KR102631854B1 - Bub1의 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커로의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비근침윤성 방광암(Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)의 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 자세하게는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커; 상기 바이오마커를 이용한 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트 또는 마이크로어레이; 및 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 RNA 시퀀싱 분석 및 다양한 방광암 환자 코호트(충북대학교 병원, GSE13507 데이터 세트 및 E-MTAT-4321 데이터 세트)에서 BUB1 유전자 발현 및 임상 결과와의 연관성 확인한 결과, 비근침윤성 방광암의 병기가 진행될수록 또는 조직학적 등급(세포분화도)이 나쁠수록 BUB1 유전자 발현이 높게 나타난바, 본 발명의 BUB1 유전자는 비근침윤성 방광암의 진행(progression) 및 재발(recurrence)을 포함하는 방광암의 예후 예측을 위한 마커로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 비근침윤성 방광암(Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)의 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 자세하게는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커; 상기 바이오마커를 이용한 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트 또는 마이크로어레이; 및 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
방광암(bladder cancer, BC)은 비뇨기계 영역에서 가장 빈번하게 발생하는 암으로서, 서양에서는 매년 인구 10만 명당 16.5명이 발병하는데 비하여 한국에서는 4.5명이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 이처럼 서양에 비하여는 발생률이 낮으나, 해마다 발생률이 높아지고 있으며, 우리나라에서는 비뇨기계 암 중 가장 발생빈도가 높은 암으로 알려져 있다(Lee C, et al., 1992).
방광암은 종양이 근육층을 침범했는지 여부에 따라 비근침윤성 방광암(Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)과 근침윤성 방광암(Muscle Invasive Bladder Cancer; MIBC)으로 분류된다. 비근침윤성 방광암은 암이 근육층의 침범 없이 점막에 국한된 병변으로써 경요도 방광절제술(transurethral resection of bladder tumor) 또는 방광내 항암제 또는 BCG를 주입함으로써 비교적 간단하게 치료가 가능하나, 암의 재발과 근침윤성 암으로의 진행이 문제가 된다. 한편, 근침윤성 방광암은 암이 근육층까지 침투한 상태를 말하는 것으로서, 이의 치료를 위하여는 근치적 방광적출술과 함께 복잡한 요로전환(urinary diversion)을 수행하여야 할 뿐 아니라, 환자에게 치명적인 결과를 초래할 수도 있다.
새로 진단된 방광암 환자의 약 75%가 비근침윤성 방광암이다(Burger et al., 2013). 비근침윤성 방광암 환자의 재발률은 60-70%, MIBC로의 진행률은 20-30%로, 이 암은 매우 이질적이기 때문에 환자들 사이에서 재발 및 진행 위험이 크다(Matulewicz and Steinberg, 2020). 근침윤성 방광암은 사망률이 높은 공격적인 암이다. 치료받지 않은 환자의 5년 생존율은 15% 미만이며, 표준 치료법인 근치 방광 절제술(radical cystectomy)을 시행한 후에도 환자의 약 50%가 사망한다. 새로운 치료법이 도입되었음에도 불구하고 MIBC 환자의 생존율은 지난 30년 동안 개선되지 않았다(Lobo et al., 2017). 따라서 비근침윤성 방광암 환자 중 근침윤성 방광암으로의 진행 가능성이 높은 환자를 미리 선별하여 보다 적극적인 치료를 시행하는 등 진행을 예방하는 것이 환자의 생존율 향상에 도움이 된다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 비근침윤성 방광암 환자 조직을 이용한 RNA 시퀀싱 분석 및 다양한 방광암 환자 코호트 분석을 통해 방광암 환자에서 차등 발현되는 유전자를 분석하고, 환자의 병리학적 특징 및 생존율과 BUB1 유전자의 발현량 사이의 연관성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 비근침윤성 방광암의 예후를 효과적으로 예측할 수 있는 바이오마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이오마커를 이용하여 비근침윤성 방광암의 예후를 효과적으로 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 BUB1 유전자를 유효성분으로 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오마커 조성물은 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 BUB1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며; 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 선택된 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 BUB1 유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계는 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 더 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 RNA 시퀀싱 분석 및 다양한 방광암 환자 코호트(충북대학교 병원, GSE13507 데이터 세트 및 E-MTAT-4321 데이터 세트)에서 BUB1 유전자 발현 및 임상 결과와의 연관성 확인한 결과, 비근침윤성 방광암의 병기가 진행될수록 또는 조직학적 등급(세포분화도)이 나쁠수록 BUB1 유전자 발현이 높게 나타난바, 본 발명의 BUB1 유전자는 비근침윤성 방광암의 진행(progression) 및 재발(recurrence)을 포함하는 방광암의 예후 예측을 위한 마커로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 전체적인 연구 설계를 보여주는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 스크리닝 테스트에서 중복된 19개 유전자에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석 결과이다.
도 3은 RNA 시퀀싱 분석을 통해 얻은 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직과 정상 주변 조직(NAT)의 전사체 프로파일을 분석한 결과이다. 도 3a는 주성분 분석(Principal component analysis; PCA) 결과이며; 도 3b는 유전자 발현 히트맵(heatmap)이고; 도 3c는 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 크게 변경된 대표적인 유전자를 Volcano 플롯 그래프로 시각화한 것이며; 도 3d는 유전자 온톨로지(GO) 분석을 통해 방광암에서 상향 및 하향 조절된 유전자들이 관련된 pathway를 분석한 결과이며; 도 3e는 유전자세트증폭분석(GSEA) 결과이다(NES, normalized enrichment score).
도 4는 RNA-시퀀싱 분석에서 비근침윤성 방광암(NMIBC) 및 정상 주변 조직(NAT)에서 BUB1의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 트레이닝 코호트(충북대학교 병원으로부터 제공받은 총 101개의 방광 조직 샘플, 표 2 참조)에서 BUB1 유전자의 발현을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 5a는 정상 방광 조직(Control)과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서의 BUB1 유전자의 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 5b는 비근침윤성 방광암 환자를 저등급(Low grade) 및 고등급(High grade) 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이고; 도 5c는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자가 나중에 근침윤성 방광암(MIBC)으로 진행된 경우와 진행되지 않은 경우로 나눈 후 BUB1 발현값을 비교한 결과이다.
도 6은 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 무진행 생존(PFS)에 대한 BUB1의 효과를 보여주는 Kaplan-Meier 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 BUB1의 중간 컷오프 값에 따라 두 그룹(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이고; 도 6b는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 종양 등급(저등급, 고등급)과 BUB1 발현 수준(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)을 조합하여 4개의 그룹으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이다.
도 7은 GSE13507 코호트에서 BUB1 유전자 발현을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 7a는 정상 방광 조직(Control)과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서의 BUB1 유전자의 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 7b는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 저등급(Low grade) 및 고등급(High grade) 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이고; 도 7c는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 Ta기 및 T1기 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 7d는 단변량 Cox 회귀 분석 결과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자 중 BUB1 과발현 환자에서의 진행 위험비(Hazard ratio, HR)를 나타낸 것이며; 도 7e는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 BUB1 발현 수준에 따른 무진행 생존율을 비교한 결과이다.
도 8은 E-MTAB-4321 코호트에서 BUB1 유전자 발현을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 8a는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 저등급(Low grade) 및 고등급(High grade) 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이고; 도 8b는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 Ta기 및 T1기 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 8c는 단변량 Cox 회귀 분석 결과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자 중 BUB1 과발현 환자에서의 진행 위험비(Hazard ratio, HR)를 나타낸 것이며; 도 8d는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 BUB1 발현 수준에 따라 두 그룹(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이고; 도 8e는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 병기(T1, Ta)와 BUB1 발현 수준(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)을 조합하여 4개의 그룹으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이며; 도 8f는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 종양 등급(저등급, 고등급)과 BUB1 발현 수준(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)을 조합하여 4개의 그룹으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이다.
도 9는 두 가지 방광암 세포주(5637, T24)에서 siRNA 형질주입을 통해 BUB1 유전자를 넉다운(knockdown, KD)시킨 후, 방광암 세포의 변화를 관찰한 결과이다. 도 9a 및 9b는 두 세포주에서 BUB1 넉다운(KD)이 잘 되었는지 확인하기 위해 RT-qPCR을 통해 BUB1 발현 수준을 확인한 결과이며(9a: 5637, 9b: T24); 도 9c 및 9d는 유세포 분석을 이용한 세포 주기 분석을 통해 BUB1을 넉다운(KD)하지 않은 세포와 넉다운(KD)을 진행한 세포의 세포 주기 변화를 확인한 결과이다(9c: 5637, 9d: T24). * P <0.05, *** P <0.001, **** P <0.0001.
도 2는 본 발명의 스크리닝 테스트에서 중복된 19개 유전자에 대한 유전자 온톨로지(GO) 분석 결과이다.
도 3은 RNA 시퀀싱 분석을 통해 얻은 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직과 정상 주변 조직(NAT)의 전사체 프로파일을 분석한 결과이다. 도 3a는 주성분 분석(Principal component analysis; PCA) 결과이며; 도 3b는 유전자 발현 히트맵(heatmap)이고; 도 3c는 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 크게 변경된 대표적인 유전자를 Volcano 플롯 그래프로 시각화한 것이며; 도 3d는 유전자 온톨로지(GO) 분석을 통해 방광암에서 상향 및 하향 조절된 유전자들이 관련된 pathway를 분석한 결과이며; 도 3e는 유전자세트증폭분석(GSEA) 결과이다(NES, normalized enrichment score).
도 4는 RNA-시퀀싱 분석에서 비근침윤성 방광암(NMIBC) 및 정상 주변 조직(NAT)에서 BUB1의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 트레이닝 코호트(충북대학교 병원으로부터 제공받은 총 101개의 방광 조직 샘플, 표 2 참조)에서 BUB1 유전자의 발현을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 5a는 정상 방광 조직(Control)과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서의 BUB1 유전자의 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 5b는 비근침윤성 방광암 환자를 저등급(Low grade) 및 고등급(High grade) 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이고; 도 5c는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자가 나중에 근침윤성 방광암(MIBC)으로 진행된 경우와 진행되지 않은 경우로 나눈 후 BUB1 발현값을 비교한 결과이다.
도 6은 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 무진행 생존(PFS)에 대한 BUB1의 효과를 보여주는 Kaplan-Meier 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 BUB1의 중간 컷오프 값에 따라 두 그룹(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이고; 도 6b는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 종양 등급(저등급, 고등급)과 BUB1 발현 수준(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)을 조합하여 4개의 그룹으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이다.
도 7은 GSE13507 코호트에서 BUB1 유전자 발현을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 7a는 정상 방광 조직(Control)과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서의 BUB1 유전자의 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 7b는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 저등급(Low grade) 및 고등급(High grade) 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이고; 도 7c는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 Ta기 및 T1기 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 7d는 단변량 Cox 회귀 분석 결과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자 중 BUB1 과발현 환자에서의 진행 위험비(Hazard ratio, HR)를 나타낸 것이며; 도 7e는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 BUB1 발현 수준에 따른 무진행 생존율을 비교한 결과이다.
도 8은 E-MTAB-4321 코호트에서 BUB1 유전자 발현을 RT-qPCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 8a는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 저등급(Low grade) 및 고등급(High grade) 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이고; 도 8b는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 Ta기 및 T1기 군으로 나눈 후 BUB1 발현 수준을 비교한 결과이며; 도 8c는 단변량 Cox 회귀 분석 결과 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자 중 BUB1 과발현 환자에서의 진행 위험비(Hazard ratio, HR)를 나타낸 것이며; 도 8d는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자를 BUB1 발현 수준에 따라 두 그룹(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이고; 도 8e는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 병기(T1, Ta)와 BUB1 발현 수준(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)을 조합하여 4개의 그룹으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이며; 도 8f는 Kaplan Meier 생존 분석을 통해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 종양 등급(저등급, 고등급)과 BUB1 발현 수준(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)을 조합하여 4개의 그룹으로 분류한 후 무진행 생존율을 비교한 결과이다.
도 9는 두 가지 방광암 세포주(5637, T24)에서 siRNA 형질주입을 통해 BUB1 유전자를 넉다운(knockdown, KD)시킨 후, 방광암 세포의 변화를 관찰한 결과이다. 도 9a 및 9b는 두 세포주에서 BUB1 넉다운(KD)이 잘 되었는지 확인하기 위해 RT-qPCR을 통해 BUB1 발현 수준을 확인한 결과이며(9a: 5637, 9b: T24); 도 9c 및 9d는 유세포 분석을 이용한 세포 주기 분석을 통해 BUB1을 넉다운(KD)하지 않은 세포와 넉다운(KD)을 진행한 세포의 세포 주기 변화를 확인한 결과이다(9c: 5637, 9d: T24). * P <0.05, *** P <0.001, **** P <0.0001.
하나의 양태로서, 본 발명은 BUB1 유전자의 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 바이오마커로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일구체예에서, 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 바이오마커로 BUB1 유전자 이외에 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 BUB1 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 UHRF1 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 AURKB 유전자는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 TPX2 유전자는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 BUB1B 유전자는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 KIF20A 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 CDC20 유전자는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 TK1 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 CEP55 유전자는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 TTK 유전자는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 CCNB2 유전자는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 HJURP 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 NUSAP1 유전자는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 TOP2A 유전자는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 PRC1 유전자는 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 TACC3 유전자는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 MCM2 유전자는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며; 상기 RECQL4 유전자는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고; 상기 SPAG5 유전자는 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 마커 유전자로서 상기 선택된 유전자는 ⅰ) 충북대학교병원 RNA 시퀀싱에서 비근침윤성 방광암 환자 조직과 방광암이 포함되지 않은 정상 주변 조직 사이의 차등적으로 증가된 발현 수준을 나타내었으며; ⅱ) GSE13507 코호트에서 정상 대조군 대비 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 차등적으로 증가된 발현 수준을 나타내었고; ⅲ) GSE13507 코호트에서 비근침윤성 방광암(NMIBC) 대비 근침윤성 방광암(MIBC) 환자에서 차등적으로 증가된 발현 수준을 나타내었다(도 1 다이아그램 참조).
또한, 본 발명의 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 마커 유전자로서 상기 선발된 19개의 유전자의 생물학적 특징을 유전자 온톨로지(GO) 분석을 통해 상기 유전자가 핵 분열, 방추 조직 및 세포질 분열과 같은 세포주기의 중요한 단계에 관련되어 있음을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 상기 19개의 유전자 중 스핀들 체크 포인트 조절자(spindle checkpoint regulator)인 BUB1의 NMIBC 병인 및 예후에 미치는 역할을 추가적으로 평가하기 위하여, 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서 BUB1의 mRNA 발현을 확인한 결과 대조군(정상 방광 점막)보다 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서 상당히 과발현되었음을 확인하였으며(도 5a 참조), 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 병기가 진행될수록 또는 조직학적 등급(세포분화도)이 나쁠수록 BUB1의 mRNA 발현이 증대되는 것을 확인하였다(도 5b 내지 5c 참조).
또한, 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 BUB1의 예후력을 평가하기 위해 생존 분석을 수행한 결과, 상대적으로 BUB1 발현 수준이 낮은 환자 대비 BUB1 발현 수준이 높은 환자에서 무진행 생존율이 낮아지는 것으로 나타났으며(도 6a 참조), BUB1 발현 수준이 높으면서 조직학적 등급(세포분화도)이 나쁜 경우 무진행 생존율이 더욱 낮아지는 것을 확인하였다(도 6b 참조).
뿐만 아니라, 방광암 환자 코호트 데이터(GSE13507 및 E-MTAT-4321)를 사용하여 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 BUB1의 발현 수준을 검증한 결과, BUB1 mRNA 발현은 정상 대조군과 비교하여 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 유의하게 향상되고(도 7a 참조), 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 병기가 진행될수록 또는 조직학적 등급(세포분화도)이 나쁠수록 BUB1의 발현량이 더 높아지는 것을 확인하였으며(도 7b, 7c, 8a 및 8b 참조), 이와 더불어 BUB1 발현 수준이 높은 경우 무진행 생존율이 낮아지는 것을 확인하였다(도 7e 및 8d 참조).
특히, E-MTAT-4321 코호트에서 종양 단계 및 등급을 BUB1 발현과 통합할 때, BUB1의 발현이 높은 T1 단계 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 최악의 무진행 생존을 보였고, BUB1의 발현이 낮은 Ta 단계 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 가장 만족스러운 무진행 생존(PFS)을 보여주었다(도 8e 참조). 그리고 BUB1 발현이 높은 고등급(High grade) 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 가장 힘든 무진행 생존을 겪는 반면, BUB1 발현이 낮은 저등급(low grade) 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 가장 낙관적인 무진행 생존을 보여주었다(도 8f 참조).
이에, 본 발명에 따른 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 마커로서 상기 선발된 유전자들은 비근침윤성 방광암의 재발 및 진행에 대한 중요한 지표가 되는 종양 단계(stage) 및 등급(grade) 사이에 발현 수준의 차이를 보이는 차등적으로 발현된 유전자들이다.
그러므로 본 발명에 따른 상기 유전자의 발현수준을 측정함으로써 보다 정확하게 비근침윤성 방광암의 예후를 예측할 수 있다.
본 발명에서 용어 "비근침윤성 방광암(Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)"이란, 암이 근육층의 침범없이 점막에 국한된 병변을 가지는 방광암으로서 '비근침습성 방광암' 또는 '표재성 방광암'이라고도 불린다.
본 발명에서 용어, "차등적으로 발현된 유전자(differentially expressed genes, DEGs)"는 정상 또는 대조군 시료에서의 발현에 비하여, 질병, 구체적으로 암, 예를 들어 방광암 환자에서 그의 발현이 보다 높거나 보다 낮은 수준으로 활성화되는 유전자를 말한다. 이 용어는 또한 그의 발현이 동일한 질병의 상이한 병기에서 보다 높거나 보다 낮은 수준으로 활성화되는 유전자를 포함한다. 차등적으로 발현되는 유전자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 또는 억제될 수 있거나, 교대 스플라이싱을 통해 상이한 폴리펩티드 산물을 생성시킬 수 있음을 또한 알 수 있다. 이러한 차이는, 예를 들면 폴리펩티드의 mRNA 수준, 표면 발현, 분비 또는 다른 분배에 있어서의 변화에 의해 입증될 수 있다. 차등적인 유전자 발현은 2개 이상의 유전자 또는 상기 유전자 산물간의 발현 비교, 또는 2개 이상의 유전자 또는 상기 유전자 산물간의 발현 비율의 비교, 또는 동일한 유전자의 2개의 상이하게 처리된 산물의 비교(이들은 정상 대상과 질병, 구체적으로 비근침윤성 방광암을 앓는 대상 사이에서 또는 동일한 질병의 다양한 병기 사이에서 다름)를 포함할 수 있다. 차등적인 발현은, 예를 들면 정상 세포와 질병에 걸린 세포들 사이에서, 또는 상이한 질병 사건 또는 질병 병기를 거치는 세포들 사이에서 유전자 또는 그의 발현 산물에서 일시적인 또는 세포 발현 양상의 정량적 및 정성적 차이를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상, "차등적인 유전자 발현"은 질병에 걸린 대상의 질병 발생의 다양한 병기 및 등급에서 주어진 유전자의 발현 사이에 적어도 약 1.5배, 바람직하게는 적어도 약 2배, 보다 바람직하게는 적어도 약 4배의 차이가 있을 때 존재하는 것으로 간주된다.
본 발명에서 용어, "예후"는 방광암과 같은 질환의, 예를 들어 재발(동일한 병리학적 단계의 원발성 NMIBC의 재발로 정의), 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 방광암-기인성 사망 또는 진행(질병 재발 후 TNM 단계 진행으로 정의)의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 방광암 치료 후 재발 가능성 또는 근침윤성 방광암(Muscle Invasive Bladder Cancer; MIBC)으로 진행 여부를 예측하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "양호한 예후"는 암 환자, 특히 방광암 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미하고, "양호하지 않은 예후"는 투병 중인 암 또는 종양의 진행(progression) 및 재발(recurrence), 전이 또는 사망할 가능성이 있음을 의미한다. 양호한 결과를 갖는 것으로 분류된 암 환자는 투병 중인 암 또는 종양이 없는 상태이다. 이와는 반대로, 양호하지 않은 결과의 암 환자는 질병의 재생, 종양 재발, 진행, 전이 또는 사망에 이른다. "양호한 예후"는 방광암 환자가 투병 중인 암 또는 종양이 적어도 2년, 보다 구체적으로는 적어도 5년 이상 동안 없는 상태로 있을 수 있음을 의미한다. 본 발명의 다른 측면에서, "양호하지 않은 예후"는 방광암 환자가 5년 미만 이내에 질병 재생, 종양 재발, 진행, 전이 또는 사망을 경험할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 화학요법 또는 방사선 치료 등의 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암의 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후의 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료방식을 선택하여 적용함으로써 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측방법은 환자가, 예를 들어 소정의 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정의 치료 처방과 같은 치료법에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존 또는 전신 또는 국소 재발이 가능한지를 예측할 수 있다. 또한 이를 통하여 불필요한 보조 항암요법을 최소화하거나 전신 또는 국소 재발이 예측되는 환자에게는 더욱 효과적인 보조 항암요법을 사용할 수 있도록 계획할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예후 예측용 마커", "예후 예측을 위한 마커" 또는 "예후 예측 마커(prognosis marker)"란 방광암 세포를 정상 세포와 구분하여 방광암 치료 후 진행 또는 재발 여부를 비롯한 예후를 예측할 수 있는 물질이다. 본 발명의 목적상 비근침윤성 방광암 진단 후 수술 또는 화학요법을 시술받고 5년 이내에 근침윤성 방광암으로의 진행 여부 또는 재발 여부를 결정하여 예후가 양호한 환자와 양호하지 않은 환자를 구별할 수 있는 마커를 의미한다.
유의성 있는 예후 예측 마커의 선택과 적용은 예후 예측 결과의 신뢰도를 결정짓는다. "유의성 있는 예후 예측 마커"란, 예후 예측하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명에 따른 방광암의 예후 예측 마커는, 비근침윤성 방광암 환자 조직을 이용한 RNA 시퀀싱 분석과 더불어 다양한 방광암 환자 코호트에 공통적으로 나타나는 차등적으로 발현된 유전자들로서, 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타낸다.
본 발명에서 방광암의 예후 예측 마커로 선택된 상기 유전자들과 방광암의 진행 또는 재발과의 관련성에 대해서는 현재까지 보고된 바 없다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 BUB1 유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 조성물은 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "mRNA 발현수준 측정"은 방광암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 방광암의 예후 마커 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 마커 유전자의 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 고안할 수 있다. 본 발명에 따른 방광암의 예후 마커 유전자의 염기서열은 유전자뱅크(GenBank)에 등록되어 당해분야에 공지된 상태이므로, 당업자는 상기 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 전형적으로 mRNA와 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 유사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 적절한 완충액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적절한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30개 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명에서는 본 발명에 따른 방광암의 예후 마커 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후 PCR 생성물의 증폭 여부를 통해 방광암의 예후를 예측할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 염기 내지 길게는 수백 개 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일가닥 DNA 프로브, 이중가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명에 따른 마커 유전자에 대해 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시한 후, 혼성화 여부를 통해 방광암의 재발 여부를 비롯한 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법을 비롯한 당해분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡핑, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 용어, "단백질의 발현수준 측정"은 방광암의 진행 또는 재발 가능성을 예후 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 코딩된 단백질의 존재 여부와 발현수준을 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(immunoprecipitation assay), 보체고정분석(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "항체"는 당해분야에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 유전자로부터 코딩된 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻은 후, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 펩티드 단편도 포함되며, 본 발명의 펩티드 단편으로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체는 그 형태가 특별히 제한되지 않으며, 다중클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이라면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다.
상기한 바와 같이 방광암의 예후 예측 마커 유전자가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다중클론 항체는 상기한 방광암의 예후 예측 마커 유전자로부터 코딩되는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당해분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology, 6: 511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222(58): 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 재조합 항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 비근침윤성 방광암의 예후 예측 마커인 BUB1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정(확인)함으로써 피험체를 대상으로 하여 비근침윤성 방광암의 예후를 예측하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트에는 상기 BUB1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 방광암의 예후 예측용 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 BUB1 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 유전자 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 BUB1 유전자 이외에 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.
상기 마이크로어레이는 본 발명의 상기 선발된 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.
마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 BUB1 유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 단계는 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 더 측정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체로부터 분리된 생물학적 시료"란 방광암에 대한 수술 및/또는 화학요법을 시술 받은 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 소변과 같은 시료 등을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
mRNA 발현수준을 측정하기 위한 분석방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 분석방법을 통하여, 정상 대조군 시료의 mRNA 발현수준과 방광암 진행 또는 재발 의심 개체에서의 mRNA 발현수준을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 mRNA로의 발현수준의 유의한 증가여부를 판단하여 방광암 진행 또는 재발 의심 개체의 실제 방광암 진행 또는 재발 여부를 예후 예측할 수 있다. mRNA 발현수준은, 바람직하게는 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합반응 또는 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프로브를 이용하는 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 마커 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 역전사효소 중합반응을 수행한 후 생성물을 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 방광암의 예후 예측 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정한 후 이를 정상 대조군의 발현수준과 비교함으로써 방광암의 진행 또는 재발 가능성을 간편하게 예후 예측할 수 있다.
또한, 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 이에 특이적인 항체 결합물은, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학법, 면역침전분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상대조군 샘플에서의 마커 유전자의 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 비근침윤성 방광암으로 약물 치료 또는 종양 제거 수술을 받은 환자에서의 마커 유전자의 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 방광암의 진행 또는 재발을 예측할 수 있다.
본 발명에서는 비근침윤성 방광암으로 약물 치료 또는 종양 제거 수술을 받은 환자에서 상기 마커 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양이 정상대조군 시료에 비해 증가된 경우, 근침윤성 방광암으로 진행 가능성이 높거나 또는 비근침윤성 방광암이 재발할 가능성이 높을 것으로 예상할 수 있다.
따라서 본 발명의 정보제공방법을 통해 비근침윤성 방광암으로 약물 치료 또는 종양 제거 수술을 받은 환자에서 근침윤성 방광암으로 진행 가능성이 높을 것으로 예상되거나, 또는, 비근침윤성 방광암이 재발할 가능성이 높을 것으로 예상된 환자군을 미리 선별할 수 있으므로, 보다 적극적인 치료가 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 연구 설계
도 1은 본 발명의 전체적인 연구 설계를 나타낸 것이다. RNA-시퀀싱 분석은 정상대조군과 비교하여 비근침윤성 방광암(Non-Muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 환자에서 차등적으로 발현되는 후보 유전자를 스크리닝하기 위해 수행되었다. 배수 변화(fold change)> 2 및 P <0.01의 조건에서 270개의 상향 조절된 유전자와 908개의 하향 조절된 유전자가 확인되었다. 상기 데이터를 이전에 보고된 방광암 프로파일링 연구에서 확인된 969개의 유전자와 비교하였으며, 그 결과 방광암과 정상 조직 사이의 19개의 차등적으로 발현된 유전자(UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, BUB1, MCM2, RECQL4 및 SPAG5)를 최종적으로 규명하였다. 이렇게 선별된 19개 유전자의 생물학적 특징을 유전자 온톨로지(GO) 분석을 통해 상기 유전자가 핵 분열, 방추 조직 및 세포질 분열과 같은 세포주기의 중요한 단계에 관련되어 있음을 확인하였다(도 2 참조). 그 중 방광암의 신규 유전자 마커로 BUB1을 선택하여 추가 검증을 진행하였다. 트레이닝 코호트(training cohort)에서 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자(n = 86) 및 정상대조군(n = 15)에서 BUB1의 mRNA 발현은 실시간 PCR 분석을 통해 측정하였다. 마지막으로, 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 BUB1의 예후력을 내부 검증 코호트(GSE13507)와 외부 검증 코호트(E-MTAB-4321) 평가를 통해 검증하였다.
2. 재료 및 방법
방광암 환자 조직 임상 샘플
연구 방법론은 헬싱키 선언에서 정한 표준을 준수하였다. 표 1은 RNA-시퀀싱 분석에 사용된 케이스 피험자의 임상 정보를 나타낸 것이다. 총 24개의 방광 조직 샘플을 분석에 사용하였다. 샘플은 16개의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자 조직 및 방광암이 포함되지 않은 정상 주변 조직(Normal adjacent tissues; NAT) 8개로 구성되었다.
이후, 본 연구에서는 총 101개의 방광 조직을 실시간 PCR 분석에 사용했으며 임상 정보는 표 2에 자세히 나타내었다. 101개의 조직 샘플 중 86개는 원발성 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 추출되었으며 조직학적으로 이행세포암종(transitional cell carcinoma)으로 확인되었다. 나머지 15개는 대조군으로 사용되었다(암이 의심되는 환자에게서 채취했지만 최종 진단은 스트레스성 요실금 또는 알수 없는 혈뇨와 같은 양성 질환이었다). 연구에 사용된 생체 표본은 국립 바이오 뱅크 회원사인 충북대학교 병원(대한민국, 청주)에서 제공받았다. 이 연구는 충북대학교 기관 심의위원회(GR2010-12-010) 및 생명윤리위원회(IRB No 2020-07-018)의 승인을 받았으며 실험은 모든 참가자의 사전 서면 동의를 받아 수행되었다. 분석에 영향을 미치는 교란 요인의 가능성을 줄이기 위해 수반되는 제자리암(concomitant carcinoma in situ) 또는 상황 병변에만 있는 암종(carcinoma in situ lesions alone)으로 진단된 환자는 제외하였다. 2000년 4월부터 2010년 10월까지 충북대학교 병원에서 이행상피암종(transitional cell carcinoma)의 외과적 절제 과정에서 신선한 조직을 채취하였다. 모든 종양은 일반적으로 외과적 절제 후 15분 이내에 거시절제되었다. 각 샘플은 근치 방광 절제술 및 방광 종양의 경요도 절제술(Trans Urethral Resection of Bladder Tumor; TURBT)에서 얻은 신선한 냉동 시료의 일부에 대한 병리학적 분석을 통해 확인되었다. 종양은 표준 기준에 따라 단계(2002 TNM 분류) 및 등급(2004 WHO 분류)으로 분류되었다. 각 환자를 추적하고 표준 지침 권고에 따라 제안된 관리를 진행하였다. 유럽 비뇨기과 협회 지침에 따라 방광경 검사와 상부 요로 영상으로 관찰을 수행하였다. 재발은 동일한 병리학적 단계의 원발성 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 재발로 정의되었으며, 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 진행은 질병 재발 후 TNM 단계의 진행으로 정의되었다. 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 평균 추적 기간은 71.15 개월(범위, 10.70-174.90)이었다.
| Characteristics | NMIBC | Control | P value |
| No. | 16 | 8 | |
| Mean age±SD | 60.5±10.3 | 60.0±11.5 | 0.809* |
| Gender (%) | 0.722# | ||
| Male | 13 (81.25%) | 6 (75%) | |
| Female | 3 (18.75%) | 2 (25%) | |
| 2004 WHO Grade | |||
| High grade | 5 (31.25%) | ||
| Low grade | 11 (68.75%) | ||
| Stage | |||
| Ta | 11 (68.75%) | ||
| T1 | 5 (31.25%) |
NMIBC, non-muscle invasive bladder cancer; SD, standard deviation.
* t-검정(student t-test)를 통해 얻은 P 값
# 카이제곱 검정(Chi-squared test)을 통해 얻은 P 값
| Variable | NMIBC | Control | P value |
| No. | 86 | 15 | |
| Mean age±SD | 64.45±13.86 | 65.53±13.97 | 0.782* |
| Gender (%) | 0.096# | ||
| Male | 73 (84.9%) | 16 (100%) | |
| Female | 13 (15.1%) | 0 | |
| Tumor size (%) | |||
| ≤ 1 cm | 52 (60.5%) | ||
| 2-3 cm | 34 (39.5%) | ||
| Multiplicity (%) | |||
| Single | 47 (54.7%) | ||
| 2-7 | 27 (31.4%) | ||
| > 7 | 12 (14.0%) | ||
| Grade, 2004 WHO grading system (%) | |||
| Low | 64 (74.4%) | ||
| High | 22 (25.6%) | ||
| Stage (%) | |||
| TaN0M0 | 25 (29.1%) | ||
| T1N0M0 | 61 (70.9%) | ||
| BCG therapy (%) | |||
| No | 54 (62.8%) | ||
| Yes | 32 (37.2%) | ||
| Recurrence - no. of patients (%) | |||
| No | 51 (59.3%) | ||
| Yes | 35 (40.7%) | ||
| Progression - no. of patients (%) | |||
| No | 71 (82.6%) | ||
| Yes | 15 (17.4%) | ||
| Survival - no. of patients (%) | |||
| Alive | 56 (65.1%) | ||
| Death | 30 (34.9%) | ||
| Mean follow-up (range) - months | 71.15 (10.70-174.90) |
BCG, Bacillus Calmette-Guerin; NMIBC, non-muscle invasive bladder cancer; SD, standard deviation.
* t-검정(student t-test)를 통해 얻은 P 값
# 카이제곱 검정(Chi-squared test)을 통해 얻은 P 값
공개 발현 프로파일
GSE13507(CBNUH microarray cohort)의 발현 프로파일은 GEO 온라인 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 다운로드하였으며, E-MTAB-4321(UROMOL cohort)은 EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)에서 다운로드하였다.
방광암 세포주
인간 방광암 세포주인 5637 및 T24는 한국 세포주 은행(KCLB, 서울, 대한민국)에서 수득하였다. 두 세포주는 10% 소태아혈청(FBS)(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)이 보충된 RPMI 1640(Gibco)에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 조건 하에 배양되었다.
RNA 시퀀싱 분석
시퀀싱 실험의 FASTQ 파일은 품질을 위해 처리되었으며 Trim Galore는 어댑터 시퀀스를 제거하는데 사용되었다. 처리된 raw read는 STAR를 사용하여 인간 게놈(hg38)에 정렬되었고 정렬된 읽기는 HOMER을 사용하여 태그 디렉토리로 변환되었다. 각 파일은 HOMER의 "analyzeRepeats"스크립트를 사용하여 정량화되었다. 각 샘플에서 유전자의 발현 수준의 정규화는 백만 개의 매핑된 판독(FPKM) 당 전사물의 킬로베이스 당 단편에 의해 이용되었다. 그런 다음, 조정된 P-value < 0.05 및 배수 변화(fold change) > 2 조건에서 HOMER의 "getDifferentialExpression"명령을 통해 DESeq2 분석에 의해 원시 읽기 카운트를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자(DEGs)를 식별하였다. Metascape를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 분석을 수행하였다. 유전자세트증폭분석(gene set enrichment analysis, GSEA)을 수행하여 MSigDB에서 추출한 유전자 목록에서 증폭된 차등적으로 발현된 유전자(DEG)를 확인하여 Hallmark 및 큐레이트(C2) 컬렉션에서 유전자 세트의 증폭을 결정하였다.
RT-qPCR analysis
[환자 조직]
전체 RNA는 이전에 설명한대로 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 조직에서 추출하고 -80℃에 보관하였다(Kim, W., et al., S100A9 and EGFR gene signatures predict disease progression in muscle invasive bladder cancer patients after chemotherapy. Annals of oncology, 2014. 25(5): p. 974-979.). 다음으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 First Strand cDNA Synthesis Kit(Clontech, TAKARA, Otsu, Japan)를 사용하여 1ug의 전체 RNA에서 cDNA를 합성하였다.
Rotor Gene 6000 기기(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 real-time PCR로 조직 mRNA를 증폭하고 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 정량화하였다. Real-Time PCR은 제조사의 프로토콜에 따라 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Clontech, TAKARA, Otsu, Japan)를 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 5μL의 2x SYBR Premix EX Taq 버퍼, 0.5μL의 각 5 '및 3'프라이머(10pM/μL) 및 2μL의 샘플 cDNA를 포함하는 10μL의 최종 부피에서 수행되었다. 그 후 알려진 PCR 산물 농도를 100 pg/μL에서 0.1 pg/μL로 연속 10배 희석하여 표준 곡선을 설정하였다. Real-Time PCR 조건은 다음과 같다: 96℃에서 20초간 1 사이클 진행한 후, 이어서 변성(denaturation) 과정을 96℃에서 3초, 어닐링(annealing) 과정을 60℃에서 15초, 연장(extension) 과정을 72℃에서 15초간 40 사이클 진행하였고, melting program은 45 초당 1℃의 가열 속도로 72-95℃에서 수행되었다. Rotor-Gene Q software 2.3.1.49는 spectral data를 캡처하고 분석하는데 사용되었다. 모든 샘플은 triplicate로 실행되었다. 각 샘플에서의 유전자 발현값은 GAPDH의 발현값으로 정규화되었다. 다음 프라이머를 사용하여 후보 유전자를 증폭하였다. BUB1(Gene ID: 699), sense, 5'-AGCCCAGACAGTAACAGACTC-3 '(21bp, Tm 64℃); antisense, 5'-GTTGGCAACCTT ATGTGTTTCAC-3 '(23bp, Tm 66℃) 및 amplicon 크기는 113bp이다. 대조군 GAPDH(Gene ID: 2597) 프라이머는 다음과 같다: sense, 5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGA-3 '(20bp, Tm 60℃); antisense, 5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3 '(20bp, Tm 60℃) 및 amplicon 크기는 156bp이다.
[siRNA 형질주입 세포주]
Ribospin II(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 세포에서 전체 RNA를 추출한 후 RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 500ng의 전체 RNA를 역전사하였다.
Real-time PCR은 TOPreal qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX)(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 반복적으로 평가되었다. Rotor-Gene Q software 2.3.1은 spectral data를 캡처하고 분석하는데 사용되었다. 다음 프라이머를 사용하여 후보 유전자를 증폭하였다. BUB1(Gene ID : 699), sense, 5'-AGCCCAGACAGTAACAGACTC-3 '(21bp, Tm 60.9℃); antisense, 5'-GTTGGCAACCTTATGTGTTTCAC-3 '(23bp, Tm 60.5℃) 및 amplicon 크기는 136bp이다. 대조군 TBP(Gene ID : 6908) 프라이머는 다음과 같았다 : sense, 5'-CCCGAAACGCCGAATATAATCC-3 '(22bp, Tm 61.2℃); antisense, 5'-AATCAGTGCCGTGGTTCGTG-3 '(20bp, Tm 63℃) 및 amplicon 크기는 80bp이다.
siRNA 형질주입
인간 BUB1 유전자 넉다운(knockdown)은 SMART pool ON-TARGETplus siRNA(Dharmacon : L-004102-00-0005)를 사용하였다. ON-TARGETplus Non-targeting Pool(Dharmacon: D-001810-10-05)을 대조군으로 사용하였다. 5637 및 T24 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 항생제 없이 제조사의 프로코콜에 따라 Opti-MEM I reduced serum medium(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 RNA 듀플렉스 및 Lipofectamine RNAi-MAX(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 형질주입하였다. 배지는 24시간 후에 항생제가 있는 완전배지로 변경하였으며, 24시간 후에 추가실험을 위해 세포를 수거하였다.
유세포 분석
5637 및 T24 세포주를 비-표적 대조군 siRNA(siNC) 및 BUB1 siRNA(siBUB1)로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수확하였다. 세포주기의 검출을 위해 세포를 PBS로 차가운 70% 에탄올에 고정시켰다. 이어서 세포주기 분석을 위해 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide, PI) 용액으로 세포를 염색하였다(Invitrogen: F10797). 세포의 DNA 함량은 CytoFLEX(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 분석되었다. 데이터는 FlowJo software (TreeStar)를 사용하여 플로팅되었다.
통계 분석
연속 변수는 평균±표준편차(SD)로 표현되었다. 데이터의 정규성은 One-Sample Kolmogorov-Smirnov 검정으로 추정되었다. Welch의 t-검정은 두 개의 비 대응 샘플의 통계 분석에 사용되었으며 쌍을 이루는 t-검정은 쌍을 이루는 샘플의 통계 분석에 사용되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. 그룹은 카이제곱 검정(Chi-squared test)에 의해 비 연속 변수 측면에서 비교되었다. 유전자 발현 값은 샘플 전체에서 자연 로그 변환 및 중앙값 중심이었다. Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 NMIBC 조직 대 대조군 조직에서 BUB1의 발현을 조사하였다. P 값 <0.05는 유의성이 있는 것으로 간주되었다. 다양한 임상 병리학적 변수의 중요성은 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 회귀 모델을 사용하여 평가되었다. 상대 위험은 위험비(Hazard ratio, HR)와 95% 신뢰 구간(confidence intervals, CI)에 의해 결정되었다. Kaplan-Meier 생존 곡선을 그려 유전적 바이오 마커의 예후값을 결정하고 로그 순위 테스트를 사용하여 비교하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 8(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 및 IBM SPSS Statistics ver. 24.0(IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하여 수행되었다. P 값 <0.05는 유의성이 있는 것으로 간주되었다.
2. 결과
스크리닝 테스트
[비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 전사체 프로파일]
비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 새로운 후보 예측 마커 유전자를 확인하기 위해 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 방광 종양(n=16) 및 정상 주변 조직(NAT; n=8)에서 RNA 시퀀싱을 수행하여 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 유전자 발현 패턴을 확인하였다.
주성분 분석(Principal component analysis; PCA)은 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자로부터 정상 주변 조직(NAT)과 종양의 전사체 프로파일을 분리하였다(도 3a 참조). 본 실험에서 정상 주변 조직(NAT)과 비교하여 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 1178개의 차등적으로 발현된 유전자(270개의 상향 조절된 유전자 및 908개의 하향 조절된 유전자)(FDR <0.05, > 2 fold differences in expression)를 확인하였다(도 3b 참조). 이중 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 크게 변경된 대표적인 유전자를 Volcano 플롯 그래프로 시각화하였다(도 3c 참조). 유전자 온톨로지(GO) 분석은 차등적으로 발현된 유전자의 기능성 프로파일을 밝혀냈다. 정상 주변 조직(NAT)에 비해 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 상향 조절된 유전자는 세포주기, DNA 패키징, 세포 분열, G2/M 체크 포인트 및 DNA 복구와 같은 경로(pathway)와 강하게 연관되어 있는 것으로 나타났으며; 반면에, 정상 주변 조직(NAT)에 비해 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 하향 조절된 유전자는 세포 외 기질 조직, 근육 시스템 과정 및 근육 구조 발달과 연관되어 있는 것으로 나타났다(도 3d 참조). 이러한 과정은 종양 발달 및 진행과 관련된 방광암의 잘 알려진 변화이다. 더욱이 유전자세트증폭분석(GSEA)은 또한 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 상향 조절된 유전자가 세포주기 및 G2/M 체크 포인트 과정과 연관되어 있음을 보여주었다(도 3e 참조).
상기 결과를 종합한 결과, 세포주기를 조절하는 유전자가 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
[두 개의 다른 코호트에서 차등적으로 발현된 유전자 비교]
RNA-시퀀싱 분석 결과 정상 주변 조직(NAT) 대비 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 상향 조절된 270개의 유전자, GSE13507 데이터 세트에서 정상 대조군 대비 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 상향 조절된 481개의 유전자, GSE13507 데이터 세트에서 비근침윤성 방광암(NMIBC) 대비 근침윤성 방광암(MIBC) 환자에서 상향 조절된 527개의 유전자를 교차시켜 비근침윤성 방광암(NMIBC) 예후를 위한 표적 이상치 유전자를 얻었다(도 1 다이아그램 참조). 따라서, 19개의 상향 조절된 유전자가 세 가지 범주 사이에 중첩되어 이러한 유전자가 방광암에 대한 가장 유망한 후보임을 확인하였다. 이렇게 선별된 19개 유전자의 생물학적 특징을 유전자 온톨로지(GO) 분석을 통해 상기 유전자가 핵 분열, 방추 조직 및 세포질 분열과 같은 세포주기의 중요한 단계에 관련되어 있음을 확인하였다(도 2 참조). 이 중 스핀들 체크 포인트 조절자(spindle checkpoint regulator)인 BUB1을 NMIBC 병인 및 예후에 미치는 역할을 평가하기 위해 최종적인 유전자로 선택하였다. RNA-시퀀싱 분석에서 비근침윤성 방광암(NMIBC) 및 정상 주변 조직(NAT)에서 BUB1의 발현은 도 4에 자세히 나타내었다.
트레이닝 테스트
[비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서 BUB1 mRNA 발현]
비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서 BUB1의 mRNA 발현을 확인하기 위해 RT-qPCR 분석을 수행한 결과, BUB1이 대조군보다 비근침윤성 방광암(NMIBC) 조직에서 상당히 과발현되었음을 확인하였다(정상 방광 점막; P <0.0001)(도 5a 참조). 그리고 BUB1 mRNA는 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 등급(grade)과 예후 변화에 따라 다르게 발현되는 것을 확인하였다. 고등급(High grade)의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 BUB1 발현은 저등급(low grade)의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서의 발현보다 유의하게 높게 나타났다(P <0.01; 도 5b 참조). 더욱이, BUB1의 mRNA 발현은 진행이 없는 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자와 비교했을 때 나중에 근침윤성 방광암(MIBC)로 진행한 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 더 높은 것으로 나타났다(P <0.05; 도 5c 참조).
이러한 결과는 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 예후 지표로서 BUB1의 가능성을 보여주는 것이다.
[BUB1 mRNA 발현의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 예후와의 관련성]
비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 BUB1의 예후력을 평가하기 위해 생존 분석을 수행하였다. 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 BUB1의 중간 컷오프 값(BUB1 높음 및 BUB1 낮음)에 따라 두 그룹으로 분류하였다. 현재 실시간 PCR 코호트를 통한 단변량(Univariate) 및 다변량(multivariate) Cox 회귀 분석은 BUB1이 HR이 등급 시스템(HR, 4.629; 95% CI, 1.593-13.450; P=0.005)과 유사한 NMIBC 환자(HR, 4.642; 95 % CI, 1.021-21.097; P = 0.047)의 진행에 대한 독립적인 예측 변수가 될 수 있음을 보여주었다(표 3 참조).
Kaplan-Meier 분석에 따르면 낮은 50 번째 백분위 수에서 BUB1 발현 수준을 가진 NMIBC 환자는 높은 50 번째 백분위 수에서 발현 수준을 가진 환자보다 진행률이 더 낮은 것으로 나타났다(log-rank test, P = 0.007; 도 6a 참조). 더욱이 2004년 WHO 등급 시스템과 BUB1 발현을 결합했을 때 Kaplan-Meier 분석은 낮은 BUB1 발현을 가진 저등급(low grade) NMIBC 환자가 가장 낮은 진행을 경험한 반면, 높은 BUB1 발현을 가진 고등급(High grade) NMIBC 환자가 가장 많은 진행을 경험한 것으로 나타났다(log-rank test, P <0.0001; 도 6b 참조).
| Variables | Univariate Cox analysis | Multivariate Cox analysis | ||
| HR (95% CI) | P value | HR (95% CI) | P value | |
| Age <65 (Ref.) vs. >65 |
1.946 (0.661-5.722) | 0.227 | ||
| Gender Male (Ref.) vs. Female |
1.872 (0.520-6.737) | 0.337 | ||
| Tumor size ≤1cm (Ref.) vs. 2-3cm |
1.563 (0.476-4.536) | 0.670 | ||
| Multiplicity | ||||
| Single | Ref. | |||
| 2-7 | 1.664 (0.437-6.326) | 0.455 | ||
| >7 | 5.178 (0.890-30.116) | 0.067 | ||
| 2004 WHO Grade Low (Ref.) vs. High |
5.808 (2.045-16.493) | 0.001* | 4.629 (1.593-13.450) | 0.005* |
| Stage Ta (Ref.) vs. T1 |
0.765 (0.261-2.243) | 0.626 | ||
| BCG No (Ref.) vs. Yes |
1.415 (0.474-4.225) | 0.534 | ||
| BUB1 expression High expression (Ref.) vs. Low expression |
6.076 (1.367-27.007) | 0.018* | 4.642 (1.021-21.097) | 0.047* |
BCG, Bacillus Calmette-Guerin; CI, confidence interval; HR, hazard ratio; Ref., reference.
*P<0.05.
검증 테스트
비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 BUB1의 발현 수준을 검증하기 위하여 공개된 방광암 환자 코호트 데이터(GSE13507 및 E-MTAT-4321)를 사용하였다.
[GSE13507 데이터 세트의 BUB1 mRNA 발현: 내부 검증]
BUB1 mRNA 발현은 GSE13507 코호트에서 정상 대조군과 비교하여 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 유의하게 향상되었으며(도 7a 참조), 이는 BUB1의 상향 조절이 비근침윤성 방광암(NMIBC) 발병에 중요한 사건이 될 수 있음을 나타낸다.
한편, BUB1은 T1 단계의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 Ta 단계의 환자보다 상당히 과발현되어 있는 것으로 나타났으며, 저등급(low grade)의 비근침윤성 방광암(NMIBC)에 비해 고등급(High grade)의 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 더 높은 발현을 나타냈다(P <0.05) (도 7b 및 7c 참조). 질병의 생물학적 공격성을 나타내는 종양 단계 및 등급은 비근침윤성 방광암(NMIBC)의 재발 및 진행에 대한 중요한 예후 인자이기 때문에 이러한 결과는 BUB1의 상향 조절이 NMIBC 예후와 관련이 있을 수 있음을 시사한다.
단변량(Univariate) Cox 회귀 분석은 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 BUB1의 발현이 무진행 생존(PFS)의 독립적인 예측인자임을 밝혀냈다. 단변량 분석에 따르면 BUB1 과발현 환자는 진행 위험이 15배 더 높은 것으로 나타났다(HR, 15; 95 % CI, 1.9-115; P = 0.011)(도 7d 참조).
Kaplan Meier 생존 분석에 따르면 BUB1 발현이 더 높은 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 경우 무진행 생존율이 더 낮은 것으로 나타났다(log-rank test, P = 0.0009)(도 7e 참조).
[E-MTAT-4321 데이터 세트의 BUB1 mRNA 발현: 외부 검증]
유사한 결과로서, E-MTAT-4321 코호트에서 고등급(High grade) 또는 T1 단계의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자가 저등급(low grade) 또는 Ta 단계의 환자보다 더 높은 BUB1 발현을 보인 것으로 확인되었다(모두 P <0.0001)(도 8a 및 8b 참조). 그러나 이 코호트에는 대조군이 없기 때문에 비근침윤성 방광암(NMIBC)과 대조군 간의 비교를 분석할 수 없었다.
단변량(Univariate) cox 회귀 분석에 따르면 BUB1 과발현 환자는 진행 위험이 5.7배 더 높은 것으로 나타나, 비근침윤성 방광암(NMIBC)에서 BUB1의 예후적 유의성을 나타냈다(HR, 5.7; 95% CI, 2.2-15; P <0.001)(도 8c 참조).
그리고 하위 50번째 백분위 수에 있는 BUB1 발현 수준을 가진 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자의 무진행 생존(PFS)은 상위 50번째 백분위 수에 있는 발현 수준을 가진 환자보다 진행을 덜 경험했다(log-rank test, P <0.00001) (도 8d 참조).
종양 단계 및 등급을 E-MTAT-4321 코호트에서 BUB1 발현과 통합 할 때, BUB1의 발현이 높은 T1 단계 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 최악의 무진행 생존(PFS)을 보였고, BUB1의 발현이 낮은 Ta 단계 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자에서 가장 만족스러운 무진행 생존(PFS)을 보여주었다(log-rank test, P<0.0001)(도 8e 참조).
그리고 BUB1 발현이 높은 고등급(High grade) 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 가장 힘든 무진행 생존(PFS)을 겪는 반면, BUB1 발현이 낮은 저등급(low grade) 그룹의 비근침윤성 방광암(NMIBC) 환자는 가장 낙관적인 무진행 생존(PFS)을 보여주었다(log-rank test, P <0.0001)(도 8f 참조).
BUB1 유전자를 넉다운시킨 방광암 세포주에서 암세포의 G2/M 세포주기 정지
BUB1이 방광암 세포에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 작은 간섭 RNA(siRNA)을 이용하여 BUB1 유전자를 넉다운(knockdown, KD)시킴으로써 방광암 세포주(5637 및 T24)에서 BUB1 발현을 조사하였다. 5637 및 T24 세포에서 BUB1의 발현량은 RT-qPCR를 통해 확인하였다.
BUB1의 발현 수준은 두 방광암 세포에서 비-표적 대조군(siNC) 대비 siBUB1을 형질주입한 세포에서 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(P <0.05), 넉다운 효율은 90-95%이었다(도 9a 및 9b 참조). 한편, 2개의 방광암 세포주의 세포주기 분석은 유세포 분석을 통해 수행되었으며, BUB1 siRNA로 형질주입된 세포의 경우 G2/M 단계에서 비율을 크게 증가한 것으로 나타났다(P <0.05)(도 9c 및 9d 참조). 따라서 BUB1 유전자 넉다운이 G2/M 단계의 전이를 억제할 수 있다. G2/M 단계에서 BUB1에 의해 유도된 세포주기의 비정상적인 조절은 세포의 과잉 증식과 비정상적인 암세포 수의 축적을 초래하여 결국 비근침윤성 방광암(NMIBC) 병인 및 진행으로 이어질수 있다고 사료된다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
NMIBC: Non-Muscle Invasive Bladder Cancer
MIBC: Muscle invasive bladder cancer
NATs: Normal adjacent tissues
TURBT: Trans Urethral Resection of Bladder Tumor
BCG: Bacillus Calmette-Guerin
PFS: Progression-free survival
KD: knockdown
GO: gene ontology
DEGs: differential expressed genes
GSEA: gene set enrichment analysis
RT-qPCR: real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
MIBC: Muscle invasive bladder cancer
NATs: Normal adjacent tissues
TURBT: Trans Urethral Resection of Bladder Tumor
BCG: Bacillus Calmette-Guerin
PFS: Progression-free survival
KD: knockdown
GO: gene ontology
DEGs: differential expressed genes
GSEA: gene set enrichment analysis
RT-qPCR: real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
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Non-muscle invasive bladder cancer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BUB1 cDNA polynucleotide sequence
<400> 1
atggacaccc cggaaaatgt ccttcaatac atacagtggg tagaagagaa ttttcctgag 60
aataaagaat acttgataac tttactagaa catttaatga aggaattttt agataagaag 120
aaataccaca atgacccaag attcatcagt tattgtttaa aatttgctga gtacaacagt 180
gacctccatc aattttttga gtttctgtac aaccatggga ttggaaccct gtcatcccct 240
ctgtacattg cctgggcggg gcatctggaa gcccaaggag agctgcagca tgccagtgct 300
gtccttcaga gaggaattca aaaccaggct gaacccagag agttcctgca acaacaatac 360
aggttatttc agacacgcct cactgaaacc catttgccag ctcaagctag aacctcagaa 420
cctctgcata atgttcaggt tttaaatcaa atgataacat caaaatcaaa tccaggaaat 480
aacatggcct gcatttctaa gaatcagggt tcagagcttt ctggagtgat atcttcagct 540
tgtgataaag agtcaaatat ggaacgaaga gtgatcacga tttctaaatc agaatattct 600
gtgcactcat ctttggcatc caaagttgat gttgagcagg ttgttatgta ttgcaaggag 660
aagcttattc gtggggaatc agaattttcc tttgaagaat tgagagccca gaaatacaat 720
caacggagaa agcatgagca atgggtaaat gaagacagac attatatgaa aaggaaagaa 780
gcaaatgctt ttgaagaaca gctattaaaa cagaaaatgg atgaacttca taagaagttg 840
catcaggtgg tggagacatc ccatgaggat ctgcccgctt cccaggaaag gtccgaggtt 900
aatccagcac gtatggggcc aagtgtaggc tcccagcagg aactgagagc gccatgtctt 960
ccagtaacct atcagcagac accagtgaac atggaaaaga acccaagaga ggcacctcct 1020
gttgttcctc ctttggcaaa tgctatttct gcagctttgg tgtccccagc caccagccag 1080
agcattgctc ctcctgttcc tttgaaagcc cagacagtaa cagactccat gtttgcagtg 1140
gccagcaaag atgctggatg tgtgaataag agtactcatg aattcaagcc acagagtgga 1200
gcagagatca aagaagggtg tgaaacacat aaggttgcca acacaagttc ttttcacaca 1260
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cctgatattt ctgatgacaa agatgaatgg caatctctag atcaaaatga agatgcattt 1440
gaagcccagt ttcaaaaaaa tgtaaggtca tctggggctt ggggagtcaa taagatcatc 1500
tcttctttgt catctgcttt tcatgtgttt gaagatggaa acaaagaaaa ttatggatta 1560
ccacagccta aaaataaacc cacaggagcc aggacctttg gagaacgctc tgtcagcaga 1620
cttccttcaa aaccaaagga ggaagtgcct catgctgaag agtttttgga tgactcaact 1680
gtatggggta ttcgctgcaa caaaaccctg gcacccagtc ctaagagccc aggagacttc 1740
acatctgctg cacaacttgc gtctacacca ttccacaagc ttccagtgga gtcagtgcac 1800
attttagaag ataaagaaaa tgtggtagca aaacagtgta cccaggcgac tttggattct 1860
tgtgaggaaa acatggtggt gccttcaagg gatggaaaat tcagtccaat tcaagagaaa 1920
agcccaaaac aggccttgtc gtctcacatg tattcagcat ccttacttcg tctgagccag 1980
cctgctgcag gtggggtact tacctgtgag gcagagttgg gcgttgaggc ttgcagactc 2040
acagacactg acgctgccat tgcagaagat ccaccagatg ctattgctgg gctccaagca 2100
gaatggatgc agatgagttc acttgggact gttgatgctc caaacttcat tgttgggaac 2160
ccatgggatg ataagctgat tttcaaactt ttatctgggc tttctaaacc agtgagttcc 2220
tatccaaata cttttgaatg gcaatgtaaa cttccagcca tcaagcccaa gactgaattt 2280
caattgggtt ctaagctggt ctatgtccat caccttcttg gagaaggagc ctttgcccag 2340
gtgtacgaag ctacccaggg agatctgaat gatgctaaaa ataaacagaa atttgtttta 2400
aaggtccaaa agcctgccaa cccctgggaa ttctacattg ggacccagtt gatggaaaga 2460
ctaaagccat ctatgcagca catgtttatg aagttctatt ctgcccactt attccagaat 2520
ggcagtgtat tagtaggaga gctctacagc tatggaacat tattaaatgc cattaacctc 2580
tataaaaata cccctgaaaa agtgatgcct caaggtcttg tcatctcttt tgctatgaga 2640
atgctttaca tgattgagca agtgcatgac tgtgaaatca ttcatggaga cattaaacca 2700
gacaatttca tacttggaaa cggatttttg gaacaggatg atgaagatga tttatctgct 2760
ggcttggcac tgattgacct gggtcagagt atagatatga aactttttcc aaaaggaact 2820
atattcacag caaagtgtga aacatctggt tttcagtgtg ttgagatgct cagcaacaaa 2880
ccatggaact accagatcga ttactttggg gttgctgcaa cagtatattg catgctcttt 2940
ggcacttaca tgaaagtgaa aaatgaagga ggagagtgta agcctgaagg tctttttaga 3000
aggcttcctc atttggatat gtggaatgaa ttttttcatg ttatgttgaa tattccagat 3060
tgtcatcatc ttccatcttt ggatttgtta aggcaaaagc tgaagaaagt atttcaacaa 3120
cactatacta acaagattag ggccctacgt aataggctaa ttgtactgct cttagaatgt 3180
aagcgttcac gaaaataa 3198
<210> 2
<211> 2382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UHRF1 cDNA polynucleotide sequence
<400> 2
atgtggatcc aggttcggac catggacggg aggcagaccc acacggtgga ctcgctgtcc 60
aggctgacca aggtggagga gctgaggcgg aagatccagg agctgttcca cgtggagcca 120
ggcctgcaga ggctgttcta caggggcaaa cagatggagg acggccatac cctcttcgac 180
tacgaggtcc gcctgaatga caccatccag ctcctggtcc gccagagcct cgtgctcccc 240
cacagcacca aggagcggga ctccgagctc tccgacaccg actccggctg ctgcctgggc 300
cagagtgagt cagacaagtc ctccacccac ggtgaggcgg ccgccgagac tgacagcagg 360
ccagccgatg aggacatgtg ggatgagacg gaattggggc tgtacaaggt caatgagtac 420
gtcgatgctc gggacacgaa catgggggcg tggtttgagg cgcaggtggt cagggtgacg 480
cggaaggccc cctcccggga cgagccctgc agctccacgt ccaggccggc gctggaggag 540
gacgtcattt accacgtgaa atacgacgac tacccggaga acggcgtggt ccagatgaac 600
tccagggacg tccgagcgcg cgcccgcacc atcatcaagt ggcaggacct ggaggtgggc 660
caggtggtca tgctcaacta caaccccgac aaccccaagg agcggggctt ctggtacgac 720
gcggagatct ccaggaagcg cgagaccagg acggcgcggg aactctacgc caacgtggtg 780
ctgggggatg attctctgaa cgactgtcgg atcatcttcg tggacgaagt cttcaagatt 840
gagcggccgg gtgaagggag ccccatggtt gacaacccca tgagacggaa gagcgggccg 900
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cacatctact gcctggaccc gcccctcagc agtgttccca gcgaggacga gtggtactgc 1080
cctgagtgcc ggaatgatgc cagcgaggtg gtactggcgg gagagcggct gagagagagc 1140
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atggcctgtg tgggccgcac caaggaatgt accatcgtcc cgtccaacca ctacggaccc 1260
atcccgggga tccccgtggg caccatgtgg cggttccgag tccaggtcag cgagtcgggt 1320
gtccatcggc cccacgtggc tggcatacac ggccggagca acgacggagc gtactcccta 1380
gtcctggcgg ggggctatga ggatgatgtg gaccatggga attttttcac atacacgggt 1440
agtggtggtc gagatctttc cggcaacaag aggaccgcgg aacagtcttg tgatcagaaa 1500
ctcaccaaca ccaacagggc gctggctctc aactgctttg ctcccatcaa tgaccaagaa 1560
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ggtggcaaga atagcaagta cgcccccgct gagggcaacc gctacgatgg catctacaag 1680
gttgtgaaat actggcccga gaaggggaag tccgggtttc tcgtgtggcg ctaccttctg 1740
cggagggacg atgatgagcc tggcccttgg acgaaggagg ggaaggaccg gatcaagaag 1800
ctggggctga ccatgcagta tccagaaggc tacctggaag ccctggccaa ccgagagcga 1860
gagaaggaga acagcaagag ggaggaggag gagcagcagg aggggggctt cgcgtccccc 1920
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gtcctcaacc agctcttccc cggctacggc aatggccggt ga 2382
<210> 3
<211> 912
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AURKB cDNA polynucleotide sequence
<400> 3
atgagccgct ccaatgtcca gcccacagct gcccctggcc agaaggtgat ggagaatagc 60
agtgggacac ccgacatctt aacgcggcac ttcacaattg atgactttga gattgggcgt 120
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atcgtggcgc tcaaggtcct cttcaagtcc cagatagaga aggagggcgt ggagcatcag 240
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<211> 2242
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TPX2 cDNA polynucleotide sequence
<400> 4
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ataagttact ggggaagaat ggaactggag ggctttttca gggcaaaact cctttgagaa 120
aggctaatct tcagcaagct attgtcacac ctttgaaacc agttgacaac acttactaca 180
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tggaagttga ggcagccata tcaagaaaaa ctccagccca gcctcagaga agatctctta 300
ggctttctgc tcagaaggat ttggaacaga aagaaaagca tcatgtaaaa atgaaagcca 360
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tagggcaacc tgtgaagaaa tcagtgagcc aggtcaccaa atcagttgac ttccacttcc 720
gcacagatga gcgaatcaaa caacatccta agaaccagga ggaatataag gaagtgaact 780
ttacatctga actacgaaag catccttcat ctcctgcccg agtgactaag ggatgtacca 840
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ctactgagaa gagagccaaa gagcggcagg agctggagaa gagaatggct gaggtagaag 1980
cccagaaagc ccagcagttg gaggaggcca gactacagga ggaagagcag aaaaaagagg 2040
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ctcgattcca ctgctaaact cagctgtgag ctgcggatac cgcccggcaa tgggacctgc 2220
tcttaacctc aaacctagga cc 2242
<210> 5
<211> 3160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BUB1B cDNA polynucleotide sequence
<400> 5
atgcaggatg gcggcggtga agaaggaagg gggtgctctg agtgaagcca tgtccctgga 60
gggagatgaa tgggaactga gtaaagaaaa tgtacaacct ttaaggcaag ggcggatcat 120
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gaaacgggca tttgaatatg aaattcgatt ttacactgga aatgaccctc tggatgtttg 240
ggataggtat atcagctgga cagagcagaa ctatcctcaa ggtgggaagg agagtaatat 300
gtcaacgtta ttagaaagag ctgtagaagc actacaagga gaaaaacgat attatagtga 360
tcctcgattt ctcaatctct ggcttaaatt agggcgttta tgcaatgagc ctttggatat 420
gtacagttac ttgcacaacc aagggattgg tgtttcactt gctcagttct atatctcatg 480
ggcagaagaa tatgaagcta gagaaaactt taggaaagca gatgcgatat ttcaggaagg 540
gattcaacag aaggctgaac cactagaaag actacagtcc cagcaccgac aattccaagc 600
tcgagtgtct cggcaaactc tgttggcact tgagaaagaa gaagaggagg aagtttttga 660
gtcttctgta ccacaacgaa gcacactagc tgaactaaag agcaaaggga aaaagacagc 720
aagagctcca atcatccgtg taggaggtgc tctcaaggct ccaagccaga acagaggact 780
ccaaaatcca tttcctcaac agatgcaaaa taatagtaga attactgttt ttgatgaaaa 840
tgctgatgag gcttctacag cagagttgtc taagcctaca gtccagccat ggatagcacc 900
ccccatgccc agggccaaag agaatgagct gcaagcaggc ccttggaaca caggcaggtc 960
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agttttccgg aagaaattaa aagagcaaag ggaagccgag ctattgacca gtgcagagaa 1320
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tactcagcaa gaaagaacag gtgatcagca agaagagacg atgcctacaa aggagacaac 1440
taaactgcaa attgcttccg agtctcagaa aataccagga atgactctat ccagttctgt 1500
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acctcattct aaaggtccca gtgtaccttt ctccattttt gatgagtttc ttctttcaga 1620
aaagaagaat aaaagtcctc ctgcagatcc cccacgagtt ttagctcaac gaagacccct 1680
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atccactcct tttcatgaga taatgtcctt gaaggatctc ccttctgatc ctgagagact 1920
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tatctacagt cagactctca gcatcaagaa gctgagccca attattgaag acagtcgtga 2040
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caaatgtctt caaattcctg agaaactaga acttactaat gagacttcag aaaaccctac 2160
tcagtcacca tggtgttcac agtatcgcag acagctactg aagtccctac cagagttaag 2220
tgcctctgca gagttgtgta tagaagacag accaatgcct aagttggaaa ttgagaagga 2280
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tcaacctgtc ccatgggact tttatatcaa cctcaagtta aaggaacgtt taaatgaaga 2460
ttttgatcat ttttgcagct gttatcaata tcaagatggc tgtattgttt ggcaccaata 2520
tataaactgc ttcacccttc aggatcttct ccaacacagt gaatatatta cccatgaaat 2580
aacagtgttg attatttata accttttgac aatagtggag atgctacaca aagcagaaat 2640
agtccatggt gacttgagtc caaggtgtct gattctcaga aacagaatcc acgatcccta 2700
tgattgtaac aagaacaatc aagctttgaa gatagtggac ttttcctaca gtgttgacct 2760
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acaaaagatc ctggctaact gttcttctcc ctaccaggta gacctgtttg gtatagcaga 2880
tttagcacat ttactattgt tcaaggaaca cctacaggtc ttctgggatg ggtccttctg 2940
gaaacttagc caaaatattt ctgagctaaa agatggtgaa ttgtggaata aattctttgt 3000
gcggattctg aatgccaatg atgaggccac agtgtctgtt cttggggagc ttgcagcaga 3060
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agggaagtta actagtcctg gggctttgct ctttcagtga 3160
<210> 6
<211> 2673
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIF20A cDNA polynucleotide sequence
<400> 6
atgtcgcaag ggatcctttc tccgccagcg ggcttgctgt ccgatgacga tgtcgtagtt 60
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tcagactgct ctgtcgtctc tacctcccta gaggacaagc agcaggttcc atctgaggac 180
agtatggaga aggtgaaagt atacttgagg gttaggccct tgttaccttc agagttggaa 240
cgacaggaag atcagggttg tgtccgtatt gagaatgtgg agacccttgt tctacaagca 300
cccaaggact cttttgccct gaagagcaat gaacggggaa ttggccaagc cacacacagg 360
ttcacctttt cccagatctt tgggccagaa gtgggacagg catccttctt caacctaact 420
gtgaaggaga tggtaaagga tgtactcaaa gggcagaact ggctcatcta tacatatgga 480
gtcactaact cagggaaaac ccacacgatt caaggtacca tcaaggatgg agggattctc 540
ccccggtccc tggcgctgat cttcaatagc ctccaaggcc aacttcatcc aacacctgat 600
ctgaagccct tgctctccaa tgaggtaatc tggctagaca gcaagcagat ccgacaggag 660
gaaatgaaga agctgtccct gctaaatgga ggcctccaag aggaggagct gtccacttcc 720
ttgaagagga gtgtctacat cgaaagtcgg ataggtacca gcaccagctt cgacagtggc 780
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gacagcaagt tgactcgagt gttccaaggt ttcttcacag gccgaggccg ttcctgcatg 1440
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cagtcagtgg cccatcagca atcagggtct gaattggccc tacggcggtc acaaaggttg 2040
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gcagagctaa actctaccac tgaagagttg cataagtatc agaaaatgtt agaaccacca 2160
ccctcagcca agcccttcac cattgatgtg gacaagaagt tagaagaggg ccagaagaat 2220
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gcttgttgcc acagcactgg ggcaggaaaa cttcgtcaag ccttgaccac ttgtgatgac 2340
atcttaatca aacaggacca gactctggct gaactgcaga acaacatggt gctagtgaaa 2400
ctggaccttc ggaagaaggc agcatgtatt gctgagcagt atcatactgt gttgaaactc 2460
caaggccagg tttctgccaa aaagcgcctt ggtaccaacc aggaaaatca gcaaccaaac 2520
caacaaccac cagggaagaa accattcctt cgaaatttac ttccccgaac accaacctgc 2580
caaagctcaa cagactgcag cccttatgcc cggatcctac gctcacggcg ttccccttta 2640
ctcaaatctg ggccttttgg caaaaagtac taa 2673
<210> 7
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDC20 cDNA polynucleotide sequence
<400> 7
atggcacagt tcgcgttcga gagtgacctg cactcgctgc ttcagctgga tgcacccatc 60
cccaatgcac cccctgcgcg ctggcagcgc aaagccaagg aagccgcagg cccggccccc 120
tcacccatgc gggccgccaa ccgatcccac agcgccggca ggactccggg ccgaactcct 180
ggcaaatcca gttccaaggt tcagaccact cctagcaaac ctggcggtga ccgctatatc 240
ccccatcgca gtgctgccca gatggaggtg gccagcttcc tcctgagcaa ggagaaccag 300
cctgaaaaca gccagacgcc caccaagaag gaacatcaga aagcctgggc tttgaacctg 360
aacggttttg atgtagagga agccaagatc cttcggctca gtggaaaacc acaaaatgcg 420
ccagagggtt atcagaacag actgaaagta ctctacagcc aaaaggccac tcctggctcc 480
agccggaaga cctgccgtta cattccttcc ctgccagacc gtatcctgga tgcgcctgaa 540
atccgaaatg actattacct gaaccttgtg gattggagtt ctgggaatgt actggccgtg 600
gcactggaca acagtgtgta cctgtggagt gcaagctctg gtgacatcct gcagcttttg 660
caaatggagc agcctgggga atatatatcc tctgtggcct ggatcaaaga gggcaactac 720
ttggctgtgg gcaccagcag tgctgaggtg cagctatggg atgtgcagca gcagaaacgg 780
cttcgaaata tgaccagtca ctctgcccga gtgggctccc taagctggaa cagctatatc 840
ctgtccagtg gttcacgttc tggccacatc caccaccatg atgttcgggt agcagaacac 900
catgtggcca cactgagtgg ccacagccag gaagtgtgtg ggctgcgctg ggccccagat 960
ggacgacatt tggccagtgg tggtaatgat aacttggtca atgtgtggcc tagtgctcct 1020
ggagagggtg gctgggttcc tctgcagaca ttcacccagc atcaaggggc tgtcaaggcc 1080
gtagcatggt gtccctggca gtccaatgtc ctggcaacag gagggggcac cagtgatcga 1140
cacattcgca tctggaatgt gtgctctggg gcctgtctga gtgccgtgga tgcccattcc 1200
caggtgtgct ccatcctctg gtctccccat tacaaggagc tcatctcagg ccatggcttt 1260
gcacagaacc agctagttat ttggaagtac ccaaccatgg ccaaggtggc tgaactcaaa 1320
ggtcacacat cccgggtcct gagtctgacc atgagcccag atggggccac agtggcatcc 1380
gcagcagcag atgagaccct gaggctatgg cgctgttttg agttggaccc tgcgcggcgg 1440
cgggagcggg agaaggccag tgcagccaaa agcagcctca tccaccaagg catccgctga 1500
1500
<210> 8
<211> 543
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK1 cDNA polynucleotide sequence
<400> 8
atgagctgca ttaacctgcc cactgtgctg cctggctccc ccagcaagac ccgggggcag 60
atccaggtga ttctcgggcc gatgttctca ggaaaaagca cagagttgat gagacgcgtc 120
cgtcgcttcc agattgctca gtacaagtgc ctggtgatca agtatgccaa agacactcgc 180
tacagcagca gcttctgcac acatgaccgg aacaccatgg aggcactgcc cgcctgcctg 240
ctccgagacg tggcccagga ggccctgggc gtggctgtca taggcatcga cgaggggcag 300
tttttccctg acatcgtgga gttctgcgag gccatggcca acgccgggaa gaccgtaatt 360
gtggctgcac tggatgggac cttccagagg aagccatttg gggccatcct gaacctggtg 420
ccgctggccg agagcgtggt gaagctgacg gcggtgtgca tggagtgctt ccgggaagcc 480
gcctatacca agaggctcgg cacagagaag gagcagattc tgcaatgcag ccctgccaac 540
tga 543
<210> 9
<211> 1395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CEP55 cDNA polynucleotide sequence
<400> 9
atgtcttcca gaagtaccaa agatttaatt aaaagtaagt ggggatcgaa gcctagtaac 60
tccaaatccg aaactacatt agaaaaatta aagggagaaa ttgcacactt aaagacatca 120
gtggatgaaa tcacaagtgg gaaaggaaag ctgactgata aagagagaca cagacttttg 180
gagaaaattc gagtccttga ggctgagaag gagaagaatg cttatcaact cacagagaag 240
gacaaagaaa tacagcgact gagagaccaa ctgaaggcca gatatagtac taccacattg 300
cttgaacagc tggaagagac aacgagagaa ggagaaagga gggagcaggt gttgaaagcc 360
ttatctgaag agaaagacgt attgaaacaa cagttgtctg ctgcaacctc acgaattgct 420
gaacttgaaa gcaaaaccaa tacactccgt ttatcacaga ctgtggctcc aaactgcttc 480
aactcatcaa taaataatat tcatgaaatg gaaatacagc tgaaagatgc tctggagaaa 540
aatcagcagt ggctcgtgta tgatcagcag cgggaagtct atgtaaaagg acttttagca 600
aagatctttg agttggaaaa gaaaacggaa acagctgctc attcactccc acagcagaca 660
aaaaagcctg aatcagaagg ttatcttcaa gaagagaagc agaaatgtta caacgatctc 720
ttggcaagtg caaaaaaaga tcttgaggtt gaacgacaaa ccataactca gctgagtttt 780
gaactgagtg aatttcgaag aaaatatgaa gaaacccaaa aagaagttca caatttaaat 840
cagctgttgt attcacaaag aagggcagat gtgcaacatc tggaagatga taggcataaa 900
acagagaaga tacaaaaact cagggaagag aatgatattg ctaggggaaa acttgaagaa 960
gagaagaaga gatccgaaga gctcttatct caggtccagt ttctttacac atctctgcta 1020
aagcagcaag aagaacaaac aagggtagct ctgttggaac aacagatgca ggcatgtact 1080
ttagactttg aaaatgaaaa actcgaccgt caacatgtgc agcatcaatt gcatgtaatt 1140
cttaaggagc tccgaaaagc aagaaatcaa ataacacagt tggaatcctt gaaacagctt 1200
catgagtttg ccatcacaga gccattagtc actttccaag gagagactga aaacagagaa 1260
aaagttgccg cctcaccaaa aagtcccact gctgcactca atgaaagcct ggtggaatgt 1320
cccaagtgca atatacagta tccagccact gagcatcgcg atctgcttgt ccatgtggaa 1380
tactgttcaa agtag 1395
<210> 10
<211> 2571
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TTK cDNA polynucleotide sequence
<400> 10
atggaatccg aggatttaag tggcagagaa ttgacaattg attccataat gaacaaagtg 60
agagacatta aaaataagtt taaaaatgaa gaccttactg atgaactaag cttgaataaa 120
atttctgctg atactacaga taactcggga actgttaacc aaattatgat gatggcaaac 180
aacccagagg actggttgag tttgttgctc aaactagaga aaaacagtgt tccgctaagt 240
gatgctcttt taaataaatt gattggtcgt tacagtcaag caattgaagc gcttccccca 300
gataaatatg gccaaaatga gagttttgct agaattcaag tgagatttgc tgaattaaaa 360
gctattcaag agccagatga tgcacgtgac tactttcaaa tggccagagc aaactgcaag 420
aaatttgctt ttgttcatat atcttttgca caatttgaac tgtcacaagg taatgtcaaa 480
aaaagtaaac aacttcttca aaaagctgta gaacgtggag cagtaccact agaaatgctg 540
gaaattgccc tgcggaattt aaacctccaa aaaaagcagc tgctttcaga ggaggaaaag 600
aagaatttat cagcatctac ggtattaact gcccaagaat cattttccgg ttcacttggg 660
catttacaga ataggaacaa cagttgtgat tccagaggac agactactaa agccaggttt 720
ttatatggag agaacatgcc accacaagat gcagaaatag gttaccggaa ttcattgaga 780
caaactaaca aaactaaaca gtcatgccca tttggaagag tcccagttaa ccttctaaat 840
agcccagatt gtgatgtgaa gacagatgat tcagttgtac cttgttttat gaaaagacaa 900
acctctagat cagaatgccg agatttggtt gtgcctggat ctaaaccaag tggaaatgat 960
tcctgtgaat taagaaattt aaagtctgtt caaaatagtc atttcaagga acctctggtg 1020
tcagatgaaa agagttctga acttattatt actgattcaa taaccctgaa gaataaaacg 1080
gaatcaagtc ttctagctaa attagaagaa actaaagagt atcaagaacc agaggttcca 1140
gagagtaacc agaaacagtg gcaatctaag agaaagtcag agtgtattaa ccagaatcct 1200
gctgcatctt caaatcactg gcagattccg gagttagccc gaaaagttaa tacagagaaa 1260
cataccactt ttgagcaacc tgtcttttca gtttcaaaac agtcaccacc aatatcaaca 1320
tctaaatggt ttgacccaaa atctatttgt aagacaccaa gcagcaatac cttggatgat 1380
tacatgagct gttttagaac tccagttgta aagaatgact ttccacctgc ttgtcagttg 1440
tcaacacctt atggccaacc tgcctgtttc cagcagcaac agcatcaaat acttgccact 1500
ccacttcaaa atttacaggt tttagcatct tcttcagcaa atgaatgcat ttcggttaaa 1560
ggaagaattt attccatatt aaagcagata ggaagtggag gttcaagcaa ggtatttcag 1620
gtgttaaatg aaaagaaaca gatatatgct ataaaatatg tgaacttaga agaagcagat 1680
aaccaaactc ttgatagtta ccggaacgaa atagcttatt tgaataaact acaacaacac 1740
agtgataaga tcatccgact ttatgattat gaaatcacgg accagtacat ctacatggta 1800
atggagtgtg gaaatattga tcttaatagt tggcttaaaa agaaaaaatc cattgatcca 1860
tgggaacgca agagttactg gaaaaatatg ttagaggcag ttcacacaat ccatcaacat 1920
ggcattgttc acagtgatct taaaccagct aactttctga tagttgatgg aatgctaaag 1980
ctaattgatt ttgggattgc aaaccaaatg caaccagata caacaagtgt tgttaaagat 2040
tctcaggttg gcacagttaa ttatatgcca ccagaagcaa tcaaagatat gtcttcctcc 2100
agagagaatg ggaaatctaa gtcaaagata agccccaaaa gtgatgtttg gtccttagga 2160
tgtattttgt actatatgac ttacgggaaa acaccatttc agcagataat taatcagatt 2220
tctaaattac atgccataat tgatcctaat catgaaattg aatttcccga tattccagag 2280
aaagatcttc aagatgtgtt aaagtgttgt ttaaaaaggg acccaaaaca gaggatatcc 2340
attcctgagc tcctggctca tccatatgtt caaattcaaa ctcatccagt taaccaaatg 2400
gccaagggaa ccactgaaga aatgaaatat gttctgggcc aacttgttgg tctgaattct 2460
cctaactcca ttttgaaagc tgctaaaact ttatatgaac actatagtgg tggtgaaagt 2520
cataattctt catcctccaa gacttttgaa aaaaaaaggg gaaaaaaatg a 2571
<210> 11
<211> 1197
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCNB2 cDNA polynucleotide sequence
<400> 11
atggcgctgc tccgacgccc gacggtgtcc agtgatttgg agaatattga cacaggagtt 60
aattctaaag ttaagagtca tgtgactatt aggcgaactg ttttagaaga aattggaaat 120
agagttacaa ccagagcagc acaagtagct aagaaagctc agaacaccaa agttccagtt 180
caacccacca aaacaacaaa tgtcaacaaa caactgaaac ctactgcttc tgtcaaacca 240
gtacagatgg aaaagttggc tccaaagggt ccttctccca cacctgagga tgtctccatg 300
aaggaagaga atctctgcca agctttttct gatgccttgc tctgcaaaat cgaggacatt 360
gataacgaag attgggagaa ccctcagctc tgcagtgact acgttaagga tatctatcag 420
tatctcaggc agctggaggt tttgcagtcc ataaacccac atttcttaga tggaagagat 480
ataaatggac gcatgcgtgc catcctagtg gattggctgg tacaagtcca ctccaagttt 540
aggcttctgc aggagactct gtacatgtgc gttggcatta tggatcgatt tttacaggtt 600
cagccagttt cccggaagaa gcttcaatta gttgggatta ctgctctgct cttggcttcc 660
aagtatgagg agatgttttc tccaaatatt gaagactttg tttacatcac agacaatgct 720
tataccagtt cccaaatccg agaaatggaa actctaattt tgaaagaatt gaaatttgag 780
ttgggtcgac ccttgccact acacttctta aggcgagcat caaaagccgg ggaggttgat 840
gttgaacagc acactttagc caagtatttg atggagctga ctctcatcga ctatgatatg 900
gtgcattatc atccttctaa ggtagcagca gctgcttcct gcttgtctca gaaggttcta 960
ggacaaggaa aatggaactt aaagcagcag tattacacag gatacacaga gaatgaagta 1020
ttggaagtca tgcagcacat ggccaagaat gtggtgaaag taaatgaaaa cttaactaaa 1080
ttcatcgcca tcaagaataa gtatgcaagc agcaaactcc tgaagatcag catgatccct 1140
cagctgaact caaaagccgt caaagacctt gcctccccac tgataggaag gtcctag 1197
<210> 12
<211> 2085
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HJURP cDNA polynucleotide sequence
<400> 12
atgctgggta cgctgcgcgc catggagggc gaggacgtgg aagacgacca gctgctgcag 60
aagctcaggg ccagtcgccg ccgcttccag aggcgcatgc agcggctgat agagaagtac 120
aaccagccct tcgaggacac cccggtggtg caaatggcca cgctgaccta cgagacgcca 180
cagggattga gaatttgggg tggaagacta ataaaggaaa gaaacgaagg agagatccag 240
cctgcagtgc ctcaaagccc tttgaaaaat gaattaagaa ggaaatactt gacccaagtg 300
gatatactgc tacaaggtgc agagtatttt gagtgtgcag gtaacagagc tggaagggat 360
gtacgtgtga ctccgctgcc ttcactggcc tcacctgccg tgcctgcccc cggatactgc 420
agtcgtatct ccagaaagag tcctggtgac ccagcgaaac cagcttcatc tcccagagaa 480
tgggatcctt tgcatccttc ctccacagac atggccttag tacctagaaa tgacagcctc 540
tccctacaag agaccagtag cagcagcttc ttaagcagcc agccctttga agatgatgac 600
atttgcaatg tgaccatcag tgacctgtac gcagggatgc tgcactccat gagccggctg 660
ttgagcacaa agccatcaag catcatctcc accaaaacgt tcatcatgca aaactggaac 720
tccaggagga ggcacagata taagagcagg atgaacaaaa catattgcaa aggagccaga 780
cgttctcaga ggagctccaa ggagaacttc ataccctgct ctgagcctgt gaaagggaca 840
ggggcattaa gagattgcaa gaacgtatta gatgtttctt gccgtaagac aggtttaaaa 900
ttggaaaaag cttttcttga agtcaacaga ccccaaatcc ataagttaga tccaagttgg 960
aaggagcgca aagtgacacc ctcgaagtat tcttccttga tttacttcga ctccagtgca 1020
acatataatc ttgatgagga aaatagattt aggacattaa aatggttaat ttctcctgta 1080
aaaatagttt ccagaccaac aatacgacag ggccatggag agaaccgtca gagggagatt 1140
gaaatccgat ttgatcagct tcatcgggaa tattgcctga gtcccaggaa ccagcctcgc 1200
cggatgtgcc tcccggactc ctgggccatg aacatgtaca gagggggtcc tgcgagtcct 1260
ggtggccttc agggcttaga aacccgcagg ctgagtttac cttccagcaa agcaaaagca 1320
aaaagtttaa gtgaggcttt tgaaaaccta ggcaaaagat ctctggaagc aggtaggtgc 1380
ctgcccaaga gcgattcatc ttcatcactt ccaaagacca accccacaca cagcgcaact 1440
cgcccgcagc agacatctga ccttcacgtt cagggaaata gttctggaat atttagaaag 1500
tcagtgtcac ccagcaaaac tctttcagtc ccagataaag aagtgccagg ccacggaagg 1560
aatcgttacg atgaaattaa agaagaattt gacaagcttc atcaaaagta ttgcctcaaa 1620
tctcctgggc agatgacagt gcctttatgt attggagtgt ctacagataa agcaagtatg 1680
gaagttcgat atcaaacaga aggcttctta ggaaaattaa atccagaccc tcacttccag 1740
ggtttccaga agttgccatc atcacccctg gggtgcagaa aaagtctact gggctcaact 1800
gcaattgagg ctccttcatc tacatgtgtt gctcgtgcca tcacgaggga tggcacgagg 1860
gaccatcagt tccctgcaaa aagacccagg ctatcagaac cccagggctc cggacgccag 1920
ggcaattccc tgggtgcctc agatggggtg gacaacaccg tcagaccggg agaccagggc 1980
agctcttcac agcccaactc agaagagaga ggagagaaca cgtcttacag gatggaagag 2040
aaaagtgatt tcatgctaga aaaattggaa actaaaagtg tgtag 2085
<210> 13
<211> 1320
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUSAP1 cDNA polynucleotide sequence
<400> 13
atgatcatcc cctctctaga ggagctggac tccctcaagt acagtgacct gcagaactta 60
gccaagagtc tgggtctccg ggccaacctg agggcaacca agttgttaaa agccttgaaa 120
ggctacatta aacatgaggc aagaaaagga aatgagaatc aggatgaaag tcaaacttct 180
gcatcctctt gtgatgagac tgagatacag atcagcaacc aggaagaagc tgagagacag 240
ccacttggcc atgtcaccaa aacaaggaga aggtgcaaga ctgtccgtgt ggaccctgac 300
tcacagaatc attcagagat aaaaataagt aatcccactg aattccagaa tcatgaaaag 360
caggaaagcc aggatctcag agctactgca aaagttcctt ctccaccaga cgagcaccaa 420
gaagctgaga atgctgtttc ctcaggtaac agagattcaa aggtaccttc agaaggaaag 480
aaatctctct acacagatga gtcatccaaa cctggaaaaa ataaaagaac tgcaatcact 540
actccaaact ttaagaagct tcatgaagct cattttaagg aaatggagtc cattgatcaa 600
tatattgaga gaaaaaagaa acattttgaa gaacacaatt ccatgaatga actgaagcag 660
cccatcaata agggaggggt caggactcca gtacctccaa gaggaagact ctctgtggct 720
tctactccca tcagccaacg acgctcgcaa ggccggtctt gtggccctgc aagtcagagt 780
accttgggtc tgaaggggtc actcaagcgc tctgctatct ctgcagctaa aacgggtgtc 840
aggttttcag ctgctactaa agataatgag cataagcgtt cactgaccaa gactccagcc 900
agaaagtctg cacatgtgac cgtgtctggg ggcaccccaa aaggcgaggc tgtgcttggg 960
acacacaaat taaagaccat cacggggaat tctgctgctg ttattacccc attcaagttg 1020
acaactgagg caacgcagac tccagtctcc aataagaaac cagtgtttga tcttaaagca 1080
agtttgtctc gtcccctcaa ctatgaacca cacaaaggaa agctaaaacc atgggggcaa 1140
tctaaagaaa ataattatct aaatcaacat gtcaacagaa ttaacttcta caagaaaact 1200
tacaaacaac cccatctcca gacaaaggaa gagcaacgga agaaacgcga gcaagaacga 1260
aaggagaaga aagcaaaggt tttgggaatg cgaaggggcc tcattttggc tgaagattaa 1320
1320
<210> 14
<211> 4596
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TOP2A cDNA polynucleotide sequence
<400> 14
atggaagtgt caccattgca gcctgtaaat gaaaatatgc aagtcaacaa aataaagaaa 60
aatgaagatg ctaagaaaag actgtctgtt gaaagaatct atcaaaagaa aacacaattg 120
gaacatattt tgctccgccc agacacctac attggttctg tggaattagt gacccagcaa 180
atgtgggttt acgatgaaga tgttggcatt aactataggg aagtcacttt tgttcctggt 240
ttgtacaaaa tctttgatga gattctagtt aatgctgcgg acaacaaaca aagggaccca 300
aaaatgtctt gtattagagt cacaattgat ccggaaaaca atttaattag tatatggaat 360
aatggaaaag gtattcctgt tgttgaacac aaagttgaaa agatgtatgt cccagctctc 420
atatttggac agctcctaac ttctagtaac tatgatgatg atgaaaagaa agtgacaggt 480
ggtcgaaatg gctatggagc caaattgtgt aacatattca gtaccaaatt tactgtggaa 540
acagccagta gagaatacaa gaaaatgttc aaacagacat ggatggataa tatgggaaga 600
gctggtgaga tggaactcaa gcccttcaat ggagaagatt atacatgtat cacctttcag 660
cctgatttgt ctaagtttaa aatgcaaagc ctggacaaag atattgttgc actaatggtc 720
agaagagcat atgatattgc tggatccacc aaagatgtca aagtctttct taatggaaat 780
aaactgccag taaaaggatt tcgtagttat gtggacatgt atttgaagga caagttggat 840
gaaactggta actccttgaa agtaatacat gaacaagtaa accacaggtg ggaagtgtgt 900
ttaactatga gtgaaaaagg ctttcagcaa attagctttg tcaacagcat tgctacatcc 960
aagggtggca gacatgttga ttatgtagct gatcagattg tgactaaact tgttgatgtt 1020
gtgaagaaga agaacaaggg tggtgttgca gtaaaagcac atcaggtgaa aaatcacatg 1080
tggatttttg taaatgcctt aattgaaaac ccaacctttg actctcagac aaaagaaaac 1140
atgactttac aacccaagag ctttggatca acatgccaat tgagtgaaaa atttatcaaa 1200
gctgccattg gctgtggtat tgtagaaagc atactaaact gggtgaagtt taaggcccaa 1260
gtccagttaa acaagaagtg ttcagctgta aaacataata gaatcaaggg aattcccaaa 1320
ctcgatgatg ccaatgatgc agggggccga aactccactg agtgtacgct tatcctgact 1380
gagggagatt cagccaaaac tttggctgtt tcaggccttg gtgtggttgg gagagacaaa 1440
tatggggttt tccctcttag aggaaaaata ctcaatgttc gagaagcttc tcataagcag 1500
atcatggaaa atgctgagat taacaatatc atcaagattg tgggtcttca gtacaagaaa 1560
aactatgaag atgaagattc attgaagacg cttcgttatg ggaagataat gattatgaca 1620
gatcaggacc aagatggttc ccacatcaaa ggcttgctga ttaattttat ccatcacaac 1680
tggccctctc ttctgcgaca tcgttttctg gaggaattta tcactcccat tgtaaaggta 1740
tctaaaaaca agcaagaaat ggcattttac agccttcctg aatttgaaga gtggaagagt 1800
tctactccaa atcataaaaa atggaaagtc aaatattaca aaggtttggg caccagcaca 1860
tcaaaggaag ctaaagaata ctttgcagat atgaaaagac atcgtatcca gttcaaatat 1920
tctggtcctg aagatgatgc tgctatcagc ctggccttta gcaaaaaaca gatagatgat 1980
cgaaaggaat ggttaactaa tttcatggag gatagaagac aacgaaagtt acttgggctt 2040
cctgaggatt acttgtatgg acaaactacc acatatctga catataatga cttcatcaac 2100
aaggaactta tcttgttctc aaattctgat aacgagagat ctatcccttc tatggtggat 2160
ggtttgaaac caggtcagag aaaggttttg tttacttgct tcaaacggaa tgacaagcga 2220
gaagtaaagg ttgcccaatt agctggatca gtggctgaaa tgtcttctta tcatcatggt 2280
gagatgtcac taatgatgac cattatcaat ttggctcaga attttgtggg tagcaataat 2340
ctaaacctct tgcagcccat tggtcagttt ggtaccaggc tacatggtgg caaggattct 2400
gctagtccac gatacatctt tacaatgctc agctctttgg ctcgattgtt atttccacca 2460
aaagatgatc acacgttgaa gtttttatat gatgacaacc agcgtgttga gcctgaatgg 2520
tacattccta ttattcccat ggtgctgata aatggtgctg aaggaatcgg tactgggtgg 2580
tcctgcaaaa tccccaactt tgatgtgcgt gaaattgtaa ataacatcag gcgtttgatg 2640
gatggagaag aacctttgcc aatgcttcca agttacaaga acttcaaggg tactattgaa 2700
gaactggctc caaatcaata tgtgattagt ggtgaagtag ctattcttaa ttctacaacc 2760
attgaaatct cagagcttcc cgtcagaaca tggacccaga catacaaaga acaagttcta 2820
gaacccatgt tgaatggcac cgagaagaca cctcctctca taacagacta tagggaatac 2880
catacagata ccactgtgaa atttgttgtg aagatgactg aagaaaaact ggcagaggca 2940
gagagagttg gactacacaa agtcttcaaa ctccaaacta gtctcacatg caactctatg 3000
gtgctttttg accacgtagg ctgtttaaag aaatatgaca cggtgttgga tattctaaga 3060
gacttttttg aactcagact taaatattat ggattaagaa aagaatggct cctaggaatg 3120
cttggtgctg aatctgctaa actgaataat caggctcgct ttatcttaga gaaaatagat 3180
ggcaaaataa tcattgaaaa taagcctaag aaagaattaa ttaaagttct gattcagagg 3240
ggatatgatt cggatcctgt gaaggcctgg aaagaagccc agcaaaaggt tccagatgaa 3300
gaagaaaatg aagagagtga caacgaaaag gaaactgaaa agagtgactc cgtaacagat 3360
tctggaccaa ccttcaacta tcttcttgat atgccccttt ggtatttaac caaggaaaag 3420
aaagatgaac tctgcaggct aagaaatgaa aaagaacaag agctggacac attaaaaaga 3480
aagagtccat cagatttgtg gaaagaagac ttggctacat ttattgaaga attggaggct 3540
gttgaagcca aggaaaaaca agatgaacaa gtcggacttc ctgggaaagg ggggaaggcc 3600
aaggggaaaa aaacacaaat ggctgaagtt ttgccttctc cgcgtggtca aagagtcatt 3660
ccacgaataa ccatagaaat gaaagcagag gcagaaaaga aaaataaaaa gaaaattaag 3720
aatgaaaata ctgaaggaag ccctcaagaa gatggtgtgg aactagaagg cctaaaacaa 3780
agattagaaa agaaacagaa aagagaacca ggtacaaaga caaagaaaca aactacattg 3840
gcatttaagc caatcaaaaa aggaaagaag agaaatccct ggtctgattc agaatcagat 3900
aggagcagtg acgaaagtaa ttttgatgtc cctccacgag aaacagagcc acggagagca 3960
gcaacaaaaa caaaattcac aatggatttg gattcagatg aagatttctc agattttgat 4020
gaaaaaactg atgatgaaga ttttgtccca tcagatgcta gtccacctaa gaccaaaact 4080
tccccaaaac ttagtaacaa agaactgaaa ccacagaaaa gtgtcgtgtc agaccttgaa 4140
gctgatgatg ttaagggcag tgtaccactg tcttcaagcc ctcctgctac acatttccca 4200
gatgaaactg aaattacaaa cccagttcct aaaaagaatg tgacagtgaa gaagacagca 4260
gcaaaaagtc agtcttccac ctccactacc ggtgccaaaa aaagggctgc cccaaaagga 4320
actaaaaggg atccagcttt gaattctggt gtctctcaaa agcctgatcc tgccaaaacc 4380
aagaatcgcc gcaaaaggaa gccatccact tctgatgatt ctgactctaa ttttgagaaa 4440
attgtttcga aagcagtcac aagcaagaaa tccaaggggg agagtgatga cttccatatg 4500
gactttgact cagctgtggc tcctcgggca aaatctgtac gggcaaagaa acctataaag 4560
tacctggaag agtcagatga agatgatctg ttttaa 4596
<210> 15
<211> 1578
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRC1 cDNA polynucleotide sequence
<400> 15
atgaggagaa gtgaggtgct ggcggaggag tccatagtat gtctgcagaa agccctaaat 60
caccttcggg aaatatggga gctaattggg attccagagg accagcggtt acaaagaact 120
gaggtggtaa agaagcatat caaggaagaa ggagagacga ccatcttgca actagaaaaa 180
gatttgcgca cccaagtgga attgatgcga aaacagaaaa aggagagaaa acaggaactg 240
aagctacttc aagagcaaga tcaagaactg tgcgaaattc tttgtatgcc ccactatgat 300
attgacagtg cctcagtgcc cagcttagaa gagctgaacc agttcaggca acatgtgaca 360
actttgaggg aaacaaaggc ttctaggcgt gaggagtttg tcagtataaa gagacagatc 420
atactgtgta tggaagcatt agaccacacc ccagacacaa gctttgaaag agatgtggtg 480
tgtgaagacg aagatgcctt ttgtttgtct ttggagaata ttgcaacact acaaaagttg 540
ctacggcagc tggaaatgca gaaatcacaa aatgaagcag tgtgtgaggg gctgcgtact 600
caaatccgag agctctggga caggttgcaa atacctgaag aagaaagaga agctgtggcc 660
accattatgt ctgggtcaaa ggccaaggtc cggaaagcgc tgcaattaga agtggatcgg 720
ttggaagaac tgaaaatgca aaacatgaag aaagtgattg aggcaattcg agtggagctg 780
gttcagtact gggaccagtg cttttatagc caggagcaga gacaagcttt tgcccctttc 840
tgtgctgagg actacacaga aagtctgctc cagctccacg atgctgagat tgtgcggtta 900
aaaaactact atgaagttca caaggaactc tttgaaggtg tccagaagtg ggaagaaacc 960
tggaggcttt tcttagagtt tgagagaaaa gcttcagatc caaatcgatt tacaaaccga 1020
ggaggaaatc ttctaaaaga agaaaaacaa cgagccaagc tccagaaaat gctgcccaag 1080
ctggaagaag agttgaaggc acgaattgaa ttgtgggaac aggaacattc aaaggcattt 1140
atggtgaatg ggcagaaatt catggagtat gtggcagaac aatgggagat gcatcgattg 1200
gagaaagaga gagccaagca ggaaagacaa ctgaagaaca aaaaacagac agagacagag 1260
atgctgtatg gcagcgctcc tcgaacacct agcaagcggc gaggactggc tcccaataca 1320
ccgggcaaag cacgtaagct gaacactacc accatgtcca atgctacggc caatagtagc 1380
attcggccta tctttggagg gacagtctac cactcccccg tgtctcgact tcctccttct 1440
ggcagcaagc cagtcgctgc ttccacctgt tcagggaaga aaacaccccg tactggcagg 1500
catggagcca acaaggagaa cctggagctc aacggcagca tcctgagtgc gagaactttc 1560
aaaggcttcc aaatctga 1578
<210> 16
<211> 2517
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TACC3 cDNA polynucleotide sequence
<400> 16
atgagtctgc aggtcttaaa cgacaaaaat gtcagcaatg aaaaaaatac agaaaattgc 60
gacttcctgt tttcgccacc agaagttacc ggaagatcgt ctgttcttcg tgtgtcacag 120
aaagaaaatg tgccacccaa gaacctggcc aaagctatga aggtgacttt tcagacacct 180
ctgcgggatc cacagacgca caggattcta agtcctagca tggccagcaa acttgaggct 240
cctttcactc aggatgacac ccttggactg gaaaactcac acccggtctg gacacagaaa 300
gagaaccaac agctcatcaa ggaagtggat gccaaaacta ctcatggaat tctacagaaa 360
ccagtggagg ctgacaccga cctcctgggg gatgcaagcc cagcctttgg gagtggcagc 420
tccagcgagt ctggcccagg tgccctggct gacctggact gctcaagctc ttcccagagc 480
ccaggaagtt ctgagaacca aatggtgtct ccaggaaaag tgtctggcag ccctgagcaa 540
gccgtggagg aaaaccttag ttcctattcc ttagacagaa gagtgacacc cgcctctgag 600
accctagaag acccttgcag gacagagtcc cagcacaaag cggagactcc gcacggagcc 660
gaggaagaat gcaaagcgga gactccgcac ggagccgagg aggaatgccg gcacggtggg 720
gtctgtgctc ccgcagcagt ggccacttcg cctcctggtg caatccctaa ggaagcctgc 780
ggaggagcac ccctgcaggg tctgcctggc gaagccctgg gctgccctgc gggtgtgggc 840
acccccgtgc cagcagatgg cactcagacc cttacctgtg cacacacctc tgctcctgag 900
agcacagccc caaccaacca cctggtggct ggcagggcca tgaccctgag tcctcaggaa 960
gaagtggctg caggccaaat ggccagctcc tcgaggagcg gacctgtaaa actagaattt 1020
gatgtatctg atggcgccac cagcaaaagg gcacccccac caaggagact gggagagagg 1080
tccggcctca agcctccctt gaggaaagca gcagtgaggc agcaaaaggc cccgcaggag 1140
gtggaggagg acgacggtag gagcggagca ggagaggacc cccccatgcc agcttctcgg 1200
ggctcttacc acctcgactg ggacaaaatg gatgacccaa acttcatccc gttcggaggt 1260
gacaccaagt ctggttgcag tgaggcccag cccccagaaa gccctgagac caggctgggc 1320
cagccagcgg ctgaacagtt gcatgctggg cctgccacgg aggagccagg tccctgtctg 1380
agccagcagc tgcattcagc ctcagcggag gacacgcctg tggtgcagtt ggcagccgag 1440
accccaacag cagagagcaa ggagagagcc ttgaactctg ccagcacctc gcttcccaca 1500
agctgtccag gcagtgagcc agtgcccacc catcagcagg ggcagcctgc cttggagctg 1560
aaagaggaga gcttcagaga ccccgctgag gttctaggca cgggcgcgga ggtggattac 1620
ctggagcagt ttggaacttc ctcgtttaag gagtcggcct tgaggaagca gtccttatac 1680
ctcaagttcg accccctcct gagggacagt cctggtagac cagtgcccgt ggccaccgag 1740
accagcagca tgcacggtgc aaatgagact ccctcaggac gtccgcggga agccaagctt 1800
gtggagttcg atttcttggg agcactggac attcctgtgc caggcccacc cccaggtgtt 1860
cccgcgcctg ggggcccacc cctgtccacc ggacctatag tggacctgct ccagtacagc 1920
cagaaggacc tggatgcagt ggtaaaggcg acacaggagg agaaccggga gctgaggagc 1980
aggtgtgagg agctccacgg gaagaacctg gaactgggga agatcatgga caggttcgaa 2040
gaggttgtgt accaggccat ggaggaagtt cagaagcaga aggaactttc caaagctgaa 2100
atccagaaag ttctaaaaga aaaagaccaa cttaccacag atctgaactc catggagaag 2160
tccttctccg acctcttcaa gcgttttgag aaacagaaag aggtgatcga gggctaccgc 2220
aagaacgaag agtcactgaa gaagtgcgtg gaggattacc tggcaaggat cacccaggag 2280
ggccagaggt accaagccct gaaggcccac gcggaggaga agctgcagct ggcaaacgag 2340
gagatcgccc aggtccggag caaggcccag gcggaagcgt tggccctcca ggccagcctg 2400
aggaaggagc agatgcgcat ccagtcgctg gagaagacag tggagcagaa gactaaagag 2460
aacgaggagc tgaccaggat ctgcgacgac ctcatctcca agatggagaa gatctga 2517
<210> 17
<211> 2715
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCM2 cDNA polynucleotide sequence
<400> 17
atggcggaat catcggaatc cttcaccatg gcatccagcc cggcccagcg tcggcgaggc 60
aatgatcctc tcacctccag ccctggccga agctcccggc gtactgatgc cctcacctcc 120
agccctggcc gtgaccttcc accatttgag gatgagtccg aggggctcct aggcacagag 180
gggcccctgg aggaagaaga ggatggagag gagctcattg gagatggcat ggaaagggac 240
taccgcgcca tcccagagct ggacgcctat gaggccgagg gactggctct ggatgatgag 300
gacgtagagg agctgacggc cagtcagagg gaggcagcag agcgggccat gcggcagcgt 360
gaccgggagg ctggccgggg cctgggccgc atgcgccgtg ggctcctgta tgacagcgat 420
gaggaggacg aggagcgccc tgcccgcaag cgccgccagg tggagcgggc cacggaggac 480
ggcgaggagg acgaggagat gatcgagagc atcgagaacc tggaggatct caaaggccac 540
tctgtgcgcg agtgggtgag catggcgggc ccccggctgg agatccacca ccgcttcaag 600
aacttcctgc gcactcacgt cgacagccac ggccacaacg tcttcaagga gcgcatcagc 660
gacatgtgca aagagaaccg tgagagcctg gtggtgaact atgaggactt ggcagccagg 720
gagcacgtgc tggcctactt cctgcctgag gcaccggcgg agctgctgca gatctttgat 780
gaggctgccc tggaggtggt actggccatg taccccaagt acgaccgcat caccaaccac 840
atccatgtcc gcatctccca cctgcctctg gtggaggagc tgcgctcgct gaggcagctg 900
catctgaacc agctgatccg caccagtggg gtggtgacca gctgcactgg cgtcctgccc 960
cagctcagca tggtcaagta caactgcaac aagtgcaatt tcgtcctggg tcctttctgc 1020
cagtcccaga accaggaggt gaaaccaggc tcctgtcctg agtgccagtc ggccggcccc 1080
tttgaggtca acatggagga gaccatctat cagaactacc agcgtatccg aatccaggag 1140
agtccaggca aagtggcggc tggccggctg ccccgctcca aggacgccat tctcctcgca 1200
gatctggtgg acagctgcaa gccaggagac gagatagagc tgactggcat ctatcacaac 1260
aactatgatg gctccctcaa cactgccaat ggcttccctg tctttgccac tgtcatccta 1320
gccaaccacg tggccaagaa ggacaacaag gttgctgtag gggaactgac cgatgaagat 1380
gtgaagatga tcactagcct ctccaaggat cagcagatcg gagagaagat ctttgccagc 1440
attgctcctt ccatctatgg tcatgaagac atcaagagag gcctggctct ggccctgttc 1500
ggaggggagc ccaaaaaccc aggtggcaag cacaaggtac gtggtgatat caacgtgctc 1560
ttgtgcggag accctggcac agcgaagtcg cagtttctca agtatattga gaaagtgtcc 1620
agccgagcca tcttcaccac tggccagggg gcgtcggctg tgggcctcac ggcgtatgtc 1680
cagcggcacc ctgtcagcag ggagtggacc ttggaggctg gggccctggt tctggctgac 1740
cgaggagtgt gtctcattga tgaatttgac aagatgaatg accaggacag aaccagcatc 1800
catgaggcca tggagcaaca gagcatctcc atctcgaagg ctggcatcgt cacctccctg 1860
caggctcgct gcacggtcat tgctgccgcc aaccccatag gagggcgcta cgacccctcg 1920
ctgactttct ctgagaacgt ggacctcaca gagcccatca tctcacgctt tgacatcctg 1980
tgtgtggtga gggacaccgt ggacccagtc caggacgaga tgctggcccg cttcgtggtg 2040
ggcagccacg tcagacacca ccccagcaac aaggaggagg aggggctggc caatggcagc 2100
gctgctgagc ccgccatgcc caacacgtat ggcgtggagc ccctgcccca ggaggtcctg 2160
aagaagtaca tcatctacgc caaggagagg gtccacccga agctcaacca gatggaccag 2220
gacaaggtgg ccaagatgta cagtgacctg aggaaagaat ctatggcgac aggcagcatc 2280
cccattacgg tgcggcacat cgagtccatg atccgcatgg cggaggccca cgcgcgcatc 2340
catctgcggg actatgtgat cgaagacgac gtcaacatgg ccatccgcgt gatgctggag 2400
agcttcatag acacacagaa gttcagcgtc atgcgcagca tgcgcaagac ttttgcccgc 2460
tacctttcat tccggcgtga caacaatgag ctgttgctct tcatactgaa gcagttagtg 2520
gcagagcagg tgacatatca gcgcaaccgc tttggggccc agcaggacac tattgaggtc 2580
cctgagaagg acttggtgga taaggctcgt cagatcaaca tccacaacct ctctgcattt 2640
tatgacagtg agctcttcag gatgaacaag ttcagccacg acctgaaaag gaaaatgatc 2700
ctgcagcagt tctga 2715
<210> 18
<211> 3627
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RECQL4 cDNA polynucleotide sequence
<400> 18
atggagcggc tgcgggacgt gcgggagcgg ctgcaggcgt gggagcgcgc gttccgacgg 60
cagcgcgggc ggcgaccgag ccaggacgac gtggaggcgg cgccggagga gacccgcgcg 120
ctctaccggg aataccgcac tctgaagcgt accacgggcc aggccggcgg cgggctccgc 180
agctccgagt cgctccccgc ggcggccgaa gaggcgccag agccccgctg ctgggggccc 240
catctgaatc gggctgcgac caagagtcca cagtctacgc cagggcggag ccgccagggc 300
tcggtgccgg actacgggca gcggctcaag gccaatctga aaggcaccct gcaggccgga 360
ccagccctgg gccgcagacc gtggcctcta ggaagagcct catctaaggc atccacccca 420
aagcccccag gtacagggcc tgtcccctcc tttgcagaaa aagtcagtga tgagcctcca 480
cagctccctg agccccagcc aaggccaggc cggctccagc atctgcaggc atccctgagc 540
cagcggctgg gctccctaga tcctggctgg ttacagcgat gtcacagtga ggtcccagat 600
tttctggggg cccccaaagc ctgcaggcct gatctaggct cagaggaatc acaacttctg 660
atccctggtg agtcggctgt ccttggtcct ggtgctggct cccagggccc agaggcttca 720
gccttccaag aagtcagcat ccgtgtgggg agcccccagc ccagcagcag tggaggcgag 780
aagcggagat ggaacgagga gccctgggag agccccgcac aggtccagca ggagagcagc 840
caagctggac ccccatcgga gggggctggg gctgtagcag ttgaggaaga ccctccaggg 900
gaacctgtac aggcacagcc acctcagccc tgcagcagcc catcgaaccc caggtaccac 960
ggactcagcc cctccagtca agctagggct gggaaggctg agggcacagc ccccctgcac 1020
atcttccctc ggctggcccg ccatgacagg ggcaattacg tacggctcaa catgaagcag 1080
aaacactacg tgcggggccg ggcactccgt agcaggctcc tccgcaagca ggcatggaag 1140
cagaagtggc ggaagaaagg ggagtgtttt gggggtggtg gtgccacagt cacaaccaag 1200
gagtcttgtt tcctgaacga gcagttcgat cactgggcag cccagtgtcc ccggccagca 1260
agtgaggaag acacagatgc tgttgggcct gagccactgg ttccttcacc acaacctgta 1320
cctgaggtgc ccagcctgga ccccaccgtg ctgccactct actccctggg gccctcaggg 1380
cagttggcag agacgccggc tgaggtgttc caggccctgg agcagctggg gcaccaagcc 1440
tttcgccctg ggcaggagcg tgcagtcatg cggatcctgt ctggcatctc cacgctgctg 1500
gtgctgccta caggtgccgg caagtccctg tgctaccagc tcccagcgct gctctacagc 1560
cggcgcagcc cctgcctcac gttggtcgtc tctcccctgc tgtcactcat ggatgaccag 1620
gtgtctggcc tgccaccgtg tctcaaggcg gcctgcatac actcgggcat gaccaggaag 1680
caacgggaat ctgtcctgca gaagattcgg gcagcccagg tacacgtgct gatgctgaca 1740
cctgaggcac tggtgggggc gggaggcctc cctccagccg cacagctgcc tccagttgct 1800
tttgcctgca ttgatgaggc ccactgcctc tcccagtggt cccacaactt ccggccctgc 1860
tacctgcgcg tctgcaaggt gcttcgggag cgcatgggcg tgcactgctt cctgggcctc 1920
acagccacag ccacacgccg cactgccagt gacgtggcac agcacctggc tgtggctgaa 1980
gagcctgacc tccacgggcc agccccagtt cccaccaacc tgcacctttc cgtgtccatg 2040
gacagggaca cagaccaggc actgttgacg ctgctgcaag gcaaacgttt tcaaaacctc 2100
gattccatta tcatttactg caaccggcgc gaggacacag agcggatcgc tgcgctcctc 2160
cgaacctgcc tgcacgcagc ctgggtccca gggtctggag gtcgtgcccc caaaaccaca 2220
gccgaggcct accacgcggg catgtgcagc cgggaacggc ggcgggtaca gcgagccttc 2280
atgcagggcc agttgcgggt ggtggtggcc acggtggcct ttgggatggg gctggaccgg 2340
ccagatgtgc gggctgtgct gcatctgggg ctgcccccaa gcttcgagag ctacgtgcag 2400
gccgtgggcc gggccgggcg tgacgggcag cctgcccact gccacctctt cctgcagccc 2460
cagggcgaag acctgcgaga gctgcgcaga catgtgcacg ccgacagcac ggacttcctg 2520
gctgtgaaga ggctggtaca gcgcgtgttc ccagcctgca cctgcacctg caccaggccg 2580
ccctcggagc aggaaggggc cgtgggtggg gagaggcctg tgcccaagta cccccctcaa 2640
gaggctgagc agcttagcca ccaagcagcc ccaggaccca gaagggtctg catgggccat 2700
gagcgggcac tcccaataca gcttaccgta caggctttgg acatgccgga ggaggccatc 2760
gagactttgc tgtgctacct ggagctgcac ccacaccact ggctggagct gctggcgacc 2820
acctataccc attgccgtct gaactgccct gggggccctg cccagctcca ggccctggcc 2880
cacaggtgtc cccctttggc tgtgtgcttg gcccagcagc tgcctgagga cccagggcaa 2940
ggcagcagct ccgtggagtt tgacatggtc aagctggtgg actccatggg ctgggagctg 3000
gcctctgtgc ggcgggctct ctgccagctg cagtgggacc acgagcccag gacaggtgtg 3060
cggcgtggga caggggtgct tgtggagttc agtgagctgg ccttccacct tcgcagcccg 3120
ggggacttga ccgctgagga gaaggaccag atatgtgact tcctctatgg ccgtgtgcag 3180
gcccgggagc gccaggccct ggcccgtctg cgcagaacct tccaggcctt tcacagcgta 3240
gccttcccca gctgcgggcc ctgcctggag cagcaggatg aggagcgcag caccaggctc 3300
aaggacctgc tcggccgcta ctttgaggaa gaggaagggc aggagccggg aggcatggag 3360
gacgcacagg gccccgagcc agggcaggcc agactccagg attgggagga ccaggtccgc 3420
tgcgacatcc gccagttcct gtccctgagg ccagaggaga agttctccag cagggctgtg 3480
gcccgcatct tccacggcat cggaagcccc tgctacccgg cccaggtgta cgggcaggac 3540
cgacgcttct ggagaaaata cctgcacctg agcttccatg ccctggtggg cctggccacg 3600
gaagagctcc tgcaggtggc ccgctga 3627
<210> 19
<211> 3582
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPAG5 cDNA polynucleotide sequence
<400> 19
atgtggcgag tgaaaaaact gagcctcagc ctgtcgcctt cgccccagac gggaaaacca 60
tctatgagaa ctcctctccg tgaacttacc ctgcagcccg gtgccctcac caactctgga 120
aaaagatccc ccgcttgctc ctcgctgacc ccatcactgt gcaagctggg gctgcaggaa 180
ggcagcaaca actcatctcc agtggatttt gtaaataaca agaggacaga cttatcttca 240
gaacatttca gtcattcctc aaagtggcta gaaacttgtc agcatgaatc agatgagcag 300
cctctagatc caattcccca aattagctct actcctaaaa cgtctgagga agcagtagac 360
ccactgggca attatatggt taaaaccatc gtccttgtac catctccact ggggcagcaa 420
caagacatga tatttgaggc ccgtttagat accatggcag agacaaacag catatcttta 480
aatggacctt tgagaacaga cgatctggtg agagaggagg tggcaccctg catgggagac 540
aggttttcag aagttgctgc tgtatctgag aaacctatct ttcaggaatc tccgtcccat 600
ctcttagagg agtctccacc aaatccctgt tctgaacaac tacattgctc caaggaaagc 660
ctgagcagta gaactgaggc tgtgcgtgag gacttagtac cttctgaaag taacgccttc 720
ttgccttcct ctgttctctg gctttcccct tcaactgcct tggcagcaga tttccgtgtc 780
aatcatgtgg acccagagga ggaaattgta gagcatggag ctatggagga aagagaaatg 840
aggtttccca cacatcctaa ggagtctgaa acagaagatc aagcacttgt ctcaagtgtg 900
gaagatattc tgtccacatg cctgacacca aatctagtag aaatggaatc ccaagaagct 960
ccaggcccag cagtagaaga tgttggtagg attcttggct ctgatacaga gtcttggatg 1020
tccccactgg cctggctgga aaaaggtgta aatacctccg tcatgctgga aaatctccgc 1080
caaagcttat cccttccctc gatgcttcgg gatgctgcaa ttggcactac ccctttctct 1140
acttgctcgg tggggacttg gtttactcct tcagcaccac aggaaaagag tacaaacaca 1200
tcccagacag gcctggttgg caccaagcac agtacttctg agacagagca gctcctgtgt 1260
ggccggcctc cagatctgac tgccttgtct cgacatgact tggaagataa cctgctgagc 1320
tctcttgtca ttctggaggt tctctcccgc cagcttcggg actggaagag ccagctggct 1380
gtccctcacc cagaaaccca ggacagtagc acacagactg acacatctca cagtgggata 1440
actaataaac ttcagcatct taaggagagc catgagatgg gacaggccct acagcaggcc 1500
agaaatgtca tgcaatcatg ggtgcttatc tctaaagagc tgatatcctt gcttcaccta 1560
tccctgttgc atttagaaga agataagact actgtgagtc aggagtctcg gcgtgcagaa 1620
acattggtct gttgctgttt tgatttgctg aagaaattga gggcaaagct ccagagcctc 1680
aaagcagaaa gggaggaggc aaggcacaga gaggaaatgg ctctcagagg caaggatgcg 1740
gcagagatag tgttggaggc tttctgtgca cacgccagcc agcgcatcag ccagctggaa 1800
caggacctag catccatgcg ggaattcaga ggccttctga aggatgccca gacccaactg 1860
gtagggcttc atgccaagca agaagagctg gttcagcaga cagtgagtct tacttctacc 1920
ttgcaacaag actggaggtc catgcaactg gattatacaa catggacagc tttgctgagt 1980
cggtcccgac aactcacaga gaaactcaca gtcaagagcc agcaagccct gcaggaacgt 2040
gatgtggcaa ttgaggaaaa gcaggaggtt tctagggtgc tggaacaagt ctctgcccag 2100
ttagaggagt gcaaaggcca aacagaacaa ctggagttgg aaaacagtcg tctagcaaca 2160
gatctccggg ctcagttgca gattctggcc aacatggaca gccagctaaa agagctacag 2220
agtcagcata cccattgtgc ccaggacctg gctatgaagg atgagttact ctgccagctt 2280
acccagagca atgaggagca ggctgctcaa tggcaaaagg aagagatggc actaaaacac 2340
atgcaggcag aactgcagca gcaacaagct gtcctggcca aagaggtgcg ggacctgaaa 2400
gagaccttgg agtttgcaga ccaggagaat caggttgctc acctggagct gggtcaggtt 2460
gagtgtcaat tgaaaaccac actggaagtg ctccgggagc gcagcttgca gtgtgagaac 2520
ctcaaggaca ctgtagagaa cctaacggct aaactggcca gcaccatagc agataaccag 2580
gagcaagatc tggagaaaac acggcagtac tctcaaaagc tagggctgct gactgagcaa 2640
ctacagagcc tgactctctt tctacagaca aaactaaagg agaagactga acaagagacc 2700
cttctgctga gtacagcctg tcctcccacc caggaacacc ctctgcctaa tgacaggacc 2760
ttcctgggaa gcatcttgac agcagtggca gatgaagagc cagaatcaac tcctgtgccc 2820
ttgcttggaa gtgacaagag tgctttcacc cgagtagcat caatggtttc ccttcagccc 2880
gcagagaccc caggcatgga ggagagcctg gcagaaatga gtattatgac tactgagctt 2940
cagagtcttt gttccctgct acaagagtct aaagaagaag ccatcaggac tctgcagcga 3000
aaaatttgtg agctgcaagc taggctgcag gcccaggaag aacagcatca ggaagtccag 3060
aaggcaaaag aagcagacat agagaagctg aaccaggcct tgtgcttgcg ctacaagaat 3120
gaaaaggagc tccaggaagt gatacagcag cagaatgaga agatcctaga acagatagac 3180
aagagtggcg agctcataag ccttagagag gaggtgaccc accttacccg ctcacttcgg 3240
cgtgcggaga cagagaccaa agtgctccag gaggccctgg caggccagct ggactccaac 3300
tgccagccta tggccaccaa ttggatccag gagaaagtgt ggctctctca ggaggtggac 3360
aaactgagag tgatgttcct ggagatgaaa aatgagaagg aaaaactcat gatcaagttc 3420
cagagccata gaaatatcct agaggagaac cttcggcgct ctgacaagga gttagaaaaa 3480
ctagatgaca ttgttcagca tatttataag accctgctct ctattccaga ggtggtgagg 3540
ggatgcaaag aactacaggg attgctggaa tttctgagct aa 3582
Claims (10)
- BUB1 유전자를 유효성분으로 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커 조성물. - BUB1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물.
- 제3항에 있어서,
UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물. - 제3항에 있어서,
mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 선택된 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며; 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 선택된 유전자로부터 코딩되는 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 조성물. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 키트.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 마이크로어레이.
- 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 BUB1 유전자의 mRNA 발현수준 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 단계는 UHRF1, AURKB, TPX2, BUB1B, KIF20A, CDC20, TK1, CEP55, TTK, CCNB2, HJURP, NUSAP1, TOP2A, PRC1, TACC3, MCM2, RECQL4 및 SPAG5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 더 측정하는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비근침윤성 방광암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210072335A KR102631854B1 (ko) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | Bub1의 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커로의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210072335A KR102631854B1 (ko) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | Bub1의 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커로의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220163765A KR20220163765A (ko) | 2022-12-12 |
| KR102631854B1 true KR102631854B1 (ko) | 2024-01-30 |
Family
ID=84391464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210072335A KR102631854B1 (ko) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | Bub1의 비근침윤성 방광암의 예후 예측용 바이오마커로의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102631854B1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101750146B1 (ko) | 2014-12-30 | 2017-06-23 | 충북대학교 산학협력단 | 방광암 예후 진단 마커로서 ｒｓｐｈ９의 용도 |
| KR102029775B1 (ko) | 2018-01-23 | 2019-10-08 | 충북대학교 산학협력단 | 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-06-03 KR KR1020210072335A patent/KR102631854B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Expert Rev Mol Diagn, 18(5): 443-455 (2018.05.31.) |
| Front Oncol, 9: 523 (2019.06.25.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220163765A (ko) | 2022-12-12 |
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