰자간 변동성이 상당할 수 있어, 특이적 마커의 부재시 다른 상피암으로부터 중피종을 식별해내기 어렵다.

폐암은 가장 흔한 암 중 하나이며, 세계 전역에서 암 관련 사망의 주된 원인이 되어왔다. 과학자들은 특정 폐암에 대한 바이오마커 및 상기 폐암의 진단, 치료 및 예후에서의 이들의 가능한 역할을 탐구하고자 노력하고 있다.

폐 편평상피암종 및 비제한적으로 폐 선암과 같은 기타 비소세포 폐암 (NSCLC) 에 대해 올바른 진단을 내리는 것 및 특히 이들을 구별하는 것은 치료법의 선택에 있어서 실제적 측면에서 중요하다. 심한 또는 치명적 출혈은 베바시주맙 (bevacizumab; Avastin) 치료를 받는 폐 편평상피암종 환자에 있어서 블랙박스 경고 (black box warning) 이다. 현재까지 편평 NSCLC 를 비(非)-편평 NSCLC 와 구별하는 객관적인 표준화된 시험법은 존재하지 않는다.

다양한 NSCLC 에 대한 초기의 감지 및 정확한 진단을 위한 바이오마커에 대한 탐색은 거의 성공하지 못하였다. 유일무이한 종양 마커에 대한 발견 및 특징분석이 많이 중요시되어 왔다. 그러나, 다수의 마커들을 조합한 것이 진단의 정확성을 증가시키는 것으로 나타나긴 했지만, 임상적으로 유용한 적절한 민감도 또는 특이도를 가진 마커는 발견되지 않았다.

특정 유형의 암에 관련된 특이적이고 정확한 마커에 대한 필요성이 해소되지 않고 있다.

발명의 개요

본 발명은 각종 암의 규명, 분류 및 진단에 사용되는 특이적 핵산 서열을 제공한다.

본 발명은 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, 상기 시료로부터 서열번호: 2, 10, 11, 24, 41, 1, 3-9, 12-23, 25, 26, 44-50, 55, 및 58-87, 이들의 절편 또는 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필 (expression profile) 을 결정하는 단계; 및 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계를 포함하는, 특정 암의 분류 방법으로서, 이 때 상기 비교의 결과에 의해 상기 특정 암의 분류가 가능해지는 방법을 제공한다.

본 발명은 나아가 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, 상기 시료로부터 서열번호: 2, 10, 11, 24, 41, 1, 3-9, 12-23, 25, 26 및 58-72, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필을 측정하는 단계; 및 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계를 포함하는, 중피종의 진단 방법으로서, 이 때, 상기 측정된 발현 프로필을 상기 참조 발현 프로필과 비교한 결과에 의해 중피종에 대한 진단이 가능해지는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, 상기 시료에서 서열번호: 2, 10, 11, 24, 41, 1, 3-9, 12-23, 25, 26 및 58-72, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필을 측정하는 단계, 및 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계를 포함하는, 중피종과 기타의 암을 구별하는 방법으로서, 상기 측정된 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교한 결과가 중피종 및 상기 기타의 암 중 하나를 시사하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에 따라서 중피종은 흉막 중피종이다. 일부 구현예에 따라서는 중피종은 복막의 중피종이다.

일부 구현예에 따라서 기타의 암은 선암이다. 선암은 폐, 위, 신장, 결장, 전립선, 자궁경부, 식도, 췌장, 소장 및 유방으로 이루어진 군에서 선택되는 장기의 선암일 수 있다. 일부 구현예에 따라서는 기타의 암은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 비롯된 것이다. 신장에서 유래된 암은 신세포암일 수 있고, 간에서 유래된 암은 간세포암일 수 있다.

일부 구현예에 따라서 핵산 서열은 서열번호: 2, 10, 11, 24 및 41, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 구현예에 따라서 상기 핵산 서열은 서열번호: 2, 10, 11 및 41, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 구현예에 따라서는 핵산 서열은 서열번호: 2, 10, 24 및 41, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된다.

부가적인 구현예에 따라서 기타의 암은 선암이고, 핵산 서열은 서열번호: 1-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 서열번호: 1, 2, 4-9, 11-14 및 16-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 선암을 시사하는 것이다. 다른 구현예에 따라서 기타의 암은 선암이고, 핵산 서열은 서열번호: 1-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 서열번호: 3, 10 및 15, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것은, 선암을 시사하는 것이다.

일부 구현예에 따라서는 기타의 암은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암이고, 핵산 서열은 서열번호: 1-7, 9-20 및 22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 서열번호: 1, 2, 4-7, 11-14 및 16-20, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암을 시사하는 것이다. 일부 구현예에 따라서는 핵산 서열은 서열번호: 1-7, 9-20 및 22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 서열번호: 3, 10 및 15, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암을 시사하는 것이다.

일부 구현예에 따라서 기타의 암은 폐암이고, 핵산 서열은 서열번호: 1, 3, 5-13, 15 및 18-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 서열번호: 1, 5-9, 11-14 및 18-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 폐암을 시사하는 것이다. 다른 구현예에 따라서 기타의 암은 폐암이고, 핵산 서열은 서열번호: 1, 3, 5-13, 15 및 18-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 서열번호: 3, 10 및 15, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것은 폐암을 시사하는 것이다. 폐암은 폐 편평상피세포암, 폐 미분화 소세포암, 폐 미분화 대세포암, 폐 선암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐 유암종 및 대세포 신경내분비암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

일부 구현예에 따라서는 기타의 암은 간암이고, 핵산 서열은 서열번호: 2, 14 및 23-25, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 핵산 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 간암을 시사하는 것이다.

일부 구현예에 따라서는 생물학적 시료는 체액, 세포주 및 조직 시료로 이루어진 군에서 선택된다. 부가적인 구현예에 따라서는 조직은 신선한 조직, 동결된 조직, 고정된 조직, 왁스 포매된 조직 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 조직이다. 일부 구현예에 따라서는 생물학적 시료는 원발부위 불명암 (CUP), 원발암 또는 전이암을 가진 대상으로부터 수득된다. 부가적인 구현예에 따라서 상기 방법은 분류기 알고리즘 (classifier algorithm) 을 추가로 포함한다. 상기 분류기는 결정 트리 분류기 (decision tree classifier), 로지스틱 회귀분석 분류기 (logistic regression classifier), 최근접 이웃 분류기 (nearest neighbor classifier), 신경망 분류기 (neural network classifier), 가우시안 혼합 모델 (Gaussian mixture model; GMM) 및 서포트 벡터 머신 (Support Vector Machine; SVM) 분류기로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

일부 구현예에 따라서는 핵산 서열 발현 프로필은 핵산 혼성화 및 핵산 증폭으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 결정된다. 일부 구현예에 따라서는 핵산 혼성화는 고체상 핵산 바이오칩 어레이 또는 원위치 혼성화법 (in situ hybridization) 을 이용하여 실시된다.

일부 구현예에 따라서는 핵산 증폭 방법은 실시간 PCR 이다. 실시간 PCR 방법은 전방향 및 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따라서는 전방향 프라이머는 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39 및 이들에 대해 적어도 약 80% 동일한 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 부가적인 구현예에 따라서는 실시간 PCR 방법은 탐침을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따라서 탐침은 서열번호: 1, 2, 10, 11, 23, 24 및 41 에서 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 부가적인 구현예에 따라서는 탐침은 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 43, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다.

본 발명에 의해 제공되는 추가적인 측면은 중피종과 기타의 암을 구별하기 위한 키트로서, 서열번호: 1, 2, 10, 11, 23, 24, 및 41 로부터 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한 탐침을 포함한 키트이다. 또 다른 구현예에 따라서는 상기 탐침은 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 43, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 기타의 암은 선암이다. 다른 구현예에서 기타의 암은 결장, 신장, 간, 췌장, 위 및 폐로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 비롯된다.

본 발명은 나아가, 편평 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 비(非)-편평 NSCLC 를 구별하는 방법으로서, 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, 상기 시료에서 서열번호: 8, 21, 25, 44-50 및 55, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필을 측정하는 단계, 및 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 측정된 발현 프로필을 참조 발현 프로필에 비교한 결과가 편평 NSCLC 및 비(非)-편평 NSCLC 중 하나를 시사하는 것인 방법을 제공한다.

일부 구현예에 따라서는 서열번호: 8 및 21, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것이 비(非)-편평 NSCLC 를 시사하는 것이다. 다른 구현예에 따라서는 서열번호: 49-50, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것이 비(非)-편평 NSCLC 를 시사하는 것이다.

일부 구현예에 따라서 비(非)-편평 NSCLC 는 선암이고, 서열번호: 8, 21, 25, 44-48, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 선암을 시사하는 것이다. 다른 구현예에 따라서는 비(非)-편평 NSCLC 는 선암이고, 서열번호: 49-50, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 편평 NSCLC 를 시사하는 것이다. 상기 선암은 폐, 위, 신장, 결장, 전립선, 자궁경부, 식도, 췌장, 소장 및 유방으로 이루어진 군에서 선택되는 장기의 선암일 수 있다.

일부 구현예에 따라서 생물학적 시료는 체액, 세포주 및 조직 시료로 이루어진 군에서 선택된다. 부가적인 구현예에 따라서 조직은 신선한 조직, 동결된 조직, 고정된 조직, 왁스 포매된 조직 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 조직이다. 일부 구현예에 따라서는 생물학적 시료는 원발부위 불명암 (CUP), 원발암 또는 전이암을 가진 대상으로부터 수득된다. 부가적인 구현예에 따라서 상기 방법은 분류기 알고리즘을 추가로 포함한다. 분류기는 결정 트리 분류기, 로지스틱 회귀분석 분류기, 최근접 이웃 분류기, 신경망 분류기, 가우시안 혼합 모델 (GMM) 및 서포트 벡터 머신 (SVM) 분류기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일부 구현예에 따라서는 핵산 서열 발현 프로필은 핵산 혼성화 및 핵산 증폭으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 측정된다. 일부 구현예에 따라서 핵산 혼성화는 고체상 핵산 바이오칩 어레이 또는 원위치 혼성화법을 이용하여 실시된다.

일부 구현예에 따라서 핵산 증폭 방법은 실시간 PCR 이다. 실시간 PCR 방법은 전방향 및 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따라서는 전방향 프라이머는 서열번호: 39, 51, 53 및 56 및 이들과 적어도 약 80% 동일한 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다.

일부 구현예에 따라서는 실시간 PCR 방법은 추가로 탐침을 포함한다. 부가적인 구현예에 따라서 탐침은 서열번호: 8, 41, 49, 55 로부터 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다. 부가적인 구현예에 따라서 탐침은 서열번호: 40, 52, 54 및 57, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다.

제공되는 부가적인 측면은 편평 NSCLC 및 비(非)-편평 NSCLC 를 구별하기 위한 키트로서, 서열번호: 8, 41, 49, 55 로부터 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한 탐침을 포함한 키트이다. 또 다른 구현예에 따라서는 상기 키트는 서열번호: 40, 52, 54 및 57, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한 탐침을 포함한다.

본 발명의 이들 및 다른 구현예들은 이하의 도면, 상세한 설명 및 특허청구범위를 종합해보면 명백해질 것이다.

도 1 은 폐 흉막 중피종 대 선암의 (log2(형광) 에서의) 마이크로RNA 어레이 결과에 대한 분석을 나타낸다. x 축은 7 개의 폐 흉막 중피종 시료들의 정규화된 평균 발현 수준을 나타내고, y 축은 상이한 기원의 85 개 선암 시료들의 정규화된 평균 발현 수준을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 선암에서 발현 수준이 더 높은 miR 로는, hsa-miR-141 (서열번호 1), hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-194 (서열번호 4), hsa-miR-200a (서열번호 5), hsa-miR-200b (서열번호 6), hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-375 (서열번호 8), 및 hsa-miR-429 (서열번호 9) 가 있다.
도 2 는, 로지스틱 회귀분석을 이용한 것으로서 hsa-miR-200a (서열번호 5), hsa-miR-200b (서열번호 6), hsa-miR-200c (서열번호 11), 및 hsa-miR-141 (서열번호 1) 4 가지의 miR 의 발현 수준에 기초하여 폐 흉막 중피종 (원 모양) 및 선암 (사각형) 을 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 2a 는 상기 4 가지의 miRNA 의 (마이크로어레이에 의한) 발현 수준 신호의 대수에 대하여 실시된 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 나타낸다(y 축). 시료 (x 축) 가 각자의 확률 점수에 따라 분류되어 있다.
도 2b 는 상기 4 가지 miRNA 의 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 확률 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 2c 는 확률 함수 (X 축) 의 값의 각 범위에 대한 발생 횟수 (Y 축) 를 보여주는, 각 군 내의 확률 함수의 값에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 2d 는 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 보여준다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 3 은 중피종 대 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암의 (log2(형광) 에서의) 마이크로RNA 어레이 결과에 대한 분석을 나타낸다. x 축은 7 개의 폐 흉막 중피종 시료의 정규화된 평균 발현 수준을 나타내고, y 축은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암으로부터의 시료들의 정규화된 평균 발현 수준을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 폐 흉막 중피종에서의 발현이 유의미하게 더 높은 miR 로는 hsa-miR-193a (서열번호 3) 이 있고, 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암으로부터의 시료에서 발현 수준이 더 높은 miR 에는 hsa-miR-141 (서열번호 1), hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-194 (서열번호 4), hsa-miR-200a (서열번호 5), hsa-miR-200b (서열번호 6), hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-429 (서열번호 9) 가 있다.
도 4 는, 로지스틱 회귀분석을 이용한 것으로서 hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-194 (서열번호 4) 2 가지의 miR 의 발현 수준에 기초하여 폐 흉막 중피종 (원 모양) 및 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암 (사각형) 을 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 4a 는 상기 2 가지 miRNA 의 (마이크로어레이에 의한) 발현 수준 신호의 대수에 대해 실시된 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 보여준다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 확률 점수에 따라 분류되어 있다.
도 4b 는 상기 2 가지 miRNA 의 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 보여준다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 확률 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 4c 는 hsa-miR-194 (서열번호 4) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-200c (서열번호 11) 의 miRNA 마이크로어레이 (x 축) 를 보여준다.
도 4d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 보여준다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 5 는 폐 흉막 중피종 대 선암의 (log2(형광) 에서의) 마이크로RNA 어레이 결과에 대한 분석을 나타낸다. x 축은 폐 흉막 중피종 시료들의 정규화된 평균 발현 수준을 나타내고, y 축은 상이한 기원의 선암 시료들의 정규화된 평균 발현 수준을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 폐 흉막 중피종에서 발현이 유의하게 더 높은 miR 에는 hsa-miR-193a (서열번호 3) 가 있고, 선암에서의 발현 수준이 더 높은 miR 에는 hsa-miR-141 (서열번호 1), hsa-miR-200a (서열번호 5), hsa-miR-200b (서열번호 6), hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-375 (서열번호 8), 및 hsa-miR-429 (서열번호 9) 가 있다.
도 6 은, 로지스틱 회귀분석을 이용한 것으로서 hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-141 (서열번호 1) 2 가지 miRNA 의 발현 수준에 기초하여 폐 흉막 중피종 (원 모양) 및 폐 종양 (사각형) 을 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 6a 는 상기 2 가지 miRNA 의 (마이크로어레이에 의한) 발현 수준 신호의 대수에 대해 실시된 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 확률 점수에 따라 분류되어 있다.
도 6b 는 상기 2 가지 miRNA 의 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 보여준다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 확률 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 6c 는 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-200c (서열번호 11) 의 miRNA 마이크로어레이 (x 축) 를 보여준다.
도 6d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 보여준다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 7 은, 로지스틱 회귀분석을 이용한 것으로서 hsa-miR-193a (서열번호 3) 및 hsa-miR-200a (서열번호 5) 2 가지의 miR 의 발현 수준에 기초하여 폐 흉막 중피종 및 폐 종양을 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 7a 는 상기 2 가지 miRNA 의 (마이크로어레이에 의한) 발현 수준 신호의 대수에 대해 실시된 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 확률 점수에 따라 분류되어 있다.
도 7b 는 상기 2 가지 miRNA 의 로지스틱 회귀분석에 기초한 확률 함수를 보여준다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 확률 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 7c 는 hsa-miR-200a (서열번호 5) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-193a (서열번호 3) 의 miRNA 마이크로어레이 (x 축) 를 나타낸다.
7d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 보여준다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 8 은, 선형 결합 (linear combination) 에 기초한 것으로서 40 개 시료에 대하여 hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 2 가지의 miR 에 기초한 qRT-PCR 을 이용하여 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 폐 선암 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 8a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 8b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 8c 는 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 miRNA 정규화된 Ct (x 축) 를 보여준다.
도 8d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=1 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 9 는, 선형 결합을 이용한 것으로서 25 개 시료에 대하여 hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122a (서열번호 23) 2 가지의 miR 에 기초한 qRT-PCR 을 이용하여 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 간 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 9a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 9b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 9c 는 hsa-miR-122a (서열번호 23) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 miRNA 정규화된 Ct (x 축) 를 나타낸다.
도 9d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=1 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 10 은, 선형 결합을 이용한 것으로서 30 개 시료에 대하여 hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 2 가지의 miR 에 기초한 qRT-PCR 을 이용하여 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 췌장 또는 결장 중 하나로부터의 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 10a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 10b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 10c 는 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 miRNA 정규화된 Ct (x 축) 를 나타낸다.
도 1Od 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=1 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 11 은, 선형 결합을 이용한 것으로서 25 개 시료에 대하여 hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 2 가지의 miR 에 기초한 qRT-PCR 을 이용하여 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 방광 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 11a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 11b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 11c 는 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 miRNA 정규화된 Ct (x 축) 를 보여준다.
도 11d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=1 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 12 는, 선형 결합을 이용한 것으로서 25 개 시료에 대하여 hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 2 가지의 miR 에 기초한 qRT-PCR 을 이용하여 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 난소 및 유방 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 보여준다:
도 12a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 12b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 12c 는 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 miRNA 정규화된 Ct (x 축) 를 보여준다.
도 12d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=1 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 13 은, 선형 결합을 이용한 것으로서 26 개 시료에 대하여 hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122a (서열번호 23) 2 가지의 miR 에 기초한 qRT-PCR 을 이용하여 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 신장 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 분류기의 일례를 나타낸다:
도 13a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 13b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 13c 는 hsa-miR-122a (서열번호 23) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 miRNA 정규화된 Ct (x 축) 를 나타낸다.
도 13d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=O.915 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 14 및 15 는 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 간, 신장, 췌장, 결장, 방광, 난소, 유방 및 폐 유형의 종양 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 2 단계 분류기의 일례를 나타낸다.
도 14 는, hsa-miR-122 (서열번호 24) 의 정규화된 Ct (y 축) 및 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 정규화된 Ct (x 축) 를 이용하는, 상기 분류기의 제 1 단계를 보여준다. 실선은 임계값을 나타내는데, 그 아래의 시료는 "비(非)-중피종"으로 식별되었다. 점선은 낮은 신뢰도 (Low Confidence) 구간을 나타낸다. hsa-miR-122 (서열번호 24) 의 정규화된 Ct 가 5.5 (최하단의 점선) 미만이거나, 또는 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 정규화된 Ct 가 7 (가장 좌측 점선) 미만인 17 개 시료는 높은 신뢰도로 비(非)-중피종으로 간주되었다.
도 15 는 62 개 시료에 대하여 hsa-miR-200c (서열번호 11) (x 축) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) (y 축) 의 선형 결합을 이용하는, 상기 분류기의 제 2 단계를 보여준다. 실선은 분류기를 나타낸다. 점선은 낮은 신뢰도 구간을 나타낸다.
도 16 및 17 은 폐 흉막 중피종 시료 (원 모양) 및 간, 신장, 췌장, 결장, 방광, 난소, 유방 및 폐 유형의 종양 시료 (사각형) 를 구별하는데 사용된 2 단계 분류기의 일례를 나타낸다. .
도 16 은 29 개 시료에 대하여 hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122a (서열번호 23) 의 선형 결합을 이용하는, 상기 분류기의 제 1 단계를 보여준다. 상기 2 가지 miRNA 의 조합에 대해 점수가 낮게 부여된 시료들은 "비(非)-중피종"으로 식별되었다. 남은 시료들은 계속해서 다음 단계로 진행되었다.
도 16a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 16b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축). 민감도: 100%, 특이도: 16%.
도 16c 는 hsa-miR-122a (서열번호 23) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 정규화된 Ct (x 축) 를 보여준다.
도 16d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=O.69298 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 17 은 65 개 시료에 대하여 hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 선형 결합을 이용하는, 상기 분류기의 제 2 단계를 보여준다. 상기 2 가지 miRNA 의 조합에 대해 점수가 낮게 부여된 시료들은 "비(非)-중피종"으로 식별되었다. 상기 2 가지 miRNA 의 조합에 대해 점수가 높게 부여된 시료들은 "중피종"으로 식별되었다.
도 17a 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 시료들 (x 축) 이 각자의 선형 결합 점수에 따라 분류되어 있다.
도 17b 는 상기 2 가지 miRNA 의 선형 결합을 나타낸다(y 축). 각 군 내의 시료들이 각자의 선형 결합 점수에 따라 개별적으로 분류되어 있다(x 축).
도 17c 는 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct (y 축) 에 대한 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 정규화된 Ct (x 축) 를 나타낸다.
도 17d 는 상기 예시된 분류기의 곡선하면적 (AUC) 을 나타내는데, 이 때 AUC=O.99468 이다. Y 축은 민감도를 나타내고, X 축은 (1-특이도) 를 나타낸다.
도 18 은 악성 흉막 중피종 (MPM), 선암, 및 신세포암 (RCC) 에서의 마이크로RNA 발현 수준을 비교한 것을 보여준다. 7 개의 MPM 시료 내의 각 마이크로RNA 의 정규화-역(inverted) 형광 중앙값이 81 개 선암 시료 (도 18A 의 Y 축) 및 16 개 RCC 시료 (도 18B 의 Y 축) 내에서의 이들 마이크로RNA 의 형광 중앙값에 대해 도표화되어 있다(x 축). 옅은 십자형은 상기 두 군 모두에서 발현 수준이 바탕 수준 (신호 중앙값<800) 인 대조 탐침 및 마이크로RNA 를 나타낸다. 적어도 1 개 군에서 바탕 수준 이상의 신호를 가진 마이크로RNA (진한 십자형) 에 대해서는 양측 독립표본 t-검정으로 통계학적 차이를 테스트하였다. 원 모양은 0.2 의 오류발견률 (False Discovery Rate; FDR) 에서 발현 값의 통계학적 유의차를 가진 마이크로RNA (p-값이 각각 0.05 및 0.04 미만인 것) 를 나타낸다. 사각형은 hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-192 (서열번호 2), 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 발현 수준을 강조한 것이다.
도 18C 는 MPM, 선암, 및 RCC 시료에서의 hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-192 (서열번호 2), 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 발현 수준에 대한 상자도표 (box-plot) 를 보여주는 것으로, 중앙값 (수평선), 25 내지 75 백분위수 (상자), 및 데이터 범위 ("세선(whisker)") 가 나타나 있다. 단위는 마이크로어레이에 의한 정규화된 형광 신호의 log2 를 보여준다.
도 18D 는 qRT-PCR 로 측정된, 22 개 MPM 시료, 39 개 선암 시료, 및 4 개의 RCC 시료에서의 상기 마이크로RNA 들의 발현 수준 (정규화된 Ct) 의 상자도표를 나타낸다.
도 19 는 마이크로RNA 들의 발현 수준을 이용하여, HCC (간세포암, 원 모양), RCC (사각형) 및 선암 (마름모꼴) 으로부터 중피종 (별 모양) 을 감별 진단하는 것을 보여준다. hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122 (서열번호 24) (도 19A, 도 19C) 및 hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) (도 19B, 도 19D) 의 발현 수준 (정규화-역(normalized-inverted) Ct) 이, 20 개의 MPM 시료, 10 개의 RCC 시료, 5 개의 HCC 시료, 및 44 개의 선암 (이 중 10 개는 결장 또는 췌장 조직으로부터의 것임) 으로 구성된 훈련 집합 (training set) (도 19 A, 도 19B), 및 12 개의 MPM 시료, 8 개의 RCC 시료 (5 개는 새로운 것), 5 개의 HCC 시료, 및 42 개의 선암 (이 중 8 개는 결장 또는 췌장 조직으로부터의 것임) 으로 구성된 독립적 맹검 집합 (도 19C, 도 19D) 에서 qRT-PCR 을 이용하여 측정되었다. 실선은 hsa-miR-192 의 발현 수준 (도 19A 및 도 19C 에서의 수직선) 및 hsa-miR-200c 및 hsa-miR-193a-3p 의 조합 발현 수준 (도 19B 및 도 19D 에서의 대각선) 에 대한 분류 한계점을 나타낸다. 평행한 점선은 1.5 정규화-역 Ct 단위들의 불확실성 한계를 나타낸다. 도 19A 및 도 19C 에서의 수평 점선은 hsa-miR-122 (서열번호 24) 의 발현 수준에 대한 가능한 분류 한계점을 나타낸다. 훈련 집합 내 2 개의 부가적 중피종 시료는 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 발현이 상당히 더 낮아(정규화-역 Ct: -5 및 -5.5), 최적화 척도 (optimal scaling) 를 위해 패널 A 에서 제외시켰다. 훈련 집합 내 1 개의 부가적 선암 시료 및 검정 집합 내 4 개의 부가적 선암 시료도 hsa-miR-193a-3p 의 발현이 낮아(정규화-역 Ct: 각각, -3.5 및 -1.3, -4, -5.4 및 -5.7), 최적화 척도를 위해 패널 B 및 D 에서 제외시켰다.
도 20 은 마이크로어레이 데이터에 대한 평균 miR 발현 (형광 (로그-스케일로 나타나 있음)) 의 산포도 (scatter plot) 를 보여주며, 이 때, X 축은 선암 시료 (n=60) 에서의 평균 발현을 나타내고, Y 축은 편평상피세포암 시료 (n=62) 에서의 평균 발현을 나타낸다. 원형의 기호는 본페로니 (Bonferroni) 방법으로 측정했을 때 유의하게 차별적으로 발현된 miR 에 대한 것인데, 이에는 hsa-miR-29b (서열번호 44), hsa-miR-30b (서열번호 47), hsa-miR-375 (서열번호 8) 및 hsa-miR-205 (서열번호 49) 가 포함된다. 가운데 대각선은 차별적으로 발현되지 않은 miRNA 들 (선암 및 편평상피세포암 시료에서 발현 수준 동일) 에 대한 예상 발현을 나타내고, 나머지 대각선들은 2 배 요인 선 (fold 2 factor line) 을 나타낸다.
도 21 은 편평세포성 조직을 가진 비소세포 폐암 (NSCLC) 의 시료 (원 모양), 및 비(非)-편평세포성 조직을 가진 NSCLC 의 시료 (사각형- 선암; 십자형- 대세포암) 를 구별하는데 사용된, qRT-PCR 을 이용한 분류기의 일례를 보여준다. Y 축은 hsa-miR-375 (서열번호 8) 의 발현수준 (단위: Ct) 에서 hsa-miR-205 (서열번호 49) 의 발현수준 (단위: Ct) 을 제하여 수득된 값을 나타낸다. (x 축은 시료들의 실시 순서임.)

발명의 상세한 설명

본 발명은 특정 핵산들 (서열번호: 1 - 87) 이 특정 암의 식별, 분류 및 진단에 사용될 수 있다는 발견에 기초한 것이다.

본 발명은 상이한 종양 기원들을 구별하는데 사용될 수 있는, 민감하고 특이적이며 정확한 방법을 제공한다.

본 발명은 나아가 중피종과, 비제한적으로 선암, 폐 종양, 및 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암으로부터의 종양을 비롯한 기타 유형의 암을 구별하는데 사용될 수 있는 방법, 및 또한 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 비(非)-편평 NSCLC 를 구별하는 방법을 제공한다.

악성 흉막 중피종

악성 흉막 중피종 (MPM) 은, 가능성 있는 분자적 및 유전자적 표적이 다수 발견되었음에도 불구하고 효과적인 치료법이 아직 발견되지 않은 비교적 드물게 발생하는 공격성 종양이다. 이는 폐 실질을 덮고 있으면서 후에 그에 침범하는 국지적 공격성의 흉막의 고형 종양으로, 생존기간 중앙값이 매우 좋지 않은 심한 임상 증상을 나타내는 질병을 초래한다. 상기 악성 종양의 발달에 대한 수많은 위험 인자들이 기술되어 왔는데, 그 중 가장 중요한 것은 석면에의 노출 및 가능성있게는 SV40 바이러스에의 감염이다. 유전적 감수성 및 가족내 집적성 (familial clustering) 의 사례들 또한 관찰되었으며, 방사선에의 노출 및 만성 감염 또한 위험 인자인 것으로 보인다. 그러나, MPM 이 상기 질병의 말기에 진단되며, 상기 노출 중 일부와 상기 질병의 진단 사이에 긴 잠복기간이 존재하기 때문에, 상기 위험 인자 각각 및 이들의 후속적인 분자적 효과가 상기 질병의 발병기전에 기여하는 바를 포괄적으로 평가하는 것이 곤란하였다.

중피종의 발생수는 서유럽 및 북아메리카의 모든 선진국에서 최근 수년간 뚜렷하게 증가하였으며, 이는 십중팔구 개발도상국에서도 마찬가지일 것이고, 앞으로 수년내에 상기 질병이 발병할 것으로 추정되는 환자의 수도 또한 증가하고 있다. 석면에의 노출은 여전히 발병 건수의 계속적인 증가에 기여하는 주요 인자이다. 중피종이 발병한 환자의 수의 계속적 증가는 또한 조기 진단 및 전암성 변화의 감지를 위한 더 나은 수단 개발의 중요성을 부각시켰다. 유효한 치료법이 아직 발견되지 않고 있지만, 초기 단계의 종양을 가진 환자에서의 예후가 훨씬 개선되는 것은, 조기 감지에 의해 생존을 유의하게 향상시킬 수 있고 심지어는 상기 종양의 발달을 저지할 수도 있다는 것을 강력하게 시사한다.

MPM 이라는 용어는 종종 오해를 일으키는데, 그 이유는 거기에 세포 구성이 상이한, 즉, 상피성, 육종성, 및 혼합성의, 상이한 유형의 종양이 포함되기 때문이다. 중피종에 대한 대대적인 연구에서, 상피성 중피종이 가장 우세한 유형이었고(61.5%), 이어서 혼합성/이상성 (biphasic) 유형 (22%) 및 육종성 유형 (16.5%) 순이었다. 중피종에 있어서 육종성 및 상피성 유형 간의 구별은 비교적 쉬우나, 상기 상피성의 아류형들 (혼합형 포함) 과 흉막을 포함한 폐의 선암 간의 구별은 종종 쉽거나 간단하지 않다. 원발성 폐암의 70% 이상에서 종국에는 흉막이 연루되고, 대다수의 다른 악성 종양도 폐 및 흉막으로 전이되기 때문에, 악성 중피종에 대한 올바른 진단 및 기타의 암으로부터의 구별은 매우 중요한 것임이 분명하다. 중피종을 진단함에 있어서 및 이를 폐 및 흉막의 기타의 암과 구별함에 있어서 병리학자들 간에 관찰자간 변동성이 존재하고, 중피종의 진단을 위한 특이적이고 신뢰할만한 단일한 바이오마커가 부재하기 때문에, 병리학자가 더 큰 확신을 가지고 이러한 구분을 할 수 있도록 도울 신뢰할만한 객관적 분석법이 명백히 필요한 실정이다.

흉막의 병변에 대한 병리학적인 평가에는 구별이 곤란할 수 있는 각종 신생의 반응성 상태가 포함된다. 가장 흔한 진단상의 문제로는 상피성 악성 중피종 및 선암 간의 구별, 및 반응성 상피조직 또는 섬유조직 증식과 상피성 또는 육종성 중피종 간의 구별이 있다. 흉막 삼출액 또는 소형 조직 시료만을 이용해 병리학적 평가를 수행해야 하는 경우 이는 훨씬 더 어려워진다. 지난 20 년에 걸쳐, 면역조직화학은 중피종의 진단을 위한 신뢰할만한 객관적인 도구를 탐색함에 있어 가장 광범위하게 조사된 기술이었다. 이러한 집중적인 노력에도 불구하고, 악성 중피종 또는 전이성 종양 중 하나에 대해 전적으로 결정적인 단일한 면역학적 염색물질 (immunostain) 은 아직 존재하지 않는다. 나아가, 문헌에 기록된 것 및 시판중인 대분분의 항체들에 있어서, 면역조직화학적 패널에서 이들 각각의 진단상의 가치 및 이들의 조합물의 가치는 여전히 논쟁 중에 있다. 악성 중피종의 전체적인 발병률이 낮기 때문에, 많은 병리학자들이 상기 종양의 조직학에 대해 충분할 만큼 친숙하지 않으며, 그에 따라 거의 전적으로 면역학적 진단에 의존하게 되었고 그 결과로서 진단에서 부정확성이 증가하게 된 것 또한 사실이다.

면역조직화학에서의 발전에도 불구하고, 장막 표면에 영향을 미치는 다른 종양으로부터 중피종을 구별해 내는 진단에 있어서 전자 현미경이 계속해서 "황금 기준(gold standard)"이 되고 있다. 전자 현미경은 상기 상피 변이체의 진단에 가장 많이 기여해 왔으며, 육종성 중피종의 식별에는 덜 유용하다. 그러나 EM 진단에 이용가능한 조직의 양이 매우 제한되어 있고 소형의 조직 파편들을 취하는 것은 매우 큰 표본 오차를 수반하기 때문에, 모든 통상의 조직학적 및 면역조직화학적 평가가 모조리 행해진 후에야 EM 진단이 필요하게 된다. 그리고, 그런 다음에라도 올바른 진단에 이르는 데는 함정이 많이 존재한다.

마이크로어레이, 및 차감식 (subtractive) 상보적 DNA (cDNA) 혼성화에 의해 결정되는 바, 악성 중피종과 정상 흉막 간의 차별적인 유전자 발현은, 중피종에 관련된 것으로서 상기 종양에 대한 잠재적인 일종의 서명이 될 수 있는 다수의 유전자를 나타내보일 수 있었다. 즉, c-myc, fra-1 및 EGFR 의 상향조절이 발암의 상이한 단계에서 나타났다. 중피종에서 발견되는 오스테오폰틴, 직신 (zyxin) 및 인테그린-연결 키나아제의 상향조절, 및 이후의 CD44 및 c-met 의 상향조절 또한 이들을 잠재적 종양 마커로 활용되도록 하였는데, 이들 중 일부는 또한 혈청에서도 검출가능하다. 또한 MPM 에서의 유전자 발현 프로필에 의해 흉부 수술을 받은 독립적 환자군들에서 종양진행 소요시간 및 생존 패턴을 예측할 수 있다는 것이 밝혀질 수 있었다. 놀랍게도, 고전적인 종양 억제 유전자들의 구성원들에서의 빈번한 변화가 본 맥락에서는 발견되지 않았다. p53 돌연변이가 MPM 세포주에서 발견되긴 했지만, MPM 발병기전에서 p53 돌연변이의 기여는 미미하다는 것이 일반적 견해이다. 그러나, pRb 억제 유전자의 활성과 밀접히 관련된 p16/CDKN2A 의 동형접합 소실이 악성 중피종의 >70% 에서 보고되었으며, 이는 좋지 않은 예후와 관련되었다.

마이크로 RNA ( miR , miRNA ) 및 이들의 가공

miRNA 를 암호화하는 유전자는 전사되어 pri-miRNA 로 알려진 miRNA 1차 전사물을 생성할 수 있다. pri-miRNA 는 스템 (stem) 과 루프 (loop) 를 가진 헤어핀을 포함하고 있을 수 있다. 상기 헤어핀의 스템은 부정합된 염기들을 포함하고 있을 수 있다. pri-miRNA 는 수 개의 헤어핀을 다시스트론성 (polycistronic) 구조로 포함하고 있을 수 있다.

상기 헤어핀 구조는 RNase III 엔도뉴클레아제인 Drosha 에 의해 인식되는 것일 수 있다. Drosha 는 pri-miRNA 에 있는 말단 루프들을 인식하여 스템에 대한 대략 2 개의 나선형 회전들을 절단하여 pre-miRNA 로 공지된 60-70 nt 전구체를 생성하는 것일 수 있다. Drosha 는 pri-miRNA 를 통상의 RNase III 엔도뉴클레아제식으로 엇갈린 절단부 (staggered cut) 를 갖도록 절단하여 5' 포스페이트 및 ~2 개 뉴클레오티드 3' 돌출부를 가진 pre-miRNA 스템 루프를 산출하는 것일 수 있다. Drosha 절단 부위 너머로 나 있는 스템의 대략 하나의 나선형 회전 (~10 개 뉴클레오티드) 은 효율적인 가공에 필수적인 것일 수 있다. 그 후 pre-miRNA 는 Ran-GTP 및 운반 수용체인 Ex-portin-5 에 의해 활발히 핵으로부터 세포질로 수송되는 것일 수 있다.

상기 pre-miRNA 는 역시 RNase III 엔도뉴클레아제인 Dicer 에 의해 인식될 수도 있다. Dicer 는 pre-miRNA 의 이중가닥 스템을 인식하는 것일 수 있다. Dicer 는 스템 루프의 염기로부터 떨어져 있는 말단 루프의 2 개의 나선형 회전들을 절단하여 부가적인 5' 포스페이트 및 ~2 개 뉴클레오티드 3' 돌출부를 산출하는 것일 수 있다. 생성된 siRNA-유사 이중체 (부정합을 포함하고 있을 수 있음) 는 성숙 miRNA 및 miRNA^* 로 공지된 유사 크기 절편을 포함한다. 상기 miRNA 및 miRNA^* 는 pri-miRNA 및 pre-miRNA 의 반대되는 측면에서 유래된 것일 수 있다. miRNA^* 서열은 클로닝된 miRNA 들의 라이브러리에서 발견될 수도 있으나, 전형적으로 miRNA 보다는 더 낮은 빈도로 발견된다.

miRNA 는 초기에는 miRNA^* 와 함께 이중가닥 형태로 존재하지만, 종국에는 단일가닥 RNA 로서 RNA-유도성 침묵 복합체 (RISC) 로 알려진 리보핵단백질 복합체 내로 통합될 수 있다. 다양한 단백질이 RISC 를 형성할 수 있는데, 이는 miRNA/miRNA^* 이중체, 표적 유전자의 결합 부위, miRNA 의 활성 (억제 또는 활성화), 및 miRNA/miRNA^* 이중체 중 어느 가닥이 RISC 에 적재되는지에 대한 특이성에 있어서 가변성을 초래할 수 있다.

miRNA:miRNA^* 이중체 중 miRNA 가닥이 RISC 내로 적재되는 경우, miRNA^* 는 제거 및 분해될 수 있다. miRNA:miRNA^* 이중체 중 RISC 에 적재되는 가닥은 5' 말단에서의 쌍 형성이 보다 느슨한 가닥일 수 있다. miRNA:miRNA^* 의 양 말단의 5' 쌍 형성이 대략 동등한 경우에는, miRNA 및 miRNA^* 둘 다 유전자 침묵 활성을 가질 수 있다.

RISC 는 miRNA 및 mRNA 간의 높은 수준의 상보성에 기초하여, 특히 miRNA 의 뉴클레오티드 2-7 에 의해 표적 핵산을 식별할 수 있다. miRNA 와 그의 표적 간의 상호작용이 miRNA 의 길이방향 전체를 따라 존재한 경우는 동물에서 단 한 차례 보고되었다. 이는 miR-196 및 Hox B8 에서 나타났으며, miR-196 이 Hox B8 mRNA 의 절단을 매개한다는 것이 추가로 밝혀졌다(Yekta 등 2004, Science 304-594). 그 외에는, 이러한 상호작용은 식물에서만이 알려져 있다(Bartel & Bartel 2003, Plant Physiol 132-709).

다수의 연구에서는 번역에 대한 효율적 저해의 달성과 관련하여 miRNA 및 그의 mRNA 표적 간 염기쌍 형성 요건을 주목하였다(Bartel 에 의한 개관: 2004, Cell 116-281). 포유류 세포에서, miRNA 의 처음 8 개 뉴클레오티드가 중요할 수 있다(Doench & Sharp 2004 GenesDev 2004-504). 그러나, 마이크로RNA 의 다른 부분들 또한 mRNA 결합에 참여하는 것일 수 있다. 나아가, 3' 에서의 충분한 염기쌍 형성은 5'에서의 불충분한 쌍 형성을 보상할 수 있다(Brennecke 등, 2005 PLoS 3-e85). 전체 게놈에 대한 miRNA 결합을 분석한 계산 연구에 의해 표적 결합에 있어서 miRNA 의 5' 에서의 염기 2-7 의 특정한 역할이 시사되었으나, 첫번째 뉴클레오티드 (보통 "A"로 나타남) 의 역할 또한 인식되었다(Lewis 등 2005 Cell 120-15). 유사하게, Krek 등 (2005, Nat Genet 37-495) 은 뉴클레오티드 1-7 또는 2-8 을 표적을 식별하고 입증하는데 사용하였다.

mRNA 에서의 표적 부위는 5' UTR 내, 3' UTR 내 또는 암호화 영역 내에 존재할 수 있다. 흥미롭게도, 다수의 miRNA 가 동일 또는 다양한 부위를 인식함으로써 동일 mRNA 표적을 조절하는 것일 수 있다. 유전적으로 밝혀진 대부분의 표적들에서 다수의 miRNA 결합 부위가 존재하는 것은 다수의 RISC 의 협력 작용에 의해 가장 효율적인 번역 저해가 일어남을 시사하는 것일 수 있다.

miRNA 는 RISC 로 하여금 mRNA 절단 또는 번역 억제 두 기전 중 하나에 의해 유전자 발현을 하향조절하도록 유도하는 것일 수 있다. miRNA 는 mRNA 가 그에 대해 일정 정도의 상보성을 갖는다면 해당 mRNA 의 절단을 지정하는 것일 수 있다. miRNA 가 절단을 인도하는 경우, 절단은 miRNA 의 잔기 10 및 11 에 대해 쌍을 이룬 뉴클레오티드들 사이에서 일어날 수 있다. 다르게는, miRNA 는 miRNA 에 대해 필요한 정도의 상보성을 갖고 있지 않다면 번역을 억제하는 것일 수 있다. 번역 억제는 동물에서 더욱 우세할 수 있는데, 그 이유는 동물에서는 miRNA 및 결합 부위 간 상보성이 더 낮을 수 있기 때문이다.

임의의 miRNA 및 miRNA^* 의 쌍의 5' 및 3' 말단에서 가변성이 존재할 수 있다는 것을 유의해야 한다. 이러한 가변성은 절단 부위에 대한 Drosha 및 Dicer 의 효소적 가공의 가변성에 기인한 것일 수 있다. miRNA 및 miRNA^* 의 5' 및 3' 말단에서의 가변성은 또한 pri-miRNA 및 pre-miRNA 의 스템 구조 내의 부정합에 기인한 것일 수도 있다. 스템 가닥들의 부정합은 상이한 헤어핀 구조들의 군집을 초래할 수 있다. 스템 구조의 가변성 또한 Drosha 및 Dicer 에 의한 절단의 생성물에서의 가변성을 초래할 수도 있다.

핵산

본원에서는 핵산이 제시된다. 상기 핵산은 서열번호: 1-87 또는 그의 변형체의 서열를 포함할 수 있다. 상기 변형체는 상기 기준 뉴클레오티드 서열의 상보체 (complement) 일 수 있다. 상기 변형체는 또한 기준 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 변형체는 또한 엄격한 조건 하에서 기준 뉴클레오티드 서열, 그의 상보체, 또는 그와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 핵산은 길이가 10 내지 250 개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 핵산은 길이가 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250 개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 핵산은 본원에 기재된 합성 유전자를 이용하여 (시험관내 또는 생체내) 세포에서 합성 또는 발현시킨 것일 수 있다. 상기 핵산은 단일 가닥 분자로 합성한 후 실질적으로 상보적인 핵산에 혼성화하여 이중체를 형성하게 한 것일 수 있다. 상기 핵산은 U.S. 특허 제 6,506,559 호 (이는 참조로 포함됨) 에 기재된 바를 포함하여, 당업자들에 잘 알려진 방법을 이용하여, 단일- 또는 이중가닥 형태로 세포, 조직 또는 기관으로 도입될 수 있고, 또는 합성 유전자에 의해 발현될 수 있다.

핵산 복합체

상기 핵산은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 펩티드, 단백질, RNA-DNA 혼성체, 항체, 항체 절편, Fab 절편, 및 앱타머 (aptamer).

Pri - miRNA

상기 핵산은 pri-miRNA 또는 그의 변형체의 서열를 포함할 수 있다. 상기 pri-miRNA 서열은 45-30,000, 50-25,000, 100-20,000, 1,000-1,500 또는 80-100 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. pri-miRNA 의 서열은 본원에 개시된 바와 같은 pre-miRNA, miRNA 및 miRNA^*, 및 이들의 변형체를 포함할 수 있다. pri-miRNA 의 서열은 서열번호: 1-22, 44-50, 55 및 58-87 또는 이들의 변형체의 서열을 포함할 수 있다.

상기 pri-miRNA 는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 상기 헤어핀은 실질적으로 상보적인 제 1 및 제 2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 제 1 및 제 2 핵산 서열은 37-50 개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 제 1 및 제 2 핵산 서열은 8-12 개 뉴클레오티드의 제 3 의 서열에 의해 분리되어 있을 수 있다. 상기 헤어핀 구조는, 문헌 [Hofacker 등, Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994)] (이의 내용은 본원에 포함됨) 에 기재된 바와 같이, 비엔나 (Vienna) 알고리즘으로 기본 매개변수를 이용하여 계산시 자유 에너지가 -25 Kcal/몰 미만일 수 있다. 상기 헤어핀은 4-20, 8-12 또는 10 개 뉴클레오티드로 된 말단 루프를 포함할 수 있다. 상기 pri-miRNA 는 적어도 19% 의 아데노신 뉴클레오티드, 적어도 16% 의 시토신 뉴클레오티드, 적어도 23% 의 티민 뉴클레오티드 및 적어도 19% 의 구아닌 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

Pre - miRNA

상기 핵산은 또한 pre-miRNA 또는 그의 변형체의 서열를 포함할 수 있다. 상기 pre-miRNA 서열은 45-90, 60-80 또는 60-70 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 pre-miRNA 의 서열은 본원에 개시된 바의 miRNA 및 miRNA^* 를 포함할 수 있다. 상기 pre-miRNA 의 서열은 또한 상기 pri-miRNA 의 5' 및 3' 말단에서 0-160 개 뉴클레오티드가 제외된 pri-miRNA 의 서열일 수 있다. 상기 pre-miRNA 의 서열은 Sanger miRBase 레지스트리 (릴리스 (release) 9.1 또는 10) 에 기재된 바의 서열번호: 1-22, 44-50, 55 및 58-87 또는 이들의 변형체의 서열을 포함할 수 있다.

miRNA

상기 핵산은 또한 miRNA (miRNA^* 포함) 또는 그의 변형체의 서열을 포함할 수도 있다. 상기 miRNA 서열은 13-33, 18-24 또는 21-23 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 miRNA 는 또한 모두 합하여 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 개 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 상기 miRNA 의 서열은 pre-miRNA 의 처음 13-33 개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 miRNA 의 서열은 또한 pre-miRNA 의 마지막 13-33 개 뉴클레오티드일 수도 있다. 상기 miRNA 의 서열은 Sanger miRBase 레지스트리 (릴리스 9.1 또는 10) 에 기재된 서열번호: 1-12, 23-25, 44, 47, 49, 55 및 58-72 또는 이들의 변형체의 서열을 포함할 수 있다.

항- miRNA

상기 핵산은 또한, pri-miRNA, pre-miRNA, miRNA 또는 miRNA^* (예컨대 안티센스 또는 RNA 침묵) 에 결합하거나, 또는 표적 결합 부위에 결합하는 등에 의해, miRNA 또는 miRNA^* 의 활성을 차단할 수 있는 항-miRNA 의 서열을 포함할 수 있다. 상기 항-miRNA 는 총 5-100 또는 10-60 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 항-miRNA 는 또한 모두 합해 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 항-miRNA 의 서열은 (a) miRNA 의 5' 과 실질적으로 동일하거나 또는 그에 상보적인 적어도 5 개 뉴클레오티드 및 상기 miRNA 의 5' 말단의 표적 부위의 측면 영역 (flanking region) 에 실질적으로 상보적인 적어도 5-12 개 뉴클레오티드, 또는 (b) miRNA 의 3' 과 실질적으로 동일하거나 또는 그에 상보적인 적어도 5-12 개 뉴클레오티드 및 상기 miRNA 의 3' 말단의 표적 부위의 측면 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 5 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 항-miRNA 의 서열은 Sanger miRBase 레지스트리 (릴리스 9.1 또는 10) 에 기재된 바의 서열번호: 1-12, 23-25, 44, 47, 49, 55 및 58-72 또는 이들의 변형체의 상보체를 포함할 수 있다.

합성 유전자

전사 및/또는 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 핵산을 포함한 합성 유전자가 또한 제시된다. 상기 합성 유전자는 본원에 기술된 핵산에 대한 결합 부위를 가진 표적 유전자의 발현을 조정할 수 있는 것일 수 있다. 표적 유전자의 발현은 세포, 조직 또는 기관에서 조정될 수 있다. 상기 합성 유전자는 표준 재조합 기술에 의해 천연의 유전자로부터 합성 또는 유도된 것일 수 있다. 상기 합성 유전자는 또한 상기 합성 유전자 서열의 전사 단위의 3'-말단에서 종결자를 포함할 수도 있다. 상기 합성 유전자는 또한 선별 마커를 포함할 수도 있다.

벡터

본원에 기술된 합성 유전자를 포함한 벡터가 또한 제시된다. 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 부가적인 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는, 2 개의 유기체에서, 예컨대, 발현을 위한 하나의 숙주 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 제 2 의 숙주 세포 (예컨대, 세균) 에서 유지될 수 있게 하는 2 개의 복제 시스템을 가질 수 있다. 발현 벡터의 통합을 위해서, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 상동인 적어도 하나의 서열, 및 바람직하게는 발현 구축물의 측면에 위치하는 2 개의 상동 서열을 포함할 수 있다. 상기 통합 벡터를 숙주 세포 내의 특정 좌위로 향하게 할 수 있는데, 이는 상기 벡터에 포함시키기에 적절한 상동 서열을 선택함으로써 가능하다. 상기 벡터는 또한 형질전환된 숙주 세포에 대한 선별을 가능하게 하는 선별 마커 유전자를 포함할 수도 있다.

탐침

본원에 기술된 핵산을 포함한 탐침이 또한 제시된다. 탐침은 이하에서 개략적으로 설명되는 바와 같이, 스크리닝 및 진단 방법에 사용될 수 있다. 상기 탐침을, 바이오칩과 같은 고체의 기판에 부착 또는 고정화할 수 있다.

상기 탐침은 길이가 8 내지 500, 10 내지 100 또는 20 내지 60 개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 탐침은 또한 길이가 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280 또는 300 개 뉴클레오티드일 수도 있다. 상기 탐침은 또한 10-60 개 뉴클레오티드의 연결자 서열을 포함할 수도 있다.

바이오칩

바이오칩이 또한 제시된다. 상기 바이오칩은 본원에 기술된 탐침 또는 다수의 탐침들이 부착되어 있는 고체 기판을 포함할 수 있다. 상기 탐침은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 것일 수 있다. 상기 탐침은 상기 기판 상의 공간적으로 규정된 주소 상에 부착될 수 있다. 표적 서열당 1 개 초과의 탐침이 사용될 수 있는데, 중복되는 탐침 또는 특정 표적 서열의 상이한 구획에 대한 탐침일 수 있다. 상기 탐침은 당업자들에게 식별되는 단일한 장애에 관련된 표적 서열들에 혼성화할 수 있는 것일 수 있다. 상기 탐침은 먼저 합성된 후 후속적으로 상기 바이오칩에 부착될 수도 있고, 또는 바이오칩 상에서 바로 합성될 수도 있다.

상기 고체 기판은 적어도 하나의 검출 방법에 순응하는 것으로서 상기 탐침의 부착 또는 결합에 적절한 분리된 개별 부위들을 포함하도록 변형될 수 있는 물질일 수 있다. 기판의 대표적인 예로서는, 유리 및 개질 또는 관능화된 유리, 플라스틱류 (아크릴 제품, 폴리스티렌 및 스티렌과 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄류, TeflonJ, 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 수지류, 실리카 또는 실리콘 및 변성 실리콘을 비롯한 실리카-기반 물질, 탄소, 금속, 무기 유리 및 플라스틱류가 있다. 상기 기판은 식별가능하게 형광을 발하지 않고도 광학적 검출을 가능하게 하는 것일 수 있다.

상기 기판은 평면일 수 있지만, 다른 형태의 기판도 또한 사용가능하다. 예를 들어, 시료 양을 최소화하기 위한 통과-흐름 (flow-through) 시료 분석에 있어서, 탐침을 관의 내부 표면 상에 위치시킬 수 있다. 유사하게, 기판은 연질일 수 있는데, 예컨대 특정 플라스틱류로 제조된 밀폐 기포 발포체 (closed cell foam) 를 비롯한, 연질 발포체일 수 있다.

상기 바이오칩 및 탐침은 이들의 후속적인 부착을 위해 화학적 작용기로 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 바이오칩은, 이들에 제한되는 것은 아니나, 아미노기, 카르복실기, 옥소기 또는 티올기를 비롯한 화학적 작용기로 유도체화될 수 있다. 이러한 작용기를 이용하여, 탐침을 그 위의 작용기를 이용하여 직접적으로 또는 연결자를 이용하여 간접적으로 부착시킬 수 있다. 탐침은, 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부 뉴클레오티드를 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다.

상기 탐침을 또한 고체 지지체에 비공유적으로 부착시킬 수도 있다. 예를 들어, 비오틴화 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있는데, 이는 스트렙타비딘이 공유적으로 코팅된 표면에 결합할 수 있고, 결과적으로 부착될 수 있다. 다르게는, 탐침을 광중합 및 포토리소그래피 등의 기술을 이용하여 표면 상에서 합성할 수도 있다.

조성물

약학 조성물이 또한 제시된다. 상기 조성물은 본원에 기술된 핵산 및 임의로는 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 치료 용도로 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물은, 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 목적하는 표적 세포 내로 도입하는 것을 포함하여, 공지의 방법으로 투여될 수 있다.

핵산 분자의 전달 방법은 문헌 [Akhtar 등, Trends Cell Bio. 2, 139, 1992] 에 기술되어 있다. WO 94/02595 에는, RNA 분자의 전달에 대한 일반적인 방법들이 기술되어 있다. 이들 프로토콜은 사실상 임의의 핵산 분자의 전달에 활용가능하다. 핵산 분자는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 리포좀 내로의 캡슐화, 이온영동법, 또는 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생체접착성 미소구체 등의 다른 비히클 내로의 혼입을 포함하여, 당해 기술에 친숙한 자들에 공지된 다양한 방법으로 세포 내로 투여할 수 있다. 다르게는, 핵산/비히클 조합물을 직접 주사로 또는 주입 펌프를 이용하여 국소적으로 전달한다. 다른 전달 경로로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 경구 (정제 또는 환제 형태) 및/또는 척수강내 전달 (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158) 이 있다. 기타 접근법으로는, 각종 수송 및 담체 시스템의 이용, 예를 들어, 접합체 및 생분해성 중합체의 이용을 통한 것을 들 수 있다. 핵산 전달 및 투여에 관한 더욱 상세한 설명은 예를 들어 WO93/23569, WO99/05094, 및 WO99/04819 에 나와 있다.

핵산은, 바이러스 감염, 미세주사, 또는 소포체 융합을 비롯한 임의 수의 경로를 통해 조직 또는 숙주 세포 내로 도입가능하다. 문헌 [Furth 등, Anal Biochem 115 205:365-368, 1992] 에 기술된 바와 같이, 분사 주사 (jet injection) 또한 근육내 투여에 이용가능하다. 상기 핵산을, 금 미세입자 상에 코팅하여, 입자총 (particle bombardment) 장치, 또는 문헌 (하기 참조: 예를 들어, Tang 등, Nature 356:152-154, 1992) 에 기술된 바와 같은 "유전자총(gene gun)"을 이용하여 피내로 전달할 수 있는데, 이 때, 금 미세사출체 (microprojectile) 를 DNA 로 코팅한 후, 피부 세포 내로 발사한다.

본 발명의 조성물을 적절한, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 약학 조성물로 제형화할 수 있으며, 이를 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸 등의 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화할 수 있다. 따라서, 상기 제제의 투여는, 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 기관내 등 다양한 방식으로 이루어질 수 있다.

진단법

진단 방법이 또한 제시된다. 당해 방법은 생물학적 시료에서 암-관련 핵산의 차별적 발현 수준을 검출하는 것을 포함한다. 상기 시료는 환자에서 유래한 것일 수 있다. 환자의 암 상태에 대한 진단은 예후 및 치료 전략에 대한 선택을 가능하게 할 수 있다. 나아가, 일시적으로 발현된 질병-관련 핵산을 측정함으로써 세포의 발달 단계를 분류할 수 있다.

표지된 탐침의 조직 어레이로의 원위치 혼성화를 실시할 수 있다. 개별 대상 및 표준 간의 지문을 비교하여, 당업자는 상기 조사 결과에 기초하여 진단, 예후, 또는 예측을 내릴 수 있다. 나아가, 진단을 시사하는 유전자들이 예후를 시사하는 유전자들과 상이할 수 있으며 세포의 상태에 대한 분자적 프로파일링을 통해 즉각 반응하는 또는 난치성의 상황을 구별할 수 있거나 또는 결과를 예측할 수 있을 것으로 생각된다.

키트

키트가 또한 제시되는데, 이는 본원에 기술된 핵산과 함께 하기 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다: 분석 시약, 완충액, 탐침 및/또는 프라이머, 및 멸균 식염수 또는 또 다른 약학적으로 허용되는 에멀젼 및 현탁액 기제. 또한, 당해 키트에는 본원에 기술된 방법의 실시를 위한 지시사항 (예컨대, 프로토콜) 이 담긴 교재가 포함될 수 있다.

예를 들어, 상기 키트는 표적 핵산 서열의 증폭, 검출, 동정 또는 정량을 위한 키트일 수 있다. 상기 키트는 폴리(T) 프라이머, 전방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 탐침을 포함할 수도 있다.

정의

본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예들을 기술하기 위한 목적의 것으로 제한하고자 하는 의도는 없다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바, 단수 형태에는 문맥상 명백히 다르게 기술되어 있지 않는 한 복수의 대상물이 포함된다는 것을 유의해야 한다.

이상 증식

본원에 사용된 바, 용어 "이상 증식"은 정상의, 적절한, 또는 예기된 추이에서 벗어난 세포 증식을 의미한다. 예를 들어, 이상 세포 증식에는, DNA 또는 다른 세포 구성요소가 손상을 받게 되었거나 또는 결함이 생긴 세포의 부적절한 증식이 포함될 수 있다. 이상 세포 증식에는, 부적절하게 높은 수준의 세포 분열, 부적절하게 낮은 수준의 아포토시스, 또는 둘 다에 의해 유발, 매개되거나 또는 이러한 결과를 야기하는 징후와 관련된 특징을 가진 세포 증식이 포함될 수 있다. 이러한 징후의 특징은, 예를 들어, 암성 또는 비(非)-암성, 양성 또는 악성을 모두 포함한, 세포, 세포군 또는 조직(들)의 단일한 또는 다수의 국지적인 비정상적 증식일 수 있다.

약

본원에 사용된 바, 용어 "약"은 +/-10% 를 의미한다.

안티센스

본원에 사용된 바, 용어 "안티센스"는, 특정 DNA 또는 RNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "안티센스 가닥"은 "센스" 가닥에 상보적인 핵산 가닥과 관련하여 사용된다. 안티센스 분자는 상보 가닥의 합성을 가능하게 하는 바이러스 프로모터에 관심 유전자(들)를 역방향으로 결찰하여 합성하는 것을 포함하여, 임의의 방법으로 제조가능하다. 이렇게 전사된 가닥은 세포 내로 도입되면, 상기 세포에 의해 생성된 천연 서열과 결합하여 이중체를 형성한다. 이러한 이중체는 그 후 추가적인 전사 또는 번역을 차단한다. 이러한 방식으로, 돌연변이 표현형이 생성될 수 있다.

부착

탐침 및 고체 지지체와 관련하여 본원에 사용된 "부착" 또는 "고정화"는 상기 탐침 및 고체 지지체 간의 결합이 충분하여 결합, 세정, 분석, 및 제거의 조건들 하에서 안정함을 의미하는 것일 수 있다. 상기 결합은 공유 결합 또는 비(非)-공유 결합일 수 있다. 공유 결합은 상기 탐침 및 고체 지지체 간에 직접적으로 형성되거나 또는 가교제에 의해 또는 고체 지지체 또는 탐침 상에 또는 두 분자 모두 상에 특정 반응성 기를 포함시킴에 의해 형성될 수 있다. 비공유 결합은 정전기적, 친수성, 및 소수성 상호작용 중 하나 이상일 수 있다. 비공유 결합에는 분자, 예컨대 스트렙타비딘의 상기 지지체에의 공유적 부착 및 비오틴화 탐침의 스트렙타비딘에의 비공유 결합이 포함된다. 고정화도 또한 공유적 상호작용과 비공유적 상호작용의 조합을 포함할 수 있다.

생물학적 시료

본원에 사용된 "생물학적 시료"는 핵산을 포함하고 있는 생물학적 조직 또는 생체액의 시료를 의미한다. 이러한 시료로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 대상체로부터 분리한 조직 또는 유체가 포함된다. 생물학적 시료에는 또한 생검 및 부검 시료 등의 조직 절편, FFPE 시료, 조직학적 목적을 위해 채취한 동결 절편, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 대변, 누액, 점액, 털, 및 피부가 포함될 수 있다. 생물학적 시료에는 또한 동물 또는 환자 조직에서 유래한 1 차 및/또는 형질전환된 세포 배양물 및 체외이식편이 포함된다.

생물학적 시료는 또한 혈액, 혈액 분획물, 소변, 삼출물, 복수, 타액, 뇌척수액, 자궁경부 분비물, 질 분비물, 자궁내막 분비물, 위장관 분비물, 기관지 분비물, 객담, 세포주, 조직 시료, 세침 흡인 (fine needle aspiration; FNA) 의 세포 내용물 또는 유방으로부터의 분비물일 수도 있다. 생물학적 시료는 동물로부터 세포 시료를 절제해냄으로써 제공될 수 있으나, 또한 사전에 분리한 세포 (예컨대, 제 3 자에 의해, 또 다른 시점에, 및/또는 또 다른 목적을 위해 분리된 것) 를 사용하거나 또는 본원에 기술된 방법을 생체내에서 실시하여 제공될 수도 있다. 치료 또는 결과 이력이 있는 것 등의 문헌에의 기록이 있는 조직 또한 사용가능하다.

암

용어 "암"에 대해서, 침범의 조직병리학적 유형 또는 단계와 관계없이 모든 유형의 암성 증식물 또는 암유발 돌기 (oncogenic process), 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함시키고자 한다. 암의 예로서는 이들에 제한되는 것은 아니나, 하기를 포함하는 고형 종양 및 백혈병이 있다: 아푸도마 (apudoma), 분리종, 새열낭종, 악성 유암 증후군, 유암 심장병, 암종 (예컨대, 워커 (Walker), 기저 세포, 기저편평, 브라운-피어스 (Brown-Pearce), 유관, 에를리히 (Ehrlich) 종양, 비(非)-소세포 폐, 연맥 세포 (oat cell), 유두상, 세기관지, 기관지원성, 편평 세포, 및 이행 세포), 조직구 장애, 백혈병 (예컨대, B 세포, 혼합 세포, 무표지 세포 (null cell), T 세포, T-세포 만성, HTLV-II-관련, 급성 림프구성, 만성 림프구성, 비만 세포, 및 골수성), 악성 조직구증, 호지킨병 (Hodgkin disease), 면역증식성 소장 질환, 비(非)-호지킨 림프종, 형질세포종, 세망내피증, 흑색종, 연골모세포종, 연골종, 연골육종, 섬유종, 섬유육종, 거대세포 종양, 조직구종, 지방종, 지방육종, 중피종, 점액종, 점액육종, 골종, 골육종, 유잉 (Ewing) 육종, 윤활막종, 선섬유종, 선림프종, 암육종, 척삭종, 두개인두종, 미분화세포종, 과오종, 간엽종, 중신종, 근육종, 법랑아세포종, 백악종, 치아종, 기형종, 흉선종, 영양막 종양, 선암, 선종, 담관암, 진주종, 원주종, 낭선암, 낭선종, 과립막 세포 종양, 음양모세포종, 간세포암, 한선종, 도세포 종양, 라이디히 (Leydig) 세포 종양, 유두종, 세르톨리 (Sertoli) 세포 종양, 난포막세포 종양, 자궁근종, 평활근육종, 근육모세포종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 상의세포종, 신경절신경종, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경초종, 신경모세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경종, 부신경절종, 비크롬친화성 부신경절종, 혈관각화종, 호산구증가를 동반한 혈관림프증식증, 경화성 혈관종, 혈관종증, 사구맥관종, 혈관내피종, 혈관종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 림프관종, 림프관근종, 림프관육종, 송과체종, 암육종, 연골육종, 낭포육종 (cystosarcoma), 엽상종양 (phyllodes), 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 백혈육종, 지방육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 난소 암종, 횡문근육종, 육종 (예컨대, 유잉, 실험, 카포시 (Kaposi), 및 비만 세포), 신경섬유종증, 및 자궁경부 이형성증, 및 기타 세포가 불멸화 또는 형질전환된 상태.

분류

분류라는 용어는 개별 항목들을 항목들에 내재한 하나 이상의 특징 (속성 (trait), 변수, 특질 (character), 특성 (feature) 등으로 지칭함) 에 대한 정량적 정보에 기초하여 및 이전에 표지된 항목들의 통계적 모형 및/또는 훈련 집합에 기초하여 군 또는 부류 (class) 들로 배치하는 절차 및/또는 알고리즘을 지칭한다. "분류 트리(classification tree)"는 범주형 변수들을 부류들로 배치하는 결정 트리이다.

상보성

핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 "상보성" 또는 "상보적"이란, 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체들 간의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) (예컨대, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 형성을 의미하는 것일 수 있다. 완전한 상보성 또는 완전히 상보적이란 것은 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체들 간 100% 상보적인 염기쌍 형성을 의미하는 것일 수 있다.

Ct

Ct 신호는 증폭이 형광의 임계점 (증폭 임계점(cycle threshold)) 을 가로지르는 최초의 PCR 사이클을 나타낸다. 따라서, Ct 값이 낮은 것은 마이크로RNA 의 풍부성 또는 발현 수준이 높은 것을 나타낸다.

일부 구현예에서는 PCR Ct 신호를 정규화하여, 정규화된 Ct 가 발현 수준의 역의 상태로 있게 한다. 다른 구현예들에서는 PCR Ct 신호를 정규화한 후 역으로 하여, 낮은 정규화-역 Ct 가 마이크로RNA 의 풍부성 또는 발현 수준이 낮은 것을 나타내도록 한다.

데이터 처리 루틴 ( data processing routine )

본원에서 사용된 바, "데이터 처리 루틴"이란 획득된 데이터 (즉, 검정 또는 분석의 최종적 결과물) 의 생물학적 의의를 결정하는 소프트웨어에 내장될 수 있는 프로세스를 지칭한다. 예를 들어, 데이터 처리 루틴은 수집된 데이터를 기초로 기원 조직에 대한 결정을 내릴 수 있다. 본원의 시스템 및 방법에서, 데이터 처리 루틴은 또한 결정된 결과에 기초하여 데이터 수집 루틴을 제어할 수 있다. 상기 데이터 처리 루틴 및 데이터 수집 루틴은 통합되어 피드백을 제공하여 데이터 획득 작업을 가동시킬 수 있고, 따라서 검정에 기반한 판단 방법을 제공할 수 있다.

데이터 세트

본원에 사용된 바, 용어 "데이터 세트"는 상기 분석으로부터 수득한 수치들을 지칭한다. 이들 분석 관련 수치들은 피크 높이 및 곡선하면적 등의 수치일 수 있다.

데이터 구조

본원에서 사용된 바 용어 "데이터 구조"는, 하나 이상의 데이터 세트에 하나 이상의 수학적 조작을 적용하여 하나 이상의 새로운 데이터 세트를 수득하거나, 또는 둘 이상의 데이터 세트를 조작하여 상기 데이터에 대한 새로운 방식의 시각적 묘사를 제공하는 형태로 만드는, 둘 이상의 데이터 세트들의 조합을 지칭한다. 둘 이상의 데이터 세트를 조작하여 제작된 데이터 구조의 예는 계층적 군집일 것이다.

검출

"검출"은 시료 내에서 어떤 성분의 존재를 감지하는 것을 의미한다. 검출은 또한 성분의 부재를 감지하는 것을 의미한다. 검출은 또한 정량적으로든 또는 정성적으로든 성분의 수준을 측정하는 것을 의미한다.

차별적 발현

"차별적 발현"이란, 세포 및 조직 간 및 내에서 시간에 따른 및/또는 세포에 따른 유전자 발현 패턴에서의 정성적 또는 정량적 차이를 의미한다. 즉, 차별적으로 발현되는 유전자는, 예컨대, 정상 조직 대 질환 조직에서, 활성화 또는 불활성화를 포함하여, 정성적으로 발현이 변경된 것일 수 있다. 유전자는 특정 상태에서 또 다른 상태에 비해 발현이 개시 (turn on) 되거나 또는 중단 (turn off) 될 수 있어, 둘 이상의 상태의 비교를 가능하게 한다. 정성적으로 조절된 유전자는 일정 상태 또는 세포 유형 내에서 표준 기술로 검출가능할 수 있는 발현 패턴을 나타낼 수 있다. 일부 유전자들은 1 가지 상태 또는 세포 유형에서만 발현되고 둘 다에서는 아닐 수 있다. 다르게는, 발현의 차이는, 예컨대, 발현이 상향조절되어 전사물의 양이 증가하거나 또는 하향조절되어 전사물의 양이 감소되도록 조정되는 점 등에서 정량적인 것일 수 있다. 발현이 상이한 정도에 대해서는, 발현 어레이, 정량적 역전사효소 PCR, 노던 (northern) 분석, 실시간 PCR, 원위치 혼성화법 및 RNase 보호 등의 표준 특징분석 기술을 통해 정량하기에 충분히 많아야 한다는 것만이 요구된다.

발현 프로필

본원에서 사용된 "발현 프로필"은 게놈 발현 프로필, 예컨대, 마이크로RNA 의 발현 프로필을 의미하는 것일 수 있다. 프로필은 마이크로RNA, 표지된 마이크로RNA, 증폭된 마이크로RNA, cRNA, 등의 정량적 혼성화, 정량적 PCR, 정량화용 ELISA 등의, 핵산 서열의 수준을 측정하는 임의의 편리한 수단으로 생성시킬 수 있으며, 이를 이용하여 두 가지 시료 간의 차별적인 유전자 발현을 분석할 수 있다. 대상 또는 환자 종양 시료, 예컨대, 세포 또는 이의 집합물, 예컨대, 조직이 분석된다. 시료는 당업계에 공지된 바의 임의의 편리한 방법으로 채취한다. 관심 핵산 서열은 상기 제시한 핵산 서열을 비롯하여 암시성인 것으로 나타나는 핵산 서열이며, 이 때 발현 프로필에는 열거된 핵산 서열 중 5, 10, 20, 25, 50, 100 개 또는 전부를 포함한 그 이상에 대한 발현 데이터가 포함될 수 있다. 발현 프로필은 핵산의 수준 또는 풍부성을 측정한 것에 기초한 것일 수 있으며, 또는 이들의 측정치를 조합한 점수에 기초한 것일 수도 있다.

발현 비율

본원에서 사용된 "발현 비율"은 생물학적 시료 내의 해당 핵산들의 상대적 발현 수준을 검출하여 결정되는, 둘 이상의 핵산의 상대적 발현 수준을 지칭한다.

FDR

다수의 통계적 검정을 실시할 때, 예를 들어 다수의 데이터 특성 하의 두 군 간의 신호를 비교함에 있어서, 다른 방식으로는 통계적으로 유의한 것으로 간주되는 수준에 이를 수 있는 상기 군들 간의 무작위적 차이에 의해, 잘못된 양성의 결과를 수득할 가능성이 점점 높아진다. 이러한 오류적 발견율을 제한하기 위해서, 그 차이가 임계값 미만의 p-값 (양측 t-검정에 의한 것) 에 달하는 데이터 특성에 대해서만 통계적 유의성을 한정하는데, 상기 임계값은 실시된 검정의 수 및 이들 검정에서 수득된 p-값의 분포에 좌우된다.

절편

"절편"은 본원에서 핵산 또는 폴리펩티드의 비(非)-전장 일부를 나타내는 것으로 사용된다. 즉, 절편은 그 자체가 또한 각각 핵산 또는 폴리펩티드이다.

유전자

본원에서 사용된 "유전자"는 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 암호화 영역 및/또는 비(非)-번역 서열 (예컨대, 인트론, 5'- 및 3'-비번역 서열) 을 포함한 천연 (예컨대, 게놈) 또는 합성 유전자일 수 있다. 유전자의 암호화 영역은 아미노산 서열 또는 기능적 RNA, 예컨대 tRNA, rRNA, 촉매 RNA, siRNA, miRNA 또는 안티센스 RNA 를 암호화하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 유전자는 또한 상기 암호화 영역에 대응하는 mRNA 또는 cDNA (예컨대, 엑손 및 miRNA) 일 수 있는데, 이들에는 5'- 또는 3'-비번역 서열이 연결되어 있을 수 있다. 유전자는 또한 암호화 영역의 일부 또는 전부 및/또는 그에 연결된 5'- 또는 3'-비번역 서열을 포함한 시험관내에서 생성된 증폭된 핵산 분자일 수 있다.

홈 결합자 / 소홈 결합자 ( minor groove binder ; MGB )

"홈 결합자" 및/또는 "소홈 결합자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있는 것으로, 이중가닥 DNA 의 소홈 (minor groove) 에, 전형적으로는 서열-특이적 방식으로 맞춤인 소형 분자를 지칭한다. 소홈 결합자는 초승달과 유사한 형상을 취하여, 이중 나선의 소홈에 (종종 물을 대체하면서) 넉넉히 들어갈 수 있는 길고 평평한 분자일 수 있다. 소홈 결합 분자는 전형적으로는 비틀림이 자유로운 결합들로 연결된 수 개의 방향족 고리, 예컨대, 푸란, 벤젠, 또는 피롤 고리들을 포함할 수 있다. 소홈 결합자는, 항생제, 예컨대 네트롭신 (netropsin), 디스타마이신 (distamycin), 베레닐 (berenil), 펜타미딘 (pentamidine) 및 기타 방향족 디아미딘류, Hoechst 33258, SN 6999, 크로모마이신 (chromomycin) 및 미트라마이신 (mithramycin) 등의 아우레올산 (aureolic) 항-종양 약물, CC-1065, 디히드로시클로피롤로인돌 트리펩티드 (DPI₃), 1,2-디히드로-(3H)-피롤로[3,2-e]인돌-7-카르복실레이트 (CDPI₃), 및 문헌 [Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 제 2 판, Blackburn and Gait, eds., Oxford University Press, 1996], 및 PCT 출원 공개공보 제 WO 03/078450 호 (이들의 내용은 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 것들을 포함한, 관련 화합물 및 유사체일 수 있다. 소홈 결합자는 프라이머, 탐침, 혼성화 표지 보체, 또는 이들의 조합물의 성분일 수 있다. 소홈 결합자는 그들이 부착된 프라이머 또는 탐침의 T_m 을 증가시켜, 상기 프라이머 또는 탐침이 더 높은 온도에서 효과적으로 혼성화할 수 있게 하는 것일 수 있다.

동일성

본원에서 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용된 "동일한" 또는 "동일성"이란 상기 서열들이 지정된 영역에 걸쳐서 동일한 잔기를 지정된 백분율로 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 백분율은 상기 두 서열을 최적으로 정렬시키고, 상기 두 서열을 상기 지정된 영역에 걸쳐 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 나타나는 위치의 수를 측정하여 정합 위치들의 수를 산출하고, 정합 위치들의 수를 상기 지정된 영역 내의 위치들의 전체 수로 나누고, 그 결과를 100 으로 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산할 수 있다. 상기 두 서열의 길이가 상이하거나 또는 상기 정렬이 하나 이상의 길이가 맞지 않은 말단 (staggered end) 을 생성하여, 지정된 비교 영역에 단 하나의 서열만 존재하는 경우, 상기 단일 서열의 잔기들은 상기 계산의 분모에는 포함시키나 분자에는 포함시키지 않는다. DNA 및 RNA 를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U) 은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수작업으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0 등의 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.

원위치 검출

본원에서 사용된 "원위치 검출"이란 본래의 위치에서 (여기서는 생검 등의 조직 시료에서를 의미) 발현 또는 발현 수준을 검출하는 것을 의미한다.

표지

본원에서 사용된 "표지"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 기타 물리적 수단으로 검출가능한 조성물을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지로는 ³²P, 형광 염료, 전자고밀도 시약, 효소 (예컨대, ELISA 에 통상 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌 (digoxigenin), 또는 합텐 (hapten) 및 기타 검출가능하게 될 수 있는 물질을 들 수 있다. 표지는 핵산 및 단백질의 임의의 위치에 편입될 수 있다.

로지스틱 회귀분석

로지스틱 회귀분석은 일반화 선형 모형으로 불리는 일 범주의 통계적 모형의 일부이다. 로지스틱 회귀분석은 연속형, 이산형, 이분형, 또는 이들 중 임의의 것의 혼합일 수 있는 변수들의 집합으로부터 군 소속 여부 (group membership) 등의 이산형 결과를 예측할 수 있게 한다. 종속 또는 반응 변수는 이분형일 수 있는데, 예를 들어, 두 가지의 가능한 암 유형 중 하나일 수 있다. 로지스틱 회귀분석은 (로그-공간(log-space)에서의) 상이한 발현 수준들의 선형 결합으로서 승산비, 즉 첫번째 군에 속할 확률 (P) 대 두번째 군에 속할 확률 (1-P) 의 비의 자연 로그를 만들어낸다. P 가 0.5 또는 50% 를 초과하는 경우 사건 또는 시료는 첫번째 유형으로 분류된다고 규정함으로써 로지스틱 회귀분석 산출물을 분류기로 사용할 수 있다. 다르게는, 1D 또는 2D 임계값 분류기 (threshold classifier) 등의 다른 상황에서는 상기 계산된 확률 P 를 변수로 사용할 수 있다.

1D/2D 임계값 분류기

본원에 사용된 "1D/2D 임계값 분류기"는 사건 또는 암 시료 등의 시료를 두 가지 유형의 암 등의 두 가지 가능한 유형 중 하나로 분류하는 알고리즘을 의미하는 것일 수 있다. 1D 임계값 분류기에 있어서, 결정은 하나의 변수 및 하나의 선결 임계값을 기초로 이루어지며; 시료는 상기 변수가 상기 임계값을 초과하는 경우 1 가지 부류로 및 상기 변수가 상기 임계값 미만인 경우 나머지 부류로 배정된다. 2D 임계값 분류기는 두 가지 변수들의 값에 기초하여 두 가지 유형 중 하나로 분류하는 알고리즘이다. 임계값은 첫번째 변수의 함수 (보통 연속 함수 또는 심지어 단조 함수) 로 계산될 수 있다; 그 후 1D 임계값 분류기와 유사하게, 두번째 변수를 상기 계산된 임계치와 비교하여 결정이 내려진다.

핵산

본원에 사용된 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 서로 공유적으로 결합된 적어도 2 개의 뉴클레오티드를 의미하는 것일 수 있다. 단일 가닥에 대한 서술은 또한 그의 상보 가닥의 서열을 규정한다. 따라서, 핵산에는 또한 서술된 단일 가닥의 상보 가닥도 포함된다. 핵산의 다수의 변형체가 주어진 핵산과 동일한 목적으로 사용될 수도 있다. 따라서, 핵산에는 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 그의 상보체도 포함된다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 탐침을 제공한다. 따라서, 핵산에는 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 탐침이 포함된다.

핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열의 일부를 모두 포함하고 있을 수도 있다. 상기 핵산은 DNA (게놈성 및 cDNA 모두 포함), RNA, 또는 혼성체일 수 있는데, 이 때 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합물, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함한 염기들의 조합물을 포함할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합적 방법으로 수득가능하다.

핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 연결을 포함하지만, 적어도 하나의 상이한 결합, 예컨대, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결 및 펩티드 핵산 골격 및 연결을 가질 수 있는 핵산 유사체도 포함될 수 있다. 기타 핵산 유사체로는 U.S.특허 제 5,235,033 호 및 제 5,034,506 호 (이들은 참조로 포함됨) 에 기재된 것들을 비롯하여, 양성 골격; 비(非)-이온성 골격, 및 비(非)-리보오스 골격을 가진 것들이 있다. 하나 이상의 비(非)-천연 발생 또는 변형 뉴클레오티드를 포함한 핵산 또한 핵산의 한 가지 정의에 포함된다. 변형 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 핵산 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 위치할 수 있다. 대표적인 뉴클레오티드 유사체의 예는 당- 또는 골격-변형 리보뉴클레오티드들로부터 선택되는 것일 수 있다. 그러나, 또한 뉴클레오티드 염기(nucleobase)-변형 리보뉴클레오티드, 즉 천연 발생 뉴클레오티드 염기 대신, 5-위치가 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예컨대 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8-위치가 변형된 아데노신 및 구아노신, 예컨대 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예컨대 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예컨대 N6-메틸 아데노신 등의 비(非)-천연 발생 뉴클레오티드 염기를 포함한 리보뉴클레오티드도 적합함을 유의해야 한다. 2'-OH-기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ 또는 CN (이 때, R 은 C₁-C₆ 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I 임) 로부터 선택되는 기로 대체될 수 있다. 변형 뉴클레오티드에는 또한, 문헌 [Krutzfeldt 등, Nature 438:685-689 (2005)], [Soutschek 등, Nature 432:173- 178 (2004)], 및 U.S. 특허 공개공보 제 20050107325 호 (이들은 참조로 본원에 포함됨) 에 기재된 바와 같은, 히드록시프롤리놀 연결 등을 통해 콜레스테롤과 접합된 뉴클레오티드도 포함된다. 부가적인 변형 뉴클레오티드 및 핵산은 U.S. 특허 공개공보 제 20050182005 호 (이는 참조로 본원에 포함됨) 에 기재되어 있다. 리보오스-포스페이트 골격의 변형은 다양한 이유로 행해질 수 있는데, 예컨대, 생리적 환경에서의 상기 분자들의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해, 세포막을 통한 확산을 증강시키기 위해, 또는 바이오칩 상에서의 탐침으로서 등이다. 골격 변형은 또한, 예컨대 세포의 무자비한 내포작용 (endocytic) 환경 등에서의, 분해에 대한 저항성을 증강시킬 수 있다. 골격 변형은 또한 간 및 신장 등에서의 간세포에 의한 핵산 제거를 감소시킬 수 있다. 천연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수도 있으며; 다르게는, 상이한 핵산 유사체들의 혼합물, 및 천연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물도 제조될 수 있다.

탐침

본원에서 사용된 "탐침"은 하나 이상의 유형의 화학적 결합을 통해, 보통은 상보적 염기쌍 형성을 통해, 보통 수소결합 형성을 통해, 상보 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것일 수 있다. 탐침은 혼성화 조건의 엄격성에 따라 해당 탐침 서열과 완전히 상보적이지는 않은 표적 서열에 결합할 수 있다. 본원에 기술된 단일 가닥 핵산과 표적 서열 간의 혼성화를 방해하는 염기쌍 부정합이 임의 수로 존재할 수 있다. 그러나, 돌연변이의 수가 너무 많아 가장 낮은 엄격성의 혼성화 조건 하에서도 혼성화가 일어날 수 없는 경우, 상기 서열은 상보적인 표적 서열이 아니다. 탐침은 단일 가닥일 수도 있고, 또는 부분 단일 및 부분 이중 가닥일 수 있다. 탐침의 가닥성질 (strandedness) 은 표적 서열의 구조, 조성 및 특성에 좌우된다. 탐침은 직접적으로 표지될 수도 있고 또는 스트렙타비딘 복합체가 후에 결합할 수 있는 비오틴 등으로 간접적으로 표지될 수도 있다.

프로모터

본원에서 사용된 "프로모터"는 세포 내에서 핵산의 발현을 가능하게 하거나, 활성화 또는 증강시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미하는 것일 수 있다. 프로모터는 발현을 추가로 증강시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변화시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수도 있다. 프로모터는 또한 원위 (distal) 인핸서 또는 억제자 (repressor) 요소를 포함할 수 있는데, 이는 전사의 시작 부위로부터 수천 염기쌍 정도로 떨어져 위치해 있을 수 있다. 프로모터는 바이러스, 세균, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함한 원천으로부터 유래한 것일 수 있다. 프로모터는 유전자 성분의 발현을, 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 따라 또는 발현이 일어나는 발달 단계에 따라, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제 등의 외부의 자극에 반응하여 차별적으로 또는 항상적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예로서는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동유전자(operator)-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터가 있다.

참조 발현 프로필

본원에서 사용된 바, "참조 발현 프로필"이라는 어구는 폐암 환자에 대한 검출을 결정하기 위해 측정된 값과 비교되는 기준 발현 값을 지칭한다. 참조 발현 프로필은 핵산의 풍부성에 기초한 것일 수도 있고, 또는 이들의 측정치를 조합한 점수에 기초한 것일 수도 있다.

선별 마커

본원에 사용된 "선별 마커"란 숙주 세포에 표현형을 부여하는 것으로서 숙주 세포에서 유전적 구축물로 트랜스펙션 또는 형질전환된 세포의 동정 및/또는 선별을 용이하게 하도록 발현되는 임의의 유전자를 의미하는 것일 수 있다. 선별 마커의 대표적인 예로서는 암피실린-저항성 유전자 (Amp^r), 테트라사이클린-저항성 유전자 (Tc^r), 세균 카나마이신-저항성 유전자 (Kan^r), 제오신 (zeocin) 저항성 유전자, 항생물질 아우레오바시딘 A (aureobasidin A) 에 대한 저항성을 부여하는 AURI-C 유전자, 포스피노트리신-저항성 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 (nptII), 하이그로마이신-저항성 유전자, 베타-글루쿠로니다아제 (GUS) 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT) 유전자, 녹색 형광 단백질 (GFP)-암호화 유전자 및 루시페라제 유전자가 있다.

민감도

본원에서 사용되는 "민감도"란 이진 분류 검정이 상황을 얼마나 잘 올바르게 식별하는지에 대한, 예를 들어 암을 두 가지 가능한 유형 중 올바른 유형으로 얼마나 빈번히 올바르게 분류하는지에 대한 통계적 측정치를 의미하는 것일 수 있다. A 부류에 대한 민감도는, 일정 절대 기준 또는 황금 기준으로 측정되는 바, "A" 부류에 속하는 사건 중 상기 검정에 의해 "A" 부류에 속하는 것으로 결정된 사건의 비율이다.

특이도

본원에서 사용되는 "특이도"란 이진 분류 검정이 상황을 얼마나 잘 올바르게 식별하는지에 대한, 예를 들어 암을 두 가지 가능한 유형 중 올바른 유형으로 얼마나 빈번히 올바르게 분류하는지에 대한 통계적 측정치를 의미하는 것일 수 있다. A 부류에 대한 특이도는, 일정 절대 기준 또는 황금 기준으로 측정되는 바, "A 가 아닌" 부류에 속하는 사건 중 상기 검정에 의해 "A 가 아닌" 부류에 속하는 것으로 결정된 사건의 비율이다.

엄격한 혼성화 조건

본원에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건"이란, 첫번째 핵산 서열 (예컨대, 탐침) 이, 예컨대 핵산의 복합 혼합물 등에서, 두번째 핵산 서열 (예컨대, 표적) 에 혼성화되는 조건을 의미하는 것일 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상황마다 상이할 것이다. 엄격한 조건은 규정된 이온 세기 pH 에서 특정 서열에 대한 열 융점 (T_m) 의 약 5-10℃ 아래로 선택될 수 있다. T_m 은 평형 상태에서 표적에 상보적인 탐침의 50% 가 상기 표적 서열에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 세기, pH, 및 핵산 농도 하에서의 것) 일 수 있다(표적 서열이 과잉으로 존재할 때, T_m 에서, 평형 상태에서 탐침의 50% 가 점유됨). 엄격한 조건은, pH 7.0 내지 8.3 에서 염 농도가 약 1.0 M 나트륨 이온 미만, 예컨대 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 기타 염) 이고, 온도가 짧은 탐침 (예컨대, 약 10-50 개 뉴클레오티드) 에 있어서는 적어도 약 30℃ 및 긴 탐침 (예컨대, 약 50 개 뉴클레오티드 초과) 에 있어서는 적어도 약 6O℃ 인 조건일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드 등의 탈안정화제의 첨가에 의해 성립될 수도 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 있어서, 양성의 신호는 바탕 혼성화의 적어도 2 내지 10 배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건으로는 하기를 들 수 있다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃ 에서 인큐베이션, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃ 에서 인큐베이션, 0.2x SSC 중에 세정, 및 65℃ 에서 0.1% SDS.

실질적으로 상보적인

본원에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"이란 첫번째 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 두번째 서열의 상보물에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것, 또는 상기 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 것을 의미할 수 있다.

실질적으로 동일한

본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한"이란 첫번째 및 두번째 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것을 의미할 수 있거나, 또는 핵산에 있어서는, 첫번째 서열이 두번째 서열의 상보물에 실질적으로 상보적인 경우에 해당할 수 있다.

대상

본원에 사용된 바, 용어 "대상"은 포유동물을 지칭하는데, 여기에는 인간 및 기타 포유동물이 모두 포함된다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 인간 대상에 적용된다.

표적

본원에서 사용된 "표적"이란 엄격한 혼성화 조건 하에서 하나 이상의 탐침에 의해 결합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것일 수 있다.

표적 핵산

본원에서 사용된 "표적 핵산"이란 또 다른 핵산에 의해 결합될 수 있는 핵산 또는 그의 변형체를 의미한다. 표적 핵산은 DNA 서열일 수 있다. 표적 핵산은 RNA 일 수도 있다. 표적 핵산은 mRNA, tRNA, shRNA, siRNA 또는 Piwi-상호작용 RNA, 또는 pri-miRNA, pre-miRNA, miRNA, 또는 항-miRNA 를 포함할 수도 있다.

표적 핵산은 표적 miRNA 결합 부위 또는 그의 변형체를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 탐침이 상기 표적 핵산에 결합할 수 있다. 표적 결합 부위는 5-100 또는 10-60 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 결합 부위는 총 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30-40, 40-50, 50-60, 61, 62 또는 63 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 부위 서열은 U.S. 특허 출원 제 11/384,049 호, 제 11/418,870 호 또는 제 11/429,720 호 (이들의 내용은 본원에 포함됨) 에 개시된 표적 miRNA 결합 부위의 서열 중 적어도 5 개의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.

임계값 발현 프로필

본원에서 사용된, "임계값 발현 프로필"이라는 어구는, 암을 분류하기 위해 측정값들과 비교되는 기준 발현 프로필을 지칭한다.

조직 시료

본원에서 사용된 바, 조직 시료는 관련 의학 업계의 통상의 지식을 가진 자들에 익히 공지된 방법을 이용하여 조직 생검으로부터 수득된 조직이다. 본원에서 사용된 "암성인 것으로 의심되는"이라는 어구는 의학 업계의 통상의 지식을 가진 자가 암성 세포를 포함한 것으로 확신하는 암 조직 시료를 의미한다. 생검으로부터 시료를 수득하는 방법으로는, 육안에 의한 덩어리 배분 (gross apportioning of a mass), 미세절제, 레이저 기반 미세절제, 또는 기타 당업계에 공지된 세포 분리 방법이 있다.

변형체

핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 "변형체"는 (i) 기준 뉴클레오티드 서열의 일부; (ii) 기준 뉴클레오티드 서열의 상보체 또는 그의 일부; (iii) 기준 핵산 또는 그의 상보체에 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에서 상기 기준 핵산, 그의 상보체, 또는 그와 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.

벡터

본원에서 사용된 "벡터"는 복제원점이 포함된 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 세균 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체 외부 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터 중 하나일 수 있다.

야생형

본원에 사용된, 용어 "야생형" 서열은 암호화, 비(非)-암호화 또는 경계면 (interface) 서열로서 상기 서열의 본연의 또는 정상적인 기능을 수행하는 대립성 형질의 서열인 것을 지칭한다. 야생형 서열에는, 다수의 대립성 형질의 동족 (cognate) 서열이 포함되는데, 예를 들어, 야생형 서열의 다수의 대립유전자는 암호화 서열이 암호화하는 단백질 서열에 침묵의 또는 보존적인 변화를 암호화하는 것일 수 있다.

실시예

본 발명의 일부 구현예를 더욱 상세히 나타내기 위해 하기 실시예를 제시한다. 이들을 그러나 어떠한 방식으로든 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.

실시예 1: 중피종과 다른 종양을 구별하기 위한 마이크로어레이 분석

1a) 시료

종양 시료는 다수의 원천으로부터 수득하였다. 모든 시료에 대해서 각 기관의 IRB 또는 IRB-동급의 지침에 따라 임상시험심사위원회의 승인을 받았다. 포르말린 고정된 파라핀 포매 (FFPE) 시료에 있어서, 초기 진단, 조직학적 유형, 등급 및 종양 백분율은 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색된 슬라이드 상에서 병리학자에 의해 측정되었으며, 시료의 첫번째 및/또는 마지막 절편에 대해 수행되었다. 임상 기록을 검토하여 오분류의 사례가 있는지 조사하였다.

하기 원천들에서 유래한 파라핀 포매 (FFPE) 조직으로부터 RNA 를 추출하였다: 폐 흉막 중피종 (7 개 시료), 폐 선암 (15 개 시료), 유방 선암 (14 개 시료), 자궁경부 선암 (3 개 시료), 결장 선암 (20 개 시료), 식도 선암 (2 개 시료), 식도-위 선암 (12 개 시료), 췌장 선암 (4 개 시료), 전립선 선암 (3 개 시료), 소장 선암 (1 개 시료), 원발병소 불명의 선암 (11 개 시료), 결장 종양 (20 개 시료), 신장 종양 (19 개 시료), 간 종양 (6 개 시료), 췌장 종양 (8 개 시료), 위 종양 (6 개 시료), 폐 유암종 종양 (7 개 시료), 폐 신경내분비 종양 (1 개 시료), 폐 신경내분비- 대세포암 (1 개 시료), 폐 비(非)-소세포암 (1 개 시료), 폐 비(非)-소 - 대세포암 (5 개 시료), 폐 종양 (2 개 시료), 폐 소세포암 (8 개 시료) 및 폐 비(非)-소 - 편평상피세포암종 (9 개 시료).

1b) 어레이 플랫폼

688 개 miRNA [Sanger 데이터베이스, 버전 9.1 (miRBase: 마이크로RNA 서열, 표적 및 유전자 명명. Griffiths- Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ.NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-D144) 및 추가적인 Rosetta Genomics 에 의해 인증 및 예측된 miR 들] 를 대표하는 DNA 올리고뉴클레오티드 탐침을 프린팅하여 맞춤형 마이크로어레이를 제조하였다. 각 탐침은 상기 탐침을 코팅된 유리 슬라이드에 커플링하기 위해 사용되는 아민기에 더하여, miRNA 의 상보체 서열의 3' 말단에 22-nt 이하의 연결자를 지닌다. 20 μM 의 각 탐침을 2X SSC + 0.0035% SDS 에 용해시키고, Genomic Solutions® BioRobotics MicroGrid II 를 MicroGrid 제조업자의 지시사항에 따라 이용하여 Schott Nexterion® Slide E 코팅된 마이크로어레이 슬라이드 상에 각각 3 개씩 점적(spotting)하였다. 상이한 miRNA 들의 센스 서열을 이용하여 64 개의 음성 대조 탐침을 설계하였다. 하기 2 개 군의 양성 대조 탐침을 설계하여 어레이에 혼성화시켰다: (1) 표지 효율을 확인하기 위해 표지 전에 RNA 에 합성 스파이크 (spikes) 소형 RNA 를 부가하였고, (2) RNA 품질을 확인하기 위해 풍부한 소형 RNA (예컨대 소형 핵 RNA (small nuclear RNA) (U43, U49, U24, Z30, U6, U48, U44), 5.8s 및 5s 리보솜 RNA) 에 대한 탐침들을 상기 어레이 상에 점적하였다. 상기 슬라이드를 50 mM 에탄올아민, 1M Tris (pH 9.0) 및 0.1% SDS 를 함유한 용액 중에서 50℃ 에서 20 분간 차단한 후, 물로 완전히 헹구고, 원심 탈수하였다.

1c) Cv -염료 표지

RNA-연결자 p-rCrU-Cy- 염료 (Thomson 등, 2004, Nat Methods 1, 47-53) (Dharmacon) 를 Cy3 또는 Cy5 를 이용하여 3'-말단에 결찰하여 15 μg 의 총 RNA 를 표지하였다. 당해 표지 반응에는 총 RNA, 스파이크 (20-0.1 fmoles), RNA-연결자-염료 500ng, 15% DMSO, 1x 리가아제 완충액 및 T4 RNA 리가아제 (NEB) 20 유닛이 포함되었고, 반응은 4℃ 에서 1hr 동안, 이어서 37℃ 에서 1hr 진행시켰다. 표지된 RNA 를 3x 혼성화 완충액 (Ambion) 과 혼합하고, 95℃ 가 되도록 3 분간 가열한 후, 어레이의 상단에 부가하였다. 슬라이드를 12-16hr 혼성화한 후, 1xSSC 및 0.2% SDS 로 2 회 세정하고, 0.1xSSC 로 최종 세정하였다.

상기 어레이를 Agilent Microarray Scanner Bundle G2565BA (100% 능력발휘시 해상도: 10 μm) 를 이용하여 스캔하였다. 데이터는 SpotReader 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

1d) RNA 추출

하기 프로토콜에 따라 FFPE 시료로부터 총 RNA 를 추출하였다:

1-2 mg 조직에 1 ml 자일렌 (Biolab) 을 첨가하고, 57℃ 에서 5 분간 인큐베이션하고, 10,000g 에서 2 분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 1 ml 에탄올 (100%) (Biolab) 을 첨가하였다. 10 분간 10,000g 에서 원심분리한 후, 상청액을 폐기하고, 세정 절차를 반복하였다. 10-15 분간 공기 건조 후, 500 μl 완충액 B (NaCl 10mM, Tris pH 7.6, 500 mM, EDTA 2OmM, SDS 1 %) 및 5 μl 프로테이나제 K (50mg/ml) (Sigma) 를 첨가하였다. 45℃ 에서 16 h 동안 인큐베이션 후, 100℃ 에서 7 분간 프로테이나제 K 의 불활성화를 수행하였다. 산 페놀 클로로포름 (1:1) (Sigma) 을 이용하여 추출하고, 4℃ 에서 최대 속도로 10 분간 원심분리한 후, 상부 층을 새로운 튜브로 옮기고, 3 배 부피의 100% 에탄올, 0.1 배 부피의 NaOAc (BioLab) 및 8 μl 글리코겐 (Ambion) 을 첨가하고, -20℃ 에서 하룻밤 방치하였다. 4℃ 에서 최대 속도로 40 분간 원심분리하고, 1 ml 에탄올 (85%) 로 세정하고, 건조시킨 후, RNA 를 45μl DDW 에 재현탁하였다.

RNA 농도를 시험하고, DNase Turbo (Ambion) 를 그에 맞추어 첨가하였다(1μl DNase/10 μg RNA). 실온에서 30 분간 인큐베이션하고, 산 페놀 클로로포름으로 추출한 후, RNA 를 45 μl DDW 에 재현탁하였다. RNA 농도를 다시 시험한 후, DNase Turbo (Ambion) 를 그에 맞추어 첨가하였다(1μl DNase/10 μg RNA). 실온에서 30 분간 인큐베이션하고, 산 페놀 클로로포름으로 추출한 후, RNA 를 20 μl DDW 에 재현탁하였다.

1e) 신호 계산 및 정규화

초기 데이터 세트는 모든 시료에 대해 다수 탐침에 대해 측정된 신호들로 이루어졌다. 3 개씩의 점적들을 조합하여 신뢰할 만한 점적들의 대수 평균을 취하여 각 탐침에 대한 하나의 신호를 생성하였다. 상기 분석에 있어서, 신호는 공지의 또는 입증된 인간 마이크로RNA 들의 발현 수준을 측정하도록 설계된 탐침에 대한 것만 사용하였다. 모든 데이터는 로그 변환되었고(자연로그 기반), 분석은 로그-스페이스에서 수행되었다. 정규화를 위한 참조 데이터 벡터 R 은 모든 시료를 대상으로 한 각 탐침에 대한 발현 수준 중앙값을 취하여 계산되었다. 각 시료 데이터 벡터 S 에 있어서, 시료 데이터와 참조 데이터가 가장 잘 대응되게 하는, 즉 R

F(S) 가 되도록 하는 2차 다항식 F 를 찾아내었다. 동떨어진 데이터 점들 ("이상값(outlier)") 은 상기 다항식 F 를 근사 (fitting) 하는데 사용하지 않았다. 시료 중의 각 탐침 (벡터 S 중의 원소 S _i ) 에 대해, 초기값 S _i 로부터 이를 다항식 함수 F 를 이용하여, M _i =F(S _i ) 가 되도록 변환하여 정규화 값 (로그-스페이스로의 것) M _i 를 계산한다.

1f) 로지스틱 회귀분석

로지스틱 회귀분석 모형의 목적은 여러 마이크로RNA 들의 발현 수준 등의 여러 특성들을 이용하여, 2 가지 가능한 군 중 하나에 속할 확률을 부여하는 것이다. 로지스틱 회귀분석은 (로그-스페이스로의) 상이한 발현 수준들의 선형 결합으로서 승산비, 즉 첫번째 군 (P) 에 속할 확률 대 두번째 군 (1-P) 에 속할 확률의 비의 자연 로그를 만들어낸다. 로지스틱 회귀분석은 하기를 가정한다:

[이 때,

는 편의 (bias) 이고, M _i 는 분류에 사용된 i-번째 마이크로RNA 의 발현 수준 (정규화된 것, 로그-스페이스에서) 이고,

은 이의 대응되는 계수이다].

여기서 P 를 P _TH 로 표시되는 임계값과 비교하는 1D 임계값 분류기를 사용하여 로지스틱 모형의 확률 산출값 (P) 을 이진 결정값으로 변환하는데, 즉 P > P _TH 이면 시료는 "첫번째 군"에 속하고, 또 그 반대도 성립한다. P _TH 는 분류 오류의 횟수가 최소화되도록 선택된다.

실시예 1.1: 특정 마이크로 RNA 들은 중피종과 선암을 구별할 수 있다

폐 흉막 중피종 (7 개 시료) 대 선암 (85 개 시료) 의 어레이 결과에 대한 분석이 도 1 에 나타나 있다. 당해 결과에서는, 표 1 에 나타난 바와 같이 여러 miR 들의 발현 패턴에서 유의미한 차이가 있다는 것이 나타났다.

miR 명칭: miRBase 레지스트리 명칭 (릴리스 9.1).

MID : 성숙 마이크로RNA 의 서열번호.

HID : 마이크로RNA 헤어핀 전구체 (Pre-마이크로RNA) 의 서열번호.

p-값: 두 시료 군 간의 독립표본 양측 t-검정의 결과.

상기 miR 들을 사용하여 중피종과 선암 종양 (원발성 또는 전이성) 을 구별할 수 있다. 상기 분류는 단순 임계값 (1 또는 2 차원 임계값), 로지스틱 회귀분석 모형 또는 기타 임의의 분류기를 이용하여 행해질 수 있다.

마이크로어레이에 의해 검출된, hsa-miR-200a (서열번호 5), hsa-miR-200b (서열번호 6), hsa-miR-200c (서열번호 11), 및 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 4 가지 miR 에 기초한 로지스틱 회귀분석을 이용한 예시적인 분류기가 도 2 에 나타나 있다. 폐 흉막 중피종 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 98% 이다. 상기 분류기의 p-값은 2.74e-24 이다.

실시예 1.2: 특정 마이크로 RNA 들은 중피종과 결장, 신장, 간, 췌장 또는 위로부터의 종양을 구별할 수 있다.

중피종 (7 개 시료) 대 결장, 신장, 간, 췌장 또는 위로부터의 종양 (59 개 시료) 의 어레이들의 결과에 대한 분석이 도 3 에 제시되어 있다. 당해 결과에 의하면 표 2 에 나타난 바와 같이, 여러 miR 들의 발현 패턴에서의 유의미한 차이가 나타났다.

miR 명칭: miRBase 레지스트리 명칭 (릴리스 9.1).

MID : 성숙 마이크로RNA 의 서열번호.

HID : 마이크로RNA 헤어핀 전구체 (Pre-마이크로RNA) 의 서열번호.

p-값: 두 시료 군 간의 독립표본 양측 t-검정 결과.

상기 miR 들을 사용하여 중피종과 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로부터의 종양 (원발성 또는 전이성) 을 구별할 수 있다. 상기 분류는 단순 임계값 (1 또는 2 차원 임계값), 로지스틱 회귀분석 모형 또는 기타 임의의 분류기를 이용하여 행해질 수 있다.

마이크로어레이에 의해 검출된, hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-194 (서열번호 4) 의 2 가지 miR 에 기초한 로지스틱 회귀분석을 이용한 예시적인 분류기가 도 4 에 나타나 있다.

hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-194 (서열번호 4) 에 의한 중피종 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 97% 이다. 상기 분류기의 p-값은 6.4186e-008 이다.

실시예 1.3: 특정 마이크로 RNA 들은 중피종과 상이한 조직학적 유형들로부터의 폐 종양을 구별할 수 있다

중피종 (7 개 시료) 대 폐 종양 (49 개 시료) 의 어레이들의 결과에 대한 분석이 도 5 에 제시되어 있다. 당해 결과에 의하면 표 3 에 나타난 바와 같이, 여러 miR 들의 발현 패턴에서의 유의미한 차이가 나타났다.

상기 miR 들을 사용하여 중피종과 폐 종양 (원발성 또는 전이성) 을 구별할 수 있다. 상기 분류는 단순 임계값 (1 또는 2 차원 임계값), 로지스틱 회귀분석 모형 또는 기타 임의의 분류기를 이용하여 행해질 수 있다.

마이크로어레이에 의해 검출된, hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-141 (서열번호 1) 의 2 가지 miR 에 기초한 로지스틱 회귀분석을 이용한 예시적인 분류기가 도 6 에 나타나 있다.

hsa-miR-200c 및 hsa-miR-141 에 의한 중피종 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 98% 이다. 상기 분류기의 p-값은 2.5278e-007 이다.

마이크로어레이에 의해 검출된, hsa-miR-193a (서열번호 3) 및 hsa-miR-200a (서열번호 5) 의 2 가지 miR 에 기초한 로지스틱 회귀분석을 이용한 또 다른 예시적인 분류기가 도 7 에 나타나 있다.

hsa-miR-193a 및 hsa-miR-200a 에 의한 중피종 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 96% 이다. 상기 분류기의 p-값은 3.7521e-007 이다.

miR 명칭: miRBase 레지스트리 명칭 (릴리스 9.1).

MID : 성숙 마이크로RNA 의 서열번호.

HID : 마이크로RNA 헤어핀 전구체 (Pre-마이크로RNA) 의 서열번호.

p-값: 시료들 간의 불일치 t-검정의 결과.

실시예 2: 중피종 및 상이한 조직학적 유형들로부터의 비(非)-중피종 종양을 구별하기 위한 qRT - PCR 분석법

2a) 시료

종양 시료는 다수의 원천으로부터 수득하였다. 모든 시료에 대해서 각 기관의 IRB 또는 IRB-동급의 지침에 따라 임상시험심사위원회의 승인을 받았다. 포르말린 고정된, 파라핀 포매 (FFPE) 시료에 있어서, 초기 진단, 조직학적 유형, 등급 및 종양 백분율은 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색된 슬라이드 상에서 병리학자에 의해 측정되었으며, 시료의 첫번째 및/또는 마지막 절편에 대해 수행되었다. 임상 기록을 검토하여 오분류의 사례가 있는지 조사하였다.

하기 원천들에서 유래한 79 개의 파라핀 포매 (FFPE) 조직 시료들로부터 RNA 를 추출하였다: 폐-흉막에서의 중피종 원발성 종양 시료 20 개 (2 개는 육종성, 12 개는 상피성이고, 6 개는 공지된 아류형이 없는 것임), 비(非)-소세포 폐 선암 원발성 시료 20 개, 신장 시료 10 개 [9 개는 전이성이고(1 개는 폐 흉막으로의 전이성 및 9 개는 폐로의 전이성) 및 1 개는 원발성 종양임], 췌장 원발성 종양 5 개, 결장의 폐로의 전이성 종양 5 개, 간 원발성 시료 5 개, 방광 원발성 시료 5 개, 유방의 폐로의 전이성 종양 5 개, 난소 시료 4 개 (1 개는 폐-흉막으로의 전이성, 3 개는 원발성 종양임).

2b) PCR 절차

하기에 따라 혼합물을 조제하였다:

상기 혼합물 6μl 를 4μl 의 적절한 RNA 시료 (또는 RNA 부재의 초순수 대조군) 에 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

폴리(T) 연결기 (adapter)

혼합물은 하기에 따라 조제하였다:

상기 혼합물 3μl 를 적절히 표지된 PCR 튜브에 첨가하였다. 폴리-아데닐화 RNA 및 RNA 부재 대조군으로부터의 5μl 를 상기 3 μl 혼합물이 담긴 PCR 튜브들로 옮겼다.

상기 튜브들을 PCR 기기 내로 삽입하고, 하기 어닐링 (annealing) 프로그램에 따라 어닐링 공정을 실시하였다:

단계 1: 85℃ 2 분간

단계 2: 70℃ → 25℃ - 20 초간 각 사이클에서 1℃ 씩 감소.

역전사 혼합물은 하기에 따라 조제하였다:

1.5μl Recombinant Rnasin 및 1μl superscript II RT (시료당) 를 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 믹스 12.5 μl 를 어닐링된 PolyA RNA 가 담긴 각 PCR 튜브 및 RNA 부재 대조군에 즉시 첨가하였다.

상기 튜브들을 즉시 열순환 반응기 (thermocycler) 에 넣고, 하기 역전사 프로그램을 실행하였다:

단계 1: 37℃ 5 분간

단계 2: 45℃ 5 분간

단계 3: 단계 1-2 를 5 회 반복

단계 4: 4℃ 에서 프로그램 종료

프라이머-탐침 믹스를 조제하였다. 각 튜브에서 10 μM Fwd 프라이머를 동일 RNA 에 대해 특이적인 동일 부피의 5 μM 의 대응 MGB 탐침과 혼합하였다.

상기 Fwd 프라이머 및 MGB 탐침의 서열은 표 4 에 나타나 있다.

cDNA 를 최종 농도 0.5ng/μl 로 희석하였다. PCR 혼합물을 하기에 따라 조제하였다:

상기 PCR 믹스 119 μl (RNA 부재 대조군 및 cDNA 부재 대조군용) 또는 289 μl 를 적절하게 표지된 마이크로튜브에 각각 넣었다. 17μl cDNA (0.5ng/μl) 를 상기 믹스가 담긴 마이크로튜브에 각각 넣었다. 상기 믹스 18μl 씩을 반복 피펫 (repeater pipette) 을 이용하여 각 웰에 분배하여 PCR 플레이트를 준비하였다. 다채널 피펫터 (multi-channel pipettor) 를 이용하여 각 웰에 2μl 프라이머 탐침 혼합물을 첨가하였다. 상기 플레이트들을 PCR 기기에 넣고, 하기 프로그램을 실행하였다:

1 기, 반복횟수=1

단계 1: 95.0 에서 10 분간 유지 (MM:SS), 온도변화율 (Ramp Rate) = 100

2 기, 반복횟수=40

단계 1: 95.0 에서 0:15 동안 유지 (MM:SS), 온도변화율 = 100

단계 2: 60.0 에서 1:00 동안 유지 (MM:SS), 온도변화율 = 100

표준 7500 모드

시료 양 (μL): 20.0

데이터 수집: 2 기, 단계 2

2c) qRT - PCR 로 검출된 발현 수준의 처리

목적 핵산의 발현 수준을 상기 기술한 바와 같은 정량적 RT-PCR 로 검출하였다. PCR Ct 신호는 증폭이 처음으로 형광의 임계값을 가로지르는 사이클을 나타낸다. Ct 값이 낮은 것은 마이크로RNA 의 풍부성 또는 발현 수준이 높은 것을 나타낸다.

음성 대조군 웰들의 Ct 는 확인되지 않았다.

상기 결과들은 하기 개설된 것들 중 하나에 의해 처리되었다:

A . 3 회 반복의 가중 Ct 를 3 개-조(triplicate)의 중앙값으로 계산하였다. 32 Ct 이하의 중앙값에 대해서는, 1 Ct 까지의 이상값이 허용된다. 32 초과 및 37 미만의 Ct 중앙값에 대해서는, 1.5 Ct 까지의 이상값이 허용된다. 37 Ct 이상의 중앙값에 대해서는, 2 Ct 까지의 이상값이 허용된다. 3 개-조가 상기 정의에 따른 2 개의 이상값을 갖는 경우, 폐기하였다.

B . 3 회 반복의 가중 Ct 를 하기와 같이 계산하였다: 모든 반복치가 1 Ct 차이 내에 있는 경우(즉 최소 및 최대 Ct 간의 차이가 1 미만인 경우를 의미함), 이들의 평균을 하기와 같이 계산하였다:

Ct최대-Ct최소 ≤ 1 -> 가중 Ct=( Ct최대+Ct중앙값+Ct최소)/3

이상값 Ct 각각이 중간값으로부터 1 Ct 미만 (또는 1 Ct) 으로 차이나는 경우 이들의 평균을 계산하였다.

Ct최대-Ct중앙값 ≤ 1 및 Ct중앙값-Ct최소 ≤ 1 -> 가중 Ct=(Ct최대+Ct중앙값+Ct최소)/3. 이상값 Ct 중 하나가 중앙값 Ct 로부터 1 Ct 를 초과하여 차이가 나는 경우 - 이를 가중 Ct 에 사용하지 않는다.

상기 데이터에 대한 해석은 하기 기준에 따라 이루어졌다:

U6 는 20 내지 32 의 가중 Ct 를 가져야 한다. 그렇지 않다면, 실험은 실패한 것이다. 실시예 2 전체에 걸쳐서, 각 시료에 대한 각 마이크로RNA 의 가중 Ct 로부터 해당 시료에 대한 U6 의 가중 Ct 를 제함으로써 각 시료에 대해 PCR 신호 (Ct) 를 정규화하였다. 따라서, 상기 정규화된 Ct 는, 낮은 정규화된 Ct 값이 높은 마이크로RNA 의 풍부성 또는 발현 수준을 나타내도록, 발현 수준과 역의 관계에 있게 된다.

실시예 2.1: 특정 마이크로 RNA 들은 폐 흉막 중피종과 폐 선암을 구별할 수 있다

PCR 에 의해 검출된, hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 2 가지 miR 에 기초한 선형 결합을 이용한 예시적인 분류기가 도 8 에 나타나 있다. 당해 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 100% 이다.

실시예 2.2: 특정 마이크로 RNA 들은 폐 흉막 중피종과 간 종양을 구별할 수 있다

PCR 에 의해 검출된, hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122a (서열번호 23) 의 2 가지 miR 에 기초한 선형 결합을 이용한 예시적인 분류기가 도 9 에 나타나 있다. 당해 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 100% 이다.

실시예 2.3: 특정 마이크로 RNA 들은 폐 흉막 중피종과 결장 또는 췌장 중 하나로부터의 종양을 구별할 수 있다

PCR 에 의해 검출된, hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 2 가지 miR 에 기초한 선형 결합을 이용한 예시적인 분류기가 도 10 에 나타나 있다. 당해 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 100% 이다.

실시예 2.4: 특정 마이크로 RNA 들은 폐 흉막 중피종과 방광 종양을 구별할 수 있다

PCR 에 의해 검출된, hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 2 가지 miR 에 기초한 선형 결합을 이용한 예시적인 분류기가 도 11 에 나타나 있다. 당해 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 100% 이다.

실시예 2.5: 특정 마이크로 RNA 들은 폐 흉막 중피종과 난소 및 유방 종양을 구별할 수 있다

PCR 에 의해 검출된, hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 2 가지 miR 에 기초한 선형 결합을 이용한 예시적인 분류기가 도 12 에 나타나 있다. 당해 검출의 민감도는 100% 이며, 신호의 특이도는 100% 이다.

실시예 2.6: 특정 마이크로 RNA 들은 폐 흉막 중피종과 신장 종양을 구별할 수 있다

PCR 에 의해 검출된, hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122a (서열번호 23) 의 2 가지 miR 에 기초한 선형 결합을 이용한 예시적인 분류기가 도 13 에 나타나 있다. 당해 검출의 민감도는 90% 이며, 신호의 특이도는 80% 이고, 4 개의 오류가 존재한다.

실시예 2.7: 중피종 및 상이한 조직학적 유형들로부터의 비(非)-중피종 종양을 구별하기 위한 qRT - PCR 분석법의 수립

2.7.1) 분석법 #1

hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 및 U6 (서열번호 41) 의 발현 수준을 상기 실시예 2b 에 기술된 PCR 절차에 따라 측정하였다.

상기 계산된 가중 Ct 를 이용하여, 상기 3 개의 miR 각각에 대하여 계산된 가중 Ct 각각에서 U6 의 가중 Ct 를 제함으로써 상기 분석에 대한 최종 점수를 결정하였다.

NormCt(miR-192) = (가중Ct(miR-192)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-193a-3p) = 가중Ct(miR-193a-3p)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-200c) = 가중Ct(miR-200c)-가중Ct(U6);

상기 qRT-PCR 분석법의 결과에 대한 분석은 하기 2 단계로 수행된다:

단계 1: hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 정규화된 Ct (NormCt(hsa-miR-192)) 를 표 5 에 나타낸 바와 같이 임계값과 비교하였다.

낮은 점수의 시료는 비(非)-중피종으로 결정되었다;

나머지 시료들은 계속해서 단계 2 로 진행되었다.

단계 2: hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct 들의 선형 결합을 계산하고, 이를 표 5 에 나타낸 바와 같이 임계값과 비교하였다.

상기 계산치 및 분석법의 결과는 표 5 에 나타나 있다.

hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 에 의한 중피종 검출의 민감도는 95% (19/20) 이고, 특이도는 93% (55/59) 이다. 비(非)-중피종 암 각각에 대한 검출의 정확도는 표 6 에 나타나 있다:

2.7.1) 분석법 #2

hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-122 (서열번호 24) hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 및 U6 (서열번호 41) 의 발현 수준을 상기 실시예 2b 에 기술된 PCR 절차에 따라 측정하였다.

상기 계산된 가중 Ct 를 이용하여, 상기 4 개의 miR 각각에 대하여 계산된 가중 Ct 각각에서 U6 의 가중 Ct 를 제함으로써 상기 분석법에 있어서의 최종 점수를 결정하였다:

NormCt(miR-192) = (가중Ct(miR-192)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-122) = 가중Ct(miR-122)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-193a-3p) = 가중Ct(miR-193a-3p)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-200c) = 가중Ct(miR-200c)-가중Ct(U6);

상기 qRT-PCR 분석법의 결과에 대한 분석은 하기 2 단계로 수행된다:

단계 1: hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122 (서열번호 24) 의 정규화된 Ct (NormCt(hsa-miR-192), NormCt(hsa-miR-122)) 를 표 7 에 나타낸 바와 같이 임계값과 비교하였다.

낮은 점수의 시료는 비(非)-중피종으로 결정되었다;

나머지 시료들은 계속해서 단계 2 로 진행되었다.

단계 2: hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct 들의 선형 결합을 계산하고, 이를 표 7 에 나타낸 바와 같이 임계값과 비교하였다.

상기 계산치 및 분석법의 결과는 표 7 에 나타나 있다.

도 14 는 79 개 시료에 대한, hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-122a (서열번호 23) 를 이용한 분석법 #2 의 분류기의 제 1 단계를 나타낸다. 상기 2 가지 miRNA 의 조합에 대해 점수가 낮게 부여된 시료들은 "비(非)-중피종"으로 확인되었다. 남아있는 시료들에 대해서는 계속해서 다음 단계로 진행하였다. 상기 분류기의 제 2 단계는 도 15 에 나타나 있다.

hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-122 (서열번호 24), hsa-miR-200c (서열번호 11) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 에 의한 중피종 검출의 민감도는 95% (19/20) 이고, 특이도는 93% (55/59) 이다. 비(非)-중피종 암 각각에 대한 검출의 정확도는 상기 표 6 에 나타나 있다:

2.7.2) 분석법 #3

hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-122 (서열번호 24), hsa-miR-141 (서열번호 1), hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 및 U6 (서열번호 41) 의 발현 수준을 상기 실시예 2b 에 기술된 PCR 절차에 따라 측정하였다.

상기 계산된 가중 Ct 를 이용하여, 상기 4 개의 miR 각각에 대하여 계산된 가중 Ct 각각에서 U6 의 가중 Ct 를 제함으로써 상기 분석에 대한 최종 점수를 결정하였다:

NormCt(miR-192) = (가중Ct(miR-192)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-122) = 가중Ct(miR-122)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-141) = 가중Ct(miR-141)-가중Ct(U6);

NormCt(miR-193a-3p) = 가중Ct(miR-193a-3p)-가중Ct(U6);

상기 qRT-PCR 분석법의 결과에 대한 분석은 하기 2 단계로 수행된다:

단계 I: hsa-miR-192 및 hsa-miR-122 의 정규화된 평균 Ct 를 하기와 같이 더하였다: 정규화된 가중 Ct(miR-192) + 정규화된 가중 Ct(miR-122).

낮은 점수의 시료는 비(非)-중피종으로 결정되었다;

높은 점수의 시료에 대해서는 표 8 에 따라 분석하였다:

단계 II: 정규화된 가중 Ct(miR-141) 에서 정규화된 가중 Ct(miR-193a-3p) 를 제하였다: 정규화된 가중 Ct(miR-141) - 정규화된 가중 Ct(miR-193a-3p).

낮은 점수의 시료는 비(非)-중피종으로 결정되었다;

높은 점수의 시료는 표 9 에 따라 중피종으로 결정되었다:

본 분석법의 분류기의 제 1 및 제 2 단계들은 각각 도 16 및 17 에 추가로 나타나 있다.

hsa-miR-192 (서열번호 2), hsa-miR-122 (서열번호 24), hsa-miR-141 (서열번호 1) 및 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 에 의한 중피종 검출의 민감도는 95% (19/20) 이고, 특이도는 98% (58/59) 이다. 비(非)-중피종 암 각각에 대한 검출의 정확도는 표 10 에 나타나 있다:

실시예 3: 마이크로 RNA 는 중피종 ( MPM ) 을 선암 및 신세포암 ( RCC ) 으로부터 식별하게 하는 분자 마커로 기능한다

폐 흉막으로부터의 MPM 시료 7 개, RCC 시료 16 개, 및 결장 (n=17), 폐 (n=15), 난소 (n=10), 식도 (n=11), 자궁내막 (n=9), 위 (n=6), 췌장 (n=6), 유방 (n=4) 및 전립선 (n=3) 으로부터의 선암 81 개를 포함한 104 개의 문헌에 기록된 포르말린 고정된, 파라핀 포매 (FFPE) 암 시료들에 대해, 마이크로RNA 마이크로어레이를 이용하여 프로필 분석하였다.

표 11 에는, 중피종 및 선암 또는 RCC 간에 차별적으로 발현된 마이크로RNA 에 있어서 악성 흉막 중피종 (MPM), 선암, 및 RCC 시료들에서의 정규화된 형광 중앙값이 제시되어 있다. 0.2 의 벤자미니-호치버그 (Benjamini-Hochberg) 오류발견률을 이용하여 차별적으로 발현된 마이크로RNA 들을 규명하였는데, 그 결과 p-값 컷오프 (cutoff) 가 각각 0.05 및 0.04 이었다. 두 가지 비교 각각에 있어서, p-값 (양측 독립표본 t-검정), 발현 중앙값의 배수 변화 (중앙값에 의해 결정되는 바, 상향조절 또는 하향조절 중 하나), 및 각 마이크로RNA 의 분류 잠재력을 시사하는, 수용자 작용 특성 (Receiver Operating Characteristic; ROC) 곡선 아래의 면적인 AUC 에 대한 값들이 나타나 있다. 마이크로RNA 는 상기 두 가지 비교의 AUC 의 합계 값의 감소에 의해 분류된다.

중피종 시료와 선암 시료 간, 및 중피종 시료와 RCC 시료 간 마이크로RNA 발현을 비교한 것이, 각각 도 18A 및 18B 에 제시되어 있다.

Hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 은 선암 및 RCC 둘 다에 비해 중피종에서 유의미하게 과발현된 유일한 마이크로RNA 였다. hsa-miR-200 계열은 선암 시료에서 강하게 과발현되었는데, hsa-miR-200c (서열번호 11) 의 신호가 가장 강하였다. RCC 에서는 Hsa-miR-192 (서열번호 2) 및 hsa-miR-194 (서열번호 4) 발현이 가장 높았는데, hsa-miR-192 (서열번호 2) 에 대한 신호가 다소 더 강하였다. 이와 함께, 이들 마이크로RNA 들은 연구된 종양 군 각각에서 특이적 발현을 갖는 패널을 포함한다(도 18C).

qRT-PCR 플랫폼을 이용하여, MPM 시료 22 개 (시료 중 7 개는 마이크로어레이 세트로부터 중복된 것이고 15 개는 새로운 시료임), 신세포암 4 개 (2 개의 중복된 시료 포함), 및 폐 (n=25), 유방 (n=4), 방광 (n=2), 난소 (n=4), 결장 (n=2) 및 췌장 (n=2) 의 선암 39 개 (이들 중 5 개는 중복된 것임) 를 포함한 FFPE 종양 시료에서 hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-193a-3p (서열번호 10), 및 hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 발현 수준을 측정하여, 이들 마이크로RNA 의 발현을 확인하였다. 각 시료에서 U6 snRNA (서열번호 41) 의 발현 수준을 측정하여, 정규화에 사용하였다. 각 시료에 대한 각 마이크로RNA 의 평균 Ct 에서 해당 시료에 대한 U6 의 평균 Ct 를 제하고, 모든 시료에 대한 상기 U6 의 평균 Ct 를 다시 더하여, 각 시료에 대한 PCR Ct 신호를 정규화하였다. 그런 다음 임의로 선택된 40 이라는 값에서 상기 정규화된 값을 제함으로써 상기 신호를 역으로 하였다. 따라서, 정규화-역 Ct 의 값이 낮은 것은 마이크로RNA 의 풍부성 또는 발현 수준이 낮은 것을 나타낸다. 상기 qRT-PCR 플랫폼을 이용하여 부가적인 독립된 시료들을 측정하였을 때, 상기 마이크로RNA 들의 발현 수준은 동일한 패턴을 유지하였는데(도 18D), 이는 상기 발현의 차이가 확고히 측정될 수 있는 이들 조직들의 일반적인 특성임을 시사한다.

명료한 분류 규칙 및 상기 마이크로RNA 들의 발현 수준의 임계값을 정의함으로써 선암, RCC 또는 HCC (간세포암) 으로부터 중피종을 차별적으로 진단하기 위한 정량적 진단 분석법이 개발되었다. 상기 qRT-PCR 플랫폼을 이용하여, 각 시료에 대해 hsa-miR-200c (서열번호 11), hsa-miR-193a-3p (서열번호 10), hsa-miR-192 (서열번호 2), 및 hsa-miR-122 (서열번호 24), 뿐만 아니라 정규화용의 U6 (서열번호 41) snRNA 의 발현 수준을 측정하였다[3 회씩]. 분류 규칙 및 임계값은 MPM 시료 20 개 (이전의 세트와 중복되는 12 개 시료 포함), RCC 시료 10 개 (중복된 시료 4 개 포함), HCC 시료 5 개, 및 폐 (n=20), 방광 (n=5), 결장 (n=5), 췌장 (n=5), 유방 (n=5), 및 난소 (n=4) 의 선암 44 개 (이들 중 16 개는 중복된 것임) 로 이루어진 79 개 시료의 세트를 이용하여 정련되었다. hsa-miR-192 (서열번호 2) 의 발현 수준은 HCC 시료 또는 결장 및 췌장 조직의 선암 시료로부터 중피종 시료를 용이하게 구별할 수 있게 하였으며, 한편 RCC 시료는 발현 수준의 분포가 보다 넓었다(도 19A). Hsa-miR-122 (서열번호 24) 는 HCC 시료에서 정말 매우 강하게 과발현되었다(도 19A). 선암에서 과발현된 hsa-miR-200c (서열번호 11), 및 중피종에서 과발현된 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 조합은 상기 두 군에서 정확히 구별적이었으며, 이 때 RCC 는 보다 넓은 신호 분포를 나타내었다(도 19B).

이들 발현 측정값을 이용하여, 주어진 시료가 중피종 시료인지를 결정하는 단순한 분류 규칙을 정의하였다. hsa-miR-192 (서열번호 24) 의 발현 (정규화된 Ct) 이 6.5 (도 19A 에서 수직 실선) 미만이고, hsa-miR-200c (서열번호 11) 의 발현 + 1.5 (정규화된 Ct 단위) 가 hsa-miR-193a-3p (서열번호 10) 의 정규화된 Ct 의 1.5 배 (도 19B 에서 실선의 대각선) 미만이면, 상기 시료는 중피종으로 식별된다; 그렇지 않다면, RCC, HCC 또는 선암 중 하나인 또 다른 유형의 종양으로 식별된다. 그래프로 보자면, 시료의 발현 값이 도 19A 에서 실선의 왼쪽에, 그리고 도 19B 에서 상기 대각선의 위쪽에 존재한다면 상기 시료는 중피종인 것으로 식별된다. 확실성이 보다 낮은 영역으로는, qRT-PCR 분석법의 재현성을 반영하고, 훈련 집합에 대해 정확한 수행을 실시하면서, 훈련 집합에는 나타나지 않았을 수 있는 추가적인 생물학적 변이를 고려하여, 이들 결정 임계값의 양측의 1.5 정규화 Ct 들의 한계 (도 19 에서 실선에 평행한 점선들) 가 선택되었다. 특이도가 상이한 세 가지 마이크로RNA 들의 발현을 조합한 상기 결정 규칙은, 훈련 집합에 대한 전체적인 정확도가 94% 에 달하였다. 표 12 에 나타난 바와 같이, 시료의 91% 는 높은 신뢰도로 분류되었고, 이 중 94% 는 올바르게 분류되었다. RCC 는 발현 수준의 분포가 다른 것들보다 넓음으로 인해 정확도가 가장 낮았으나, 상기 조합 결정 기준에 의해 10 개 시료 중 7 개가 정확히 식별되었으며, 이들 중 5 개는 정확도가 높았다.

중피종에 대한 구별적 진단에서 이들 마이크로RNA 들의 중요성 및 유용성은 상이한 시료 집합 및 플랫폼들에서 증명되었다. 상기 선택된 결정 규칙 및 결정 임계값의 정확도를 확인하기 위해, 이들 임계값을 이용하여 초기의 발견 단계들에서 사용된 시료뿐 아니라 새로운 시료를 포함한 상기 훈련 집합에 포함되지 않은 시료들을 분류하였다. 훈련 집합을 이용하여 분류 규칙을 정의한 후, 동일 프로토콜을 이용하여 검정 집합에서 상기 마이크로RNA 들의 발현을 측정하였는데(도 19C 및 19D), 상기 집합에는 중피종 시료 12 개, RCC 시료 8 개, HCC 시료 5 개, 및 폐 (n=15), 방광 (n=9), 난소 (n=6), 결장 (n=5), 유방 (n=4), 및 췌장 (n=3) 의 선암 42 개가 포함되었다. 검정 집합의 67 개 시료 중, 44 개는 독립적 시료들이고, 23 개 시료 (중피종 9 개, RCC 3 개 및 선암 11 개) 는 더 이른 발견 단계로부터 중복된 것이었으나(도 18), 이들은 결정 규칙 또는 임계값을 정련함에 있어서는 사용되지 않았다. 상기 사전 정의된 분류 규칙을 이용하여, 각 시료를 하기 4 가지 범주 중 하나로 배정하였다: "높은 신뢰도의 중피종"; "낮은 신뢰도의 중피종"; "낮은 신뢰도의 비(非)-중피종"; 또는 "높은 신뢰도의 비(非)-중피종". 표 12 에 나타난 바와 같이, 상기 분류 규칙에 의해 67 개 검정 시료 중 66 개 (98.5%) 가 올바르게 식별되었으며, 이들 중 57 개는 높은 신뢰도로 분류되었다. 44 개의 새로운 검정 시료 중에서는, 43 개가 올바르게 분류되었고, 이들 중 37 개는 높은 신뢰도로 분류되었는데, 그 결과 중피종 식별에 있어서 민감도는 100% 이었고, 특이도는 98% 이었다.

상기 결과는, 3 가지 마이크로RNA 들의 발현 수준을 이용한 마이크로RNA-기반 분석법이 악성 흉막 중피종 (MPM) 을 정확히 진단할 수 있고, 이를 흉막을 비롯한 다른 상피성 악성 종양으로부터 매우 높은 민감도 및 특이도로 구별할 수 있다는 것을 보여준다. 당해 분석법은 실시하기가 간단하며, 재현성에 있어서 고도로 신뢰할 만하며, 적어도 상기 암을 진단하기 위해 병리학자들이 이용하는 현재 이용가능한 수단들에 대한 유력한 부가 수단이다. 분류에 있어서 적은 수의 마이크로RNA 가 필요하다는 점, 이들 마이크로RNA 의 조직 특이성이 높다는 점, 문헌에 기록된 파라핀 포매된 고정된 조직으로부터 측정이 용이하다는 점에서 이들은 상기 질병에 대한 신뢰할 만하고 강력한 바이오마커로서 매우 매력적인 후보가 된다. 체액 및 혈청 중에 이들이 보존되어 있다는 최근의 증거 또한 이들이 관련 흉막 삼출에서의 중피종에 대한 조기의 정확한 진단에 및 일반적인 중피종의 조기 검출에 앞으로 사용되리라는 것을 시사하는 것일 수 있다.

실시예 4: 편평상피암종과 선암을 구별하는 마이크로어레이 분석법

4a) 시료

새로이-동결된 시료 및 FFPE 시료를 포함한, 62 개의 NSCLC 편평 세포 폐 암종 시료 및 60 개의 NSCLC 폐 선암 시료를 여러 원천으로부터 입수하였다.

대표적인 블록들의 조직을 절편화하여 1.5 ml 마이크로원심분리기 튜브에 넣고(10 마이크로미터 절편 5 개), 각 블록으로부터 일련의 헤마톡실린 및 에오신-염색된 슬라이드를 수득하여, 절편화시의 종양의 양을 평가하였다. 모든 시료를 익명화하여, 검증 분석법 및 분석을 실시하는 조사자에 대해 맹검처리하였다.

FFPE 조직들을 자일렌을 이용하여 탈파라핀화하고, 에탄올 중에 세정하고, 프로테이나제 K 로 분해(digestion)하였다. 산 페놀:클로로포름, 이어서 에탄올 침전 및 DNAse 분해를 이용하여 RNA 를 추출하였다. 동결된 조직으로부터는, miRvana 마이크로RNA 단리 키트 (Ambion) 를 이용하여 총 RNA 를 추출하였다.

4b) 마이크로어레이

하기와 같이 맞춤 마이크로RNA 마이크로어레이를 제작하였다: 마이크로RNA 들을 대표하는 ~650 개 DNA 올리고뉴클레오티드 탐침을 코팅된 마이크로어레이 슬라이드 (Nexterion® Slide E, Schott, Mainz, Germany) 상에 각각 3 회씩 점적하였다. RNA-연결자, p-rCrU-Cy/염료 (Dharmacon, Lafayette, CO; Cy3 또는 Cy5) 를 총 RNA 의 3' 말단에 결찰하여 3-5 μg 의 총 RNA 를 표지하였다. 슬라이드들을 상기 표지된 RNA 와 함께 42℃ 에서 12-16 hr 동안 인큐베이션한 후, 2 회 세정하였다. 어레이들을 10 μm 의 해상도로 스캐닝하고, SpotReader 소프트웨어 (Niles Scientific, Portola Valley, CA) 를 이용하여 화상들을 분석하였다. 마이크로어레이 점적들을 수합하고, 신호들을 정규화하였다.

4c) 마이크로어레이 데이터 분석 및 통계

두 군 중 적어도 하나 (편평상피세포암 시료 또는 선암 시료) 에서 정규화 형광 신호 중앙값이 300 초과인 것을 마이크로어레이에서 신뢰할 만한 발현인 것으로 간주하였다. 발현 수준에 있어서의 유의차는 양측 독립표본 t-검정으로 평가하였다. 본페로니 방법을 이용하여 p-값 임계값을 0.05/141=0.00035 로 조정하여 다중 가설 검정을 통제하였다.

4d) 분석법

편평상피세포암 시료 대 선암 시료의 어레이들의 결과가 도 20 에 나타나 있다.

hsa-miR-205 (서열번호 49) 의 발현은 선암 시료에서보다 편평상피세포암 시료에서 유의하게 더 높다. 이와 대조적으로, hsa-miR-29b (서열번호 44), hsa-miR-30b (서열번호 47) 및 hsa-miR-375 (서열번호 8) 의 발현은 선암 시료에서보다 편평상피세포암 시료에서 유의하게 더 낮다. 따라서, 이들 miR 들은 도 21 에 나타난 바와 같이 편평상피세포암과 선암 시료를 구별짓는 도구로 소용될 수 있다.

실시예 5: 편평 및 비(非)- 편평세포성 조직을 가진 비소세포 폐암 ( NSCLC ) 시료들을 구별하기 위한 qRT - PCR 분석법

5a) 시료

새로이 동결된 시료 및 FFPE 시료를 포함한 47 개 시료 (이 중, 19 개는 편평 세포 폐 암종이고, 15 개는 선암이고, 13 개는 대세포 NSCLC 임) 를 여러 원천으로부터 입수하였다.

대표적인 블록들의 조직을 절편화하여 1.5 ml 마이크로원심분리기 튜브에 넣고(10 마이크로미터 절편 5 개), 각 블록으로부터 일련의 헤마톡실린 및 에오신-염색된 슬라이드를 수득하여, 절편화시의 종양의 양을 평가하였다. 모든 시료를 익명화하여, 검증 분석법 및 분석을 실시하는 조사자에 대해 맹검처리하였다.

FFPE 조직들을 자일렌을 이용하여 탈파라핀화하고, 에탄올 중에 세정하고, 프로테이나제 K 로 분해하였다. 산 페놀:클로로포름, 이어서 에탄올 침전 및 DNAse 분해를 이용하여 RNA 를 추출하였다. 동결된 조직으로부터는, miRvana 마이크로RNA 단리 키트 (Ambion) 를 이용하여 총 RNA 를 추출하였다.

5b) PCR 프라이머 및 탐침

당해 PCR 에 사용된 Fwd 프라이머 및 MGB 탐침의 서열은 하기 나타낸 바와 같다:

miR-375 (서열번호 8) 및 miR-205 (서열번호 49) 의 발현 수준은 hsa-miR-21 (서열번호 55) 및 U6 (서열번호 41) 로 정규화되었다.

5c) 분석법

miR-375 (서열번호 8) 의 발현 수준은 편평 시료에서보다 비(非)-편평 시료에서 더 높은 반면, miR-205 (서열번호 49) 의 발현 수준은 비(非)-편평 시료에서보다 편평 시료에서 더 높다.

hsa-miR-375 (서열번호 8) 의 발현 수준에서 miR-205 (서열번호 49) 의 발현 수준을 제하면 도 21 에 나타난 바와 같이 편평 및 비(非)-편평세포성 조직을 가진 NSCLC 시료들이 구별된다.

결정 규칙은 하기와 같다:

민감도 100%; 특이도 100%; 높은 신뢰도로 분류된 시료의 백분율은 92.6 이다.

전기의 특정 구현예들에 대한 기술은 본 발명의 전반적인 특성들을 상세히 드러내어, 다른 사람들이 과도한 실험없이 및 유개념을 벗어나지 않으면서 현재의 지식을 적용하여 상기와 같은 특정 구현예들을 다양한 응용을 위해 용이하게 수정 및/또는 개조할 수 있도록 할 것이며, 따라서, 상기와 같은 개조 및 수정은 개시된 구현예들의 취지 및 범위 내에 속하는 것으로 이해되어야 하며 그런 것을 의도한다. 본 발명이 특정 구현예들과 함께 기술되었으나, 다수의 대안물, 변경물 및 변형물이 당업자들에 자명할 것임은 분명하다. 따라서, 첨부된 청구항들의 넓은 범위 및 취지에 속하는 상기와 같은 모든 대안물, 변경물 및 변형물을 포함시키고자 한다.

본 발명의 취지 및 범위 내의 다양한 변화 및 수정은 상기 상세한 설명을 통해 당업자들에 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 특정 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내고 있으나, 이들은 오로지 예시로써 제시된 것임을 이해해야 한다.

<110> ROSETTA GENOMICS LTD <120> DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF SPECIFIC CANCERS Nitzan Rosenfeld Shai Rosenwald Hila Benjamin <130> 116_PCT <160> 87 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uaacacuguc ugguaaagau gg 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacuggccua caaaguccca g 21 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uguaacagca acuccaugug ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 uaauacugcc ugguaaugau gac 23 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uaauacugcc ggguaaugau gg 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uuuguucguu cggcucgcgu ga 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uaauacuguc ugguaaaacc gu 22 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 aacuggccua caaaguccca gu 22 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uaauacugcc ugguaaugau ga 22 <210> 13 <211> 95 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 cggccggccc uggguccauc uuccaguaca guguuggaug gucuaauugu gaagcuccua 60 acacugucug guaaagaugg cucccgggug gguuc 95 <210> 14 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 gccgagaccg agugcacagg gcucugaccu augaauugac agccagugcu cucgucuccc 60 cucuggcugc caauuccaua ggucacaggu auguucgccu caaugccagc 110 <210> 15 <211> 88 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 cgaggauggg agcugagggc ugggucuuug cgggcgagau gagggugucg gaucaacugg 60 ccuacaaagu cccaguucuc ggcccccg 88 <210> 16 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 augguguuau caaguguaac agcaacucca uguggacugu guaccaauuu ccaguggaga 60 ugcuguuacu uuugaugguu accaa 85 <210> 17 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 ugguucccgc ccccuguaac agcaacucca uguggaagug cccacugguu ccaguggggc 60 ugcuguuauc uggggcgagg gccag 85 <210> 18 <211> 90 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ccgggccccu gugagcaucu uaccggacag ugcuggauuu cccagcuuga cucuaacacu 60 gucugguaac gauguucaaa ggugacccgc 90 <210> 19 <211> 95 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 ccagcucggg cagccguggc caucuuacug ggcagcauug gauggaguca ggucucuaau 60 acugccuggu aaugaugacg gcggagcccu gcacg 95 <210> 20 <211> 68 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 cccucgucuu acccagcagu guuugggugc gguugggagu cucuaauacu gccggguaau 60 gauggagg 68 <210> 21 <211> 64 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 ccccgcgacg agccccucgc acaaaccgga ccugagcguu uuguucguuc ggcucgcgug 60 aggc 64 <210> 22 <211> 83 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 cgccggccga ugggcgucuu accagacaug guuagaccug gcccucuguc uaauacuguc 60 ugguaaaacc guccauccgc ugc 83 <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 uggaguguga caaugguguu ugu 23 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uggaguguga caaugguguu u 21 <210> 25 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 ccuuagcaga gcuguggagu gugacaaugg uguuuguguc uaaacuauca aacgccauua 60 ucacacuaaa uagcuacugc uaggc 85 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 uaacacuguc ugguaaagau ggc 23 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 cagtcatttg ggtggagtgt gacaatgg 28 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 ccgttttttt tttttaaaca cca 23 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 cagtcatttg ggctgaccta tgaattga 28 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 cgtttttttt ttttggctgt ca 22 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cagtcatttg ggaactggcc tacaaagt 28 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 ccgttttttt tttttactgg gac 23 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 cagtcatttg ggtaacactg tctggtaa 28 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 ccgttttttt tttttgccat ctt 23 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 cagtcatttg ggtggagtgt gacaatgg 28 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ccgttttttt tttttacaaa cac 23 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 cagtcatttg ggtaatactg ccgggtaa 28 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 cgtttttttt ttttccatca tt 22 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 gcaaggatga cacgcaaatt c 21 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 aatatggaac gcttcacg 18 <210> 41 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 gugaagcguu ccauauu 17 <210> 42 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (46) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> v is a, c or g <400> 42 gcgagcacag aattaatacg actcactatc ggtttttttt ttttvn 46 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cgtttttttt ttttccatct tt 22 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 45 <211> 81 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 cuucaggaag cugguuucau auggugguuu agauuuaaau agugauuguc uagcaccauu 60 ugaaaucagu guucuugggg g 81 <210> 46 <211> 81 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 cuucuggaag cugguuucac augguggcuu agauuuuucc aucuuuguau cuagcaccau 60 uugaaaucag uguuuuagga g 81 <210> 47 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 uguaaacauc cuacacucag cu 22 <210> 48 <211> 88 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 accaaguuuc aguucaugua aacauccuac acucagcugu aauacaugga uuggcuggga 60 gguggauguu uacuucagcu gacuugga 88 <210> 49 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 uccuucauuc caccggaguc ug 22 <210> 50 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 aaagauccuc agacaaucca ugugcuucuc uuguccuuca uuccaccgga gucugucuca 60 uacccaacca gauuucagug gagugaaguu caggaggcau ggagcugaca 110 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 cagtcatttg ggtccttcat tccaccgg 28 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 cgtttttttt ttttcagact cc 22 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 cagtcatttg ggtttgttcg ttcggctc 28 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 ccgttttttt tttttcacgc gag 23 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 55 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 cagtcatttg ggtagcttat cagactga 28 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 ccgttttttt tttttcaaca tca 23 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 58 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 59 <211> 23 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 59 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 60 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 60 uguaaacauc cccgacugga ag 22 <210> 61 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 61 aacuggcccu caaagucccg cu 22 <210> 62 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 62 ugaaacauac acgggaaacc uc 22 <210> 63 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 63 ugggucuuug cgggcgagau ga 22 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 64 ucagugcaug acagaacuug g 21 <210> 65 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 65 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 66 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 66 cugugcgugu gacagcggcu ga 22 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 67 cagcagcaca cugugguuug u 21 <210> 68 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 68 cagugcaaug uuaaaagggc au 22 <210> 69 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 69 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 70 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 70 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 71 <211> 23 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 71 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 72 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 72 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 73 <211> 106 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 73 gcgcagcgcc cugucuccca gccugaggug cagugcugca ucucugguca guugggaguc 60 ugagaugaag cacuguagcu caggaagaga gaaguuguuc ugcagc 106 <210> 74 <211> 110 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 74 ugaacaucca ggucuggggc augaaccugg cauacaaugu agauuucugu guucguuagg 60 caacagcuac auugucugcu ggguuucagg cuaccuggaa acauguucuc 110 <210> 75 <211> 70 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 75 guuguuguaa acauccccga cuggaagcug uaagacacag cuaagcuuuc agucagaugu 60 uugcugcuac 70 <210> 76 <211> 83 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 76 guggucucag aaucgggguu uugagggcga gaugaguuua uguuuuaucc aacuggcccu 60 caaagucccg cuuuuggggu cau 83 <210> 77 <211> 81 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 77 gauacucgaa ggagagguug uccguguugu cuucucuuua uuuaugauga aacauacacg 60 ggaaaccucu uuuuuaguau c 81 <210> 78 <211> 88 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 78 cgaggauggg agcugagggc ugggucuuug cgggcgagau gagggugucg gaucaacugg 60 ccuacaaagu cccaguucuc ggcccccg 88 <210> 79 <211> 87 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 79 uguccccccc ggcccagguu cugugauaca cuccgacucg ggcucuggag cagucagugc 60 augacagaac uugggcccgg aaggacc 87 <210> 80 <211> 71 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 80 gcgacuguaa acauccucga cuggaagcug ugaagccaca gaugggcuuu cagucggaug 60 uuugcagcug c 71 <210> 81 <211> 110 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 81 acccggcagu gccuccaggc gcagggcagc cccugcccac cgcacacugc gcugccccag 60 acccacugug cgugugacag cggcugaucu gugccugggc agcgcgaccc 110 <210> 82 <211> 112 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 82 ccaccccggu ccugcucccg ccccagcagc acacuguggu uuguacggca cuguggccac 60 guccaaacca cacuguggug uuagagcgag ggugggggag gcaccgccga gg 112 <210> 83 <211> 89 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 83 ugcugcuggc cagagcucuu uucacauugu gcuacugucu gcaccuguca cuagcagugc 60 aauguuaaaa gggcauuggc cguguagug 89 <210> 84 <211> 68 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 84 gcauccugua cugagcugcc ccgaggcccu ucaugcugcc cagcucgggg cagcucagua 60 caggauac 68 <210> 85 <211> 85 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 85 cgcuggcgac gggacauuau uacuuuuggu acgcgcugug acacuucaaa cucguaccgu 60 gaguaauaau gcgccgucca cggca 85 <210> 86 <211> 110 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 86 ccagagguug uaacguuguc uauauauacc cuguagaacc gaauuugugu gguauccgua 60 uagucacaga uucgauucua ggggaauaua uggucgaugc aaaaacuuca 110 <210> 87 <211> 72 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 87 cuugggaaug gcaaggaaac cguuaccauu acugaguuua guaaugguaa ugguucucuu 60 gcuauaccca ga 72

Claims (58)

1. (a) 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
   (b) 상기 시료로부터 서열번호: 2, 10, 11, 24, 41, 1, 3-9, 12-23, 25, 26 및 58-72, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필을 측정하는 단계; 및
   (c) 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계
   를 포함하고, 이 때 상기 측정된 발현 프로필을 상기 참조 발현 프로필과 비교함으로써 중피종의 진단이 가능해지는, 중피종 진단 방법.
2. (a) 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
   (b) 상기 시료에서 서열번호: 2, 10, 11, 24, 41, 1, 3-9, 12-23, 25, 26 및 58-72, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필을 측정하는 단계; 및
   (c) 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계
   를 포함하고, 이 때 상기 측정된 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교한 결과가 중피종 및 기타의 암 중 하나를 시사하는, 중피종과 기타의 암을 구별하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 중피종이 흉막 중피종인 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 중피종이 복막의 중피종인 방법.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 기타의 암이 선암인 방법.
6. 제 2 항에 있어서, 상기 기타의 암이 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래한 것인 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 신장에서 유래한 암이 신세포암인 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 간에서 유래한 암이 간세포암인 방법.
9. 제 2 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 2, 10, 11, 24 및 41, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 2, 10, 11 및 41, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 2, 10, 24 및 41, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
12. 제 5 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 1-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 이 때 서열번호: 1, 2, 4-9, 11-14 및 16-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 선암을 시사하는 것인 방법.
13. 제 5 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 1-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 이 때 서열번호: 3, 10 및 15, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것은 선암을 시사하는 것인 방법.
14. 제 5 항에 있어서, 상기 선암이 폐, 위, 신장, 결장, 전립선, 자궁경부, 식도, 췌장, 소장 및 유방으로 이루어진 군에서 선택되는 장기의 선암인 방법.
15. 제 6 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 1-7, 9-20 및 22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 이 때 서열번호: 1, 2, 4-7, 11-14 및 16-20, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암을 시사하는 것인 방법.
16. 제 6 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 1-7, 9-20 및 22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 이 때 서열번호: 3, 10 및 15, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것은 결장, 신장, 간, 췌장 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래된 암을 시사하는 것인 방법.
17. 제 2 항에 있어서, 상기 기타의 암이 폐암이고, 핵산 서열이 서열번호: 1, 3, 5-13, 15 및 18- 22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 이 때 서열번호: 1, 5-9, 11-14 및 18-22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 폐암을 시사하는 것인 방법.
18. 제 2 항에 있어서, 상기 기타의 암이 폐암이고, 핵산 서열은 서열번호: 1, 3, 5-13, 15 및 18- 22, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 이 때 서열번호: 3, 10 및 15, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것은 폐암을 시사하는 것인 방법.
19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 폐암이 폐 편평상피세포암, 폐 미분화 소세포암, 폐 미분화 대세포암, 폐 선암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐 유암종 및 대세포 신경내분비암으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
20. 제 2 항에 있어서, 상기 기타의 암이 간암이고, 핵산 서열이 서열번호: 2, 14 및 23-25, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 핵산 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것은 간암을 시사하는 것인 방법.
21. 제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 체액, 세포주 및 조직 시료로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 조직이 신선한 조직, 동결된 조직, 고정된 조직, 왁스 포매된 조직 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 조직인 방법.
23. 제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 원발부위 불명암 (CUP), 원발암 또는 전이암을 가진 대상으로부터 수득된 것인 방법.
24. 제 2 항에 있어서, 분류기 알고리즘을 추가로 포함하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 분류기가 결정 트리 분류기, 로지스틱 회귀분석 분류기, 최근접 이웃 분류기, 신경망 분류기, 가우시안 혼합 모델 (GMM) 및 서포트 벡터 머신 (SVM) 분류기로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
26. 제 2 항에 있어서, 핵산 서열 발현 프로필이 핵산 혼성화 및 핵산 증폭으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 측정되는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 핵산 혼성화가 고체상 핵산 바이오칩 어레이 또는 원위치 혼성화법을 이용하여 수행되는 방법.
28. 제 26 항에 있어서, 핵산 증폭 방법이 실시간 PCR 인 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 실시간 PCR 방법이 전방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 전방향 프라이머가 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 39 및 이와 적어도 약 80% 동일한 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 방법.
31. 제 28 항에 있어서, 실시간 PCR 방법이 탐침을 추가로 포함하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 탐침이 서열번호: 1, 2, 10, 11, 23, 24 및 41 에서 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 탐침이 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 43, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 방법.
34. 중피종과 기타의 암을 구별하기 위한 키트로서, 서열번호: 1, 2, 10, 11, 23, 24, 및 41 로부터 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한 탐침을 포함한 키트.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 탐침이 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 43, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 키트.
36. 제 34 항에 있어서, 상기 기타의 암이 선암인 키트.
37. 제 34 항에 있어서, 상기 기타의 암이 결장, 신장, 간, 췌장, 위 및 폐로 이루어진 군에서 선택되는 장기에서 유래한 것인 키트.
38. (a) 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 시료에서 서열번호: 8, 21, 25, 44-50 및 55, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열의 발현 프로필을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교하는 단계
    를 포함하고, 이 때 상기 측정된 발현 프로필을 참조 발현 프로필과 비교한 결과가 편평 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 비(非)-편평 NSCLC 중 하나를 시사하는, 편평 NSCLC 과 비(非)-편평 NSCLC 를 구별하는 방법.
39. 제 38 항에 있어서, 서열번호: 8 및 21, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것이 비(非)-편평 NSCLC 를 시사하는 것인 방법.
40. 제 38 항에 있어서, 서열번호: 49-50, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 낮은 것이 비(非)-편평 NSCLC 를 시사하는 것인 방법.
41. 제 38 항에 있어서, 상기 비(非)-편평 NSCLC 가 선암이고, 이 때 서열번호: 8, 21, 25, 44-48, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것이 선암을 시사하는 것인 방법.
42. 제 38 항에 있어서, 상기 비(非)-편평 NSCLC 가 선암이고, 서열번호: 49-50, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 것의 발현 수준이 상기 참조 발현 프로필과 비교하여 상대적으로 높은 것이 편평 NSCLC 를 시사하는 것인 방법.
43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 상기 선암이 폐, 위, 신장, 결장, 전립선, 자궁경부, 식도, 췌장, 소장 및 유방으로 이루어진 군에서 선택되는 장기의 선암인 방법.
44. 제 38 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 체액, 세포주 및 조직 시료로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 조직이 신선한 조직, 동결된 조직, 고정된 조직, 왁스 포매된 조직 또는 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 조직인 방법.
46. 제 38 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 원발부위 불명암 (CUP), 원발암 또는 전이암을 가진 대상으로부터 수득된 것인 방법.
47. 제 38 항에 있어서, 분류기 알고리즘을 추가로 포함하는 방법.
48. 제 47 항에 있어서, 상기 분류기가 결정 트리 분류기, 로지스틱 회귀분석 분류기, 최근접 이웃 분류기, 신경망 분류기, 가우시안 혼합 모델 (GMM) 및 서포트 벡터 머신 (SVM) 분류기로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
49. 제 38 항에 있어서, 핵산 서열 발현 프로필이 핵산 혼성화 및 핵산 증폭으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 측정되는 방법.
50. 제 49 항에 있어서, 핵산 혼성화가 고체상 핵산 바이오칩 어레이 또는 원위치 혼성화법을 이용하여 실시되는 방법.
51. 제 49 항에 있어서, 핵산 증폭 방법이 실시간 PCR 인 방법.
52. 제 51 항에 있어서, 실시간 PCR 방법이 전방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 방법.
53. 제 52 항에 있어서, 전방향 프라이머가 서열번호: 39, 51, 53 및 56 및 이와 적어도 약 80% 동일한 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 방법.
54. 제 52 항에 있어서, 실시간 PCR 방법이 탐침을 추가로 포함하는 방법.
55. 제 54 항에 있어서, 탐침이 서열번호: 8, 41, 49, 55 로부터 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 방법.
56. 제 55 항에 있어서, 탐침이 서열번호: 40, 52, 54 및 57, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 방법.
57. 편평 NSCLC 및 비(非)-편평 NSCLC 를 구별하기 위한 키트로서, 서열번호: 8, 41, 49, 55 로부터 선택되는 서열에 상보적인 서열, 이의 절편 및 이에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한 탐침을 포함하는 키트.
58. 편평 NSCLC 및 비(非)-편평 NSCLC 를 구별하기 위한 키트로서, 서열번호: 40, 52, 54 및 57, 이들의 절편 및 이들에 대해 적어도 약 80% 의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한 탐침을 포함한 키트.

Images