JP2023108978A - ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤、抑制方法、ＨＢＶ感染症用医療組成物、およびＨＢＶ感染症の治療方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、核内に存在するｃｃｃＤＮＡを抑制する新たな薬剤を提供する。【解決手段】 本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤は、フェリチン軽鎖を抑制するフェリチン軽鎖抑制剤を含むことを特徴とする。前記フェリチン軽鎖抑制剤は、前記フェリチン軽鎖の発現を抑制する発現抑制剤である。本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前記本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を含むことを特徴とする。【選択図】 図１
Description
本発明は、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤、抑制方法、ＨＢＶ感染症用医療組成物、およびＨＢＶ感染症の治療方法に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus: ＨＢＶ）は、その感染が急性肝炎または慢性肝炎の発症の原因となり、長期化すると、肝硬変および肝細胞癌に到ることが知られている。
ＨＢＶは、通常、成熟型ＤＮＡ(relaxed circular DNA: ｒｃＤＮＡ)の状態で存在する。そして、ＨＢＶが細胞に感染し、細胞質から核内に侵入すると、宿主である細胞の持っている酵素等で複製中間体である共有結合性閉環状ＤＮＡ（covalently closed circular DNA: ｃｃｃＤＮＡ）に変化する。これがＲＮＡに転写され、転写されたＲＮＡは、核から細胞質に放出され、ウイルスが持っている逆転写酵素により再度ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）に転写され、成熟型のＨＢＶとして細胞外に放出される。
ＨＢＶ感染に対する現在の治療薬は、前記逆転写酵素に対する阻害剤が一般的であり、これによって、ＲＮＡからＤＮＡへの再度の転写（ｒｃＤＮＡへの転写）を阻害し、複製されたＨＢＶが細胞外に放出することを抑制している。しかしながら、この治療薬では、核内に存在するｃｃｃＤＮＡが除去できないため、投与を中断すると、核内でｃｃｃＤＮＡからＲＮＡへの転写が起こり、その後、細胞質において、ＲＮＡからｒｃＤＮＡへの逆転写も再開されてしまう。このため、逆転写酵素による工程よりも上流に作用する治療薬、具体的には、ｃｃｃＤＮＡの合成阻害等により、核内のｃｃｃＤＮＡを低減する治療薬の開発が望まれる。
そこで、本発明は、核内に存在するｃｃｃＤＮＡを抑制する新たな薬剤の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤は、フェリチン軽鎖を抑制するフェリチン軽鎖抑制剤を含むことを特徴とする。
本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前記本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を含むことを特徴とする。
本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制方法は、フェリチン軽鎖を抑制する抑制工程を含むことを特徴とする
。
。
本発明のＨＢＶ感染症の治療方法は、フェリチン軽鎖を抑制する抑制工程を含むことを特徴とする。
本発明者らは鋭意研究の結果、フェリチン軽鎖を抑制することによって、細胞に感染したＨＢＶから産生されるｃｃｃＤＮＡ量を低減できることを見出した。本発明によれば、前述のような逆転写酵素阻害剤によるｒｃＤＮＡへの転写ではなく、それより上流側における複製中間体のｃｃｃＤＮＡを低減できるため、より効果的にウイルスの複製を抑制できる。したがって、本発明は、例えば、ＨＢＶ感染症の新たな治療方法として非常に有用である。
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記フェリチン軽鎖抑制剤が、前記フェリチン軽鎖の発現を抑制する発現抑制剤または前記フェリチン軽鎖の機能を抑制する機能抑制剤である。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記発現抑制剤が、前記フェリチン軽鎖をコードする遺伝子からの転写を抑制する物質、転写された転写産物を分解する物質、および前記転写物からのタンパク質の翻訳を抑制する物質からなる群から選択された少なくとも一つである。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記発現抑制物質が、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、およびリボザイムからなる群から選択された少なくとも一つの核酸物質である。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記発現抑制物質が、前記核酸物質を発現する発現ベクターである。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記機能抑制物質が、前記フェリチン軽鎖に対する活性阻害物質または活性中和物質である。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記活性中和物が、前記フェリチン軽鎖に対する抗体または抗原結合断片である。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記機能抑制物質が、前記フェリチン軽鎖に対する活性中和物質を発現する発現ベクターである。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡの抑制方法は、例えば、前記抑制工程において、フェリチン軽鎖の発現を抑制する。
本発明のＨＢＶ感染症の治療方法は、例えば、前記抑制工程において、フェリチン軽鎖の発現を抑制する。
本発明において、治療は、広義の意味であり、例えば、進行の抑制、改善(緩和)、および根治等の狭義の治療、感染の防止、および再発の防止等の予防の意味を含む。本発明においては、例えば、いずれか１つを目的として使用してもよいし、２つ以上を目的として使用してもよい。
本発明において、ＨＢＶ感染症とは、ＨＢＶの感染が原因となる疾患であり、例えば、急性肝炎または慢性肝炎等のＢ型肝炎、肝硬変、肝がん等があげられる。
（１）ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤
本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤は、フェリチン軽鎖を抑制するフェリチン軽鎖抑制剤を含むことを特徴とする。本発明において、以下、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡを「ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ」または「ｃｃｃＤＮＡ」ともいい、フェリチン軽鎖を「ＦＴＬ」ともいい、フェリチン軽鎖抑制剤を「ＦＴＬ抑制剤」、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を「ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤」または「ｃｃｃＤＮＡ抑制剤」ともいう。
本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤は、フェリチン軽鎖を抑制するフェリチン軽鎖抑制剤を含むことを特徴とする。本発明において、以下、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡを「ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ」または「ｃｃｃＤＮＡ」ともいい、フェリチン軽鎖を「ＦＴＬ」ともいい、フェリチン軽鎖抑制剤を「ＦＴＬ抑制剤」、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を「ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤」または「ｃｃｃＤＮＡ抑制剤」ともいう。
ＨＢＶは、肝細胞に感染すると、以下のような複製過程をたどる。すなわち、まず、（１）ＨＢＶは、肝細胞表面のレセプターに結合し、細胞内に侵入する。（２）細胞質において、ＨＢＶの表面の膜構造が壊れ、成熟型ウイルスゲノム（ｒｃＤＮＡ）が核内に移行する。（３）核内において、宿主細胞の酵素によりｒｃＤＮＡはｃｃｃＤＮＡに変化し、４種のＲＮＡが転写される。（４）転写されたＲＮＡのうち、Ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡは、核外に放出され、細胞質においてウイルスの逆転写酵素によりｒｃＤＮＡ（成熟型）に逆転写される。（５）そして、細胞質において、ｒｃＤＮＡはキャプシドに覆われ、細胞外に放出される。本発明は、前記（３）におけるｃｃｃＤＮＡを抑制する抑制剤である。
本発明において、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制とは、例えば、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制である。前記産生抑制は、例えば、ｃｃｃＤＮＡの合成自体の抑制でも、合成されたｃｃｃＤＮＡの分解でもよく、好ましくはｃｃｃＤＮＡの合成自体の抑制である。前記産生抑制とは、例えば、前記ＦＴＬ抑制剤無添加の場合と比較して、細胞におけるｃｃｃＤＮＡ量が相対的に減少することを意味する。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、前記ＦＬＴ抑制剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。また、本発明のＦＴＬ抑制剤は、後述する本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制方法等の記載を援用できる。
本発明において、ＦＴＬ抑制剤は、例えば、ＦＴＬの発現を抑制する発現抑制物質でもよいし、ＦＴＬの機能を抑制する機能抑制物質でもよい。本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、ＦＴＬ抑制剤として、前記発現抑制物質のみを含んでもよいし、前記機能抑制剤のみを含んでもよいし、両方を含んでもよい。
前記ＦＴＬ抑制剤の種類は、特に制限されず、例えば、核酸物質等の低分子化合物、抗体等のタンパク質、抗原結合断片等のペプチド等があげられる。
前記発現抑制物質は、例えば、ＦＴＬをコードする遺伝子（以下、ＦＴＬ遺伝子ともいう）からのＦＴＬの発現において、転写および翻訳のいずれの工程を抑制するものでもよく、特に制限されない。転写の抑制としては、例えば、ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体への転写の阻害、ｍＲＮＡ前駆体から成熟ｍＲＮＡを形成するＲＮＡプロセシングの阻害、ｍＲＮＡ前駆体または成熟ｍＲＮＡの分解等があげられる。前記翻訳の抑制としては、例えば、成熟ｍＲＮＡからの翻訳の阻害、翻訳産物の修飾の阻害等があげられる。
前記発現抑制物質は、例えば、核酸物質（以下、核酸型抑制物質もいう）であり、そのままで発現を抑制する形態（第１形態）でもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下において発現を抑制する状態となる、前駆体の形態（第２形態）でもよい。
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、アンチジーン、アンチセンス（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）物質、リボザイム等があげられる。ＲＮＡｉ物質は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、人工ミミックｍｉＲＮＡ等があげられる。アンチジーンは、例えば、ｍＲＮＡの転写を阻害し、アンチセンスおよびｍｉＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡからの翻訳を阻害し、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、例えば、ｍＲＮＡを分解する。前記人工ミミックｍｉＲＮＡは、例えば、ＷＯ２０１５／０９９１２２に記載される構造があげられる。これらの発現抑制物質は、例えば、前記ＦＴＬ遺伝子の全領域および部分領域のいずれをターゲット領域としてもよい。具体例として、アンチセンスおよびｍｉＲＮＡは、例えば、ＦＴＬ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域に結合するようにデザインでき、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、例えば、ＦＴＬ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの一部の領域に完全に相補的に結合するようにデザインできる。
ヒトのＦＴＬの遺伝子およびタンパク質の配列は、例えば、データベース（ＮＣＢＩ）にアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０００１４６．４およびＮｏ．ＮＭ＿０００１３７．２で登録されている（配列番号１および２）。
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、前記ＦＴＬ遺伝子の標的配列に対して相補的なアンチセンス配列（ガイド配列ともいう）を有することが好ましい。前記ＦＴＬ遺伝子の標的配列は、例えば、前記表１の四角で囲んだ領域、すなわち、以下に示す、配列番号１の５３３～５６３位（ｆｔｌ＿＃１）、５９９～６２９位（ｆｔｌ＿＃２）、または８２２～８５２位（ｆｔｌ＿＃３）の領域内における１９～３１個、または１９～２５個の連続する配列であり、下線は、１９塩基の標的配列の一例である。
ftl_#1
ttggatcttcatgccctgggttctgcccgca（配列番号３）
cttcatgccctgggttctg（配列番号４）
ftl_#2
ttcctagatgaggaagtgaagcttatcaaga（配列番号５）
gatgaggaagtgaagctta（配列番号６）
ftl_#3
aactatcctaacaagccttggaccaaatgga（配列番号７）
cctaacaagccttggacca（配列番号８）
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前記発現抑制物質がｓｉＲＮＡの場合、アンチセンス鎖とセンス鎖の二本鎖で構成され、前記アンチセンス鎖（ガイド鎖ともいう）が前記アンチセンス配列を有することが好ましい。前記アンチセンス鎖および前記センス鎖は、それぞれ、３’末端に、数塩基（例えば、１～３塩基）のオーバーハングが付加されていることが好ましい。
前記ＦＴＬ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの具体例を表１に示す。これらのｓｉＲＮＡは、前述した１９塩基の標的配列に対して設計したｓｉＲＮＡである。表２の配列において、小文字は、オーバーハングを示す。なお、本発明は、この例示には制限されない。
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、ＦＴＬ遺伝子の発現系を利用したスクリーニング方法により得ることもでき、また、前記ＦＴＬ遺伝子の配列から設計することもできる。
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、一本鎖でも二本鎖でもよい。前記発現抑制物質の構成単位は、特に制限されず、例えば、糖と、プリンまたはピリミジン等の塩基と、リン酸とを含み、デオキシリボヌクレオチド骨格またはリボヌクレオチド骨格があげられ、この他に、例えば、ピロリジンまたピペリジン等の塩基を含む非ヌクレオチド骨格等でもよい。これらの骨格は、修飾型でも非修飾型でもよい。また、前記構成単位は、例えば、天然型でも、人工の非天然型でもよい。前記発現抑制物質は、例えば、同じ構成単位から形成されてもよいし、二種類以上の構成単位から形成されてもよい。
前記第２形態の発現抑制物質は、前述のように、前記前駆体であり、具体例としては、前記第１形態の発現抑制物質を発現する前駆体があげられる。前記前駆体は、対象に投与することで、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下、前記第１形態の発現抑制物質を発現させ、機能させることができる。
前記前駆体は、例えば、前記第１形態の発現抑制物質とリンカーとを含む形態があげられる。具体例として、前記前駆体は、ｓｉＲＮＡの両鎖を前記リンカーで連結した形態があげられる。このような前駆体によれば、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下、前記前駆体が切断されることにより、前記前駆体から前記リンカーが除去され、二本鎖のｓｉＲＮＡを生成（発現）できる。前記前駆体の具体例として、例えば、切断によりｓｉＲＮＡを生成するｓｈＲＮＡ等が例示できる。
また、前記前駆体は、例えば、前記第１形態の発現抑制物質のコード配列を挿入した発現ベクターでもよい。前記発現ベクターによれば、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下、前記第１形態の発現抑制物質を発現することができる。前記発現ベクターには、例えば、前述のｓｈＲＮＡ等の前駆体のコード配列を挿入してもよい。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられ、前記ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター等があげられる。
前記機能抑制物質は、例えば、前記ＦＴＬの活性を阻害する活性阻害物質、前記ＦＴＬの活性を中和する活性中和物質があげられる。前記活性阻害物質は、特に制限されず、低分子化合物等があげられる。
前記活性中和物質は、例えば、前記ＦＴＬに対する抗体または抗原結合断片（抗原結合ペプチド）（以下、あわせて抗体型抑制物質ともいう）等があげられる。前記抗体型抑制物質は、例えば、前記ＦＴＬへの結合によって、前記ＦＴＬの機能を抑制できることから、中和抗体または中和抗原結合断片ともいう。前記抗体型抑制物質は、例えば、後述するようなスクリーニング方法により得ることもできる。
前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、また、そのアイソタイプは、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ等があげられる。前記抗体は、ヒトに投与する場合、例えば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等が好ましい。
前記抗原結合断片は、例えば、前記ＦＴＬの標的部位を認識して結合できればよく、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有している断片があげられる。具体例として、前記抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）等の断片等があげられる。
前記機能抑制物質は、例えば、そのままで前記ＦＴＬの機能を抑制する第１形態でもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下において前記ＦＴＬの機能を抑制する状態となる、前駆体の第２形態でもよい。前記第１形態の機能抑制物質は、例えば、前述のような抗体型抑制物質である。また、前記第２形態の前駆体は、例えば、前記ＦＴＬの機能を抑制するタンパク質またはペプチドのコード配列を挿入した発現ベクターがあげられる。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、前述と同様に、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。
また、前記機能抑制物質は、例えば、前記ＦＴＬが活性を有し、その機能を失ってはいないが、機能しうる状態を抑制する物質でもよい。すなわち、具体例として、前記ＦＴＬが機能するために必要な他の物質を減少させる、または前記他の物質を変化させる等の抑制物質でもよい。前記他の物質の減少は、例えば、前記他の物質の生成の抑制でもよいし、前記他の物質の分解でもよい。
本発明のｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、有効成分として、前記ＦＴＬ抑制剤のみを含んでもよいし、前記ＦＴＬ抑制剤と、その他のＨＢＶに対する薬剤（ＨＢＶ用薬剤）とを含んでもよい。前記ＨＢＶ用薬剤は、例えば、ＨＢＶ等のウイルスの複製阻害剤があげられる。前記複製阻害剤としては、例えば、核酸系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）がある。ＮＲＴＩは、五炭糖の３’の水酸基を欠いた修飾ヌクレオシドであり、細胞内でリン酸化酵素により３’にリン酸基が付加され活性型であるヌクレオチド型となる。ウイルスＲＮＡを鋳型として逆転写酵素によりウイルスＤＮＡが伸長される工程において、前記ヌクレオチド型が基質として、伸長過程にあるＤＮＡ鎖内に組み込まれると、五炭糖の水酸基を欠くため、次のヌクレオチドが結合できなくなり、ウイルスＤＮＡの伸長が停止する。
前記ＮＲＴＩの具体例としては、例えば、エンテカビル、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、テノホビルアラフェナミドフマル酸塩、ラミブジン、アデフォビル、インターフェロン製剤（アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ポリエチレングルコール付加アルファインターフェロン）等があげられる。この他に、前記ＮＲＴＩとしては、例えば、zidovudine（ＡＺＴ、またはＺＤＶ）、didanosine（ｄｄＩ）、stavudine（ｄ４Ｔ）、abacavir（ＡＢＣ）、emtricitabine（ＦＴＣ）等もあげられる。また、前記ＦＴＬ抑制剤と併用できる合剤としては、例えば、epzicom（ＥＰＺ）（lamivudine + abacavir ［３ＴＣ＋ＡＢＣ］）、truvada（ＴＶＤ）（tenofovir + emtricitabine ［ＴＤＦ＋ＦＴＣ］）、combivir（ＣＢＶ）（zidovudine + lamivudine ［ＡＺＴ＋３ＴＣ］）、descovy（ＤＶＹ）（tenofovir alafenamide + emtricitabine ［ＴＡＦ＋ＦＴＣ］）等があげられる。
さらに、併用できる非核酸系逆転写酵素阻害剤としては、例えば、nevirapine（ＮＶＰ）、efavirenz（ＥＦＶ）、delavirdine（ＤＬＶ）、etravirine（ＥＴＲ）、rilpivirine（ＲＰＶ）等、合剤としては、例えば、complera（ＣＭＰ）（rilpivirine + tenofovir + emtricitabine［ＲＰＶ＋ＴＤＦ＋ＦＴＣ］）等があげられる。
本発明のｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、例えば、前記有効成分のみを含んでもよいし、さらにその他の添加成分を含んでもよい。前記添加成分は、特に制限されず、例えば、以下のような成分、好ましくは、薬理学的に許容される成分があげられる。前記添加成分は、例えば、前記ｃｃｃＤＮＡ抑制剤の投与方法、投与対象、および剤型等に応じて、適宜設定できる。
前記添加成分は、例えば、賦形剤があげられる。前記賦形剤は、例えば、水性溶媒、アルコール溶媒、ポリアルコール溶媒、油性溶媒、これらの混合溶媒（例えば、乳化溶媒）等の液体媒質、乳糖、デンプン等があげられる。前記水性溶媒は、例えば、水、生理食塩水、塩化ナトリウム等の等張液等があげられ、油性溶媒は、例えば、大豆油等があげられる。前記添加成分は、これらの他に、例えば、デンプン糊等の結合剤；デンプン、炭酸塩等の崩壊剤；タルク、ワックス等の滑沢剤等があげられる。また、前記添加成分は、例えば、前記有効成分を目的部位にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよい。
本発明において、前記ｃｃｃＤＮＡ抑制の対象となる細胞は、特に制限されず、例えば、ＨＢＶに感染した細胞、ＨＢＶに感染した可能性がある細胞、ＨＢＶを感染させたくない細胞等があげられる。細胞の種類は、例えば、肝臓細胞である。
本発明のｃｃｃＤＮＡ抑制剤の使用方法は、特に制限されず、例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの産生を抑制させたい対象に添加すればよい。添加方法は、特に制限されず、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。本発明のｃｃｃＤＮＡ抑制剤の添加対象は、例えば、細胞、もしくは組織、または生体等である。前記細胞および組織の種類、ならびに生体の部位（器官）は、特に制限されず、例えば、肝臓である。前記細胞および組織は、例えば、生体から単離したものでもよいし、セルラインまたはその培養物でもよい。前記添加対象の細胞および組織は、例えば、ヒト由来でもよいし、非ヒト動物由来でもよく、前記添加対象の生体は、例えば、ヒトでもよいし、非ヒト動物でもよい。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ラクダ等の哺乳類動物があげられる。前記添加対象が非ヒト動物由来または非ヒト動物の場合、前記ｃｃｃＤＮＡ抑制剤における前記ＦＴＬ抑制物質は、例えば、その特定の非ヒト動物由来のＦＴＬまたはＦＴＬ遺伝子に特異的に対応する抑制物質が好ましく、また、前記添加対象がヒト由来またはヒトの場合、前記ＦＴＬ抑制物質は、例えば、ヒト由来のＦＴＬまたはＦＴＬ遺伝子に特異的に対応する抑制物質が好ましい。
（２）ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制方法
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡの抑制方法は、前述のように、ＦＴＬを抑制する工程を含むことを特徴とする（本発明の第１の抑制方法ともいう）。本発明は、ＦＴＬの抑制によってＨＢＶｃｃｃＤＮＡを抑制できることを見出したことがポイントであり、ＦＴＬを抑制する方法、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の第１の抑制方法において、ＦＴＬの抑制は、例えば、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を添加することにより行うことができる。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡの抑制方法は、前述のように、ＦＴＬを抑制する工程を含むことを特徴とする（本発明の第１の抑制方法ともいう）。本発明は、ＦＴＬの抑制によってＨＢＶｃｃｃＤＮＡを抑制できることを見出したことがポイントであり、ＦＴＬを抑制する方法、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の第１の抑制方法において、ＦＴＬの抑制は、例えば、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を添加することにより行うことができる。
本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制方法は、前述のように、前記本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を添加することを特徴とする（本発明の第２の抑制方法ともいう。）。本発明の第２の抑制方法は、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の有効成分、すなわちＦＴＬ抑制剤の添加により、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡを抑制できる。本発明の第２の抑制方法は、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を使用することがポイントであり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制方法は、例えば、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の記載を援用できる。
前記ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の添加対象が細胞の場合は、例えば、培地の存在下、前記ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を添加し、インキュベートすることによって、前記ＨＶ由来ｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できる。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、細胞の種類に応じて、前記培地、温度、時間、湿度等を設定できる。
前記添加対象が組織の場合は、例えば、培地の存在下、前記ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を添加し、インキュベートすることによって、前記組織を構成する細胞におけるＨＢＶｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できる。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、組織の種類、大きさ等に応じて、前記培地、温度、時間、湿度等を設定できる。
前記添加対象（投与対象）が生体の場合、前記ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の投与方法は、特に制限されず、非経口投与、経口投与、静脈投与等があげられる。投与条件は、特に制限されず、例えば、生体の種類等に応じて、適宜決定できる。
前記非経口投与の場合、投与部位は、例えば、対象器官、すなわち、肝臓でもよいし、前記対象器官まで前記有効成分をデリバリーできる部位でもよい。具体例として、例えば、前記対象器官が肝臓の場合、投与部位は、対象器官の肝臓でもよいし、肝臓にまで前記有効成分をデリバリーできる部位でもよい。前記非経口投与の方法は、例えば、患部注射、静脈注射、皮下注射、皮内注射、点滴注射、経皮投与等があげられる。前記ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の形態は、特に制限されず、前述のように、投与方法等に応じて適宜設定でき、前述の記載を援用できる。
非経口投与の場合、剤型は、特に制限されず、投与方法により適宜決定でき、例えば、液状、クリーム状、ジェル状等であり、媒質と前記有効成分とを混合することで調製できる。前記媒質のうち、水性溶媒は、例えば、生理食塩水、等張液等であり、油性溶媒は、例えば、大豆油等であり、乳化溶媒は、例えば、これらの混合液である。前記非経口投与剤は、例えば、さらに、アルコール、ポリアルコール、界面活性剤等を含んでもよい。また、前記非経口投与剤は、前記有効成分を、対象器官以外から前記対象器官に効果的にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよい。また、前記対象器官の中でも、例えば、ＨＢＶ感染細胞に前記有効成分を効果的にデリバリーする場合、前記非経口投与剤は、例えば、前記ＨＢＶ感染細胞を特異的に認識するＤＤＳ剤を含んでもよい。
前記経口投与の場合、経口投与剤の剤型は、特に制限されず、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤等があげられる。前記経口投与剤は、例えば、希釈剤、賦形剤、担体等を含んでもよい。また、前記経口投与剤は、例えば、前記有効成分を前記対象部位に効果的にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよい。また、前記対象器官の中でも、例えば、前記ＨＢＶ感染細胞に前記有効成分を効果的にデリバリーする場合、前記経口投与剤は、例えば、前記ＨＢＶ感染細胞を特異的に認識するＤＤＳ剤を含んでもよい。
前記生体への投与において、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の投与条件は、特に制限されず、例えば、年齢、体重、投与対象の器官の種類、性別等に応じて適宜決定できる。前記生体は、例えば、治療の点から、前記ＨＢＶに感染した対象でもよいし、予防の点から、前記ＨＢＶに感染していない対象、または感染の有無が不明な対象でもよい。
具体例として、前記ＦＴＬ抑制剤がｓｉＲＮＡ等の前記核酸型抑制物質の場合、投与条件は、例えば、前記ＦＴＬ抑制剤の投与量は０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ／日、投与間隔は１～３週間に一度、投与時間は７０分以上かけ緩徐に行う（例えば、特に投与開始１５分間は１ｍｌ／分、その後は３ｍｌ／分）等が例示できる。また、ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（急性輸液反応）の発生が予想される場合は、前記ＦＴＬ抑制剤の投与に先立って、例えば、さらに、以下の薬剤を前投薬することが望ましい。
・コルチコステロイド（デキサメタゾン１０ｍｇまたは同等薬）（静脈内投与）
・アセトアミノフェン（５００ｍｇ）（経口投与）
・Ｈ１拮抗薬（クロルフェニラミンマレイン酸塩５ｍｇまたは同等薬）（静脈内投与）
・Ｈ２拮抗薬（ファモチジン２０ｍｇまたは同等薬）（静脈内投与）
・コルチコステロイド（デキサメタゾン１０ｍｇまたは同等薬）（静脈内投与）
・アセトアミノフェン（５００ｍｇ）（経口投与）
・Ｈ１拮抗薬（クロルフェニラミンマレイン酸塩５ｍｇまたは同等薬）（静脈内投与）
・Ｈ２拮抗薬（ファモチジン２０ｍｇまたは同等薬）（静脈内投与）
本発明において、例えば、前述のように、前記ＦＴＬ抑制剤と前記複製阻害剤とを併用する場合、両者は、同じ投与方法により同時または異なるタイミングで投与してもよいし、同じ投与方法により別のタイミングで投与してもよいし、異なる投与方法により同時または異なるタイミングで投与してもよい。本発明においては、例えば、前記逆転写酵素阻害剤および／またはＨＢＶ ＤＮＡ（例えば、ｒｃＤＮＡ）に対するｓｉＲＮＡ等の発現抑制剤を投与して、ＨＢＶ量を低減し、さらに、前記ＦＴＬ抑制剤で処理して、ｃｃｃＤＮＡを抑制することが好ましい。
（３）ＨＢＶ感染症用医薬組成物
本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前述のように、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の有効成分、すなわち前記ＦＬＴ抑制剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。また、本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤およびＨＢＶｃｃｃＤＮＡの抑制方法等の記載を援用できる。
本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前述のように、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の有効成分、すなわち前記ＦＬＴ抑制剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。また、本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤およびＨＢＶｃｃｃＤＮＡの抑制方法等の記載を援用できる。
本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、前述のように、有効成分として、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの産生を抑制する前記ＦＴＬ抑制剤の他に、さらに、核酸系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）等の複製阻害剤を含んでもよい。前記ＦＴＬ抑制剤と前記ＮＲＴＩとは、例えば、同じ投与方法により投与されてもよいし、異なる投与方法により投与されてもよい。後者の場合、本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物は、例えば、前記ＦＴＬ抑制剤と前記ＮＲＴＩ抑制剤とを、それぞれ別個に投与する組成物であってもよい。
（４）ＨＢＶ感染症の治療方法
本発明のＨＢＶ感染症の治療方法は、前述のように、患者の対象器官におけるＦＴＬを抑制する工程を含むことを特徴とする（本発明の第１の治療方法ともいう）。本発明は、ＦＴＬの抑制によってＨＢＶｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できることを見出したことがポイントであり、ＦＴＬを抑制する方法、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の第１の治療方法において、ＦＴＬの抑制は、例えば、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤（または本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物）を添加することにより行うことができる。
本発明のＨＢＶ感染症の治療方法は、前述のように、患者の対象器官におけるＦＴＬを抑制する工程を含むことを特徴とする（本発明の第１の治療方法ともいう）。本発明は、ＦＴＬの抑制によってＨＢＶｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できることを見出したことがポイントであり、ＦＴＬを抑制する方法、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の第１の治療方法において、ＦＴＬの抑制は、例えば、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤（または本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物）を添加することにより行うことができる。
本発明のＨＢＶ感染症の治療方法は、前述のように、前記本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤（または本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物）を、患者に投与することを特徴とする（本発明の第２の治療方法ともいう。）。本発明の第２の治療方法は、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤の有効成分、すなわちＦＴＬ抑制剤の添加により、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの産生を抑制することで、ＨＢＶ感染症を治療できる。本発明の第２の治療方法は、前記本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制剤（または本発明のＨＢＶ感染症用医薬組成物）を使用することがポイントであり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明のＨＢＶ感染症の治療方法、例えば、本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ抑制方法の記載援用できる。
（５）用途
本発明は、ＨＢＶ感染症の治療のための、前記ＦＴＬを抑制するＦＴＬ抑制剤である。前記ＦＴＬ抑制剤は、前述の記載を援用できる。
本発明は、ＨＢＶ感染症の治療のための、前記ＦＴＬを抑制するＦＴＬ抑制剤である。前記ＦＴＬ抑制剤は、前述の記載を援用できる。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
ヒトＦＴＬに対するｓｉＲＮＡにより、細胞核内におけるＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ合成の抑制を確認した。
ヒトＦＴＬに対するｓｉＲＮＡにより、細胞核内におけるＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ合成の抑制を確認した。
実施例のｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡとして、前記表１に示すｈＦＴＬ＿＃３を合成した（配列番号６および７）。比較例のｓｉＲＮＡとして、ＨＢＶのゲノムＤＮＡを標的とした下記ｓｉＲＮＡ（以下、ゲノム用ｓｉＲＮＡという）と、ヒト遺伝子およびウイルス遺伝子を標的としない下記ｓｉＲＮＡ（以下、ネガティブコントロール（ＮＣ）という）を使用した。
ヒト肝細胞として、細胞株であるＨｅｐ３８．７－Ｔｅｔ細胞を使用した。これは、ヒト肝臓がん由来細胞株ＨｅｐＡＤ３８細胞の核内にＨＢＶゲノムを組み込むことで、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの発現効率を上昇させた細胞であり、テトラサイクリンの添加により、ＨＢＶゲノムの転写が停止される。Ｈｅｐ３８．７－Ｔｅｔ細胞は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのコピー数が、１コピー／１細胞であり、ＲＮａｓｅＰ遺伝子のコピー数が２コピー／１細胞であることが知られている（久留主ら、数理解析研究所録、２０１７年、2043巻、95-101頁、発行所：京都大学数理解析研究所）。
９６ウェルプレートに、５００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ｓｉＲＮＡ ２．４μＬおよびＯＰＴＩ－ＭＥＮ（商標） ７．６μＬを添加し、さらに、リポフェクタミン液１０μＬを添加し、室温で２０分間インキュベートした。前記リポフェクタミン液は、１ウェルあたり、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（商標）０．２μＬおよびＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（商標）９．８μＬとした。
継代しているＨｅｐ３８．７‐ｔｅｔ細胞を回収し、テトラサイクリン添加（０．３μｇ／ｍｌ）のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ Ｔｅｔ（＋））で３×１０４ cells／１００μＬに調整し、前記９６ウェルプレートのウェルに、１００μＬずつ添加し、３７°、５％ ＣＯ２で２０時間インキュベートした。培地を除去し、テトラサイクリン未添加のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ Ｔｅｔ（－））２００μＬに置換し、さらに、同条件で７２時間インキュベートした。そして、細胞を観察した後、細胞上清を全量（約２００μＬ）回収し、上清５０μＬおよびウェル中の全細胞から、それぞれ、ＤＮＡ抽出試薬（商品名SMITEST EX-R&D、MBLライフサイエンス社)を用いて、ＤＮＡを抽出した。そして、上清由来のＤＮＡ抽出液をｒｃＤＮＡの定量を行い、細胞由来のＤＮＡ抽出液をデジタルＰＣＲにより、ｃｃｃＤＮＡの定量を行った。
ｃｃｃＤＮＡの定量は、以下の方法により行った。すなわち、前記細胞由来のＤＮＡサンプルを外来のＤＮａｓｅで処理することなく、下記組成の反応液を調製し、ウェル２０，０００個のプレートに前記反応液を分配し、デジタルＰＣＲに供し、蛍光シグナルを検出した。デジタルＰＣＲは、市販の機器（商品名QuantStudio（商標） 3D デジタル PCR システム、Applied Biolad System社）を使用し、操作条件は、その使用説明書に従った。
ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッションＮｏ．Ｄ１２９８０で登録されており、１５４１～１９２０位の領域の配列を配列番号２２に示す。フォワードプライマーは、１５５０～１５７０位の配列（配列番号１９）とし、リバースプライマーは、１８８２～１８６３位に対する相補的な配列（配列番号２０）とし、プローブは、１７８１～１８０５位の配列（配列番号２１）とした。
フォワードプライマー１（配列番号１９）（1550-1570位）
5’-cgtctgtgccttctcatctgc-3’
リバースプライマー１（配列番号２０）（1882-1863位）：
5’-gcacagcttggaggcttgaa-3’
プローブ１（配列番号２１）（1781-1805位）
5’- FAM/CT GTA GGC A/ZEN/T AAA TTG GTC TGT TCA /TAMSp -3’
フォワードプライマー１（配列番号１９）（1550-1570位）
5’-cgtctgtgccttctcatctgc-3’
リバースプライマー１（配列番号２０）（1882-1863位）：
5’-gcacagcttggaggcttgaa-3’
プローブ１（配列番号２１）（1781-1805位）
5’- FAM/CT GTA GGC A/ZEN/T AAA TTG GTC TGT TCA /TAMSp -3’
ＮＣのＤＮＡサンプルの蛍光シグナルを相対値１として、それぞれの蛍光シグナルの相対値を算出した。これらの結果を図１に示す。ＨＢＶゲノムに対するｓｉＲＮＡを添加すると、ネガティブコントロールと比較して、細胞培養の上清画分におけるＨＢＶＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）は減少したが（図示せず）、図１に示すように、ネガティブコントロールと比較して、細胞の核内のｃｃｃＤＮＡの減少は確認できなかった。これに対して、ｈＦＴＬ＿＃３を導入して得られたＤＮＡサンプルにおいては、有意にｃｃｃＤＮＡの減少が確認できた（約２０％の減少）。この結果から、ＦＴＬをターゲットとして設計された発現抑制剤によれば、ＨＢＶ感染細胞の核内で産生されるｃｃｃＤＮＡを減少できることがわかった。細胞質でのｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡからの逆転写酵素によるｒｄＤＮＡの逆転写は、逆転写酵素阻害剤を供給している間しか抑制することができないが、本発明によれば、ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡの元となる上流側の核内のｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できるため、効果的にＨＢＶの複製を阻害して、感染を抑制することができるといえる。
また、同様の方法により、細胞培養、実施例のｓｉＲＮＡの導入を行い、経時的なｃｃｃＤＮＡの変化を確認した。具体的には、ｓｉＲＮＡの導入をＤａｙ０として、２４時間後のＤａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５のｃｃｃＤＮＡを測定した。比較例として、前記ＮＣのｓｉＲＮＡを導入した系（ＮＣ）と、ｓｉＲＮＡ未添加の系（ＮＴ）についても、並行して、同様に経時的なｃｃｃＤＮＡの変化を確認した。
ＮＣのＤａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５のＤＮＡサンプルの蛍光シグナルを、それぞれ相対値１として、Ｄａｙごとの蛍光シグナルの相対値を算出した。その結果、ｓｉＲＮＡ未添加の系（ＮＴ）は、Ｄａｙ３を経過しても、ＮＣと比較してｃｃｃＤＮＡの減少は確認されなかった。これに対して、実施例のｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡを導入した系は、Ｄａｙ３からＮＣと比較してｃｃｃＤＮＡの減少が確認され、Ｄａｙ５において、ｃｃｃＤＮＡの有意な減少が確認できた（相対値０．７８）。
（実施例２）
実施例１において、ヒトＦＴＬに対するｓｉＲＮＡにより、細胞核内におけるＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ産生が抑制できることが確認できた。
実施例１において、ヒトＦＴＬに対するｓｉＲＮＡにより、細胞核内におけるＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ産生が抑制できることが確認できた。
そこで、実施例１で使用したｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡ（ｈＦＴＬ＿＃３）と、それ以外のｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡ（ｈＦＴＬ＿＃１、＃２）とについて、ｈＦＴＬの発現抑制効果を確認した。
具体的には、前記実施例１と同様にして、Ｈｅｐ３８．７－Ｔｅｔ細胞に各ｓｉＲＮＡを導入し、細胞上清を回収し、ＤＮＡサンプルを調製した。そして、前記細胞上清由来のＤＮＡサンプルについて、ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲによりｈＦＴＬ遺伝子の発現量を蛍光シグナルとして測定した。コントロール（ＮＴ）は、ｓｉＲＮＡ未添加とした以外は、同様に処理して測定を行った。
そして、コントロール（ＮＴ）の測定結果を相対値１として、それぞれの相対値を算出した。これらの結果を図２に示す。図２に示すように、いずれのｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡを導入した場合も、コントロールと比較して、有意にｈＦＴＬ遺伝子の発現量が減少した。前記実施例１に示すように、ｈＦＴＬ遺伝子をターゲットとするｈＦＴＬ＿＃３の導入によって、ＨＢＶ感染細胞の核内におけるｃｃｃＤＮＡの産生が抑制されることは確認済みであることから、ｈＦＴＬをターゲットとしｈＦＴＬ遺伝子の発現を抑制する他のｓｉＲＮＡ（＃１または＃２）によっても、同様にｃｃｃＤＮＡの産生が抑制されることは明らかである。
（実施例３）
ＦＴＬをターゲットとするｓｉＲＮＡによって、ＨＶＢ感染細胞の核内におけるｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できることが、実施例１において確認できた。一方、ＨＢＶ感染におけるＨＢＶの複製の抑制に関しては、本発明とは異なるメカニズムとして、前述のような逆転写酵素阻害剤エンテカビルが知られている。ＨＢＶ感染細胞は、核内においてｃｃｃＤＮＡを元に転写されたｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡが、細胞質に放出され、ｒｃＤＮＡに逆転写される。この逆転写工程を阻害するのがエンテカビルである。本発明のｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、上流である核内でのｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できることから、異なる工程を抑制する逆転写酵素阻害剤との併用によって、ＨＢＶの複製の段階的な抑制が可能になる。そこで、本実施例においては、実施例１で使用したｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡ（ｈＦＴＬ＿＃３）と、エンテカビルとの併用により、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制と、ＨＢＶ ｒｃＤＮＡの産生抑制とを確認した。
ＦＴＬをターゲットとするｓｉＲＮＡによって、ＨＶＢ感染細胞の核内におけるｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できることが、実施例１において確認できた。一方、ＨＢＶ感染におけるＨＢＶの複製の抑制に関しては、本発明とは異なるメカニズムとして、前述のような逆転写酵素阻害剤エンテカビルが知られている。ＨＢＶ感染細胞は、核内においてｃｃｃＤＮＡを元に転写されたｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡが、細胞質に放出され、ｒｃＤＮＡに逆転写される。この逆転写工程を阻害するのがエンテカビルである。本発明のｃｃｃＤＮＡ抑制剤は、上流である核内でのｃｃｃＤＮＡの産生を抑制できることから、異なる工程を抑制する逆転写酵素阻害剤との併用によって、ＨＢＶの複製の段階的な抑制が可能になる。そこで、本実施例においては、実施例１で使用したｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡ（ｈＦＴＬ＿＃３）と、エンテカビルとの併用により、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制と、ＨＢＶ ｒｃＤＮＡの産生抑制とを確認した。
ヒト幹細胞として、ヒト初代培養肝細胞（フェニックスバイオ社）を使用した。前記細胞（ＰＸＢ細胞）が４×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（ｄＨＣＧＭ培地）で播種された市販のウェルプレート（フェニックスバイオ社製）を購入し、各ウェルの培地を、ＨＢＶ ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）を６×１０６Ｇｅｑ（Genome Equivalent）／ｍｌで含有するｄＨＣＧＭ培地に置換し（Ｄａｙ０）、さらに培養を行った。ＨＢＶ ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）は、Ｂ型肝炎患者の血清由来を使用した。そして、Ｄａｙ３、Ｄａｙ８、Ｄａｙ１３、Ｄａｙ１８に、新たなｄＨＣＧＭ培地に置換し、置換の度に、前記培地には、ｓｉＲＮＡを１０ｎｍｏｌ／ｌ（終濃度）、エンテカビルを１ｎｇ／ｍｌ（終濃度）となるように添加した。Ｄａｙ２３の時点で、細胞と細胞上清とを回収し、ＤＮＡサンプルを調製した。細胞由来のＤＮＡサンプルについて、前記実施例１と同様にしてｃｃｃＤＮＡをデジタルＰＣＲにより測定した。細胞上清由来のＤＮＡサンプルについて、ｒｃＤＮＡに対するプライマーセットおよびプローブを用いたｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い
、ＨＢＶ ＤＮＡの発現量を蛍光シグナルとして測定した。コントロールは、前記ＮＣのｓｉＲＮＡのみを添加した系（ＮＣ）、エンテカビルのみを添加した系とし、同様に培養と測定を行った。
、ＨＢＶ ＤＮＡの発現量を蛍光シグナルとして測定した。コントロールは、前記ＮＣのｓｉＲＮＡのみを添加した系（ＮＣ）、エンテカビルのみを添加した系とし、同様に培養と測定を行った。
これらの結果を図３に示す。図３において、各系において左のバーの縦軸がｃｃｃＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）、右のバーの縦軸がＨＢＶ ＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）を示す。前記細胞上清には、ｃｃｃＤＮＡは含まれないことから、前記細胞上清のＤＮＡサンプルにおけるＨＢＶ ＤＮＡ量は、理論上、ほぼＨＢＶ ｒｃＤＮＡである。図３に示すように、ＮＣのｓｉＲＮＡのみを導入した系と比較して、エンテカビルのみを添加した系は、ＨＢＶ ｒｃＤＮＡの有意な減少は確認できたが、ｃｃｃＤＮＡ量の減少は確認できなかった。これに対して、ｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡとエンテカビルとを併用した系は、ｃｃｃＤＮＡおよびＨＢＶ ｒｃＤＮＡの両方を有意に減少できた。
（実施例４）
フェリチン（ＦＴ）は、鉄代謝に関連する核内存在たんぱくの一つであり、２種類のサブユニットから成るヘテロオリゴマーであり、前記サブユニットは、Ｌ型（Ｌｉｇｈｔ；軽鎖）とＨ型（Ｈｅａｖｙ；重鎖）の２種類であり、これら重合し、核内で鉄を保持している。前記実施例１において、ＦＴのＬ型サブユニットであるＦＴＬをターゲットとするｓｉＲＮＡにより、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制が確認されたことから、ＦＴのＨ型サブユニット（以下、ＦＴＨという）、ＦＴと同様に鉄を保持するタンパク質であるトランスフェリンをターゲットとした場合における、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制を確認した。
フェリチン（ＦＴ）は、鉄代謝に関連する核内存在たんぱくの一つであり、２種類のサブユニットから成るヘテロオリゴマーであり、前記サブユニットは、Ｌ型（Ｌｉｇｈｔ；軽鎖）とＨ型（Ｈｅａｖｙ；重鎖）の２種類であり、これら重合し、核内で鉄を保持している。前記実施例１において、ＦＴのＬ型サブユニットであるＦＴＬをターゲットとするｓｉＲＮＡにより、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制が確認されたことから、ＦＴのＨ型サブユニット（以下、ＦＴＨという）、ＦＴと同様に鉄を保持するタンパク質であるトランスフェリンをターゲットとした場合における、ｃｃｃＤＮＡの産生抑制を確認した。
前記実施例１のｈＦＴＬ＿＃３、ヒトＦＴＨをターゲットとするｓｉＲＮＡ（ｈＦＴＨ１＿＃１、＃２、＃３）、ヒトトランスフェリン受容体をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＴＦＲＣ＿＃１、＃２、＃３）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、細胞のＤＮＡサンプルにおけるｃｃｃＤＮＡを測定した。具体的には、１細胞中のｃｃｃＤＮＡを測定した。１細胞中には２コピーのＲＮａｓｅＰ分子が存在する。このため、「ｃｃｃＤＮＡの検出値」を、細胞数に想到する「ＲＮａｓｅＰ検出値／２」で割ることにより、１細胞中のｃｃｃＤＮＡの値を算出した。
これらの結果を図４に示す。図４において、縦軸は、１細胞中のｃｃｃＤＮＡ量を示す値（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ）である。図４に示すように、ｃｃｃＤＮＡの減少が確認されたのは、ｈＦＴＬ用ｓｉＲＮＡのみであった。この結果から、ＦＴＬの発現抑制が、核内におけるｃｃｃＤＮＡの産生抑制に関与することが示唆された。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
本発明によれば、前述のような逆転写酵素阻害剤によるｒｃＤＮＡへの転写ではなく、それより上流側における複製中間体のｃｃｃＤＮＡを低減できるため、より効果的にウイルスの複製を抑制できる。したがって、本発明は、例えば、ＨＢＶ感染症の新たな治療方法として非常に有用である。
Claims (16)
- フェリチン軽鎖を抑制するフェリチン軽鎖抑制剤を含むことを特徴とするＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤。
- 前記フェリチン軽鎖抑制剤が、前記フェリチン軽鎖の発現を抑制する発現抑制剤または前記フェリチン軽鎖の機能を抑制する機能抑制剤である、請求項１に記載の抑制剤。
- 前記発現抑制剤が、前記フェリチン軽鎖をコードする遺伝子からの転写を抑制する物質、転写された転写産物を分解する物質、および前記転写物からのタンパク質の翻訳を抑制する物質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２に記載の抑制剤。
- 前記発現抑制物質が、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、およびリボザイムからなる群から選択された少なくとも一つの核酸物質である、請求項３に記載の抑制剤。
- 前記発現抑制物質が、前記核酸物質を発現する発現ベクターである、請求項４に記載の抑制剤。
- 前記機能抑制物質が、前記フェリチン軽鎖に対する活性阻害物質または活性中和物質である、請求項２に記載の抑制剤。
- 前記活性中和物が、前記フェリチン軽鎖に対する抗体または抗原結合断片である、請求項６に記載の抑制剤。
- 前記機能抑制物質が、前記フェリチン軽鎖に対する活性中和物質を発現する発現ベクターである、請求項２に記載の抑制剤。
- 請求項１から８のいずれか一項に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を含むことを特徴とするＨＢＶ感染症用医薬組成物。
- フェリチン軽鎖を抑制する抑制工程を含むことを特徴とするＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制方法。
- 前記抑制工程において、フェリチン軽鎖の発現を抑制する、請求項１０に記載の抑制方法。
- 請求項１から８のいずれか一項に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を添加する添加工程を含むことを特徴とするＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制方法。
- 患者の対象器官におけるフェリチン軽鎖を抑制する抑制工程を含むことを特徴とするＨＢＶ感染症の治療方法。
- 前記抑制工程において、フェリチン軽鎖の発現を抑制する、請求項１３に記載の治療方法。
- 請求項１から８のいずれか一項に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの抑制剤を、患者に投与する投与工程を含むことを特徴とするＨＢＶ感染症の治療方法。
- ＨＢＶ感染症の治療のための、フェリチン軽鎖を抑制するフェリチン軽鎖抑制剤。
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