KR102029775B1 - 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102029775B1
KR102029775B1 KR1020180008223A KR20180008223A KR102029775B1 KR 102029775 B1 KR102029775 B1 KR 102029775B1 KR 1020180008223 A KR1020180008223 A KR 1020180008223A KR 20180008223 A KR20180008223 A KR 20180008223A KR 102029775 B1 KR102029775 B1 KR 102029775B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
bladder cancer
invasive bladder
seq
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
KR1020180008223A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190089552A (ko
Inventor
김원재
윤석중
이종영
정필두
Original Assignee
충북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충북대학교 산학협력단 filed Critical 충북대학교 산학협력단
Priority to KR1020180008223A priority Critical patent/KR102029775B1/ko
Publication of KR20190089552A publication Critical patent/KR20190089552A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102029775B1 publication Critical patent/KR102029775B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

본 발명은 비근침윤성 방광암 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 비근윤성 방광암 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 키트 또는 마이크로어레이; 및 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비근윤성 방광암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명은 정상조직 대비 비근침윤성 방광암에서 이상발현되는 새로운 miRNA를 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 외과적 시술 없이 비침습적인 방법으로 방광암을 빠르고 신속하게 진단(감별)할 수 있다.

Description

비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for diagnosis of Non-muscle invasive bladder cancer and uses thereof}
본 발명은 비근침윤성 방광암 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 비근윤성 방광암 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 키트 또는 마이크로어레이; 및 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비근윤성 방광암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
방광암(bladder cancerM, BC)은 비뇨기계 영역에서 가장 빈번하게 발생하는 암으로서, 서양에서는 매년 인구 10만 명당 16.5명이 발병하는데 비하여 한국에서는 4.5명이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 이처럼 서양에 비하여는 발생률이 낮으나, 해마다 발생률이 높아지고 있으며, 우리나라에서는 비뇨기계 암 중 가장 발생빈도가 높은 암으로 알려져 있다(Lee C, et al., 1992).
방광암은 침윤정도에 따라 크게 비침윤성(non-muscle invasive) 방광암과 침윤성(invasive) 방광암으로 구분된다. 비침윤성 방광암은 암이 근육층의 침범 없이 점막에 국한된 병변으로써 경요도 방광절제술(transurethral resection of bladder tumor) 또는 방광 내 항암제 또는 BCG를 주입함으로써 비교적 간단하게 치료가 가능하나, 암의 재발과 침윤성 암으로의 진행이 문제가 된다. 한편, 침윤성 방광암은 암이 근육층까지 침투한 상태를 말하는 것으로서, 이의 치료를 위하여는 근치적 방광적출술과 함께 복잡한 요로전환(urinary diversion)을 수행하여야 할 뿐 아니라, 환자에게 치명적인 결과를 초래할 수도 있다.
따라서, 일차 치료 후 재발과 진행에 대한 예측과 조기발견 및 예방이 매우 중요하다.
이러한 배경하에, 본 발명는 코호트 연구를 통해 방광암 질환으로 진단된 141명의 환자 및 방광암이 없는 83명의 환자를 대상으로 하여 특정 기간 동안 주기적인 추적 검사를 통해 환자의 임상적인 데이터를 평가하였으며, 이러한 정보에 근거하여 비근침윤성 방광암에서 특정 miRNA 및 mRNA의 발현 양상이 정상조직과 차별화되며 miRNA-mRNA 사이의 상호작용을 규명함으로써 이들 바이오마커가 비근침윤성 방광암 진단에 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1750146호 한국등록특허 제10-1683961호 한국등록특허 제10-1557183호
따라서 본 발명의 목적은 비근침윤성 방광암을 효과적으로 진단(감별)할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단(감별)용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단(감별)용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바이오마커를 이용하여 비근침윤성 방광암을 효과적으로 진단(감별)하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 miR-1260a는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-149는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-191는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-335는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-34a는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-484는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-5701는 서열번호 7의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 ABCA8, ACTA2, ACTN1, ADAMTS1, ADAMTS8, AKAP12, ANTXR2, AOC3, ASF1B, ATP1A2, ATP8B2, AURKB, AXIN2, AXL, BCL2, BHMT2, BIN1, BNC2, BOC, C1S, CACHD1, CALD1, CAV1, CAV2, CCL19, CD14, CD1D, CD37, CD8A, CDC20, CDH11, CDKN1C, CELSR3, CENPM, CEP55, CFI, CGNL1, CHN1, CLIC4, CNN3, COL18A1, COL21A1, COL3A1, COL6A1, COL6A2, COLEC12, CPE, CREB5, CRISPLD2, CRTAP, CSF1R, CTGF, CYBRD1, CYGB, CYR61, CYTL1, CYYR1, DACH1, DACT1, DDR2, DENND2A, DKK3, DLG2, DNASE1L3, DOCK11, DPYSL2, DSTN, DTL, E2F2, EDNRA, EGR1, EGR2, EOMES, EPB41L2, EPB41L3, ESR1, F10, F3, FAM110B, FAM129A, FAM20C, FBLN2, FBLN5, FGF9, FGL2, FHL1, FILIP1L, FLNA, FNBP1, FOS, FZD1, FZD10, GABARAPL1, GAS1, GATA5, GFPT2, GJA1, GLT8D2, GNA14, GNG7, GPR124, GPR162, GSN, GZMK, HBB, HCST, HHIP, HLA-DRB5, HOXA9, IGFBP5, ITGA8, ITGB2, ITK, ITM2A, ITPR1, JAZF1, JUN, KATNAL1, KCNMB1, KDELC2, KIAA0513, KIAA1644, KLF2, KLF9, KLRB1, KRT7, LAMC2, LIFR, LITAF, LMO3, LMOD1, LPPR4, LTBP4, MAFB, MAOB, MAP1B, METTL7A, MFGE8, MGLL, MGP, MOXD1, MXRA8, MYH11, MYLK, NAALAD2, NFIB, NFIL3, NFIX, NKG7, NPTN, NR2F1, OLFML3, OTUD1, P2RX1, PALLD, PAPPA, PAX8, PCOLCE2, PDE5A, PDGFC, PDGFD, PDK4, PLA2G4A, PLSCR4, PODN, POLQ, PPAP2A, PPAP2B, PRDM8, PRICKLE1, PRICKLE2, PRNP, PROS1, PTGIS, PTRF, RAB23, RARRES2, RASD1, RECK, RERG, RHOB, RNASE4, RNF150, ROR2, RORB, RTN4, RUNX1T1, RUNX3, SCARA5, SCRG1, SERPINF1, SERPING1, SFRP1, SLC46A2, SMOC2, SNCA, SORBS2, SORCS2, STAT4, STMN3, SYNPO2, TAGLN, TCF21, TCF4, TGFB3, TGFBI, TGFBR2, TGM2, TIMP2, TLR1, TMEM119, TNC, TPM1, TPM2, TSC22D3, TSHZ3, TUBB2A, TYMS, UCHL1, VASN, VCAM1, VEGFA, VIM, VNN2, ZBTB16, ZEB2 및 ZFP36L1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명은 정상조직 대비 비근침윤성 방광암에서 이상발현되는 새로운 miRNA를 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 외과적 시술 없이 비침습적인 방법으로 방광암을 빠르고 신속하게 진단(감별)할 수 있다.
도 1은 비근침윤성 방광암에서 음의 상관 관계가 있는 유전자-miRNA 쌍을 보여주는 모식도이다. 차별적으로 발현된 mRNA와 miRNA를 발현정도의 변화(fold change) 및 p-value 기준의 변화에 따라 동정하였다. miRNA-표적된 유전자 쌍을 mRNA-miRNA 상호 작용에 관한 이전에 검증된 정보에 따라 비근침윤성 방광암 대비 정상 조직에서 차별적으로 발현된 miRNA 및 mRNA를 사용하여 동정하였다.
도 2는 방광암에서 차별적으로 발현되는 mRNA와 miRNA를 보여주는 벤 다이어그램을 나타낸 것이다(A: mRNA 발현, B: miRNA 발현).
도 3은 방광암에서 쌍을 이루는 유전자와 miRNA를 보여주는 벤 다이어그램을 나타낸 것이다(A: 유전자-miRNA 상호작용에 관련된 유전자, B: 유전자-miRNA 상호작용에 관련된 miRNA).
본 발명은 비근침윤성 방광암 진단을 위한 바이오커에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비근침윤성 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)"이란, 암이 근육층의 침범 없이 점막에 국한된 병변을 가지는 방광암으로서 ‘비침윤성 방광암’ 또는 ‘표재성 방광암’이라고도 불린다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 방광암의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 총 7개의 miRNA 중 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비근침윤성 방광암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 miR-1260a는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-149는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-191는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-335는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-34a는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-484는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-5701는 서열번호 7의 염기서열로 이루어질 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 7로 기재된 염기서열은 비근침윤성 방광암의 진행 또는 발병 여부를 진단할 수 있는 진단 마커로 활용될 수 있으며, 상기 서열은 비근침윤성 방광암의 진행 또는 발명 여부를 진단하는데 있어서 일정정도 변형이 가능하다. 본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 비근침윤성 방광암 진단 마커로서 정상 개체와 방광암 질환을 가진 개체 간에 발현량 차이를 유의있게 비교 가능하는 한, 본 발명의 상기 염기서열과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 비근침윤성 방광암 질환을 가진 개체를 정상 세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 방광암이 진행 또는 발병된 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 비근침윤성 방광암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 비근침윤성 방광암 세포에서 특이적으로 발현 수준의 차이를 보이는 miRNA 또는 해당 miRNA의 단편이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA 또는 이의 단편의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 해당 miRNA 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 비근침윤성 방광암 진단 마커로서 활용될 수 있는 miRNA를 도출하였다. 상기 miRNA는, 조직학적으로 방광암으로 진단된 141명의 환자 및 방광암이 없는 83명의 환자의 조직 샘플을 마이크로 어레이 및 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 분석하였다.
표 2 및 표 3에 개시한 바와 같이, 정상조직과 비교하여 비근침윤성 방광암에서 차별화되게 발현되는 miRNA 및 mRNA의 비교 결과, 비근침윤성 방광암에서 특이적으로 그 발현량이 하향 조절 또는 상향 조절되는 총 54개의 miRNA 및 이와 쌍을 이루는 총 227개의 유전자(역발현 관계: miRNA 발현이 증대되는 경우 표적 유전자의 발현이 감소되며, miRNA 발현이 감소되는 경우 표적 유전자의 발현이 증대됨)를 도출할 수 있었다.
비근침윤성 방광암에서 상향 조절되는 miRNA로는 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1260a, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-149-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-191-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-34a-5p, miR-34c-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-484, miR-5701, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p 및 miR-96-5p 등이 있음을 확인하였으며, 하향 조절되는 miRNA로는 miR-125b-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-214-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-411-5p 및 miR-99a-5p 등이 있음을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 도출된 54개의 miRNA는 이전에 보고된 190개의 miRNA와 비교 분석한 결과 비근침윤성 방광암에서 7개의 새로운 miRNA(miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701)를 확인하였으며, 상기 7개의 신규 miRNA는 GSE40355 및 TCGA로부터 RNA 서열을 사용하여 비근침윤성 방광암에서 이상발현되는 것을 검증하였다.
본 발명의 비근침윤성 방광암 바이오마커로서 신규한 상기 7개의 miRNA는 정상조직 대비 모두 상향 조절되는 것을 확인하였다(표 3 참조).
이러한 결과를 통하여, 상기 다양한 miRNA들은 비근침윤성 방광암 질환이 있는 경우 발현량이 증가 또는 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 본 발명의 7개의 새로운 miRNA(miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701)를 비롯한 다양한 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하면 비근침윤성 방광암을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물을 제공할 수 있으며, 또한, 본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 조성물은 상기 7개의 새로운 miRNA 이외에 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 ABCA8, ACTA2, ACTN1, ADAMTS1, ADAMTS8, AKAP12, ANTXR2, AOC3, ASF1B, ATP1A2, ATP8B2, AURKB, AXIN2, AXL, BCL2, BHMT2, BIN1, BNC2, BOC, C1S, CACHD1, CALD1, CAV1, CAV2, CCL19, CD14, CD1D, CD37, CD8A, CDC20, CDH11, CDKN1C, CELSR3, CENPM, CEP55, CFI, CGNL1, CHN1, CLIC4, CNN3, COL18A1, COL21A1, COL3A1, COL6A1, COL6A2, COLEC12, CPE, CREB5, CRISPLD2, CRTAP, CSF1R, CTGF, CYBRD1, CYGB, CYR61, CYTL1, CYYR1, DACH1, DACT1, DDR2, DENND2A, DKK3, DLG2, DNASE1L3, DOCK11, DPYSL2, DSTN, DTL, E2F2, EDNRA, EGR1, EGR2, EOMES, EPB41L2, EPB41L3, ESR1, F10, F3, FAM110B, FAM129A, FAM20C, FBLN2, FBLN5, FGF9, FGL2, FHL1, FILIP1L, FLNA, FNBP1, FOS, FZD1, FZD10, GABARAPL1, GAS1, GATA5, GFPT2, GJA1, GLT8D2, GNA14, GNG7, GPR124, GPR162, GSN, GZMK, HBB, HCST, HHIP, HLA-DRB5, HOXA9, IGFBP5, ITGA8, ITGB2, ITK, ITM2A, ITPR1, JAZF1, JUN, KATNAL1, KCNMB1, KDELC2, KIAA0513, KIAA1644, KLF2, KLF9, KLRB1, KRT7, LAMC2, LIFR, LITAF, LMO3, LMOD1, LPPR4, LTBP4, MAFB, MAOB, MAP1B, METTL7A, MFGE8, MGLL, MGP, MOXD1, MXRA8, MYH11, MYLK, NAALAD2, NFIB, NFIL3, NFIX, NKG7, NPTN, NR2F1, OLFML3, OTUD1, P2RX1, PALLD, PAPPA, PAX8, PCOLCE2, PDE5A, PDGFC, PDGFD, PDK4, PLA2G4A, PLSCR4, PODN, POLQ, PPAP2A, PPAP2B, PRDM8, PRICKLE1, PRICKLE2, PRNP, PROS1, PTGIS, PTRF, RAB23, RARRES2, RASD1, RECK, RERG, RHOB, RNASE4, RNF150, ROR2, RORB, RTN4, RUNX1T1, RUNX3, SCARA5, SCRG1, SERPINF1, SERPING1, SFRP1, SLC46A2, SMOC2, SNCA, SORBS2, SORCS2, STAT4, STMN3, SYNPO2, TAGLN, TCF21, TCF4, TGFB3, TGFBI, TGFBR2, TGM2, TIMP2, TLR1, TMEM119, TNC, TPM1, TPM2, TSC22D3, TSHZ3, TUBB2A, TYMS, UCHL1, VASN, VCAM1, VEGFA, VIM, VNN2, ZBTB16, ZEB2 및 ZFP36L1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 비근침윤성 방광암 진단 마커인, 상기 총 7개의 miRNA(miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701) 중 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정(확인)함으로써 피험체를 대상으로 하여 비근침윤성 방광암을 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 비근침윤성 방광암 진단용 키트에는 상기 총 7개의 miRNA(miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701) 중 하나 이상의 miRNA를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 총 7개의 miRNA(miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701) 중 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 유전자 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 7개의 새로운 miRNA 이외에 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있으며; 또한, ABCA8, ACTA2, ACTN1, ADAMTS1, ADAMTS8, AKAP12, ANTXR2, AOC3, ASF1B, ATP1A2, ATP8B2, AURKB, AXIN2, AXL, BCL2, BHMT2, BIN1, BNC2, BOC, C1S, CACHD1, CALD1, CAV1, CAV2, CCL19, CD14, CD1D, CD37, CD8A, CDC20, CDH11, CDKN1C, CELSR3, CENPM, CEP55, CFI, CGNL1, CHN1, CLIC4, CNN3, COL18A1, COL21A1, COL3A1, COL6A1, COL6A2, COLEC12, CPE, CREB5, CRISPLD2, CRTAP, CSF1R, CTGF, CYBRD1, CYGB, CYR61, CYTL1, CYYR1, DACH1, DACT1, DDR2, DENND2A, DKK3, DLG2, DNASE1L3, DOCK11, DPYSL2, DSTN, DTL, E2F2, EDNRA, EGR1, EGR2, EOMES, EPB41L2, EPB41L3, ESR1, F10, F3, FAM110B, FAM129A, FAM20C, FBLN2, FBLN5, FGF9, FGL2, FHL1, FILIP1L, FLNA, FNBP1, FOS, FZD1, FZD10, GABARAPL1, GAS1, GATA5, GFPT2, GJA1, GLT8D2, GNA14, GNG7, GPR124, GPR162, GSN, GZMK, HBB, HCST, HHIP, HLA-DRB5, HOXA9, IGFBP5, ITGA8, ITGB2, ITK, ITM2A, ITPR1, JAZF1, JUN, KATNAL1, KCNMB1, KDELC2, KIAA0513, KIAA1644, KLF2, KLF9, KLRB1, KRT7, LAMC2, LIFR, LITAF, LMO3, LMOD1, LPPR4, LTBP4, MAFB, MAOB, MAP1B, METTL7A, MFGE8, MGLL, MGP, MOXD1, MXRA8, MYH11, MYLK, NAALAD2, NFIB, NFIL3, NFIX, NKG7, NPTN, NR2F1, OLFML3, OTUD1, P2RX1, PALLD, PAPPA, PAX8, PCOLCE2, PDE5A, PDGFC, PDGFD, PDK4, PLA2G4A, PLSCR4, PODN, POLQ, PPAP2A, PPAP2B, PRDM8, PRICKLE1, PRICKLE2, PRNP, PROS1, PTGIS, PTRF, RAB23, RARRES2, RASD1, RECK, RERG, RHOB, RNASE4, RNF150, ROR2, RORB, RTN4, RUNX1T1, RUNX3, SCARA5, SCRG1, SERPINF1, SERPING1, SFRP1, SLC46A2, SMOC2, SNCA, SORBS2, SORCS2, STAT4, STMN3, SYNPO2, TAGLN, TCF21, TCF4, TGFB3, TGFBI, TGFBR2, TGM2, TIMP2, TLR1, TMEM119, TNC, TPM1, TPM2, TSC22D3, TSHZ3, TUBB2A, TYMS, UCHL1, VASN, VCAM1, VEGFA, VIM, VNN2, ZBTB16, ZEB2 및 ZFP36L1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수도 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.
상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.
마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데, 구체적으로 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
자세하게는, 상기 (a) 단계에서 miRNA 또는 이의 단편의 발현수준을 측정한 후, 상기 (b) 단계에서 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하여, miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 발현수준이 유의하게 증가하는 경우 비근침윤성 방광암이 진행 또는 발병된 것으로 판정할 수 있다.
이때, 상기 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 miR-1260a는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-149는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-191는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-335는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-34a는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-484는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-5701는 서열번호 7의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 총 7개의 miRNA 중 하나 이상의 miRNA를 측정하는 단계와 함께, miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
개체로부터 분리된 생물학적 시료는 피험자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 예시할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 비근침윤성 방광암의 진행 또는 발병을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하고, miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비근침윤성 방광암의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 비근침윤성 방광암의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법은 (ⅰ) 대조군인 비근침윤성 방광암이 발병된 실험동물의 시료로부터 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; (ⅱ) 상기 실험동물에 비근침윤성 방광암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및, (d) 대조군에서 측정된 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 비근침윤성 방광암의 진행 또는 발병을 방지하는 예방하거나 치료하는 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
비근침윤성 방광암을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포, 보다 바람직하게는 요로상피세포에서의 본 발명의 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 miRNA 또는 이의 단편의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 비근침윤성 방광암의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
또한, 상기 miRNA 이외에 비근침윤성 방광암에서 상향 조절되는 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1260a, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-149-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-191-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-34a-5p, miR-34c-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-484, miR-5701, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p 및 miR-96-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 감소시키는 물질을 비근침윤성 방광암 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
아울러, 비근침윤성 방광암에서 하향 조절되는 miR-125b-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-214-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-411-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 증가시키는 물질을 비근침윤성 방광암 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편을 표적으로 한 억제제를 유효성분으로 포함하는 비근침윤성 방광암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 치료용 조성물은 추가적으로 miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1260a, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-149-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-191-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-34a-5p, miR-34c-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-484, miR-5701, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p 및 miR-96-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편을 표적으로 한 억제제를 더 포함할 수 있으며; 또한, 상기 치료용 조성물을 추가적으로 iR-125b-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-214-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-411-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA 또는 이의 단편을 표적으로 한 증진제를 더 포함할 수 있다.
상기 miRNA들 또는 이의 단편을 표적으로 한 억제제에는, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는, 상기 miRNA들 또는 이의 단편에 특이적인 siRNA, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 화합물 형태일 수 있다.
상기 miRNA들 또는 이의 단편을 표적으로 한 증진제에는, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는, 상기 miRNA들 또는 이의 단편에 특이적인 화합물 또는 그 유사체(mimic) 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유사체(mimic)"란, miRNA 작용을 모방하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 유사체에 의해 치료적으로 표적이 될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머(aptamer)"란, 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스"란, 유전자 발현을 방해하고 특정한 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 인지하거나 결합할 수 있도록 설계된 분자를 말한다. 안티센스 분자는 전형적으로 RNA 분자 상에 존재하는 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"란, DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드로 구성된 한 분자이며, "올리고뉴클레오티드 유사체"란 용어는, 올리고뉴클레오티드-유사 구조를 포함하는 한 분자이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "리보자임(ribozyme)"이란, 효소 활성이 있는 RNA 분자를 의미하는 것으로서, 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 생체 내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용 가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 본 발명의 목적상 RNA 기질을 절단할 수 있다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 방법
환자(조사 대상)
본 연구 코호트에서는 조직학적으로 방광 요로상피세포암으로 진단된 141명의 환자 및 방광암이 없는 83명의 환자를 포함하였다. 종양 수준은 표준 기준에 따라 평가되었다. 상기 방광암은 비근침윤성 방광암(Non Muscle Invasive Bladder Cancer, 이하 간략하게 ‘NMIBC’라 표시함)으로 세부 분류하였고, 일반적으로 경요도절제술(Transurethral resection, TUR) 치료를 진행한 환자는 처음 2년 동안은 3개월마다, 이후 3년 동안은 6개월마다, 이후로는 매년 주기적으로 방광내시경 및 비뇨기 세포 검사를 실시하였다. 모든 환자에 대해 후향적으로 임상적인 데이터를 평가하였다. 이들 환자의 평균 추적 관찰 기간은 71개월(중앙값 61개월, 범위 15-115개월)이었다. 양성 질환에서 정상적인 점막은 종양 및 실제 정상 점막으로부터 멀리 수집되었다. 모든 검체는 액체 질소에서 급속 동결시키고 사용할때까지 80℃에서 보관하였다. 샘플의 수집 및 분석은 충북 대학교 기관 심의위원회 (IRB 승인 번호 : 2006-01-001 및 GR2010-12-010)으로부터 승인을 받았으며 각 피험자로부터 정보에 근거한 동의를 얻었다.
데이터 세트
높은 처리량 분자 데이터 세트는 두가지 기술을 이용하여 miRNA에 대해 생성되었다. 마이크로 어레이 및 RNA 시퀀싱 mRNA 데이터는 RNA 시퀀싱에 의해 생성되었다. 상기 분석은 이전 본 연구 그룹에서 이전에 발표한 (Gene Expression Omnibus accession number GSE13507) 마이크로 데이터세트를 포함한다. 샘플 사이즈는 하기 표 1에서 자세히 나타내었다.
라이브러리 준비 및 데이터 생성
[RNA 추출]
TRIzol 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 지시된 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 제조자의 지시에 따라 페놀을 기초로 한 추출 방법을 사용하여 정제를 수행하였다. NanoDrop ND-1000 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고, RNA 6000 Nano Kit (Agilent, Santa Clara, CA)를 사용하여 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA)에서 RIN(RNA integrity number)를 평가하였다.
[miRNA 마이크로 어레이]
각 샘플의 총 RNA (100 ng)를 탈인산화시키고, Cy3-pCp로 3‘ 말단을 표지하고, Micro Bio-Spin 컬럼으로 정제하고, 건조시키고, miRNA 마이크로 어레이 시스템 라벨링 키트 (Illumina, San Diego, CA) 및 Agilent Human miRNA Microarray Release 16.0 플랫폼(1,205 개의 인간과 144 개의 바이러스 miRNA가 포함)을 이용하여 혼성화시켰다. 마이크로어레이 유전자 발현 데이터 세트를 생성하는데 사용되는 프로토콜은 참조로 제공되었다.
[기준 mRNA 라이브러리 구축]
mRNA 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq Stranded mRNA 샘플 준비 키트 (RS-122-2101) (Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 준비되었다. Oligo dT 부착 자성 비드를 사용하여 총 RNA 1㎍에서 poly-A 함유 mRNA를 정제하였다. 이후, 정제된 mRNA를 짧은 단편으로 분절하고, SuperScript II 역전사 효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 랜덤 헥사 머를 사용하여 제 1 가닥 cDNA를 합성하였다. 양쪽 말단에 연결된 어댑터를 갖는 cDNA는 PCR을 통해 증폭되었다. cDNA 라이브러리 크기와 품질은 2100 BioAnalyzer에서 Agilent DNA 1000 Kit (부품 번호 5067-1504)를 사용하여 전기 영동으로 평가하였다. 이어서, 라이브러리를 Illumina HiSeq 2500에서 시퀀싱하였다. 이미지 분석은 HiSeq 제어 소프트웨어 버전 2.2.58을 사용하여 수행하였다. 로우 데이터를 처리하고 표준 Illumina 파이프 라인 (CASAVA 버전 1.8.2 및 RTA 버전 1.18.64)을 사용하여 base calling을 수행하였다.
[small mRNA 라이브러리 구축]
TruSeq Small RNA 샘플 준비 프로토콜 (RS-200-0012) (Illumina, San Diego, CA)을 사용하여 small RNA 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. Illumina 어댑터는 3'- 히드록실기 및 5'- 인산염을 갖는 마이크로 RNA 분자에 직접적으로 및 특이적으로 연결시켰다. 어댑터-연결 RNA 및 증폭 라이브러리의 품질 및 크기 분포는 고감도 DNA 분석 키트 (Cat. # 5067-4626) (Agilent, Santa Clara, CA)를 사용하여 확인하였다. 라이브러리는 NGS(KK4824)(Kapa Biosystems, Wilmington, MA)를 위한 라이브러리 정량 키트를 사용하여 정량화되었다. 이후, 라이브러리는 Illumina HiSeq 2500에서 시퀀싱되었다. HiSeq 시퀀싱 제어 소프트웨어 버전 2.2.58을 사용하여 실시간 이미지 분석 및 base calling을 수행하였다. CASAVA 소프트웨어 버전 1.8.2와 RTA 버전 1.18.64는 FASTQ 시퀀스 파일의 역 다중화(de-multiplexing) 및 생성(generation)에 사용되었다.
데이터 분석
[마이크로어레이]
R 패키지에서 The Robust Multiarray Average는 전역 정정, 양자화 표준화 및 중앙 폴란드어 요약을 수행하는데 사용되었다. 비드 mRNA 신호 강도로부터 P 값 (t 테스트)을 계산하였다(Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003; 4:249-264.).
[mRNA 시퀀싱]
총 시퀀싱 리드는 다음과 같은 전처리를 거쳤다 : 어댑터 절단은 기본 매개 변수가 있는 cutadapt를 사용하여 수행되었으며 품질 조정 (Q30)은 기본 매개 변수가 있는 FastQC를 사용하여 수행되었다. 처리된 판독은 기본 매개 변수를 사용하여 tophat 및 cufflink를 사용하여 인간 참조 게놈 (Ensembl 72 [GRCh37 : hg19])에 매핑되었다. FPKM 값은 통계적 유의성 (예 : P 및 Q 값) 및 차별화되는 발현(예 : -fold changes) 을 결정하기 위해 R 패키지 태그 카운트 비교 (Tag Count Comparison, TCC)를 사용하여 정규화 및 정량화되었다.
[miRNA 시퀀싱]
총 시퀀싱 리드는 어댑터 트리밍, 품질 트리밍, 크기 선택 (17-24nt) 및 기본 매개 변수가 있는 mirDeep2를 사용한 클러스터링과 같은 전처리를 거쳤다. 전처리된 클러스터 대표자를 인간 참조 게놈 (Ensembl 72 [GRCh37; hg19])에 매핑하고, miRNA 영역을 miRBase 기준좌표계(reference coordinates)에 대하여 추출했다. 총 리드 카운트를 R package edgeR를 사용하여 m-값 표준화 및 정량화를 통해 정리하고, 통계적 유의성 (예 : P 및 Q 값) 및 차별화되는 발현(예 : -fold changes)을 결정하였다.
[차별적으로 발현되는 miRNA 및 mRNA의 통합 분석]
각 기술을 사용하여 얻은 데이터의 경우 차별적으로 발현된 mRNA와 miRNA를 확인하기 위해 여러 가지 컷 오프(cut-offs)를 사용하였다. 처음에는 p 값 (P≤0.05)을 위한 기준치 및 -fold changes (log2FC≥1.0)에 대한 임계값을 마이크로어레이 데이터 세트에 적용하였다. mRNA (FPKM ≥ 0.3, P≤ 0.05, FDR ≤ 0.05, log2FC ≥ 1.0)와 miRNA (판독 횟수 ≥ 10, P≤0.0, FDR ≤ 0.05 및 log2FC ≥ 1.0)가 RNA 시퀀싱 데이터 세트의 임계 값이었다). 마지막으로 마이크로어레이 데이터 세트와 mRNA-Seq 데이터 세트에 공통적인 mRNA를 검증된 mRNA로 선택하였다. 마이크로어레이 데이터 세트와 miRNA-Seq 데이터 세트에 공통적인 miRNA가 검증된 miRNA로 선택되었다. 선택된 mRNA 및 miRNA는 유효성이 검증된 표적 데이터 세트 및 역 발현 관계(즉, miRNA 발현이 증대되는 것은 표적이 감소되는 또는 그 반대의 경우)에 따라 쌍을 이룹니다.
[경로 강화 분석]
경로 강화 분석(Pathway enrichment analysis)은 선택된 miRNA를 DIANA mirPath V3.0에 제출하여 수행되었다. 유의미한 상관 관계가 있고 강화된 경로는 특이적 miRNA에 대해 피셔의 메타 분석법을 사용하여 중요한 p 값을 계산함으로써 확인하였다. 마지막으로 유전자 목록은 기존 데이터베이스로부터 상호 기능 네트워크를 확인하기 위해 GeneMANIA를 사용하여 검증하였다.
2. 결과
NMIBC 조직과 정상 조직 사이에서 차별적으로 발현되는 유전자 동정
mRNA의 측정은 도 1과 같이 수행되었다. NMIBC(비근침윤성 방광암)와 정상 조직에서 차별적으로 발현되는 522 개의 유전자를 추출하였다. 모든 유전자는 두 번째 코호트로부터 RNA 시퀀싱을 통해 검증되었다. Venn 도표는 NMIBC에서 522 유전자 중 402 유전자가 정상 조직과 비교하여 배타적으로 이상조절되는 것을 보여주었다(도 2A 참조). 상기 유전자의 생물학적 기능을 이해하기 위해 GeneMANIA 및 STRING을 사용하여 네트워크 강화 분석을 수행했하였다. NMIBC에서 402/522 차별적으로 발현된 유전자는 세포 외 기질 (Extracellular matrix, ECM) (FDR, 1.35E-17) 및 세포 외 구조 조직 (FDR, 2.98E-13)과 강하게 연관되어있는 것으로 나타났다(하기 표 1 참조). 세포 분열에서 핵 분열과 G2/M 전이와 관련된 기능을 하는 72 개의 유전자는 방광암과 정상 조직 사이에 다른 발현을 보였다.
NMIBC 및 정상 조직 사이의 차별화된 발현을 보이는 402 유전자의 생물학적 기능
Biological Functions FDR Genes in network
Extracellular matrix 1.35E-17 35
Extracellular structure organization 2.98E-13 35
Extracellular matrix organization 2.98E-13 35
Platelet alpha granule 1.46E-05 12
Platelet activation 1.46E-05 21
Multicellular organismal metabolic process 3.61E-05 14
Extracellular matrix disassembly 6.17E-05 15
Collagen metabolic process 6.17E-05 13
Platelet alpha granule lumen 7.54E-05 10
Endoplasmic reticulum lumen 7.54E-05 16
Multicellular organismal macromolecule metabolic process 7.54E-05 13
Proteinaceous extracellular matrix 0.000103 14
NMIBC 조직과 정상 조직 사이에서 차별적으로 발현되는 miRNA의 동정
miRNA는 도 1과 같이 결정되었다. 본 연구에서는 정상조직에 비하여 NMIBC에서 차별화되게 발현되는 70 개의 miRNA를 추출하였으며, 두 번째 코호트에서 RNA 시퀀싱을 통해 검증하였다. Venn 도표는 58 개의 miRNA가 정상군 대비 NMIBC에서 배타적으로 이상발현되는 것을 보여준다(도 2B 참조).
NMIBC 특이적 유전자- miRNA 상호 작용
본 연구에서는 NMIBC에 특이적인 검증된 mRNA와 miRNA를 기반으로 하여 유전자 miRNA 상호 작용을 확인하였다. 이 분석은 두 단계로 진행되었다. 첫째, miRWalk 2.0에서 mirTarBase v6로부터 실험적으로 검증된 데이터세트에 기반하여 후보 유전자 타겟 miRNAs를 동정하였다. 이를 통해 우리는 mRNA 발현 프로파일(NMIBC vs 정상)로부터 유도된 522개의 NMIBC 유전자에 대해 8,542개의 유전자-miRNA 상호작용 쌍을 얻을 수 있었다. 다음으로, 상기 유전자-miRNA 상호작용 쌍 중에서, 정상 대비 NMIBC에서 차이를 더 분석하기 위하여 서로 쌍을 이루는 두드러지게 발현된 유전자 및 miRNA를 선별하였다. 결과적으로 NMIBC에서 54 개의 miRNA 및 이와 쌍을 이루는 227 개의 유전자를 얻었다(하기 도 3 및 표 2 참조). 본 연구에서 도출된 54개의 miRNA는 이전에 보고된 190개의 miRNA와 비교하였으며, 그 결과 NMIBC에서 7개의 새로운 miRNA (miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701)를 확인할 수 있었다(하기 표 3 참조). 한편, miRNA-mRNA 상호 작용 유전자의 생물학적 복제를 검증하기 위해 AnaltAnlyzer를 이용하여 GSE 및 암 게놈지도(The cancer genome atlas, TCGA) 데이터를 모집하고 재분석하였다. 최종적으로, 상기 7개의 신규 miRNA는 GSE40355 및 TCGA로부터 RNA 서열을 사용하여 NMIBC에서 발현이 검증된 것으로서, 차별적으로 발현된 분석으로부터 130개의 유전자와 음성적인 관련성을 갖는 것으로 나타났다. miRNA와 상호 작용하는 유전자의 생물학적 기능을 이해하기 위해 선택된 유전자를 GeneMANIA 및 STRING을 사용하여 네트워크 강화 분석에 적용하였다. 그 결과 NMIBC에서 차별적으로 발현된 221 개의 유전자가 ECM (FDR, 4.60E-18) 및 세포 외 구조 형성(FDR, 1.72E-11)과 강력하게 연관되어 있는 것을 발견하였다(하기 표 4 참조).
Figure 112018007912170-pat00001
Figure 112018007912170-pat00002
Figure 112018007912170-pat00003
Figure 112018007912170-pat00004
Figure 112018007912170-pat00005
Figure 112018007912170-pat00006
Figure 112018007912170-pat00007
NMIBC 및 정상 조직 사이의 차별화된 발현을 보이는 유전자-miRNA 쌍으로부터 217 유전자의 생물학적 기능
Biological Functions FDR Genes in network
Extracellular matrix 4.60E-18 29
Extracellular structure organization 1.72E-11 26
Extracellular matrix organization 1.72E-11 26
Proteinaceous extracellular matrix 4.58E-06 13
Muscle contraction 4.53E-05 15
Extracellular matrix disassembly 8.44E-05 12
Muscle system process 1.47E-04 15
Muscle structure development 1.47E-04 16
Muscle organ development 4.57E-04 13
Actin cytoskeleton 6.63E-04 16
Transmembrane receptor protein S 6.63E-04 16
Serine/threonine kinase signaling pathway 8.59E-04 14
Figure 112018007912170-pat00008
Figure 112018007912170-pat00009
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
BC: Bladder cancer
ECM: Extracellular matrix
FDR: False discovery rate
MIBC: Muscle invasive bladder cancer
miRNA: microRNA
MOXD1: Monooxygenase DBH-like 1
NMIBC: Non-muscle invasive bladder cancer
TCC: Tag count comparison
TCGA: The cancer genome atlas
TUR: Transurethral resection
TYMS: Thymidylate synthetaset
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Biomarkers for diagnosis of Non-muscle invasive bladder cancer and uses thereof <130> NPDC-66059 <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1260a <400> 1 aucccaccuc ugccacca 18 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-149-5p <400> 2 ucuggcuccg ugucuucacu ccc 23 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-191-5p <400> 3 caacggaauc ccaaaagcag cug 23 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-335-3p <400> 4 uuuuucauua uugcuccuga cc 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-34a-5p <400> 5 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-484 <400> 6 ucaggcucag uccccucccg au 22 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-5701 <400> 7 uuauugucac guucugauu 19 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-106b-5p <400> 8 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-10a-3p <400> 9 caaauucgua ucuaggggaa ua 22 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-10a-5p <400> 10 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-125b-5p <400> 11 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1285-3p <400> 12 ucugggcaac aaagugagac cu 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-130b-3p <400> 13 cagugcaaug augaaagggc au 22 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-135b-5p <400> 14 uauggcuuuu cauuccuaug uga 23 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-138-5p <400> 15 agcugguguu gugaaucagg ccg 23 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-141-3p <400> 16 uaacacuguc ugguaaagau gg 22 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-141-5p <400> 17 caucuuccag uacaguguug ga 22 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-143-5p <400> 18 ggugcagugc ugcaucucug gu 22 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-145-5p <400> 19 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-150-5p <400> 20 ucucccaacc cuuguaccag ug 22 <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-15b-5p <400> 21 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-17-5p <400> 22 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 23 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-182-5p <400> 23 uuuggcaaug guagaacuca cacu 24 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-183-5p <400> 24 uauggcacug guagaauuca cu 22 <210> 25 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-185-5p <400> 25 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-18a-5p <400> 26 uaaggugcau cuagugcaga uag 23 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-199a-3p <400> 27 acaguagucu gcacauuggu ua 22 <210> 28 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-199a-5p <400> 28 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 29 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-199b-5p <400> 29 cccaguguuu agacuaucug uuc 23 <210> 30 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-200a-3p <400> 30 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 31 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-200a-5p <400> 31 caucuuaccg gacagugcug ga 22 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-200b-3p <400> 32 uaauacugcc ugguaaugau ga 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-200b-5p <400> 33 caucuuacug ggcagcauug ga 22 <210> 34 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-200c-3p <400> 34 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-205-3p <400> 35 gauuucagug gagugaaguu c 21 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-205-5p <400> 36 uccuucauuc caccggaguc ug 22 <210> 37 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-20a-5p <400> 37 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21-3p <400> 38 caacaccagu cgaugggcug u 21 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-214-3p <400> 39 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21-5p <400> 40 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-22-5p <400> 41 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-30a-3p <400> 42 cuuucagucg gauguuugca gc 22 <210> 43 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-30a-5p <400> 43 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-335-5p <400> 44 ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23 <210> 45 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-34c-5p <400> 45 aggcagugua guuagcugau ugc 23 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-411-5p <400> 46 uaguagaccg uauagcguac g 21 <210> 47 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-425-5p <400> 47 aaugacacga ucacucccgu uga 23 <210> 48 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-429 <400> 48 uaauacuguc ugguaaaacc gu 22 <210> 49 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-7-5p <400> 49 uggaagacua gugauuuugu ugu 23 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-92a-3p <400> 50 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-93-3p <400> 51 acugcugagc uagcacuucc cg 22 <210> 52 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-93-5p <400> 52 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 53 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-96-5p <400> 53 uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23 <210> 54 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-99a-5p <400> 54 aacccguaga uccgaucuug ug 22

Claims (12)

  1. miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 7개의 miRNA 발현수준을 모두 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miR-1260a는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-149는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-191는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-335는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-34a는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-484는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-5701는 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    ABCA8, ACTA2, ACTN1, ADAMTS1, ADAMTS8, AKAP12, ANTXR2, AOC3, ASF1B, ATP1A2, ATP8B2, AURKB, AXIN2, AXL, BCL2, BHMT2, BIN1, BNC2, BOC, C1S, CACHD1, CALD1, CAV1, CAV2, CCL19, CD14, CD1D, CD37, CD8A, CDC20, CDH11, CDKN1C, CELSR3, CENPM, CEP55, CFI, CGNL1, CHN1, CLIC4, CNN3, COL18A1, COL21A1, COL3A1, COL6A1, COL6A2, COLEC12, CPE, CREB5, CRISPLD2, CRTAP, CSF1R, CTGF, CYBRD1, CYGB, CYR61, CYTL1, CYYR1, DACH1, DACT1, DDR2, DENND2A, DKK3, DLG2, DNASE1L3, DOCK11, DPYSL2, DSTN, DTL, E2F2, EDNRA, EGR1, EGR2, EOMES, EPB41L2, EPB41L3, ESR1, F10, F3, FAM110B, FAM129A, FAM20C, FBLN2, FBLN5, FGF9, FGL2, FHL1, FILIP1L, FLNA, FNBP1, FOS, FZD1, FZD10, GABARAPL1, GAS1, GATA5, GFPT2, GJA1, GLT8D2, GNA14, GNG7, GPR124, GPR162, GSN, GZMK, HBB, HCST, HHIP, HLA-DRB5, HOXA9, IGFBP5, ITGA8, ITGB2, ITK, ITM2A, ITPR1, JAZF1, JUN, KATNAL1, KCNMB1, KDELC2, KIAA0513, KIAA1644, KLF2, KLF9, KLRB1, KRT7, LAMC2, LIFR, LITAF, LMO3, LMOD1, LPPR4, LTBP4, MAFB, MAOB, MAP1B, METTL7A, MFGE8, MGLL, MGP, MOXD1, MXRA8, MYH11, MYLK, NAALAD2, NFIB, NFIL3, NFIX, NKG7, NPTN, NR2F1, OLFML3, OTUD1, P2RX1, PALLD, PAPPA, PAX8, PCOLCE2, PDE5A, PDGFC, PDGFD, PDK4, PLA2G4A, PLSCR4, PODN, POLQ, PPAP2A, PPAP2B, PRDM8, PRICKLE1, PRICKLE2, PRNP, PROS1, PTGIS, PTRF, RAB23, RARRES2, RASD1, RECK, RERG, RHOB, RNASE4, RNF150, ROR2, RORB, RTN4, RUNX1T1, RUNX3, SCARA5, SCRG1, SERPINF1, SERPING1, SFRP1, SLC46A2, SMOC2, SNCA, SORBS2, SORCS2, STAT4, STMN3, SYNPO2, TAGLN, TCF21, TCF4, TGFB3, TGFBI, TGFBR2, TGM2, TIMP2, TLR1, TMEM119, TNC, TPM1, TPM2, TSC22D3, TSHZ3, TUBB2A, TYMS, UCHL1, VASN, VCAM1, VEGFA, VIM, VNN2, ZBTB16, ZEB2 및 ZFP36L1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 키트.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암 진단용 마이크로어레이.
  8. 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-1260a, miR-149, miR-191, miR-335, miR-34a, miR-484 및 miR-5701로 이루어진 7개의 miRNA 발현수준을 모두 측정하는 단계; 및
    상기 7개의 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 miR-1260a는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-149는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-191는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-335는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-34a는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-484는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고; 상기 miR-5701는 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    miR-106b-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-125b-5p, miR-1285-3p, miR-130b-3p, miR-135b-5p, miR-138-5p, miR-141-3p, miR-141-5p, miR-143-5p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-15b-5p, miR-17-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-185-5p, miR-18a-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-205-3p, miR-205-5p, miR-20a-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-21-5p, miR-22-5p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-335-5p, miR-34c-5p, miR-411-5p, miR-425-5p, miR-429, miR-7-5p, miR-92a-3p, miR-93-3p, miR-93-5p, miR-96-5p 및 miR-99a-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방광암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
KR1020180008223A 2018-01-23 2018-01-23 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 KR102029775B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180008223A KR102029775B1 (ko) 2018-01-23 2018-01-23 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180008223A KR102029775B1 (ko) 2018-01-23 2018-01-23 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190089552A KR20190089552A (ko) 2019-07-31
KR102029775B1 true KR102029775B1 (ko) 2019-10-08

Family

ID=67474061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180008223A KR102029775B1 (ko) 2018-01-23 2018-01-23 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102029775B1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3770277A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-27 Taipei Medical University Detection of a tumor in a urinary organ
KR102332540B1 (ko) 2020-07-02 2021-11-29 의료법인 성광의료재단 다운증후군 특이적인 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 진단 방법
KR102332539B1 (ko) 2020-07-02 2021-11-29 의료법인 성광의료재단 다운증후군 진단용 후성학적 바이오마커 조성물 및 이의 용도
KR102489708B1 (ko) * 2020-09-14 2023-01-18 서울대학교산학협력단 GDF11 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2와 microRNA를 함유하는 조성물
KR102632423B1 (ko) 2021-02-26 2024-01-31 충북대학교 산학협력단 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도
KR102631854B1 (ko) 2021-06-03 2024-01-30 충북대학교 산학협력단 Bub1의 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커로의 용도
CN114150063A (zh) * 2021-12-09 2022-03-08 觅瑞（杭州）生物科技有限公司 膀胱癌诊断用尿液miRNA标志物、诊断试剂及试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101557183B1 (ko) 2012-08-14 2015-10-02 충북대학교 산학협력단 방광암 예후 진단 마커
KR101683961B1 (ko) 2014-03-31 2016-12-07 동아대학교 산학협력단 방광암 재발 진단 마커
KR101750146B1 (ko) 2014-12-30 2017-06-23 충북대학교 산학협력단 방광암 예후 진단 마커로서 ｒｓｐｈ９의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Int J Oncol. 2012 Nov;41(5):1871-8. doi: 10.3892/ijo.2012.1622. Epub 2012 Sep 6.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190089552A (ko) 2019-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102029775B1 (ko) 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
US11220713B2 (en) MicroRNAs as biomarkers for endometriosis
US8465917B2 (en) Methods for determining heptocellular carcinoma subtype and detecting hepatic cancer stem cells
KR101443214B1 (ko) 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로어레이
JP4938672B2 (ja) ｐ５３の状態と遺伝子発現プロファイルとの関連性に基づき、癌を分類し、予後を予測し、そして診断する方法、システム、およびアレイ
US11591655B2 (en) Diagnostic transcriptomic biomarkers in inflammatory cardiomyopathies
US20110160290A1 (en) Use of extracellular rna to measure disease
EP2867376B1 (en) Targeted rna-seq methods and materials for the diagnosis of prostate cancer
JP2010510769A (ja) 食道癌の診断ならびに患者の生存の予後および改善のための方法および組成物
WO2014075911A1 (en) Diagnostic mirna markers for alzheimer
US11827938B2 (en) Methods of prostate cancer prognosis
US20110143948A1 (en) Molecular signatures and biomarkers associated with melanoma and methods of use thereof
EP3122905B1 (en) Circulating micrornas as biomarkers for endometriosis
EP2942403B1 (en) Method for predicting the outcome of a cancer by analysing mirna expression
US20120004119A1 (en) Gene expression markers of oncolytic virus sensitivity
KR102108299B1 (ko) 위암의 림프절 전이를 예측하기 위한 마이크로rna 마커
KR102067879B1 (ko) 침습성 방광암 진단용 바이오마커
Visani MicroRNAs expression analysis in high grade gliomas

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant