KR102489708B1 - GDF11 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2와 microRNA를 함유하는 조성물 - Google Patents

GDF11 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2와 microRNA를 함유하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GDF11 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2와 microRNA를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 PCBP2 단백질과 microRNA-93-5p는 상호작용하여 항암 유전자인 GDF11의 발현을 조절할 수 있으므로, 암에 대한 예방, 개선 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

GDF11 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2와 microRNA를 함유하는 조성물{Composition for controlling expression of GDF11 gene comprising PCBP2 and microRNA}
본 발명은 GDF11(Growth differentiation factor 11) 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2(poly(rC) binding protein)와 microRNA를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
수십 년간의 노력에도 암은 아직까지 질병에 의한 현대인의 사망원인 중 1~2위를 차지하고 있다. 이와 같은 암은 정상세포가 발암물질이나 바이러스 등이 원인이 되어 유전 변이를 일으켜 발생하는 것으로, 항암제 개발과 치료는 정상세포에서는 발현되지 않고 암세포에서만 특이적으로 발현되는 유전자나 단백질을 표적으로 개발되어 왔다. 항암제는 단독 또는 방사능 요법 등의 다른 치료법과 병행하여 암을 치료하는 가장 일반적이며 효율적인 치료 방법이다. 이러한 항암제에 의한 암의 치료는 암세포를 사멸시킬 수 있는 능력에 기인하는데, 암세포뿐만 아니라 정상세포도 사멸시켜 빈번하게 탈모, 식욕부진, 오심, 구토, 호흡곤란, 구내염, 호중구 감소성 발열 등의 부작용을 유발한다. 환자의 일반적인 건강 상태에 따라 이와 같은 부작용은 항암제 치료를 불가능하게 하거나 적어도 환자에게 극도의 불쾌감과 불편함을 줄 수 있으며, 암 환자의 삶의 질을 심각하게 훼손시킬 수 있다.
마이크로 RNA(microRNA)는 18~25개 정도의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 비암호화 RNA로, 세포 내에 존재하는 헤어핀 구조 전사체(hairpin-shaped transcript)에 의해 생성된다. 마이크로 RNA는 표적 mRNA(messenger RNA)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억제자로서 작용하는데, mRNA 번역을 억제하여 유전자 발현을 억제하거나 mRNA 절단을 촉매하여 불안정화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 마이크로 RNA는 세포사멸, 세포주기, 유전자 조절 등 체내에서 다양한 역할에 관여하며, 표적 유전자와의 상호작용에 의해 암의 분화, 성장, 전이, 신생혈관생성, 세포사멸 등을 포함하는 생물의 전반적인 과정을 조절할 수 있으며, 표적 유전자에 따라 암에서 마이크로 RNA의 역할 및 기능이 좌우될 수 있다.
한편, 한국등록특허 제1042052호에 자궁경부암에서 특이적으로 생성이 증가하는 miR-199a의 '항-microRNA를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2110454호에 'microRNA-550a-3-5p 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 GDF11 유전자의 발현을 조절하는 PCBP2와 microRNA를 함유하는 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 microRNA-93-5p의 활성을 억제시키면 항암 유전자인 GDF11의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, RNA 풀-다운 기법(RNA pull-down assay)을 통해 GDF11 mRNA 내 microRNA-93-5p 표적 서열의 인접 서열과 PCBP2(poly(rC) binding protein) 단백질이 결합하여 서로 상호작용할 수 있음을 확인하였다. 또한 PCBP2 단백질의 발현을 억제시키면 microRNA-93-5p를 처리시 GDF11의 발현의 저해가 감소하였고, PCBP2 단백질이 존재하면 microRNA-93-5p에 의해 GDF11의 발현이 억제되는 것을 통해 microRNA-93-5p에 의한 GDF11 유전자의 발현 조절 현상이 PCBP2 단백질의 존재 하에 일어나는 것임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2(poly(rC) binding protein) 단백질 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p를 유효성분으로 포함하는 GDF11(Growth differentiation factor 11) 유전자의 발현 저해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p를 유효성분으로 포함하는 GDF11(Growth differentiation factor 11) 유전자의 발현 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 PCBP2 단백질 및 microRNA-93-5p는 서로 상호작용하여 항암 유전자인 GDF11의 발현을 조절할 수 있으므로 암에 대한 예방, 개선 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 microRNA-93-5p에 의한 GDF11 유전자의 발현 조절 효과를 확인한 것으로, 도 1A는 microRNA-93-5p 발현 벡터로 형질전환된 인간 간암 세포주 Huh7에서 GDF11 단백질의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯(Western blot) 결과이고, 도 1B는 GDF11 유전자를 표적으로 하는 microRNA-93-5p의 특정 서열이 GDF11 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 입증하기 위해 루시퍼라아제 리포터 어세이(Luciferase reporter assay)를 수행한 결과이며, 도 1C는 microRNA-93-5p 억제제(anti-miR-93)가 처리된 Huh7 세포에서 GDF11 유전자의 발현 수준을 확인한 루시퍼라아제 리포터 어세이 결과이다. WT: Mock(아무것도 처리하지 않은 Huh7 세포), miR-124: 음성 대조군(GDF11 유전자를 표적하지 않는 microRNA인 hsa-miR-124의 발현 벡터로 형질전환된 세포), miRNA target site Mutant: GDF11 유전자에서 microRNA-93-5p의 표적 서열(microRNA 2~7번째 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열)을 임의로 변경한 서열을 가지는 돌연변이체, anti-miR-93: microRNA-93-5p 활성 억제제(microRNA-93-5p를 표적할 수 있는 상보적 서열로, 모든 뉴클레오티드 2번 하이드록실기를 2'-O-methyl로 변형시킨 서열을 포함), anti-siGFP: 음성 대조군(세포에 어떠한 영향도 주지 않을 것이라 예상되는 RNA의 모든 뉴클레오티드 2번 하이드록실기를 2'-O-methyl로 변형시킨 서열을 포함).
도 2는 RNA binding protein인 PCBP2(poly(rC) binding protein) 단백질과 microRNA-93-5p 간의 상호작용 관계를 확인하기 위해 RNA 풀-다운 기법(RNA pull-down assay; A) 및 전기영동 이동성 변화 분석(Electrophoretic mobility shift assay; B)을 수행한 결과이다. miR-93 flanking; 시험관 전사법(in vitro transcription)으로 제조된 GDF11의 3'-UTR 영역 내 microRNA-93-5p 표적 서열의 인접 서열, miR-93 antisense; 음성 대조군(miR-93 flanking의 상보적인 서열), IGF2BP1; 인슐린 유사 성장인자 2 mRNA-결합 단백질 1(Insulin Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 1), RNA:RBP Complex; RNA:RNA binding protein 복합체(miR-93 flanking 서열-PCBP2의 복합체).
도 3은 microRNA-93-5p에 의한 GDF11 유전자 발현 조절에 있어서 PCBP2 단백질의 역할을 확인하기 위해, Huh7 세포에서 PCPB2 단백질을 넉아웃(konck out, KO)시키거나 재발현(PCBP2rescue)시킨 후 GDF11 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2(poly(rC) binding protein) 단백질 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p를 유효성분으로 포함하는 GDF11(Growth differentiation factor 11) 유전자의 발현 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 GDF11 유전자의 발현 저해용 조성물에 있어서, 상기 microRNA-93-5p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p를 유효성분으로 포함하는 GDF11(Growth differentiation factor 11) 유전자의 발현 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 GDF11 유전자의 발현 증진용 조성물에 있어서, 상기 microRNA-93-5p은 GDF11 mRNA(GenBank accession No: NM_005811.5)의 CDS(coding sequence)에서 종결코돈인 UAA가 끝난 직후(3'-UTR)를 1 bp라 했을 때, GDF11 3'-UTR의 1,626~1,632 bp 영역과 3,639~3,645 bp 영역을 표적으로 하여 GDF11 유전자의 발현 조절이 가능하며, 상기 GDF11 mRNA 내 microRNA-93-5p 표적 서열의 인접 서열(표적 서열 위치에서 5' 방향으로 50 뉴클레오티드와 3' 방향으로 50 뉴클레오티트의 인접서열을 모두 포함하는 총 107 뉴클레오티드)과 PCBP2 단백질이 결합하여 서로 상호작용하는 특징이 있다.
상기 PCBP2 단백질이 세포에 존재하면 microRNA-93-5p에 의해 GDF11 유전자의 발현이 저해되지만, PCBP2 단백질의 발현을 억제시키면 microRNA-93-5p를 처리시 GDF11 유전자의 발현의 저해가 감소하므로, 이를 통해 microRNA-93-5p에 의한 GDF11 유전자의 발현이 감소하는 현상이 PCBP2 단백질의 존재 하에 일어나는 것임을 알 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 세포에서 PCBP2 단백질이 존재할 경우 microRNA-93-5p에 의해 GDF11 유전자의 발현이 감소하고, PCBP2 단백질의 발현이 억제되면 microRNA-93-5p에 의한 GDF11 유전자의 발현 저해의 감소를 확인하였다. 따라서, PCBP2 코딩 유전자의 발현 억제제와 microRNA-93-5p를 암 세포에 처리하면 항암 유전자인 GDF11가 암 세포에서 발현 저해되지 않으므로 암 세포의 증식을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 PCBP2 코딩 유전자의 발현 억제제는 PCPB2 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "암(cancer)"이라는 용어는 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환을 말하며, 바람직하게는 간암, 폐암, 위암, 결장암, 유방암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 또는 섬유육종암일 수 있고, 바람직하게는 간암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제(base)로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 투여될 수 있으나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1.세포 배양 및 플라스미드 제작
인간 간암 세포주 Huh7은 9%의 소태아혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 배양된 Huh7 세포를 대상으로 miR-124 duplex(서열번호 4: 5'-cguguucacagcggaccuugau-3'), miR-93 duplex, miR-93 flanking(서열번호 5: 5'-ATGACAGCACCCGCCACAGCCAAGAGATGAATTCTGAGCACTTACCACGGGCACTTTATGGACATAAAATACCTCTCGCTGTGGGACAGATAACCAGGGCACCAGAG-3'), miR-93-antisense(서열번호 6: 5'-CTCTGGTGCCCTGGTTATCTGTCCCACAGCGAGAGGTATTTTATGTCCATAAAGTGCCCGTGGTAAGTGCTCAGAATTCATCTCTTGGCTGTGGCGGGTGCTGTCAT-3'), anti-siGFP 또는 anti-miR-93(Bioneer)를 사용하여 Lipofectamine 2000 transfection reagent(Thermofisher scientific)의 제조사의 방법에 따라 형질전환하였다. 상기 anti-miR-93은 microRNA-93-5p를 표적할 수 있도록 상보적 서열을 갖는 single-stranded synthetic inhibitor로 모든 뉴클레오티드 2번 하이드록실기를 2'-O-methyl로 변형하여 microRNA-93-5p의 활성을 억제하는 역할을 하며, anti-siGFP는 세포에 어떠한 영향도 주지 않을 것이라고 예상되는 RNA의 모든 뉴클레오티드 2번 하이드록실기를 2'-O-methyl로 변형한 것으로 anti-miR-93에 대한 음성 대조군으로 사용되었다.
또한, GDF11 3'-UTR을 활용한 루시퍼라아제 리포터 어세이(Luciferase reporter assay) 실험을 위하여 GDF11 3'-UTR(1,296~3,152 bp)을 증폭하여 psichek-2 벡터에 클로닝하였고, 해당 GDF11 3'-UTR 서열의 부위 특이적 돌연변이 유도는 inverse PCR을 통해 진행되었다. PCBP2rescue 실험은 PCBP2 knock out 세포에 pcDNA3.1 PCBP2 ORF 벡터로 다시 형질전환하였다. 모든 클로닝 과정은 Overlap cloner DNA cloning kit(Elpis Biotech.)을 활용하였다.
2. 웨스턴 블롯(Western blot)
상기 형질전환된 Huh7 세포에 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼를 처리하고 반복적인 볼텍싱(vortexing) 후 12,000 rpm에서 원심분리하여 세포 용해물을 수득하였다. 이후 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 총 30 μg의 단백질을 로딩하여 분리하였고 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼하였다. GDF11 검출을 위하여 1차 항체로서 Rabbit anti-GDF11 polyclonal 항체(Abcam, ab71347), GAPDH 검출을 위하여 1차 항체로서 Rabbit anti-GAPDH monoclonal 항체(Cell Signaling Technology, #2118), PCBP2 검출을 위하여 Rabbit anti-PCBP2(MBL Life Science, RN025P), IGF2BP1 검출을 위하여 Rabbit anti-IGF2BP1 항체(MBL Life Science)를 사용하였다. 2차 항체는 Goat anti-rabbit IgG (H+L) HRP-conjugated 항체를 사용하였다. 항체가 처리된 멤브레인을 ECL reagent(Elpis biotech.)와 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 분석하였다.
3. 루시퍼라아제 리포터 어세이(Luciferase reporter assay)
루시퍼라아제 리포터 어세이는 Dual-luciferase® reporter assay system(Promega)을 이용하여 수행하였다. 구체적으로 24-웰 플레이트에 Huh7 세포를 웰 당 1×104 cells씩 접종하였고 형질전환시키고 48시간 뒤에 Passive lysis buffer(Promega)를 처리하여 형질전환된 세포를 용해시키고, 용출액에 luciferase assay reagent Ⅱ(LAR Ⅱ)를 처리하여 파이어플라이 루시퍼라아제(firefly luciferase) 활성을 측정한 후 Stop & Glo® Buffer를 다시 처리하여 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 활성을 측정하였다. Glomax® 96 microplate luminometer(Promega)를 이용하여 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase)와 파이어플라이 루시퍼라아제(firefly luciferase) 활성을 각각 측정한 후 레닐라 루시퍼라아제 활성을 각각의 파이어플라이 루시퍼라아제 활성으로 정규화하여 분석하였다.
4. RNA 풀-다운 기법(RNA pull-down assay)
T7 RNA polymerase를 이용하여 시험관 전사법(in vitro transcription)으로 제작된 GDF11의 3'-UTR에서 miRNA 표적 서열의 인접 RNA 서열을 합성하였고, 이를 과요오드산나트륨(sodium m-periodate)을 이용하여 비드(bead)에 연결하였다. RNA와 연결된 비드를 Huh7 용출액과 반응시킨 후 아크릴아마이드 겔에서 분리하였다. 분리된 단백질들은 관찰하기 위하여 SiverQuest™ staining kit(Invitrogen)를 이용하여 은 염색법을 수행하였다.
5. 재조합 단백질 생산
GST 및 GST-rPCBP2를 생산하기 위하여 GST 또는 GST-rPCBP2 ORF 서열을 포함하는 pET28b 플라스미드를 Rosetta™ 2 competent cell에 형질전환한 후 배양하였다. 배양한 균들을 원심분리하여 모은 다음 초음파 처리를 통해 용출액을 얻었다. 상기 용출액과 글루타치온-아가로스 비드(Glutathione-agarose bead)를 반응시켜 GST 및 GST-rPCBP2를 정제하였고, 브래드포드 단백질 정량법(Bradford assay)을 이용하여 단백질을 정량한 후 아크릴아마이드 겔에서 분리한 후 쿠마씨 블루 염색(Coomassie blue staining)을 통하여 정제 여부를 확인하였다.
6. 전기영동 이동성 변화 분석(Electrophoretic mobility shift assay)
[α-32P]UTP를 사용하여 GDF11의 3'-UTR 서열을 시험관 전사법으로 준비하였다. 재조합 GST 혹은 여러 농도의 GST-PCBP2와 해당 서열을 함께 반응시킨 후 아크릴아마이드 겔에 분리시켰다. 이 아크릴아마이드 겔은 phosphorimaging을 통해 시각화하여 분석하였다.
실시예 1. microRNA-93-5p의 GDF11 유전자 발현 조절 분석
본 발명에서는 MicroRNA 표적 예측 프로그램 TargetScan을 이용하여 GDF11 3'-UTR의 1,626~1,632 bp 영역과 3,639~3,645 bp 영역에 microRNA-93-5p(AAAGUGC)의 일부 서열이 결합할 수 있음을 확인한 후, microRNA-93-5가 GDF11 유전자의 발현 조절에 미치는 영향을 분석하기 위해, 인간 간암 세포주 Huh7에 microRNA-93-5를 처리한 후 GDF11 단백질 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 대조군(Mock, 아무것도 처리하지 않은 Huh7 세포) 및 miR-124 처리군에 비해 miR-93 처리군에서 GDF11 단백질의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 1A). 이때 miR-124는 GDF11 유전자 내 표적 서열이 존재하지 않는 microRNA로, GDF11 발현에는 영향을 주지 않기 때문에 miR-93 처리군에 대한 대조군으로 사용되었다.
또한, microRNA-93-5p 처리군과 GDF11 유전자에서 microRNA-93-5p의 표적 서열(microRNA 2~7번째 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열)을 임의로 변경한 서열을 가지는 돌연변이체를 대상으로 루시퍼라아제 리포터 어세이를 수행하여, microRNA-93-5p 처리군에서의 GDF11 발현 억제율(약 1.9 fold)이 miRNA target site Mutant 처리군(약 1.0 fold)에 비해 현저히 높은 것을 확인함으로써, 실제로 본 발명에서 GDF11 유전자를 표적으로 하는 microRNA-93-5p의 특정 서열이 GDF11 유전자의 발현 조절이 가능함을 알 수 있었다(도 1B).
또한, microRNA-93-5의 활성 억제가 GDF11 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 Huh7 세포에 microRNA-93-5 억제제(Anti-miR-93)를 처리한 후 GDF11 유전자의 발현량을 분석한 결과, 도 1C에 나타난 바와 같이 대조군(anti-siGFP)에 비해 microRNA-93-5 억제제 처리군에서 GDF11 유전자의 발현 억제 효과가 감소했음을 확인하였다.
실시예 2. microRNA-93-5p와 PCBP2 단백질의 상호작용 분석
GDF11 3'UTR 내 microRNA-93-5p 표적 서열에 인접한 miR-93 flanking 서열과 상기 miR-93 flanking 서열에 상보적인 miR-93 antisense 서열을 합성하고 비드에 연결하여 RNA 풀-다운 기법 및 웨스턴 블롯을 수행한 결과, miR-25 flanking, miR-93 flanking 또는 miR-93 antisense 서열이 포함된 세포에서 RNA-binding protein 중 하나인 IGF2BP1 단백질이 모두 검출되었으나, PCBP2 단백질은 miR-93 flanking 서열이 포함된 세포에서만 검출되었다. 이를 통해, PCBP2 단백질은 microRNA-93-5p 표적 서열의 인접 서열(miR-93 flanking)과 결합할 수 있음을 알 수 있었다(도 2A).
또한, in vitro transcription으로 제작된 GDF11 3'-UTR 서열과 재조합 단백질 GST 또는 GST-PCBP2를 반응시킨 후 아크릴아마이드 겔에 분리시켜 전기영동 이동성 변화를 분석한 결과, GST-PCBP2 단백질의 농도가 증가할 수록 RNA-RBP 복합체의 발현량이 증가한 것을 확인하였고, 이를 통해 microRNA-93-5p 표적 서열의 인접 서열(miR-93 flanking)과 RNA-binding protein인 PCBP2 단백질이 결합하여 서로 상호작용할 수 있음을 확인하였다(도 2B).
실시예 3. PCBP2 단백질과 microRNA-93-5p의 상호작용에 의한 GDF11 유전자의 발현 조절 분석
microRNA-93-5p와 상호작용하는 PCBP2 단백질이 GDF11 유전자의 발현 조절에 미치는 영향을 분석하기 위해 PCBP2 단백질을 넉아웃(konck out)시킨 Huh7 세포에서 GDF11 유전자의 발현 수준을 분석한 결과, 대조군(WT)에 비해 PCBP2 단백질을 넉아웃시킨 세포(KO)에서 GDF11 유전자의 발현 억제 효과가 감소하였지만, PCBP2 단백질을 재발현시켰을 때 GDF11 유전자의 발현 억제 효과가 증가한 것을 확인하였다(도 3).
즉, PCBP2 단백질의 존재 하에 microRNA-93-5p가 GDF11 유전자의 발현을 조절할 수 있으므로, PCBP2 단백질과 microRNA-93-5p의 상호작용을 통해 항암 유전자인 GDF11의 발현을 조절하여 항암 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료되었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition for controlling expression of GDF11 gene comprising PCBP2 and microRNA <130> PN20216 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1101 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggacaccg gtgtgattga aggtggatta aatgtcactc tcaccatccg gctacttatg 60 catggaaagg aagttggcag tatcatcgga aagaaaggag aatcagttaa gaagatgcgc 120 gaggagagtg gtgcacgtat caacatctca gaagggaatt gtcctgagag aattatcact 180 ttggctggac ccactaatgc catcttcaaa gcctttgcta tgatcattga caaactggaa 240 gaggacataa gcagctctat gaccaatagc acagctgcca gtagaccccc ggtcaccctg 300 aggctggtgg tccctgctag tcagtgtggc tctctcattg gaaaaggtgg atgcaagatc 360 aaggaaatac gagagagtac aggggctcag gtccaggtgg caggggatat gctacccaac 420 tcaactgagc gggccatcac tattgctggc attccacaat ccatcattga gtgtgtcaaa 480 cagatctgcg tggtcatgtt ggagactctc tcccagtccc ccccgaaggg cgtgaccatc 540 ccgtaccggc ccaagccgtc cagctctccg gtcatctttg caggtggtca ggacaggtac 600 agcacaggca gcgacagtgc gagctttccc cacaccaccc cgtccatgtg cctcaaccct 660 gacctggagg gaccacctct agaggcctat accattcaag gacagtatgc cattccacag 720 ccagatttga ccaagctgca ccagttggca atgcaacagt ctcattttcc catgacgcat 780 ggcaacaccg gattcagtgg cattgaatcc agctctccag aggtgaaagg ctattgggca 840 ggtttggatg catctgctca gactacttct catgaactca ccattccaaa cgatttgatt 900 ggctgcataa tcgggcgtca aggcgccaaa atcaatgaga tccgtcagat gtctggggcg 960 cagatcaaaa ttgcgaaccc agtggaagga tctactgata ggcaggttac catcactgga 1020 tctgctgcca gcattagcct ggctcaatat ctaatcaatg tcaggctttc ctcggagacg 1080 ggtggcatgg ggagcagcta g 1101 <210> 2 <211> 366 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Thr Gly Val Ile Glu Gly Gly Leu Asn Val Thr Leu Thr Ile 1 5 10 15 Arg Leu Leu Met His Gly Lys Glu Val Gly Ser Ile Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gly Glu Ser Val Lys Lys Met Arg Glu Glu Ser Gly Ala Arg Ile Asn 35 40 45 Ile Ser Glu Gly Asn Cys Pro Glu Arg Ile Ile Thr Leu Ala Gly Pro 50 55 60 Thr Asn Ala Ile Phe Lys Ala Phe Ala Met Ile Ile Asp Lys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ser Ser Ser Met Thr Asn Ser Thr Ala Ala Ser Arg Pro 85 90 95 Pro Val Thr Leu Arg Leu Val Val Pro Ala Ser Gln Cys Gly Ser Leu 100 105 110 Ile Gly Lys Gly Gly Cys Lys Ile Lys Glu Ile Arg Glu Ser Thr Gly 115 120 125 Ala Gln Val Gln Val Ala Gly Asp Met Leu Pro Asn Ser Thr Glu Arg 130 135 140 Ala Ile Thr Ile Ala Gly Ile Pro Gln Ser Ile Ile Glu Cys Val Lys 145 150 155 160 Gln Ile Cys Val Val Met Leu Glu Thr Leu Ser Gln Ser Pro Pro Lys 165 170 175 Gly Val Thr Ile Pro Tyr Arg Pro Lys Pro Ser Ser Ser Pro Val Ile 180 185 190 Phe Ala Gly Gly Gln Asp Arg Tyr Ser Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser 195 200 205 Phe Pro His Thr Thr Pro Ser Met Cys Leu Asn Pro Asp Leu Glu Gly 210 215 220 Pro Pro Leu Glu Ala Tyr Thr Ile Gln Gly Gln Tyr Ala Ile Pro Gln 225 230 235 240 Pro Asp Leu Thr Lys Leu His Gln Leu Ala Met Gln Gln Ser His Phe 245 250 255 Pro Met Thr His Gly Asn Thr Gly Phe Ser Gly Ile Glu Ser Ser Ser 260 265 270 Pro Glu Val Lys Gly Tyr Trp Ala Gly Leu Asp Ala Ser Ala Gln Thr 275 280 285 Thr Ser His Glu Leu Thr Ile Pro Asn Asp Leu Ile Gly Cys Ile Ile 290 295 300 Gly Arg Gln Gly Ala Lys Ile Asn Glu Ile Arg Gln Met Ser Gly Ala 305 310 315 320 Gln Ile Lys Ile Ala Asn Pro Val Glu Gly Ser Thr Asp Arg Gln Val 325 330 335 Thr Ile Thr Gly Ser Ala Ala Ser Ile Ser Leu Ala Gln Tyr Leu Ile 340 345 350 Asn Val Arg Leu Ser Ser Glu Thr Gly Gly Met Gly Ser Ser 355 360 365 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-93-5p <400> 3 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-124 duplex <400> 4 cguguucaca gcggaccuug au 22 <210> 5 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-93 flanking <400> 5 atgacagcac ccgccacagc caagagatga attctgagca cttaccacgg gcactttatg 60 gacataaaat acctctcgct gtgggacaga taaccagggc accagag 107 <210> 6 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-93-antisense <400> 6 ctctggtgcc ctggttatct gtcccacagc gagaggtatt ttatgtccat aaagtgcccg 60 tggtaagtgc tcagaattca tctcttggct gtggcgggtg ctgtcat 107

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 시험관 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PCBP2(poly(rC) binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 microRNA-93-5p 활성 저해 방법으로서,
    상기 PCBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PCPB2 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 PCPB2 유전자의 발현 억제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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