KR102067879B1 - 침습성 방광암 진단용 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634로 이루어진 마이크로RNA 그룹 중 하나 이상을 포함하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커를 제공함으로써 방광암의 신속한 진단이 가능하며 특히 용이하게 고위험 환자군을 선별할 수 있다.

Description

침습성 방광암 진단용 바이오마커 {Biomarker for diagnosis of muscle invasive bladder cancer}
본 발명은 방광암에서 특이적으로 발현되는 마이크로 RNA(micro RNA, 이하 ‘miRNA’라 한다)를 이용한 침습성 방광암의 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
방광암(Bladder Cancer)은 미국에서 두 번째로 흔한 비뇨기과적인 악성 종양으로, 2015년에만 약 73,510건이 새로 진단되었으며, 14,680명이 사망했다. 한국에서 방광암은 비뇨 생식기 종양 중 두 번째로 흔한 종양이며, 방광암의 발생률은 여성에서보다 남성에서 약 5 배 더 높게 나타나고 있다.
방광암의 통상적인 진단은 종양을 임상병리학적 특징에 기초하여 비근육 침습성(NMIBC; non-muscle invasive)과 근육 침습성 (MIBC; muscle invasive)의 두 그룹으로 분류한다. 첫 진단에서 대다수의 경우가 NMIBC로 분류된다. 그러나, 실제로는 방광암의 약 20%가 MIBC로 확인되며, 이는 방광암 환자에서 사망의 주요 원인이 되고 있다.
일반적으로 NMIBC는 MIBC보다 훨씬 예후가 좋으며 NMIBC의 생존율은 다른 악성 종양의 생존율보다 높다. 그러나 원발 종양의 요도경유절제술(TUR; transuretheral resection) 후에도 재발 가능성은 NMIBC와 같다. NMIBC 환자의 약 30-50 %는 재발을 경험한다. NMIBC는 또한 MIBC로 진행할 가능성도 있지만, 일반적으로 10-20% 정도로 가능성이 낮다. 따라서 MIBC의 잦은 재발과 MIBC로의 진행은 환자 및 비뇨기과 전문의 모두에게 어려운 문제가 되어 왔다. 따라서 방광암의 보다 정확한 진단 테스트의 개발이 필요하다.
한편, miRNA는 다양한 종양 유전자 또는 종양 억제 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 짧은 비코딩 RNA단편이다. 이들 miRNA 분자는 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해, 유전자 전사에의 영향을 통해 단백질 발현 패턴을 조절할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 발달 및 분화, 세포 증식 제어, 스트레스 반응 및 대사작용 등의 다양한 과정에서 중심적 역할을 한다.
특히 많은 유형의 암발병 상태에서 다수의 miRNA의 발현이 변화된 상태로 발견되었으며, 일부 경우 그러한 변화가 종양 진행에서 원인적 역할을 할 수 있다는 강력한 증거가 제시되고 있다.
miRNA 발현은 고도로 조직 특이적이어서, 종양 조직 기원의 규명에도 유익하며, 그에 따라 진단 및 치료 목적용 생물학적 마커로도 이용될 수 있다. 현재까지 1,100 개 이상의 마이크로 RNA (miRNA)가 인간 게놈에서 확인되었는데, 총 mRNA 수보다 훨씬 적다. 이러한 miRNA와 표적 유전자 사이의 상호 작용은 일대일 방식이 아니라 일대 다 방식 또는 일대 다 방식 일 수 있으며, 결과적으로 매우 많은 잠재적인 조절 효과를 나타낼 수 있다.
그러나 miRNA의 방광암에서의 역할과 이용은 아직 많이 알려져 있지 않다. 방광암과 관련하여, 마이크로 어레이 기반 접근법을 사용한 발현 프로파일링 연구는 miRNA의 이론을 뒷받침할 수 있는 풍부한 정보를 제공해 왔다. 그럼에도 불구하고 miRNA와 mRNA 사이의 상호 작용에 관한 데이터는 일관성이 없으며 암세포의 발현 수준과 생리적으로 관련된 기능에 대해 알려진 바가 거의 없는 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2014-0064899호에서는 방광암에 대한 특이도가 높으며, 또한 악성도가 낮은 방광암 조직을 검출할 수 있는 검출 감도(感度)가 높은 방광암의 검출 방법 및 방광암 마커를 제공하며, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA로 이루어지는 방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머 및 방광암 마커를 개시하고 있다. 대한민국 공개특허 제10-2016-0006673호에서는 miRNA 및 이들의 전구체를 포함하는 엑소좀을 이용함으로써 암을 진단하고 처리하기 위한 방법. 예를 들면, 일부 양태에서, 암은 개체로부터의 샘플 내 엑소좀의 miRNA 함량을 측정함으로써 또는 엑소좀 내 miRNA 프로세싱을 검출함으로써 진단되거나 평가될 수 있는 진단 및 치료를 위한 엑소좀 내 miRNA 생합성을 개시하고 있다. 대한민국 등록특허 제10-1672057호에서는 특정 암의 식별 및 진단에 사용되는 핵산 서열을 제공하며, 상기 핵산 서열은 또한 생물학적 시료의 발현 프로필에 기초한 대상의 예후 평가에도 사용가능한 마이크로―ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ 의 감별 검출을 이용한 특정 암에 대한 진단 및 예후를 개시하고 있다. 대한민국 등록특허 제10-1785795호에서는 두경부암 예후 예측용 바이오마커로 사용할 수 있는 마이크로 RNA(micro RNA, 이하 'miRNA'라 한다)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 miRNA는 miR-206, miR-127-5p, miR-432-5p, miR-409-5p, miR-145-3p, miR-497-5p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-214-3p, miR-125b-5p, miR-99a-5p, miR-203a, miR-200a-5p, miR-200a-3p, miR-200b-5p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-141-3p, miR-205-5p, miR-183-5p, miR-106b-3p, miR-93-5p, miR-17-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-92a-3p, miR-744-5p, miR-324-3p, miR-193a-5p, miR-149-5p, miR-1307-3p, miR-107, miR-103a-3p, miR-221-3p, miR222, miR-532-5p, miR-24-3p, miR-27b-5p, miR-27b-3p 및 miR-23b-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 발현 정도에 따른 두경부암 아형의 판정 및 예후 예측을 목적으로 하는 두경부암 예후 예측용 바이오마커 마이크로 RNA를 개시하고 있다. 그러나 상기 발명들은 MIBC에서 차별적으로 발현되는 유전자 14 개(DKK3, FGF9, ITGA8, MGLL, MOXD1, NELL2, AURKA, CDCA8, EZH2, KIF20A, KIF2C, MCM10, MELK 및 POLQ)와 miRNA 10 개(miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634)를 포함하는 유전자-miRNA 상호 작용 쌍을 이용한 방광암 마커를 제공하는 본 발명과는 그 구성 및 효과에서 차이를 보인다.
본 발명은 정상조직에 비하여 침습적 방광암에서 다르게 발현되는 유전자와 miRNA가 침습적방광암 진단에 필요한 정보를 이용한 침습적 방광암 진단용 칩을 제공하는데에 목적이 있다.
상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634로 이루어진 마이크로RNA 그룹 중 하나 이상을 포함하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커를 제공한다.
또한 본 발명은 DKK3, FGF9, ITGA8, MGLL, MOXD1, NELL2, AURKA, CDCA8, EZH2, KIF20A, KIF2C, MCM10, MELK 및 POLQ로 이루어진 유전자중 하나 이상을 포함하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커를 제공한다.
본 발명은 Microarray 및 RNA sequencing gene expression profiling을 통해 정상대비 침습성 방광암(MIBC)에 발현되는 유전자 정보와 유전자-miRNA 관계를 형성하는 14개 유전자 및 10개 miRNA를 제공하며 방광암에서 MIBC를 구별할 수 있는 바이오마커를 제공하여 침습성 방광암 진단을 용이하게 함으로써 진행 고위험 환자군 선별에 있어 임상적 활용성이 가능하며, 개별 환자의 맞춤형 치료에 도움이 된다.
도 1은 MIBC에서 음의 상관관계가 있는 유전자-miRNA 쌍 선별의 실험방법을 보여주는 개략도이다.
도 2는 BC에서 차별적으로 발현되는 mRNA와 miRNA를 보여주는 벤 다이어그램이다.
도 3은 BC에서 짝 지어진 유전자와 miRNA를 보여주는 다이어그램이다.
도 4는 NMIBC에서 표적 유전자와 상호작용하는 miRNA-mRNA의 발현 프로파일링을 나타낸 표이다.
도 5는 MIBC에서 표적 유전자와 상호작용하는 miRNA-mRNA의 발현 프로파일링을 나타낸 표이다.
도 6은 NMIBC에서 음의 상관관계가 있는 유전자-miRNA 쌍 선별의 실험방법을 보여주는 개략도이다.
본 발명은 MIBC 특이적 miRNA를 확인하고, 생물 정보학 분석 및 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의한 검증을 기반으로 관련 유전자 및 miRNA-mRNA 상호 작용을 예측할 수 있으며, 이를 통하여 방광암의 진단을 보다 빠르고 정확하게 수행하기 위하여 안출된 것이다.
방광암 환자에서 조절장애가 있는 중요한 네트워크 및 경로를 결정하고자 하였으며, 본 발명을 통하여 방광암뿐만 아니라 인간 환자의 MIBC를 구성하는 메커니즘에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있다.
차별적으로 발현된 유전자와 그 전사 후 조절 인자 - 마이크로 RNA (miRNA)는 암 진단 및 치료의 선구자 역할을 할 수 있는 열쇠이다. 본 발명은 miRNA-mRNA 상호 작용이 방광암 (BC)의 종양 발생에 어떻게 영향을 미치는지를 확인하고 침습성 방광암 (MIBC)에서 특정 miRNA와 mRNA 유전자 마커를 개시하고 있다. 이하 본 발명을 구체적인 예를 들어 상세히 설명한다.
< 실시예 1> 방광암 샘플 분석
1. 환자
본 발명을 위한 실험 코호트에는 조직학적으로 MIBC로 진단받은 93 명의 환자와 BC가 없는 83 명의 환자가 포함되었다. 종양 수준은 표준 기준에 따라 평가되었다. MIBC 환자는 근치적 방광 절제술을 받고 골반 림프절 절제술을 완료했다. 이 환자들은 또한 도관 생성, continent cutaneous reservoir 및 orthotopic ileal neobladder을 포함하는 비뇨기 전환술을 받았다. 또한 pT3 / pT4 / 림프절 양성 질환을 가진 MIBC 환자에게 시스플라틴계 보조 화학 요법의 4-6주기가 시행되었다. 이 MIBC 환자들은 최초 2 년 동안 3 개월마다, 2 년 동안 6 개월마다, 그리고 그 후 매년 신체 검사, 소변 세포 검사, 혈청 화학 검사, 흉부 엑스선 검사, 복부 및 골반 전산화 단층 촬영을 받았다.
모든 환자에 대해 소급적으로 임상 데이터를 평가했다. 이 환자의 평균 추적 관찰 기간은 71 개월 (중앙값 61 개월, 범위 15-115 개월)이었다. 정상적인 muscosae는 양성 질환에서 종양 및 실제 정상 점막으로부터 먼 부위에서 수집하였다. 모든 시료는 액체 질소에서 급속 동결시켰으며 사용할 때까지 80C에서 보관하였다. 검체 채취 및 분석은 충북대학교 기관 심의위원회 (IRB 승인 번호 : 2006-01-001 및 GR2010-12-010)에 승인을 받았으며 각 피험자로부터 정보에 근거한 동의를 얻었다.
2. 데이터 세트
높은 처리량 분자 데이터 세트는 두 가지 기술을 사용하여 miRNA에 대해 생성되었습니다. 마이크로 어레이 및 RNA 시퀀싱 mRNA 데이터는 RNA 시퀀싱에으로 생성하다. 이 분석은 발명자들이 선행하여 개발한 마이크로 어레이 데이터세트(Gene Expression Omnibus accession number GSE13507)를 포함하고 있다. 샘플 크기는 도 1에 표시하였다.
< 실시예 2> 라이브러리 준비와 데이터 생성
1. RNA 추출
TRIzol 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 지시 된 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 제조자의 지시에 따라 페놀을 기초로 한 추출 방법을 사용하여 정제를 수행 하였다. NanoDrop ND-1000 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고, RNA 6000 Nano Kit (Agilent, Santa Clara, CA)를 사용하여 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA)에서 RNA integrity number를 평가하였다.
2. miRNA microarrays
각 시료의 총 RNA (100 ng)를 탈 인산화시키고, Cy3-pCp로 3 '말단 표지하고, Micro Bio-Spin 컬럼으로 정제하고, 건조시키고, miRNA 마이크로 어레이 시스템 라벨링 키트 (Illumina, San Diego, CA)와 1,205 개의 인간 및 144 개의 바이러스 miRNA가 포함된 Agilent Human miRNA Microarray Release 16.0 플랫폼(Wang et al., 2007)을 사용하여 혼성화하였다. 마이크로 어레이 유전자 발현 데이터 세트를 생성하기 위해 사용 된 프로토콜은 Takeshita 등(2013)이 사용한 방법을 따랐다.
3. Stranded mRNA 라이브러리 구축
mRNA 시퀀싱 라이브러리 구축에는 TruSeq Stranded mRNA 샘플 준비 키트 (RS-122-2101) (Illumina, San Diego, CA)를 사용하였다. Oligo dT 부착 자성 비드를 사용하여 총 RNA 1 μg에서 poly-A 함유 mRNA를 정제했다. 다음으로, 정제 된 mRNA를 짧은 단편으로 분쇄하고, SuperScript II 역전사 효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 랜덤 헥사머를 사용하여 제 1 가닥 cDNA를 합성 하였다. 양쪽 말단에 연결된 어댑터를 갖는 cDNA는 PCR을 이용하여 농축하였다. cDNA 라이브러리 크기와 품질은 2100 BioAnalyzer에서 Agilent DNA 1000 Kit (부품 번호 5067-1504)를 사용하여 전기 영동으로 평가하였다. 이어서, 라이브러리를 Illumina HiSeq 2500에서 시퀀싱하였다. 이미지 분석은 HiSeq 제어 소프트웨어 버전 2.2.58을 사용하여 수행 하였다. Raw data를 처리한 후 base calling은 표준 Illumina 파이프 라인 (CASAVA 버전 1.8.2 및 RTA 버전 1.18.64)을 사용하여 수행하였다.
3. 소형 RNA 라이브러리 구축
TruSeq Small RNA Sample Preparation protocol (RS-200-0012) (Illumina, San Diego, CA)을 사용하여 작은 RNA 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. Illumina 어댑터는 3'- 히드록 실기 및 5'- 인산염을 갖는 마이크로 RNA 분자에 직접적, 특이적으로 연결시켰다. 어댑터 - 연결 RNA 및 증폭 라이브러리의 품질 및 크기 분포는 고감도 DNA 분석 키트 (Cat. # 5067-4626) (캘리포니아 주 산타 클라라 소재의 애질런트)를 사용하여 확인하였다. 라이브러리는 NGS 용 라이브러리 정량 키트 (KK4824) (Kapa Biosystems, Wilmington, MA)를 사용하여 정량하였다. 라이브러리는 Illumina HiSeq 2500에서 시퀀싱하였다. HiSeq 시퀀싱 제어 소프트웨어 버전 2.2.58을 사용하여 실시간 이미지 분석 및 base calling을 수행하였다. FASTQ 시퀀스 파일의 de-multiplexing 및 생성은 .CASAVA 소프트웨어 버전 1.8.2와 RTA 버전 1.18.64를 사용하였다.
< 실시예 3> 데이터 분석
1. 마이크로 어레이
Irizarry 등(2003) 마이크로 어레이 방법을 이용하였다. R 패키지의 Robust Multiarray Average는 perform global correction, quantile normalization, and median Polish summarization을 수행하는 데 사용하였다. P 값 (t test)은 비드 mRNA 신호 강도로부터 계산되었다.
2. mRNA 시퀀싱
총 시퀀싱 읽기는 다음과 같은 전처리를 거쳤다 : Adapter trimming은 기본 매개 변수가 있는 cutadapt를 사용하여 수행되었으며 Quality trimming (Q30)은 기본 매개 변수가 있는 FastQC를 사용하여 수행되었다. 처리 된 판독은 기본 매개 변수로 tophat와 cufflink를 사용하여 인간 참조 게놈 (Ensembl 72 [GRCh37 : hg19])에 매핑되었다. FPKM 값은 통계적 유의성 (예 : P 및 Q 값) 및 미분 표현 (예 : 배 변화)을 결정하기 위해 R 패키지 태그 수 비교 (TCC)를 사용하여 표준화 및 정량화되었다.
3. miRNA 시퀀싱
총 시퀀싱 읽기는 어댑터 트리밍, 품질 트리밍, 크기 선택 (17-24nt) 및 기본 매개 변수가 있는 mirDeep2를 사용하는 클러스터링의 전처리 과정을 거쳤다. 전처리된 클러스터 대표자를 인간 참조 게놈 (Ensembl 72 [GRCh37; hg19])에 매핑하고, miRNA 영역을 miRBase 참조 좌표에 대해 채취했다. 총 판독 카운트를 R 패키지 에지 R을 사용하여 트림된 평균 m- 값 표준화 및 정량화하고, 통계적 유의성 (예를 들어, P 및 Q 값) 및 미분 표현 (e.g. -fold changes)을 결정하였다.
4. 차별적으로 발현된 miRNA와 mRNA의 통합 분석
각 기술을 사용하여 얻은 데이터의 경우, 차별적으로 발현된 mRNA와 miRNA를 확인하기 위해 여러 cut-off를 사용했다. 처음에는 p 값 (P≤0.05)과 배의 변화 (log2FC≥1.0)에 대한 임계값을 마이크로 어레이 데이터 세트에 적용했다. mRNA (FPKM ≥ 0.3, P≤ 0.05, FDR ≤ 0.05, log2FC ≥ 1.0)와 miRNA (판독 횟수 ≥ 10, P≤0.0, FDR ≤ 0.05 및 log2FC ≥ 1.0)가 RNA 시퀀싱 데이터 세트의 임계 값이었다. 마지막으로 microarray 데이터 세트와 mRNA-Seq 데이터 세트에 공통적 인 mRNA를 검증 된 mRNA로 선택했다. 마이크로 어레이 데이터 세트와 miRNA-Seq 데이터 세트에 공통적인 miRNA가 검증된 miRNA로 선택하였다.
선택된 mRNA 및 miRNA는 유효성이 검증된 표적 데이터 세트 및 역 발현 관계 (즉, 표적의 양이 감소 된 miRNA 및 감소 된 miRNA)에 따라 쌍을 이룬다.
5. Pathway enrichment 분석
Vlachos 등(2015)의 DIANA mirPath V3.0 를 이용하여 선택된 miRNA의 Pathway enrichment analysis를 수행되었다. 유의미한 상관관계가 있고 강화된 경로는 특정 miRNA에 대해 피셔의 메타 분석법을 사용하여 중요한 p 값을 계산하여 확인하였다.
마지막으로 GeneMANIA(Zuberi K 등, 2013)]를 사용하여 기존 데이터베이스의 대화형 기능 네트워크를 확인하여 유전자 목록을 조사하였다.
< 실시예 4> MIBC 조직과 정상 조직 사이에서 차별적으로 발현된 유전자의 동정
도 1은 MIBC에서 음의 상관관계가 있는 유전자-miRNA 쌍을 보여주는 개략도이다. MIBC에서 발현되는 105 개의 유전자를 정상 조직과 비교하여 추출했다. 모든 유전자는 두 번째 코호트로부터 RNA 서열 분석으로 검증하였다.
도 2는 BC에서 차별적으로 발현되는 mRNA와 miRNA를 보여주는 벤 다이어그램이다. 벤 다이어그램 (Venn diagram)은 MIBC에서 33/105 개의 유전자가 정상 조직의 유전자와 독점적으로 조절되지 않음을 보여준다(도 2A). 이 유전자의 생물학적 기능을 이해하기 위해 GeneMANIA 및 STRING을 사용하여 네트워크 농축 분석을 수행하였다.
Biological Functions FDR Genes in network
Mitosis 1.72E-21 19
Nuclear division 1.88E-20 20
Organelle fission 8.27E-20 20
Spindle 5.72E-15 14
Condensed chromosome kinetochore 2.21E-12 8
Chromosome segregation 2.88E-12 12
Condensed chromosome, centromeric region 7.66E-12 8
Kinetochore 1.49E-11 10
Regulation of cell division 1.70E-11 12
Microtubule cytoskeleton organization 3.66E-11 13
Sister chromatid segregation 3.66E-11 9
Condensed chromosome 4.78E-11 10
표 1은 상기 105개의 유전자 중 정상 조직에 대하여 MIBC에서 차별적으로 발현되는 33개 유전자의 생물학적 기능을 보여주고 있다. MIBC의 33/105 차별적으로 발현된 유전자는 유사 분열 (FDR, 1.72E-21)과 핵 분열 (FDR, 1.88E-20)과 관련이 있음을 확인하였다. 세포 분열에서 핵 분열과 G2 / M 전이와 관련된 기능을 하는 72 개의 유전자는 BC와 정상 조직 사이에 다른 발현을 보였다.
< 실시예 5> MIBC 조직과 정상 조직 사이에서 차별적으로 발현되는 miRNA의 동정
miRNA는 도 1과 같이 결정되었다. MIBC와 정상 조직에서 차별적으로 발현 된 25 개의 miRNA를 추출했으며, 두 번째 코호트에서는 모두 RNA 시퀀싱으로 검증하였다. 도 2B에서 보는 바와 같이 17 miRNA가 MIBC 대 정상에서 특이적으로 deregulation되었다. miR-124, miR-302c, miR-331, miR-335, miR-371a, miR-371a, miR-371a, miR-371a, miR- miR-4492, miR-4634, miR-483가 포함된다.
표 2는 MIBC에서 표적 유전자와 상호작용하는 miRNA-mRNA의 발현 프로파일링을 나타낸 것이다.
miRNAs miRNA Expression Target genes Target Gene Expression GSE40355 Expression GSE66064 Expresssion TCGA Expression
miR-124 Down EZH2 Up NA NA Up
KIF2C Up NA Up Up
AURKA Up Up NA Up
KIF20A Up NA NA Up
miR-302c Down MELK Up Up NA Up
mi-331 Up NELL2 Down Dwon NA NA
miR=371a Down MCM10 Up Up Up Up
MELK Up Up NA Up
miR-4492 Down CDCA8 Up Up Up Up
miR-4634 Down POLQ Up Up NA Up
miR-483 Up FGF9 Down Down NA NA
NA : Not available
MIBC : muscle invasive bladder cancer
< 실시예 6> NMIBC - / MIBC - 특이적 유전자 - miRNA 상호 작용
다음으로, 검증된 mRNA와 MIBC에 특이적인 miRNA를 기반으로 유전자 miRNA 상호작용을 확인하였다. 이 분석은 Dweep H 등(2015)의 miRWalk 2.0 에서 mirTarBase v6의 실험적으로 검증된 데이터세트를 기반으로 후보 유전자 표적 miRNA를 확인하는 두 단계로 진행하였다. 이를 통해 우리는 105 개의 MIBC 유전자에 대해 1,740 개의 유전자 - miRNA 상호 작용 쌍을 얻었다(MIBC 대 정상).
이후, 유전자 miRNA 상호 작용 쌍 중에서, 유의하게 발현된 유전자와 서로 쌍을 이룬 miRNA을 정상 대 MIBC의 차이를 더 분석하기 위하여 선택하였으며 MIBC에서 10 개의 miRNA와 짝 지어진 14 개의 유전자를 얻었다. 도 3은 BC에서 짝 지어진 유전자와 miRNA를 보여주는 다이어그램이며, 표 3은 MIBC에서 14 개의 유전자와 10 개의 miRNA의 음성 상관 관계 쌍을 보여준다.
Gene miRNA Gene expression miRNA expression
DKK3 miR-183-5p down-regulated up-regulated
FGF9 miR-483-3p down-regulated up-regulated
ITGA8 miR-183-5p down-regulated up-regulated
MGLL miR-7-5p down-regulated up-regulated
MOXD1 miR-96-5p down-regulated up-regulated
NELL2 miR-331-3p down-regulated up-regulated
AURKA miR-124-3p up-regulated down-regulated
CDCA8 miR-4492 up-regulated down-regulated
EZH2 miR-124-3p up-regulated down-regulated
KIF20A miR-124-3p up-regulated down-regulated
KIF2C miR-124-3p up-regulated down-regulated
MCM10 miR-371a-5p up-regulated down-regulated
MELK miR-371a-5p up-regulated down-regulated
miR-302c-3p up-regulated down-regulated
POLQ miR-4634 up-regulated down-regulated
참고: DKK3 (Dickkopf-related protein 3), FGF9 (Fibroblast growth factor 9), ITGA8 (Integrin alpha-8), MGLL (Monoglyceride lipase), MOXD1 (Monooxygenase DBH like 1), NELL2 (Protein kinase C-binding protein NELL2), AURKA (Aurora kinase A), CDCA8 (Borealin), EZH2 (Histone-lysine N-methyltransferase EZH2), KIF20A (Kinesin-like protein KIF20A), KIF2C (Kinesin-like protein KIF2C), MCM10 (Protein MCM10 homolog), MELK (Maternal embryonic leucine zipper kinase), POLQ (DNA polymerase theta)
miRNA-mRNA 상호 작용 유전자의 생물학적 복제를 검증하기 위해 AnaltAnlyzer와 함께 GSE 및 암 게놈지도 (TCGA) 데이터를 모집하고 재분석하였다. 마지막으로, 7 개의 miRNA는 차별적으로 발현 된 분석에서 10 개의 유전자와 음성 상관 관계를 보였으며, Dhawan D(2015)등의 GSE40355, GSE66064 및 TCGA의 RNA 서열 (표 2)을 사용하여 MIBC에서의 발현이 확인되었다.
miRNA와 상호 작용하는 유전자의 생물학적 기능을 이해하기 위해 선택된 유전자를 GeneMANIA 및 STRING을 사용하여 네트워크 농축 분석에 적용하였다. 이로써 MIBC에서 차별적으로 발현된 8 개의 유전자가 스핀들 형성 (FDR, 7.53E-15)과 유사 분열 (FDR, 2.80E-10)에 관여한다는 것을 확인하였다(표 4).
Biological Functions FDR Genes in network
Spindle 7.53E-15 12
Mitosis 2.80E-10 10
Nuclear division 2.80E-10 11
Organelle fission 4.39E-10 11
Microtubule cytoskeleton organization 1.15E-09 10
Midbody 6.20E-08 7
Microtubule 7.79E-08 8
Regulation of cell division 8.44E-08 8
Microtubule-based movement 1.40E-07 7
Chromosome, centromeric region 1.46E-07 7
Chromosome segregation 8.79E-07 7
Spindle organization 9.47E-07 6
상기와 같이 본 발명은 글로벌 miRNA-mRNA 상호 작용 및 MIBC에 특화된 풍부한 기능적 네트워크를 확인하기 위해 두 가지 방법을 사용했다. Microarrays는 차별화된 발현 프로파일을 얻기 위해 사용되었으며, RNA-Seq은 miRNA와 mRNA 수준의 실험적 검증에 사용하였다. 또한, 유전자 발현 양상은 GSE와 TCGA가 이전에 보고된 다른 코호트를 사용하여 검증하였다. 이러한 결과는 유전자 - miRNA 상호 작용 유전자의 발현 패턴이 종양 형성에 대한 MIBC에서 보존되었음을 보여 주었다. 이와 같이 miRNA와 유전자 발현에 대한 자세한 패턴을 밝혀 내어 BC의 특정 아형에 대한 분자 마커를 안출할 수 있었다. MIBC에서 차별적으로 발현 된 33 개의 유전자는 주로 유사 분열, MHC 클래스 II 및 G2 / M 전이를 통한 항원 가공 및 제시와 관련이 있었다. 또한 MIBC에서 8 개의 miRNA 상호 작용 유전자가 스핀들 형성, 유사 분열 및 핵 분열과 관련이 있음을 발견하였다.
세포주기 관련 유전자 (AURKA, CDCA8, KIF20A 및 KIF2C)는 NMIBC와 비교하여 MIBC에서 과발현되었다. 또한 세포주기 분열에서 역할을 하는 유전자는 정상 조직과 비교했을 때 BC에서 과다 발현된다. 따라서 세포 분열, 염색질 복제 및 염색체 분리가 약물 개발의 핵심 목표이기 때문에 핵 분열 및 G2 / M 전환과 관련된 miRNA 표적 유전자가 BC 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
종래의 연구는 190 개의 유니온 miRNA를 포함하는 BC 바이오 마커로 440 개의 상향 또는 하향 조절 된 miRNA가 제안되었는데, 그 중 miR-145는 여러 종류의 암 조직에서 하향 조절되어 평활근 세포의 분화 상태를 유지하는 역할을 하며,이는 miR-145가 BC 종양 발생에 중요한 요소가 될 가능성이 있음을 시사하고 있다. 본 발명에서는 MIBC에 특이한 miRNA, 즉, miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634를 확인하였다.
miR-124, miR-302c, miR-331, miR-335, miR-371a, miR-4492, miR-4634, miR-483, miR-183 클러스터의 구성원은 인간 염색체 7q32.2의 5kb 영역에 위치하고 있으며 텔로미어에서 동맥 경화까지 동일한 방향으로 전사된다. miR-183 클러스터는 다양한 종양에서 비정상적으로 발현되며 인간 암에 직접 관련 될 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 특히, miR-183-3p, miR-182-5p 및 miR-96-5p는 BC에서 종양 발생 기능을 가지고 있으며, 이들 miRNA가 NMIBC 및 MIBC 모두에서 과발현된다는 것을 발견하였다. 특히, miR-183 클러스터는 NMIBC 및 MIBC 모두에서 중첩되는 유전자, 즉 DKK3 (miR-183-5p의 표적), FGF9 (miR-182-5p의 표적) 및 MOXD1 (표적의 miR-96-5p)과 같은 유전자를 조절하며, 이는 이러한 miRNA가 방광 종양 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
본 발명은 또한 MOXD1 (monooxygenase, DBH-like 1)이 BC 조직에서 miR-96-5p에 의해 조절된다는 것을 밝혀내었다. MOXD1은 소포체에 국한되는 구리 모노옥시게나제 / 도파민 / β- 히드록실라제의 일원을 코딩하는데, 이 단백질군의 구성원은 주로 신경 전달 물질과 호르몬의 생합성에 관여한다.
요약하면, 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS; 이하 NGS라 함) 기반 실험에서 얻은 검증된 데이터는 발표된 데이터의 포괄적이고 편향되지 않은 계산 분석으로 MIBC에서 7 개의 새로운 miRNA를 확인하였고, 유전자 miRNA 쌍의 유전자 농축 분석은 또한 MIBC에서 DNA 복제와 G2 / M 전이가 중요함을 시사하고 있다.
따라서 본 발명은 MIBC에서 차별적으로 발현되는 유전자 14 개(DKK3, FGF9, ITGA8, MGLL, MOXD1, NELL2, AURKA, CDCA8, EZH2, KIF20A, KIF2C, MCM10, MELK 및 POLQ)와 miRNA 10 개(miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634)를 포함하는 새로운 유전자 miRNA 상호 작용 쌍을 제공하며 이는 침습성 BC의 새로운 진단방법에 이용될 수 있다.
방광암 환자 및 정상 대조군 조직에서 total RNA를 추출하여, 이를 다시 세분화하여 mRNA와 microRNA를 대상으로 발현량 변화를 측정하기 위하여, 두 가지 서로 다른 플랫폼인 expression array chip과 NGS를 이용하여 mRNA 및 miRNA의 expression data를 생산하였다.
mRNA의 경우, 정상 조직(68샘플)과 침습성 암조직(62샘플)에서 확보한 Expression array를 이용하여 정상조직대비 침습성 암조직에서 발현량 변화가 많은 유전자를 1차로 확보(424개 유전자)하였고, 1차 데이터를 검증하기 위하여, 별도의 정상조직(5샘플)과 칩습성 암조직(18)에서 NGS를 통하여 확보한 정상조직대비 칩습성 암조직에서의 발현량에서도 지속적으로 차이를 보이는 mRNA(105개 유전자)만을 선별하였다.
miRNA의 경우, 정상 조직(10샘플)과 침습성 암조직(20샘플)에서 확보한 Expression array를 이용하여 정상조직대비 칩습성 암조직에서 발현량 변화가 많은 유전자를 1차로 확보(601개 miRNA)하였고, 1차 데이터를 검증하기 위하여, 별도의 정상조직(5샘플)과 침습성 암조직(11샘플)에서 NGS를 통하여 확보한 정상조직대비 칩습성 암조직에서의 발현량에서도 지속적으로 차이를 보이는 miRNA(25개)만을 선별하였다.
최종적으로, 정상조직대비 침습성 암조직에서 발현량 차이를 보이는 mRNA 및 microRNA를 발굴하였고, 이들 mRNA와 miRNA가 서로 결합한다는 실험적 결과와 시퀀싱비교 분석 결과를 기반으로 본 연구에서 확보한 mRNA(105개 유전자)와 miRNA(25개)가 상호결합하면서 상호작용(negative correlation)이 있는 것만을 재분석한 결과 10개 miRNA가 14개 유전자를 조절하고 있음을 발굴하였다.
이들 10개 miRNA와 14개 유전자는 침습방광암(MIBC)에서 암 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 기대되며, 침습성 방광암 진단용 키트를 개발하기 위한 컨텐츠로서 활용가능성이 기대되었다.
< 실시예 7> 침습성 방광암 진단용 마커와 유전자칩 키트
본 발명은 MIBC에서 차별적으로 발현되는 miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634로 이루어진 miRNA 군 중 하나 이상을 포함하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커를 제공한다. 또한 MIBC에서 차별적으로 발현되는 DKK3, FGF9, ITGA8, MGLL, MOXD1, NELL2, AURKA, CDCA8, EZH2, KIF20A, KIF2C, MCM10, MELK 및 POLQ로 이루어진 유전자중 하나 이상을 포함하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커를 제공한다.
방광암 환자 또는 방광암 의심환자의 조직으로부터 상기 miRNA 또는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 침습성 방광암을 진단하는 정보를 제공할 수 있다. 즉, 본 발명은 miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 침습성 방광암 진단용 조성물을 제공하며, 이때 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 방광암 환자 또는 방광암 의심환자의 조직으로부터 DKK3, FGF9, ITGA8, MGLL, MOXD1, NELL2, AURKA, CDCA8, EZH2, KIF20A, KIF2C, MCM10, MELK 및 POLQ로 이루어진 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 침습성 방광암 진단용 조성물을 제공하며, 이때 상기 제제는 상기 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 바이오마커 또는 조성물을 포함하는 침습성 방광암 진단용 유전자 칩 키트를 제공한다.
본 발명은 MIBC에서 차별적으로 발현되는 miRNA 또는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 침습성 방광암 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 방광암 환자 또는 방광암 의심환자의 조직으로부터 miR-183-5p, miR-483-3p, miR-7-5p, miR-96-5p, miR-331-3p, miR-124-3p, miR-4492, miR-371a-5p, miR-302c-3p 및 miR-4634로 이루어진 miRNA 중 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 침습성 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한 환자로부터 분리한 시료의 DKK3, FGF9, ITGA8, MGLL, MOXD1, NELL2, AURKA, CDCA8, EZH2, KIF20A, KIF2C, MCM10, MELK 및 POLQ로 이루어진 유전자 중 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 침습성 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 비침습성방광암 진단을 위한 바이오마커를 제공한다.
방광암 환자 및 정상 대조군 조직에서 total RNA를 추출하고, 이를 다시 세분화하여 mRNA와 microRNA를 대상으로 발현량 변화를 측정하기 위하여, 두 가지 서로 다른 플랫폼인 expression array chip과 NGS를 이용하여 mRNA 및 miRNA의 expression data를 생산하였다.
mRNA의 경우, 정상 조직(68샘플)과 비침습성 암조직(103샘플)에서 확보한 expression array를 이용하여 정상조직대비 비침습성 암조직에서 발현량 변화가 많은 유전자를 1차로 확보(1073개 유전자)하였고, 1차 데이터를 검증하기 위하여, 별도의 정상조직(5샘플)과 비침습성 암조직(18)에서 NGS를 통하여 확보한 정상조직대비 비침습성 암조직에서의 발현량에서도 지속적으로 차이를 보이는 mRNA(522개 유전자)만을 선별하였다.
miRNA의 경우, 정상 조직(10샘플)과 암조직(20샘플)에서 확보한 expression array를 이용하여 정상조직대비 암조직에서 발현량 변화가 많은 유전자를 1차로 확보(601개 miRNA)하였고, 1차 데이터를 검증하기 위하여, 별도의 정상조직(5샘플)과 암조직(18)에서 NGS를 통하여 확보한 정상조직대비 암조직에서의 발현량에서도 지속적으로 차이를 보이는 miRNA(70개)만을 선별하였다.
최종적으로, 정상조직대비 비침습성 암조직에서 발현량 차이를 보이는 mRNA 및 microRNA를 발굴하였고, 이들 mRNA와 miRNA가 서로 결합한다는 실험적 결과와 시퀀싱비교 분석 결과를 기반으로 본 연구에서 확보한 mRNA(522개 유전자)와 miRNA(70개)가 상호결합하면서 상호작용(negative correlation)이 있는 것만을 재분석한 결과 54개 miRNA가 227개 유전자를 조절하고 있음을 발굴하였다.
이들 54개 miRNA와 227개 유전자는 비침습방광암(NMIBC)에서 암 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 기대되며, 비칩습성 방광암 진단용 키트를 개발하기 위한 컨텐츠로서 활용가능성이 기대된다.
약어 설명
BC: Bladder cancer
ECM: Extracellular matrix
ETM: Epithelial-mesenchymal transition
FDR: False discovery rate
MIBC: Muscle invasive bladder cancer
miRNA: microRNA
MOXD1: Monooxygenase DBH-like 1
NMIBC: Non-muscle invasive bladder cancer
TCC: Tag count comparison
TCGA: The cancer genome atlas
TF: Transcription factor
TRED: Transcriptional regulatory element database
TUR: Transurethral resection
TYMS: Thymidylate synthetaset
본 발명은 정상조직에 비하여 침습성 방광암(MIBC)에서 차별적으로 발현되는 유전자 정보와 유전자-miRNA 관계를 형성하는 유전자 및 miRNA를 제공하고 이를 이용한 침습성 방광암 진단용 유전자칩 키트를 제공함으로써 고위험 환자군 선별에 있어 임상적 활용성이 가능하고 개별 환자의 맞춤형 치료에 도움이 되어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (9)

  1. miR-371a-5p로 이루어진 것을 특징으로 하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커 조성물
  2. 제1항에 있어서, 침습성 방광암 진단용 바이오마커 조성물은 miR-483-3p, miR-331-3p, miR-4492, miR-302c-3p 및 miR-4634로 이루어진 miRNA 군 중에서 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 침습성 방광암 진단용 바이오마커 조성물
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