WO2020032160A1 - 炎症性腸疾患治療薬およびそのスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2020032160A1
WO2020032160A1 PCT/JP2019/031313 JP2019031313W WO2020032160A1 WO 2020032160 A1 WO2020032160 A1 WO 2020032160A1 JP 2019031313 W JP2019031313 W JP 2019031313W WO 2020032160 A1 WO2020032160 A1 WO 2020032160A1
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regnase
mice
test substance
substance
expression
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審良　静男
前田　和彦
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国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory bowel disease and a method for screening the same.
  • IEC Intestinal epithelial cells
  • IEC Intestinal epithelial cells
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • IBD inducers, including poor diet and enteral nutrition factors, are risk factors for human colorectal cancer.
  • Laboratory animal models of IBD provide valuable insight into the complex mechanisms of IBD.
  • mTOR Mechanical rapamycin target protein
  • mTOR signaling plays an essential role in health and disease by different mechanisms. In vivo studies with knockout mice have revealed various physiological functions of mTOR signaling.
  • mTORC1 is one of the mTOR signaling complexes that serves as a key integrator of the nutrient sensing pathway that controls cell growth and survival. Although the primary role of mTORC1 is amino acid sensing, mTORC1 also stimulates nucleotide biosynthesis to control the assimilation process. This sensing mechanism coordinates reprogramming of energy metabolism to promote cell growth and proliferation.
  • mTOR signaling is an important therapeutic target for several diseases, including colorectal cancer. The mTOR pathway is important for epithelial regeneration in response to colitis, and mTORC1 inactivation promotes colitis-induced colon cancer.
  • Legnase 1 (also known as ZC3H12A and MCPIP1) is a zinc finger protein of the CCCH type. Regnase 1 has a ribonuclease domain in its central region and is mediated by Toll-like receptors (TLRs) and IL-1 receptors by degradation of target mRNAs such as the p40 subunit of IL-6 and IL-12. The response is negatively regulated (Non-patent Documents 1 to 4). Deficiency of regnase 1 in mice causes severe autoimmune disease and results in T cell hyperactivation. In non-immune cells, regnase 1 maintains iron homeostasis in duodenal epithelium (Non-Patent Document 5). However, the role of regnase 1 in the colon is not clear.
  • Matsushita K, et al. (2009) Zc3h12a is an RNase essential for controlling immune responses by regulating mRNA decay. Nature 458 (7242): 1185-1190.
  • An object of the present invention is to find molecules involved in the development of inflammatory bowel disease and to provide a method for screening a therapeutic drug for inflammatory bowel disease. Another object is to provide a novel drug for treating inflammatory bowel disease.
  • a medicament for treating inflammatory bowel disease comprising a regnase 1 inhibitor as an active ingredient.
  • the regnase 1 inhibitor is a substance that inhibits the expression of regnase 1 or a substance that inhibits the function of regnase 1.
  • the substance that inhibits the expression of regnase 1 is a nucleic acid that inhibits the expression of regnase 1.
  • the medicament according to the above [2], wherein the substance that inhibits the function of regnase 1 is an antibody or a peptide that specifically binds to regnase 1.
  • a method for screening a therapeutic agent for inflammatory bowel disease comprising selecting a substance that inhibits the expression of regnase 1 or a substance that inhibits the function of regnase 1.
  • the step of contacting regnase 1 with substrate RNA and a test substance, the step of measuring the degradation level of substrate RNA, and the step of measuring the level of degradation when contacting regnase 1 with substrate RNA without adding the test substance Selecting a test substance that reduces the level of degradation of the substrate RNA, as compared to the level of degradation of the substrate RNA.
  • a substance useful as a therapeutic drug for inflammatory bowel disease can be obtained. Further, the medicament of the present invention is useful for treating inflammatory bowel disease.
  • FIG. 3 is a view showing the results of measuring the expression of regnase 1 in the brain, thymus, spleen, and large intestine of wild-type mice by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 7 shows the results of quantitative RT-PCR measuring the expression of regnase 1 in the colon and rectum of intestinal epithelial cell-specific regnase 1-deficient mice (Regnase-1 ⁇ IEC mice) and control mice (Regnase-1 fl / fl mice). It is.
  • (B) is the result of principal component analysis (PCA) of the genus level of fecal microorganisms.
  • PCA principal component analysis
  • DSS dextran sodium sulfate
  • FIG. 7 shows the results of recording the rate of change of (A), the results of male mice administered 2% DSS, (B) the results of female mice administered 2% DSS, and (C) the results of 3% DSS. Is a result of a female mouse to which was administered.
  • FIG. 3 is a diagram showing a protocol for the combined administration of DSS and azoxymethane (AOM).
  • FIG. 23 is a diagram showing a relative expression level of each protein in FIG. 22 as a heat map, where the amount of each protein in a Regnase-1 fl / fl mouse not treated with DSS is set to 1. It is a figure which shows the result of the luciferase assay with respect to 3'-UTR of mTOR signal transduction pathway protein, The length in parenthesis is each 3'-UTR.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing metabolites in normal intestinal epithelial cells of Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice. It is a figure which shows a purine metabolic pathway.
  • 2% DSS was administered for 7 days, and the body weight was measured every day when combined with EHNA, and the rate of change from the body weight at the start of administration was recorded.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result compared with the weight change rate of 1 fl / fl mouse. It is a figure which shows the result of the luciferase assay with respect to 3'-UTR of adenosine kinase 1 (Ak1), xanthine oxidase (Xod), and adenosine deaminase (Ada), and the length in parentheses is each 3'-UTR.
  • Ak1 adenosine kinase 1
  • Xod xanthine oxidase
  • Ada adenosine deaminase
  • FIG. 7 shows the results of measuring the amounts of uric acid, xanthine hypoxanthine, and inosine in intestinal epithelial cells of Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice during DSS administration (days 5, 6, and 7).
  • FIG. 4 shows the results of seahorse analysis of basal oxygen consumption rate (A) and basal extracellular acidification rate (B) in intestinal epithelial cells derived from DSS-treated Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice.
  • FIG. 9 is a view showing the results of measuring the crypt weight of Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice during DSS administration (day 5, 6, 7).
  • Quantitative RT-PCR measures the expression of Hif1a and Epas1 (Hif2a) mRNA in intestinal epithelial cells of Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice during DSS administration (Days 0, 3, 5, and 7) It is a figure which shows the result.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the ATP transport pathway, and the inside of the right frame indicates the type of P1 receptor.
  • FIG. 4 shows the results of quantitative RT-PCR measuring the expression of Cd73 and Cd39 mRNA in normal intestinal epithelial cells of Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice.
  • Diagram showing the results of quantitative RT-PCR measuring the expression of the ATP receptor gene in intestinal epithelial cells of Regnase-1 ⁇ IEC mice and Regnase-1 fl / fl mice during DSS administration (day 0, 3, 5, 7) It is. It is a figure which shows the result of the luciferase assay with respect to 3'-UTR of Cd39, Cd73, and Adora1, and the length in parentheses is each 3'-UTR.
  • the present inventors generated mice lacking regnase 1 specifically in intestinal epithelial cells, and compared the findings associated with dextran sodium sulfate (DSS) -induced colitis with those of control mice. Increased proliferation, decreased apoptosis, and enhanced cell membrane barrier mechanism were confirmed. From these findings, it was thought that targeting regnase 1 would allow the development of a revolutionary therapeutic agent for inflammatory bowel disease for which a therapeutic method has not yet been established.
  • DSS dextran sodium sulfate
  • the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for inflammatory bowel disease.
  • the screening method of the present invention may be any method that uses regnase 1.
  • Regnase 1 used in the screening method of the present invention may be a protein or a gene. When regnase 1 is a protein, it may be a full-length protein or an active fragment containing a ribonuclease domain.
  • the regnase 1 used in the screening method of the present invention may be regnase 1 derived from any organism, and is not particularly limited.
  • the regnase 1 used for the screening method of the present invention may be a mammalian regnase 1. Mammals include humans, chimpanzees, monkeys, dogs, cows, mice, rats, guinea pigs, and the like, and are preferably humans.
  • Information on the nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene encoding regnase 1 of various animals can be obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.). For example, the accession numbers of human, mouse, and rat base sequences and amino acid sequences are as follows.
  • the test substance is not particularly limited, for example, nucleic acids, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammalian tissue extracts, plasma, etc. It may be.
  • the test substance may be a novel substance or a known substance.
  • the test substance may form a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid or base is used as the salt of the test substance.
  • the screening method of the present invention may be a method of selecting a substance that inhibits the expression of regnase 1.
  • a substance that inhibits the expression of regnase 1 is selected by the screening method of the present invention, for example, a step of contacting a test substance with a cell that expresses regnase 1, and a step of measuring the expression level of regnase 1 in the cell Comparing the expression level with the expression level of regnase 1 in the cells not contacted with the test substance, and selecting a test substance that reduces the expression level of regnase 1.
  • Cells expressing ⁇ regnase 1 may be cells in a living body or cultured cells.
  • the cultured cells may be primary cultured cells or cell lines.
  • the cells expressing regnase 1 may be cells expressing endogenous regnase 1 or cells expressing exogenous regnase 1.
  • Cells that express endogenous regnase 1 include, for example, HeLa cells, HEK293 cells, Jurkat cells, Caco-2 cells, mouse embryonic fibroblasts (MEF), EL-4 cells, and the like.
  • Cells expressing exogenous regnase 1 can be prepared by introducing a recombinant expression vector containing a regnase 1-encoding DNA (regnase 1 expression vector) into an appropriate host cell.
  • As host cells for example, MEF cells and primary cultured cells derived from mice deficient in regnase 1, HeLa cells, HEK293 cells, Jurkat cells, Caco-2 cells, EL-4 cells, and the
  • the method of contacting the test substance with the cells is not particularly limited.
  • a method of adding a test substance to a medium may be used.
  • systemic administration such as oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, and local administration to a target organ or target tissue can be mentioned.
  • the measurement of the expression level of regnase 1 may be performed by measuring the amount of regnase 1 protein or the amount of regnase 1 mRNA.
  • the protein can be extracted from the cells by a known method and quantified using a known protein amount measurement method.
  • Known methods for measuring the amount of protein include, for example, Western blotting, EIA, ELISA, RIA, and a method using a protein measurement reagent.
  • RNA can be extracted from cells by a known method and quantified using a known method for measuring the amount of mRNA.
  • Known methods for measuring the amount of mRNA include Northern blotting, RT-PCR, quantitative RT-PCR, and RNase protection assay.
  • the test substance is treated with the target substance.
  • the screening method of the present invention may be a method of selecting a substance that inhibits the function of regnase 1.
  • the function of regnase 1 may be an endoribonuclease activity.
  • selecting a substance that inhibits the endoribonuclease activity of regnase for example, a step of contacting regnase 1 with substrate RNA and a test substance, a step of measuring the degradation level of substrate RNA, Comparing the level of degradation of substrate RNA when the substrate RNA is brought into contact with regnase 1 without adding the same, and selecting a test substance that reduces the level of degradation of substrate RNA.
  • the screening method including selecting a substance that inhibits the endoribonuclease activity of regnase 1 may be performed in any of a system using cells expressing regnase 1 and a system not using cells expressing regnase 1. .
  • an appropriate reaction solution for example, magnesium-containing Tris salt buffer such as “20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , and 1 mM DTT”
  • Ligase 1 Ligase 1
  • substrate RNA, and a test substance are added to the solution, and reacted at 30 to 37 ° C. for 30 to 120 minutes, and the degradation (cleavage) level of the substrate RNA is measured.
  • the test substance inhibits endoribonuclease activity, the cleavage of substrate RNA is suppressed, and the degradation level is reduced.
  • a recombinant regnase 1 protein is preferable.
  • the recombinant regnase 1 protein may be a full-length protein or an active fragment containing a ribonuclease domain.
  • the substrate RNA RNA containing a sequence known to be cleaved by regnase 1 can be used.
  • the substrate RNA may be a synthetic RNA.
  • the method for measuring the degradation level of the substrate RNA is not particularly limited, and examples thereof include PCR and electrophoresis.
  • PCR is used, for example, there is a method of synthesizing a chimeric oligo in which DNA is linked to the 5 ′ side and 3 ′ side of a substrate RNA and using this as a substrate RNA.
  • quantitative PCR is performed using primers complementary to the DNA sequences linked to the 5 ′ and 3 ′ sides of the substrate chimeric oligo. If the substrate chimera oligo is cleaved, the PCR amplification efficiency decreases, and if the substrate chimera oligo is not cleaved, the PCR amplification efficiency increases.
  • test substance when the test substance is a substance that inhibits the endoribonuclease activity of regnase 1, the PCR amplification efficiency is higher than that of a system without addition of the test substance (the substrate chimeric oligo is cleaved by regnase 1).
  • a suitable test substance can be selected as a test substance that reduces the level of degradation of substrate RNA.
  • the PCR amplification level when the test substance is added is 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more, 1.9 times or more or 2 times the PCR amplification level when the test substance is not added.
  • a test substance that increases by a factor of two or more may be selected.
  • a substrate RNA in which the terminal (both or one) of the substrate chimeric oligo is labeled may be used.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as the concentration of the band after electrophoresis can be quantified, and examples thereof include a fluorescent label, an RI label, and a biotin label.
  • the substrate chimeric oligo when the substrate chimeric oligo is cleaved, it appears as at least two short bands or fragments that have been further degraded. That is, if the test substance is a substance that inhibits the endoribonuclease activity of regnase 1, one full-length band appears predominantly as compared to the system without the test substance (the substrate chimeric oligo is cleaved by regnase 1). Therefore, such a test substance can be selected as a test substance that reduces the degradation level of substrate RNA.
  • the cell that expresses regnase 1 may be a cell that expresses endogenous regnase 1.
  • cells expressing exogenous regnase 1 may be used.
  • a cell expressing exogenous regnase 1 a regnase 1 expression cell prepared by introducing a regnase 1 expression vector into a host cell can be used.
  • the substrate RNA RNA containing a sequence known to be cleaved by regnase 1 can be used. For example, a transcript of the 3′-UTR of the IL-6 gene can be mentioned.
  • a cell in which a regnase 1 expression vector and a vector containing a DNA in which the 3′-UTR of the IL-6 gene is ligated downstream of the luciferase gene is introduced into an appropriate host cell is used as a regnase 1 expressing cell.
  • the test substance is added to the medium, cultured for about 1 to 3 days (preferably 2 days), and then the cells are lysed, and the luciferase activity in the cell lysate is measured using a known method.
  • the luciferase activity decreases when the 3′-UTR portion of the luciferase gene mRNA is cleaved by regnase 1, but when the endoribonuclease activity of regnase 1 is inhibited, the 3′-UTR of the luciferase gene mRNA is inhibited. -The UTR portion is not cleaved and luciferase activity is maintained.
  • the test substance is a substance that inhibits the endoribonuclease activity of regnase 1
  • a higher luminescence intensity can be obtained as compared to a system without the test substance added (the substrate chimeric oligo is cleaved by regnase 1).
  • Such a test substance can be selected as a test substance that reduces the level of degradation of substrate RNA.
  • the luminescence intensity when the test substance is added is 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more, 1.9 times or more or 2 times or more the luminescence intensity without the test substance added. May be selected.
  • a phenomenon in which the expression level of an mTOR-related molecule increases when the function of regnase 1 in a cell that expresses endogenous regnase 1 decreases, or
  • the target test substance can be selected by utilizing the phenomenon that the expression level of the extracellular ATP receptor increases when the function of regnase 1 in the cell that expresses ATP decreases.
  • the screening method of the present invention includes, for example, a step of contacting a test substance with a cell expressing regnase 1, a step of measuring the expression level of an mTOR-related molecule or an extracellular ATP receptor in the cell, And comparing the expression level of the mTOR-related molecule or the extracellular ATP receptor in the cells that are not brought into contact with the test substance, and selecting a test substance that increases these expression levels.
  • Cells expressing endogenous regnase 1 are suitable for cells expressing regnase 1.
  • Such cells include, for example, HeLa cells, HEK293 cells, Jurkat cells, Caco-2 cells, mouse fetal fibroblasts (MEF), EL-4 cells, and the like.
  • human colon cancer-derived cells for example, Caco-2 cells are preferably used.
  • the test substance When measuring the expression level of mTOR-related molecules, the test substance is added to the medium of cells expressing endogenous regnase 1 and cultured for about 1 to 3 days (preferably 2 days), and then the cells are lysed.
  • the cell lysate may be subjected to Western blotting.
  • mTOR-related molecules include Tsc1, Rheb, Akt1, mTor, mLst8, and Rptor.
  • One or two or more mTOR-related molecules may be selected.
  • a test substance that increases the expression level of the mTOR-related molecule in comparison with the expression level of the mTOR-related molecule in cells to which the test substance has not been added can be selected as the target test substance.
  • the expression level of the mTOR-related molecule when the test substance is added is 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more the expression level of the mTOR-related molecule when the test substance is not added.
  • a test substance that increases 1.9-fold or more or 2-fold or more may be selected.
  • the test substance When measuring the expression level of extracellular ATP receptor, the test substance is added to the medium of cells expressing endogenous regnase 1 and cultured for about 1 to 3 days (preferably 2 days). Cells may be stained with an antibody against a related molecule (eg, CD39, CD73, A1R, etc.) and subjected to flow cytometry.
  • a related molecule eg, CD39, CD73, A1R, etc.
  • One type of ATP-related molecule may be selected, or two or more types may be selected. It is known that the expression level of the ATP-related molecule and the expression level of the extracellular ATP receptor are correlated, so that the expression level of the ATP-related molecule is compared with the expression level of the ATP-related molecule in the cells to which the test substance is not added.
  • a test substance that increases the expression level can be selected as a target test substance.
  • the expression level of the ATP-related molecule when the test substance is added is 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more the expression level of the ATP-related molecule when the test substance is not added.
  • a test substance that increases 1.9-fold or more or 2-fold or more may be selected.
  • the present invention provides a medicament for treating inflammatory bowel disease, comprising a regnase 1 inhibitor as an active ingredient.
  • Inflammatory bowel disease includes ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • the drug of the present invention may contain, as an active ingredient, a substance selected using the above-described screening method of the present invention.
  • the medicament of the present invention can be formulated by a conventional method using a regnase 1 inhibitor as an active ingredient.
  • formulations for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), Syrups, emulsions, suspensions and the like can be mentioned.
  • These preparations are manufactured by a known method and contain a carrier, diluent or excipient usually used in the field of preparation.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like.
  • injections examples include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, and intraarticular injections. And other dosage forms.
  • Such injections are prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above active ingredient in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and suitable solubilizing agents such as alcohol (for example, ethanol and the like) and polyalcohol (for example, , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50, etc.).
  • suitable solubilizing agents such as alcohol (for example, ethanol and the like) and polyalcohol (for example, , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50, etc.).
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the above active ingredient with a conventional suppository base.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and are thus orally administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.). Alternatively, they can be administered parenterally.
  • mammals eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.
  • they can be administered parenterally.
  • the active ingredient of the medicament of the present invention may be a substance that inhibits the expression of regnase 1 or a substance that inhibits the function of regnase 1.
  • the substance that inhibits the expression of regnase 1 may be a nucleic acid that inhibits the expression of regnase 1. Examples of the nucleic acid that inhibits expression of regnase 1 include siRNA (short interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA) and antisense oligonucleotide of the regnase 1 gene.
  • the nucleotide sequence of the regnase 1 gene of the animal to be administered can be easily obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.), and a nucleic acid that inhibits the expression of regnase 1 can be designed by a known method.
  • siRNA is a double-stranded RNA having a length of about 20 bases (for example, about 21 to 23 bases) or less. By expressing such siRNA in a cell, a gene (the present In the present invention, expression of the regnase 1 gene) can be suppressed.
  • shRNA is a single-stranded RNA that contains a partially palindromic base sequence, takes a double-stranded structure in the molecule, and is composed of a short hairpin structure with a protruding portion at the 3 ′ end, about 20 base pairs. The above molecules are referred to.
  • shRNA After being introduced into a cell, such shRNA is degraded in the cell to a length of about 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, and 23 bases) and becomes a target similarly to siRNA.
  • the expression of the gene (the regnase 1 gene in the present invention) can be suppressed.
  • the siRNA and the shRNA may be in any form as long as they can suppress the expression of regnase 1.
  • siRNA or shRNA can be designed by a known method based on the base sequence of the target gene. siRNA or shRNA can be chemically synthesized artificially.
  • antisense and sense RNA can be synthesized in vitro from template DNA using, for example, T7 RNA polymerase and T7 promoter.
  • the antisense oligonucleotide may be any nucleotide that is complementary to or hybridizes to 5 to 100 consecutive nucleotide sequences in the DNA sequence of the regnase 1 gene, and may be either DNA or RNA. Further, it may be modified as long as the function is not hindered.
  • the antisense oligonucleotide can be synthesized by a conventional method, and can be easily synthesized by, for example, a commercially available DNA synthesizer.
  • the active ingredient of the medicament of the present invention is a nucleic acid that inhibits the expression of regnase 1
  • it can be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • methods for introducing nucleic acid molecules using liposomes liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method, etc.
  • microinjection method gene gun
  • a method of transferring a nucleic acid molecule into a cell together with a carrier (metal particles) in (Gene @ Gun) can be used.
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or retrovirus
  • the gene can be introduced into a cell or tissue by introducing the recombinant virus into the cell or tissue.
  • the siRNA and the target sequence be identical, but they need not be completely identical as long as RNA interference can be induced.
  • the siRNA may be one in which one to several bases have been substituted, added or deleted from the target sequence, and may induce RNA interference.
  • the siRNA may have 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more sequence identity with the target sequence, and may induce RNA interference.
  • siRNA can be obtained by converting all nucleotides of either the sense strand or the antisense strand into DNA (hybrid type), or by converting some nucleotides of the sense strand and / or antisense strand into DNA. (Chimera type).
  • the hybrid type includes those obtained by converting the nucleotides of the sense strand into DNA.
  • Examples of the chimeric type include those obtained by converting some nucleotides on the downstream side (3 'end of the sense strand and 5' end of the antisense strand) into DNA.
  • both the 3 ′ end of the sense strand and the 5 ′ end of the antisense strand are converted into DNA, and either the 3 ′ end of the sense strand or the 5 ′ end of the antisense strand In which DNA is converted to DNA.
  • the length of the nucleotide to be converted may be any length up to a nucleotide corresponding to 1/2 of the RNA molecule.
  • the nucleotide may be a nucleotide analog in which sugar, base and / or phosphate are chemically modified.
  • Examples of the base-modified nucleotide analog include, for example, 5-position-modified uridine or cytidine (for example, 5-propynyluridine, 5-propynylcytidine, 5-methylcytidine, 5-methyluridine, 5- (2-amino) propyl 8-position modified adenosine or guanosine (eg, 8-bromognosine, etc.); deazanucleotides (eg, 7-deaza-adenosine, etc.); O- and N -Alkylated nucleotides (eg, N6-methyladenosine) and the like.
  • 5-position-modified uridine or cytidine for example, 5-propynyluridine, 5-propynylcytidine, 5-methylcytidine, 5-methyluridine, 5- (2-amino) propyl 8-position modified adenosine or guanosine (eg, 8-bromognos
  • sugar-modified nucleotide analog examples include, for example, 2′-OH of ribonucleotide is H, OR, R, a halogen atom, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , or CN (here, , R represents an alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms) and the like, and a 2′-terminal sugar modification and a 5′-terminal phosphorylation modification in which the 5′-terminal is monophosphorylated.
  • Phosphate-modified nucleotide analogs include those in which a phosphoester group that binds adjacent ribonucleotides has been replaced with a phosphothioate group.
  • the active ingredient of the medicament of the present invention may be an antibody or peptide that specifically binds to regnase 1.
  • the binding of the antibody or peptide to regnase 1 can inhibit the binding of regnase 1 to the substrate RNA.
  • the antibody that specifically binds to regnase 1 may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Further, it may be a complete antibody molecule or an antibody fragment (for example, Fab, F (Ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv, etc.) capable of specifically binding to regnase 1.
  • the antibodies may be human chimeric antibodies or humanized antibodies. Both antibodies and peptides can be produced by known methods.
  • a parenteral administration route for example, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, as an injection or infusion formulated with a pharmaceutically acceptable carrier It is preferred to administer internally, subcutaneously or topically.
  • the medicament of the present invention can contain 0.001 to 50% by mass, preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.1 to 1% by mass of the active ingredient.
  • the dose of the medicament of the present invention is appropriately set in consideration of the purpose, the type of disease, the severity of the disease, the age, weight, sex, medical history, type of active ingredient, and the like of the patient. For an average human having a body weight of about 65 to 70 kg, the dose is preferably about 0.02 mg to 4000 mg per day, more preferably about 0.1 mg to 200 mg.
  • the total daily dose may be a single dose or a divided dose.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for treating inflammatory bowel disease comprising a step of administering an effective amount of a substance that inhibits the expression of regnase 1 or a substance that inhibits the function of regnase 1.
  • B A substance that inhibits the expression of regnase 1 or a substance that inhibits the function of regnase 1 for use in treating inflammatory bowel disease.
  • C Use of a substance that inhibits the expression of regnase 1 or a substance that inhibits the function of regnase 1 for producing a medicament for treating inflammatory bowel disease.
  • mice Regnase-1 fl / fl mice were obtained from Uehata et al. (Uehata T, et al. (2013) Malt1-induced cleavage of regnase-1 in CD4 (+) helper T cells regulates immune activation. Cell 153 (5) Transgeneic mice that express Villin-Cre specifically in the intestine are described in El Marjou et al. (El Marjou F, et al. (2004) Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis 39 (3): 186-193.).
  • Intestinal epithelial cell-specific regnase 1-deficient mice (Regnase-1 ⁇ IEC mice) were obtained by crossing Regnase-1 fl / fl mice and Villin-Cre mice to obtain Villin-Cre + Regnase-1 fl / + mice (hetero-deficient), This was crossed again with Regnase-1 fl / fl mice to produce a Villin-Cre + Regnase-1 fl / fl mouse, ie, a Regnase-1 ⁇ IEC mouse.
  • Regnase-1 AA / AA mutant mice were created by homologous recombination. That is, a targeting vector was constructed in which the codons encoding serine at amino acid residues 435 and 439 of mouse Regnase-1 were substituted with alanine, injected into mouse ES cells, and a homologous recombinant clone was isolated. . A chimeric mouse was prepared based on this clone, and its transmission to the germ line was confirmed. Then, a mutant-1 AA / AA mutant mouse was established. All mice were bred under SPF (specific pathogen free) conditions. All animal experiments were performed with the approval of the Animal Experiment Committee of the Institute for Microbial Diseases, Osaka University.
  • SPF specific pathogen free
  • DSS Dextran sodium sulfate
  • Chronic colitis was induced by three cycles of 7 days of drinking water containing 2% DSS and then 14 days of regular water. Mice were analyzed for body weight and histological changes.
  • rapamycin Sigma, 10 mg / kg
  • EHNA erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine, Sigma, 0.3 mg / kg
  • Allopurinol (Nichiiko, 1 mg / ml) was administered by supplementing drinking water during DSS administration.
  • Rath et al. (Rath HC, et al. (1996) Normal luminal bacteria, especially Bacteroides species, mediate chronic colitis, gastritis, and arthritis in HLA-B27 / human beta2 microglobulin transgenic rats. J Clin Invest 98 (4): 945-953.), And colon inflammation was scored by a slightly modified method. Goblet cells, mucosal thickening, inflammatory cells, and submucosal cell invasion were evaluated. Each criterion was scored as 0-4, and the sum of each score was defined as a histological score.
  • FITC-dextran permeability assay Intestinal permeability was assessed by intestinal administration of FITC-dextran 4000 (Sigma). All mice received FITC-dextran (250 mg / kg body weight) by gavage 4 hours before blood collection. Whole blood was obtained by cardiac puncture under 1.5-2.0% isoflurane anesthesia, and the amount of FITC-dextran in plasma was measured in duplicate using a fluorimeter (ARVO, Perkin Elmer). FITC-dextran was diluted with PBS to prepare a standard curve, and the absorbance of 25 ⁇ l of plasma or standard solution was measured at a wavelength of 488 nm using a fluorimeter.
  • CE-TOFMS capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometer
  • Luciferase assay A pGL3-3'-UTR plasmid or a pGL3-empty plasmid for inserting a target mRNA together with a wild-type or nuclease-deficient (D141N) Regnase-1 expression plasmid or an empty control plasmid is transfected into HEK293 cells. I did it. Two days after the culture, the cells were lysed, and the luciferase activity in the lysate was measured using a Dual-luciferase reporter assay system (Promega). A Renilla luciferase expression vector was co-transfected as an internal control.
  • Regnase-1 ⁇ IEC mice are healthy and indistinguishable from control mice (Regnase-1 f1 / fl ). In addition, Regnase-1 ⁇ IEC mice do not show symptoms of autoimmune disease. This point is due to the fact that conventional regnase 1 deficient mice (Matsushita K, et al. (2009) Nature 458 (7242): 1185-1190) and CD4-specific regnase 1 deficient mice (Uehata T, et al. (2013) Cell 153 (5): 1036-1049).
  • Regnase-1 ⁇ IEC mice are resistant to experimental colitis
  • drinking water containing 2% DSS was given for 7 days to induce colitis.
  • Control mice Regnase-1 f1 / fl ) lost significantly more weight than Regnase-1 ⁇ IEC mice (FIG. 8).
  • the weight loss tolerance of Regnase-1 ⁇ IEC mice did not differ by gender (FIG. 9).
  • weight loss of the Regnase-1 ⁇ IEC mouse was significantly suppressed (FIG. 9). This result indicates that regnase 1 is involved in DSS-induced colitis.
  • rapamycin has been used as an inhibitor to study mTOR function and signal transduction. Systemic administration of rapamycin to inflammatory bowel disease model mice has been reported to inhibit intestinal regeneration with weight loss (Guan Y, et al. (2015) J Immunol 195 (1): 339-346 ).
  • 3′-UTR of mTOR signaling protein was cloned and luciferase assay was performed.
  • luciferase assay of the mTOR signaling protein
  • regnase 1 significantly reduced the luciferase activity of the components of mTORC1, Tsc1, Rheb, Akt1, mTor, mLst8 and Rptor (FIG. 24). This result indicates that regnase 1 controls the mTORC1 pathway more than the mTORC2 pathway (FIG. 25).
  • Regnase 1 is involved in purine metabolic pathways Both the initiation and resolution of inflammation is accompanied by metabolic reprogramming.
  • metabolome analysis was performed using DSS-untreated mice.
  • changes in purine metabolite levels were detected in Regnase-1 ⁇ IEC mice.
  • FIG. 26 the production of intracellular ATP in IEC isolated from Regnase-1 ⁇ IEC mice increased significantly, but the amount of ADP and AMP decreased.
  • Adenosine levels also decreased significantly, but levels of inosinic acid (IMP) and its degradation products increased.
  • IMP inosinic acid
  • Xanthine oxidase converts hypoxanthine to xanthine and then to uric acid.
  • Adenosine deaminase converts adenosine to inosine.
  • Adenylate kinase-1 converts AMP / ADP to ATP.
  • EHNA administration caused a significant decrease in body weight in Regnase-1 ⁇ IEC mice and control mice (FIG. 28 (A)). This indicates that Ada-mediated enzyme activity was increased in Regnase-1 ⁇ IEC mice. The results also show that EHNA administration can increase adenosine levels, convert AMP, and activate AMP-activated protein kinase and attenuate mTOR signaling. Allopurinol also caused weight loss in Regnase-1 ⁇ IEC mice (FIG. 28 (B)). This indicates that blocking uric acid production may enhance intestinal damage during inflammation of Regnase-1 ⁇ IEC mice. Conversely, inosine administration reduces colitis, as previously reported (Mabley JG, et al.
  • inosine levels can enhance the endogenous antioxidant system.
  • the anti-inflammatory effect of inosine is mediated in several mouse disease models by activation of the adenosine receptor, which prevents the onset of the disease (Hasko G, et al. (2000) J Immunol 164 (2): 1013-1019, Hasko G, et al. (2004) Trends Pharmacol Sci 25 (3): 152-157).
  • mTOR is essential for Xod activation (Abooali M, et al. (2014) Sci Rep 4: 6307).
  • Regnase 1 regulates purine catabolism by upregulating mTOR.
  • Regnase 1 negatively regulates post-inflammatory regeneration by regulating energy metabolism. Consistent with this, the crypt weight of the Regnase-1 ⁇ IEC mice increased significantly up to day 7 during the DSS injury induction period (FIG. 34). Hypoxia is also a key factor in the inflammatory microenvironment affecting adenosine and hypoxia-inducible factor (HIF) signaling (Colgan SP & Eltzschig HK (2012) Annu Rev Physiol 74: 153-175). Severe hypoxia has been associated with inflammatory bowel disease. However, expression of Hif1a and Epas1 (Hif2a) mRNA was not different between control and Regnase-1 ⁇ IEC mice, both (FIG. 35). These data indicate that purine metabolism is consistently increased in the IEC of Regnase-1 ⁇ IEC mice.
  • HIF hypoxia-inducible factor
  • CD39 knockout mice and CD73 knockout mice have severe colitis, their expression is protective against DSS-induced colitis due to depletion of inflammatory ATP signaling (Bynoe MS, et al. (2012) J Biomed Biotechnol 2012: 260983, Friedman DJ, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106 (39): 16788-16793).
  • ectonucleotidases shift ATP-driven proinflammatory immune cell activity toward adenosine-mediated anti-inflammatory conditions (Antonioli L, et al. (2013) Trends Mol Med 19 (6): 355-367 ).
  • Increased numbers of extracellular receptors in the IEC of Regnase-1 ⁇ IEC mice may contribute to resolution of inflammation.
  • Extracellular adenosine interacts with the P1 purinergic receptor (FIG. 36).
  • expression of the adenosine A1 receptor (A1R, encoded by Adora1) which has the highest affinity for adenosine, is significantly significant in Regnase-1 ⁇ IEC mice on days 5 and 7 after DSS colitis induction.
  • A2AR Adora2a
  • A2BR Adora2b
  • A3R Adora3R
  • the equilibrium nucleoside transporters ENTs, Ent1 (Slc29a1) and Ent2 (Slc29a2) did not change significantly (FIG. 38).
  • luciferase assay was performed on the full-length or deleted 3'UTR of the CD73, CD39 and Adora1 genes (FIG. 39). Luciferase activity was significantly reduced by wild-type regnase 1, indicating that these genes are targets for regnase 1. Increased A1R levels, in concert with CD73, can maintain epithelial barrier integrity and inhibition of inflammation and prevent tumor progression (Bowser JL, et al. (2016) J Clin Invest 126 (1): 220 -238). These data indicate that regnase 1 deficiency reduces inflammation by up-regulating ectonucleotidase expression.

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Abstract

本発明は、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質を選択することを含む、炎症性腸疾患治療薬のスクリーニング方法、および、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質であるレグナーゼ１阻害剤を有効成分とする炎症性腸疾患の治療用医薬を提供する。

Description

炎症性腸疾患治療薬およびそのスクリーニング方法
　本発明は、炎症性腸疾患治療薬およびそのスクリーニング方法に関するものである。
　腸管上皮細胞（intestinal epithelial cell: IEC）は、腸管における共生微生物叢との恒常性を維持するために協力する。炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease: IBD）は、IEC層の障害によって引き起こされる腸管の慢性炎症状態である。低質の食事および経腸栄養因子を含むIBD誘発物質は、ヒト大腸がんの危険因子である。IBDの実験動物モデルは、IBDの複雑なメカニズムに関する貴重な洞察を提供する。
　メカニスティックなラパマイシン標的タンパク質（mTOR）は、酵母および哺乳動物の両方に保存されたセリン－スレオニンキナーゼである。mTORシグナル伝達は、異なるメカニズムによって健康および疾患において不可欠な役割を果たす。ノックアウトマウスを用いたインビボ研究は、mTORシグナル伝達の様々な生理学的機能を明らかにしている。mTORC1は、細胞増殖および生存を制御する栄養感知経路の重要なインテグレーターとして働くmTORシグナル伝達複合体の１つである。mTORC1の主要な役割はアミノ酸感知であるが、mTORC1は、同化プロセスを制御するためにヌクレオチド生合成も刺激する。この感知機構は、エネルギー代謝の再プログラミングを調整して、細胞の成長および増殖を促進する。mTORシグナル伝達は、大腸がんを含むいくつかの疾患の重要な治療薬標的である。mTOR経路は、大腸炎に応答する上皮再生に重要であり、mTORC1不活性化は、大腸炎誘導性大腸がんを促進する。
　レグナーゼ１（ZC3H12AおよびMCPIP1としても知られる）は、CCCH型のジンクフィンガータンパク質である。レグナーゼ１は、その中央領域にリボヌクレアーゼドメインを有し、IL-6およびIL-12のp40サブユニットなどの標的mRNAの分解によって、Toll様受容体（TLR）およびIL-1受容体を介した免疫応答を負に調節する（非特許文献１～４）。マウスにおけるレグナーゼ１の欠損は、重度の自己免疫疾患を引き起こし、T細胞の過剰活性化をもたらす。非免疫細胞では、レグナーゼ１は十二指腸上皮において鉄ホメオスタシスを維持する（非特許文献５）。しかし、結腸におけるレグナーゼ１の役割は明らかでない。
Matsushita K, et al. (2009) Zc3h12a is an RNase essential for controlling immune responses by regulating mRNA decay. Nature 458(7242):1185-1190. Iwasaki H, et al. (2011) The IkappaB kinase complex regulates the stability of cytokine-encoding mRNA induced by TLR-IL-1R by controlling degradation of regnase-1. Nat Immunol 12(12):1167-1175. Uehata T, et al. (2013) Malt1-induced cleavage of regnase-1 in CD4(+) helper T cells regulates immune activation. Cell 153(5):1036-1049. Mino T, et al. (2015) Regnase-1 and Roquin Regulate a Common Element in Inflammatory mRNAs by Spatiotemporally Distinct Mechanisms. Cell 161(5):1058-1073. Yoshinaga M, et al. (2017) Regnase-1 Maintains Iron Homeostasis via the Degradation of Transferrin Receptor 1 and Prolyl-Hydroxylase-Domain-Containing Protein 3 mRNAs. Cell Rep 19(8):1614-1630.
　本発明は、炎症性腸疾患の発症に関与する分子を見出し、炎症性腸疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。また、新規な炎症性腸疾患治療用医薬を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］レグナーゼ１阻害剤を有効成分とする炎症性腸疾患の治療用医薬。
［２］レグナーゼ１阻害剤が、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質である前記［１］に記載の医薬。
［３］レグナーゼ１の発現を阻害する物質が、レグナーゼ１の発現を阻害する核酸である前記［２］に記載の医薬。
［４］レグナーゼ１の機能を阻害する物質が、レグナーゼ１と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［２］に記載の医薬。
［５］炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である前記［１］～［４］のいずれかに記載の医薬。
［６］レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質を選択することを含む、炎症性腸疾患治療薬のスクリーニング方法。
［７］レグナーゼ１と基質ＲＮＡと被験物質を接触させる工程と、基質ＲＮＡの分解レベルを測定する工程と、該分解レベルを、被験物質を加えずにレグナーゼ１と基質ＲＮＡを接触させた際の基質ＲＮＡの分解レベルと比較し、基質ＲＮＡの分解レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［６］に記載の方法。
［８］被験物質とレグナーゼ１を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のレグナーゼ１発現レベルを測定する工程と、該発現レベルを、被験物質と接触させない前記細胞におけるレグナーゼ１の発現レベルと比較し、レグナーゼ１の発現レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［６］に記載の方法。
［９］被験物質とレグナーゼ１を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のｍＴＯＲ関連分子または細胞外ＡＴＰ受容体の発現レベルを測定する工程と、該発現レベルを、被験物質と接触させない前記細胞におけるｍＴＯＲ関連分子または細胞外ＡＴＰ受容体の発現レベルと比較し、これらの発現レベルを上昇させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［６］に記載の方法。
　本発明のスクリーニング方法によれば、炎症性腸疾患治療薬として有用な物質を取得することができる。また、本発明の医薬は、炎症性腸疾患の治療に有用である。
野生型マウスの脳、胸腺、脾臓、大腸におけるレグナーゼ１の発現を、定量RT-PCRで測定した結果を示す図である。 腸管上皮細胞特異的レグナーゼ１欠損マウス（Regnase-1ΔIECマウス）および対照マウス（Regnase-1fl/flマウス）の結腸および直腸におけるレグナーゼ１の発現を、定量RT-PCRで測定した結果を示す図である。 （Ａ）はRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの結腸の代表的な写真であり、（Ｂ）はRegnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）の結腸の長さを測定して比較した結果を示す図である。 Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの結腸の組織切片を、HE染色、Muc2免疫染色、アルシアンブルー染色、およびGob5転写物のin situ hybridizationを行った代表的な観察画像を示す図である。 Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスからそれぞれ調製した血液細胞および脾細胞をFACS解析した結果を示す図であり、（Ａ）は抗CD11c抗体と抗CD11b抗体で染色した各細胞の２次元プロット、（Ｂ）は抗Ly6C抗体と抗CD11b抗体で染色した各細胞の２次元プロット、（Ｃ）は抗Ly6G抗体と抗CD11b抗体で染色した各細胞の２次元プロットである。 Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスからそれぞれ調製した血液細胞および脾細胞をFACS解析し、マクロファージ、単球および好中球の各細胞数を比較した結果を示す図であり、（Ａ）は血液細胞の結果、（Ｂ）は脾細胞の結果である。 Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの腸管の微生物プロファイルを確認した結果を示す図であり、（Ａ）のy軸は、x軸上に示される配列数をサンプリングした後に見出されると予想される観察された種の数を示す。（Ｂ）は糞便微生物の属レベルの主成分分析（PCA）の結果である。 Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）に2％（w/v％、以下同じ）デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を7日間投与して大腸炎を誘発した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を示す図である。 Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）にDSSを7日間投与して大腸炎を誘発した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を示す図であり、（Ａ）は2％DSSを投与した雄マウスの結果、（Ｂ）は2％DSSを投与した雌マウスの結果、（Ｃ）は3％DSSを投与した雌マウスの結果である。 野生型レグナーゼ１発現マウス（Regnase-1WT/WT、n=4）および分解耐性レグナーゼ１を発現する変異マウス（Regnase-1AA/AA、n=5）に2％DSSを7日間投与して大腸炎を誘発した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を示す図である。 （Ａ）は、2％DSSを7日間投与した後2日間回復（DSS非投与）したRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの結腸の代表的な写真であり、（Ｂ）は、（Ａ）のDSS処理したRegnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）の結腸の長さを測定して比較した結果を示す図である。 2％DSSを7日間投与した後2日間回復（DSS非投与）したRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの結腸の組織切片をHE染色して顕微鏡で観察した代表的な画像を示す図である。 Regnase-1ΔIECマウス（n=3）およびRegnase-1fl/flマウス（n=3）の大腸炎の組織学的スコアを示す図である。 左側は、2％DSSを7日間投与した後2日間回復（DSS非投与）したRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの結腸の組織切片を、アルシアンブルー染色、Muc2免疫染色、TUNEL染色、Ki67免疫染色、ZO-1免疫染色を行った代表的な顕微鏡観察画像を示す図であり、右側は、5つのクリプト（n=5）で計数された各陽性細胞数を示す図である。 腸内分泌細胞、杯細胞および房細胞の腸細胞マーカー遺伝子の3'-UTRに対するルシフェラーゼアッセイの結果を示す図であり、カッコ内は各3'-UTRの長さである。 FITC-デキストラン透過性アッセイの結果を示す図であり、FITC-デキストランの強制経口投与（250mg/kg体重）の4時間後における、Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）の血漿FITC-デキストラン濃度を示す図である。 DSSとアゾキシメタン（AOM）との併用投与のプロトコールを示す図である。 図17のプロトコールでDSSとAOMを併用投与した65日目のRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスから摘出した結腸の組織切片をHE染色して、顕微鏡で炎症および腫瘍を観察した結果を示す図である。 図17のプロトコールでDSSとAOMを併用投与した65日目のRegnase-1ΔIECマウス（n=6）およびRegnase-1fl/flマウス（n=6）の結腸炎症および腫瘍進行の組織学的スコアを示す図である。 DSS誘導大腸炎の急性期および慢性期におけるレグナーゼ１の発現レベルを測定した結果を示す図である。 Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）に2％DSSを7日間投与した際、ならびに、Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）に2％DSSを7日間投与し、さらにラパマイシンを併用投与した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を示す図である。 DSS処理した、または、DSS処理していないRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスからそれぞれクリプトを単離し、各mTORシグナル伝達タンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティングで評価した結果を示す図である。 図22の各タンパク質の相対発現量をヒートマップで示した図であり、DSS処理していないRegnase-1fl/flマウスの各タンパク質量を１としている。 mTORシグナル伝達経路タンパク質の3'-UTRに対するルシフェラーゼアッセイの結果を示す図であり、カッコ内は各3'-UTRの長さである。 mTORシグナル伝達経路におけるレグナーゼ１の標的遺伝子を示す図であり、赤の輪郭（少し薄い輪郭）は標的遺伝子、青の輪郭（少し濃い輪郭）は非標的遺伝子を示す。点線の輪郭はテストされていない。 Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの正常な腸管上皮細胞における代謝物質を分析した結果を示す図である。 プリン代謝経路を示す図である。 （Ａ）は、Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）に2％DSSを7日間投与し、さらにAda阻害剤であるEHNAを併用投与した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を示す図であり、（Ｂ）は、Regnase-1ΔIECマウス（n=5）およびRegnase-1fl/flマウス（n=5）に2％DSSを7日間投与し、さらにXod阻害剤であるアロプリノールを併用投与した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を示す図である。 （Ａ）は、Regnase-1fl/flマウス（n=5）に2％DSSを7日間投与し、さらにイノシンを併用投与した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を、イノシンに変えてPBSを投与したRegnase-1fl/flマウス（n=5）の体重変化率と比較した結果を示す図であり、（Ｂ）はRegnase-1ΔIECマウスに2％DSSを7日間投与し、さらにEHNAを併用投与した際に毎日体重を測定し、投与開始時の体重からの変化率を記録した結果を、上記（Ａ）のイノシンを併用投与したRegnase-1fl/flマウスの体重変化率と比較した結果を示す図である。 アデノシンキナーゼ1（Ak1）、キサンチンオキシダーゼ（Xod）およびアデノシンデアミナーゼ（Ada）の3'-UTRに対するルシフェラーゼアッセイの結果を示す図であり、カッコ内は各3'-UTRの長さである。 DSS投与中（5、6、7日目）のRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの腸管上皮細胞における尿酸、キサンチンヒポキサンチンおよびイノシン量を測定した結果を示す図である。 DSS処理したRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウス由来の腸管上皮細胞における基礎酸素消費速度（Ａ）および基底細胞外酸性化速度（Ｂ）のシーホース分析の結果を示す図である。 DSS投与中（5、6、7日目）のRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの腸管上皮細胞における（Ａ）ミトコンドリア呼吸バイオエネルギーパラメータ、（Ｂ）ATP連鎖呼吸、（Ｃ）プロトンリーク、（Ｄ）最大および予備呼吸能を測定した結果を示す図である。 DSS投与中（5、6、7日目）のRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスのクリプト重量を測定した結果を示す図である。 DSS投与中（0、3、5、7日目）のRegnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの腸管上皮細胞におけるHif1aおよびEpas1 (Hif2a)のmRNAの発現を定量RT-PCRで測定した結果を示す図である。 ATP輸送経路の模式図であり、右側枠内はP1受容体の種類を示す。 Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの正常な腸管上皮細胞におけるCd73およびCd39のmRNAの発現を定量RT-PCRで測定した結果を示す図である。 DSS投与中（0、3、5、7日目）Regnase-1ΔIECマウスおよびRegnase-1fl/flマウスの腸管上皮細胞におけるATP受容体遺伝子の発現を定量RT-PCRで測定した結果を示す図である。 Cd39、Cd73およびAdora1の3'-UTRに対するルシフェラーゼアッセイの結果を示す図であり、カッコ内は各3'-UTRの長さである。
　本発明者らは、腸管上皮細胞特異的にレグナーゼ１を欠くマウスを作製し、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎に伴う所見についてコントロールマウスの所見と比較検討したところ、体重減少抑制、細胞増殖増加、アポトーシス減少、細胞膜バリアー機構亢進が確認された。これらの知見から、レグナーゼ１を標的とすることにより、未だ治療法が確立されていない炎症性腸疾患に対する画期的な治療薬を開発できると考えられた。
〔スクリーニング方法〕
　本発明は炎症性腸疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、レグナーゼ１を用いるものであればよい。本発明のスクリーニング方法で用いるレグナーゼ１はタンパク質でもよく、遺伝子でもよい。また、レグナーゼ１がタンパク質の場合、全長タンパク質でもよく、リボヌクレアーゼドメインを含む活性断片でもよい。
　本発明のスクリーニング方法に用いるレグナーゼ１は、どのような生物由来のレグナーゼ１でもよく、特に限定されない。本発明のスクリーニング方法に用いるレグナーゼ１は、哺乳動物のレグナーゼ１であってもよい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが挙げられ、好ましくはヒトである。各種動物のレグナーゼ１をコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。例えば、ヒト、マウス、ラットの塩基配列およびアミノ酸配列のアクセッション番号は以下のとおりである。
ヒト　：NM_001323550（塩基配列）、NP_001310479（アミノ酸配列）
　　　　NM_001323551（塩基配列）、NP_001310480（アミノ酸配列）
マウス：NM_153159（塩基配列）、NP_694799（アミノ酸配列）
ラット：NM_001077671（塩基配列）、NP_001071139（アミノ酸配列）
　被験物質は特に限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等であってもよい。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
　本発明のスクリーニング方法は、レグナーゼ１の発現を阻害する物質を選択する方法であってもよい。本発明のスクリーニング方法により、レグナーゼ１の発現を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とレグナーゼ１を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のレグナーゼ１の発現レベルを測定する工程と、該発現レベルを被験物質と接触させない前記細胞におけるレグナーゼ１の発現レベルと比較し、レグナーゼ１の発現レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。
　レグナーゼ１を発現する細胞は、生体内の細胞でもよく、培養細胞でもよい。培養細胞は、初代培養細胞でもよく、株化細胞でもよい。レグナーゼ１を発現する細胞は、内在性のレグナーゼ１を発現する細胞でもよく、外来性のレグナーゼ１を発現する細胞でもよい。内在性のレグナーゼ１を発現する細胞としては、例えば、HeLa細胞、HEK293細胞、Jurkat細胞、Caco-2細胞、マウス胎児繊維芽細胞(MEF)、EL-4細胞などが挙げられる。外来性のレグナーゼ１を発現する細胞は、適当な宿主細胞にレグナーゼ１をコードするDNAを含む組換え発現ベクター（レグナーゼ１発現ベクター）を導入して作製することができる。宿主細胞としては、例えば、レグナーゼ１欠損マウス由来のMEF細胞および初代培養細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、Jurkat細胞、Caco-2細胞、EL-4細胞などを用いることができる。
　被験物質と細胞を接触させる方法は特に限定されない。例えば、培養細胞を用いる場合には、培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。例えば、非ヒト動物の生体において被験物質と細胞とを接触させる場合には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与、標的臓器や標的組織への局所投与などが挙げられる。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
　レグナーゼ１の発現レベルの測定は、レグナーゼ１のタンパク質量を測定してもよく、レグナーゼ１のmRNA量を測定してもよい。タンパク質量を測定する場合は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、EIA法、ELISA法、RIA法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。mRNA量を測定する場合は、公知の方法で細胞からＲＮＡを抽出し、公知のmRNA量測定方法を用いて定量することができる。公知のmRNA量測定方法としては、ノーザンブロット法、RT-PCR法、定量RT-PCR法、RNaseプロテクションアッセイなどが挙げられる。
　被験物質を接触させない対照群におけるレグナーゼ１のタンパク質量またはmRNA量と比較して、被験物質を接触させた場合にレグナーゼ１のタンパク質量またはmRNA量が減少していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がレグナーゼ１のタンパク質量またはmRNA量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のタンパク質量またはmRNA量と比較して、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下または10％以下に減少させる被験物質を選択してもよい。
　本発明のスクリーニング方法は、レグナーゼ１の機能を阻害する物質を選択する方法であってもよい。レグナーゼ１の機能は、エンドリボヌクレアーゼ活性であってもよい。レグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する物質を選択する場合、例えば、レグナーゼ１と基質RNAと被験物質を接触させる工程と、基質RNAの分解レベルを測定する工程と、該分解レベルを、被験物質を加えずにレグナーゼ１と基質RNAを接触させた際の基質RNAの分解レベルと比較し、基質RNAの分解レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。
　レグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する物質を選択することを含むスクリーニング方法は、レグナーゼ１を発現する細胞を用いる系およびレグナーゼ１を発現する細胞を用いない系のいずれの系で実施してもよい。レグナーゼ１を発現する細胞を用いない場合、適当な反応液（例えば、「20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, and 1 mM DTT」等のマグネシウム含有トリス塩緩衝液）にレグナーゼ１と基質RNAと被験物質を添加して、30～37℃で30～120分間反応させ、基質ＲＮＡの分解（切断）レベルを測定する。被験物質がエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する場合、基質RNAの切断が抑制され、分解レベルが低下する。
　この系で用いるレグナーゼ１としては、組換えレグナーゼ１タンパク質が好適である。組換えレグナーゼ１タンパク質は全長タンパク質でもよく、リボヌクレアーゼドメインを含む活性断片でもよい。基質RNAはレグナーゼ１により切断されることが公知の配列を含むRNAを用いることができる。基質RNAは合成RNAであってもよい。
　基質RNAの分解レベルの測定方法は特に限定されないが、例えばPCR、電気泳動などが挙げられる。PCRを用いる場合、例えば基質RNAの5'側および3'側にDNAを連結したキメラオリゴを合成しこれを基質RNAとする方法が挙げられる。この方法では、基質キメラオリゴの5'側および3'側に連結したDNA配列と相補するプライマーを用いて定量PCRを行う。基質キメラオリゴが切断されていればPCR増幅効率が低下し、基質キメラオリゴが切断されていなければPCR増幅効率が高くなる。すなわち、被験物質がレグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する物質であれば、被験物質を加えていない系（レグナーゼ１により基質キメラオリゴが切断される）と比較してPCR増幅効率が高くなり、このような被験物質を基質RNAの分解レベルを低下させる被験物質として選択することができる。この系では、被験物質を添加した場合のPCR増幅レベルが、被験物質を添加していない場合のPCR増幅レベルの1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上または2倍以上に増加させる被験物質を選択してもよい。
　電気泳動を用いる場合、例えば上記基質キメラオリゴの末端（両方または一方）が標識された基質RNAを用いてもよい。標識物質は、電気泳動後のバンドの濃さを定量できるものであれば特に限定されず、例えば、蛍光標識、RI標識、ビオチン標識などが挙げられる。両端を蛍光標識した基質キメラオリゴを用いた場合、反応後に基質キメラオリゴを回収して電気泳動を行うと、切断されていない基質キメラオリゴは両端が蛍光標識された一本の全長バンドが現れる。一方、基質キメラオリゴが切断されている場合は、少なくとも短い二本のバンド、またはさらに分解が進んだ断片として現れる。すなわち、被験物質がレグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する物質であれば、被験物質を加えていない系（レグナーゼ１により基質キメラオリゴが切断される）と比較して一本の全長バンドが優勢に現れるので、このような被験物質を基質RNAの分解レベルを低下させる被験物質として選択することができる。
　レグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する物質を選択することを含むスクリーニング方法において、レグナーゼ１を発現する細胞を用いる場合、レグナーゼ１を発現する細胞としては、内在性のレグナーゼ１を発現する細胞でもよく、外来性のレグナーゼ１を発現する細胞でもよい。外来性のレグナーゼ１を発現する細胞は、レグナーゼ１発現ベクターを宿主細胞に導入して作製したレグナーゼ１発現細胞を用いることができる。基質RNAとしては、レグナーゼ１により切断されることが公知の配列を含むRNAを用いることができる。例えば、IL-6遺伝子の3'-UTRの転写物が挙げられる。
　この系では、適当な宿主細胞にレグナーゼ１発現ベクターと、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にIL-6遺伝子の3'-UTRを連結したDNAを含むベクターを導入した細胞を、レグナーゼ１を発現する細胞として用いてもよい。被験物質を培地に添加して、1～3日程度（好ましくは2日間）培養し、その後細胞を溶解して細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性を公知の方法を用いて測定する。この細胞を用いた場合、ルシフェラーゼ遺伝子のmRNAの3'-UTR部分がレグナーゼ１によって切断されるとルシフェラーゼ活性が低下するが、レグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性が阻害されるとルシフェラーゼ遺伝子のmRNAの3'-UTR部分が切断されず、ルシフェラーゼ活性が維持される。
　すなわち、被験物質がレグナーゼ１のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する物質であれば、被験物質を加えていない系（レグナーゼ１により基質キメラオリゴが切断される）と比較して高い発光強度が得られるので、このような被験物質を基質RNAの分解レベルを低下させる被験物質として選択することができる。この系では、被験物質を添加した場合の発光強度が、被験物質を添加していない場合の発光強度の1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上または2倍以上に増加させる被験物質を選択してもよい。
　レグナーゼ１の機能を阻害する物質を選択するスクリーニング方法において、内在性レグナーゼ１を発現する細胞のレグナーゼ１の機能が低下したときにmTOR関連分子の発現レベルが上昇する現象、または、内在性レグナーゼ１を発現する細胞のレグナーゼ１の機能が低下したときに細胞外ATP受容体の発現レベルが上昇する現象を利用して、目的の被験物質を選択することができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、例えば、被験物質とレグナーゼ１を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のmTOR関連分子または細胞外ATP受容体の発現レベルを測定する工程と、該発現レベルを、被験物質と接触させない前記細胞におけるmTOR関連分子または細胞外ATP受容体の発現レベルと比較し、これらの発現レベルを上昇させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法であってもよい。
　レグナーゼ１を発現する細胞には、内在性レグナーゼ１を発現する細胞が好適である。このような細胞としては、例えばHeLa細胞、HEK293細胞、Jurkat細胞、Caco-2細胞、マウス胎児繊維芽細胞(MEF)、EL-4細胞などが挙げられる。中でもヒト大腸がん由来細胞（例えば、Caco-2細胞）を用いることが好ましい。
　mTOR関連分子の発現レベルを測定する場合、内在性レグナーゼ１を発現する細胞の培地に被験物質を添加して1～3日程度（好ましくは2日間）培養し、その後細胞を溶解して得られた細胞溶解液をウエスタンブロッティングに供してもよい。mTOR関連分子としては、例えばTsc1、Rheb、Akt1、mTor、mLst8およびRptorなどが挙げられる。mTOR関連分子は1種を選択してもよく、2種以上を選択してもよい。被験物質を添加していない細胞におけるmTOR関連分子の発現レベルと比較して、mTOR関連分子の発現レベルを上昇させる被験物質を目的の被験物質として選択することができる。この系では、被験物質を添加した場合のmTOR関連分子の発現レベルが、被験物質を添加していない場合のmTOR関連分子の発現レベルの1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上または2倍以上に増加させる被験物質を選択してもよい。
　細胞外ATP受容体の発現レベルを測定する場合、内在性レグナーゼ１を発現する細胞の培地に被験物質を添加して1～3日程度（好ましくは2日間）培養し、細胞を回収してATP関連分子（例えば、CD39、CD73、A1R等）に対する抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーに供してもよい。ATP関連分子は1種を選択してもよく、2種以上を選択してもよい。ATP関連分子の発現レベルと細胞外ATP受容体の発現レベルは相関することが知られているので、被験物質を添加していない細胞におけるATP関連分子の発現レベルと比較して、ATP関連分子の発現レベルを上昇させる被験物質を目的の被験物質として選択することができる。この系では、被験物質を添加した場合のATP関連分子の発現レベルが、被験物質を添加していない場合のATP関連分子の発現レベルの1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上または2倍以上に増加させる被験物質を選択してもよい。
〔炎症性腸疾患の治療用医薬〕
　本発明は、レグナーゼ１阻害剤を有効成分として含有する炎症性腸疾患の治療用医薬を提供する。炎症性腸疾患には潰瘍性大腸炎とクローン病が含まれる。本発明の医薬は、上記本発明のスクリーニング方法を用いて選択される物質を有効成分としてもよい。
　本発明の医薬は、レグナーゼ１阻害剤を有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO-50等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
　本発明の医薬の有効成分は、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質であってもよい。レグナーゼ１の発現を阻害する物質はレグナーゼ１の発現を阻害する核酸であってもよい。レグナーゼ１の発現を阻害する核酸としては、レグナーゼ１遺伝子のsiRNA（short interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。投与対象動物のレグナーゼ１遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から容易に取得することができ、公知の方法でレグナーゼ１の発現を阻害する核酸を設計することができる。
　siRNAは、約20塩基（例えば、約21～23塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖RNAであり、このようなsiRNAを細胞に発現させることにより、そのsiRNAの標的となる遺伝子（本発明においてはレグナーゼ１遺伝子）の発現を抑制することができる。shRNAは、一本鎖RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、3'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約20塩基対以上の分子のことをいう。そのようなshRNAは、細胞内に導入された後、細胞内で約20塩基（代表的には例えば、21塩基、22塩基、23塩基）の長さに分解され、siRNAと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはレグナーゼ１遺伝子）の発現を抑制することができる。siRNAおよびshRNAは、レグナーゼ１の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。siRNAまたはshRNAは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の方法により設計することができる。siRNAまたはshRNAは、人工的に化学合成することができる。また、例えばT7RNAポリメラーゼおよびT7プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンスおよびセンスのRNAをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、レグナーゼ１遺伝子のDNA配列中の連続する5から100の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、DNAまたはRNAのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のDNA合成装置によって容易に合成することができる。
　本発明の医薬の有効成分が、レグナーゼ１の発現を阻害する核酸である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクターの形態で投与する場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、HVJ-リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。siRNAまたはshRNAをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、SV40などのDNAウイルスまたはRNAウイルスに、siRNAまたはshRNAを発現するDNAを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
　siRNAと標的配列は同一であることが望ましいが、RNA干渉を誘導できる限り、完全に同一な配列でなくてもよい。具体的には、siRNAのアンチセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り、1～数個（例えば2、3、4個）のミスマッチがあってもよい。すなわち、siRNAは、標的配列に対して1～数個の塩基が置換、付加もしくは欠失したものであってRNA干渉を誘導できるものであってもよい。また、siRNAは、標的配列と85％以上、90％以上、95％以上、98％以上の配列同一性を有し、かつRNA干渉を誘導できるものであってもよい。
　siRNAは、RNA干渉を誘導できる限り、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方のヌクレオチドを全てDNAに変換したもの（ハイブリッド型）や、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドをDNAに変換したもの（キメラ型）であってもよい。ハイブリッド型としては、センス鎖のヌクレオチドをDNAに変換したものが挙げられる。キメラ型としては、下流側（センス鎖の3'末端側、アンチセンス鎖の5'末端側）の一部のヌクレオチドをDNAに変換したものが挙げられる。具体的には、センス鎖の3'末端側およびアンチセンス鎖の5'末端側のヌクレオチドを共にDNAに変換したもの、センス鎖の3'末端側またはアンチセンス鎖の5'末端側の何れかのヌクレオチドをDNAに変換したものが挙げられる。また、変換するヌクレオチド長は、RNA分子の1/2に相当するヌクレオチドまでの任意長であってもよい。
　siRNAは、RNA干渉を誘導できる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基および／またはリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジンまたはシチジン（例えば、5-プロピニルウリジン、5-プロピニルシチジン、5-メチルシチジン、5-メチルウリジン、5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ハロシチジン、5-ハロウリジン、5-メチルオキシウリジン等）；8位修飾アデノシンまたはグアノシン（例えば、8-ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば7-デアザ-アデノシン等）；O-およびN-アルキル化ヌクレオチド（例えば、N6-メチルアデノシン等）等が挙げられる。また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、リボヌクレオチドの2'-OHが、H、OR、R、ハロゲン原子、SH、SR、NH2、NHR、NR2、もしくはCN（ここで、Rは炭素数1-6のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を示す）等によって置換された2'位糖修飾、5'末端がモノリン酸化された5'末端リン酸化修飾が挙げられる。リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。
　本発明の医薬の有効成分は、レグナーゼ１と特異的に結合する抗体またはペプチドであってもよい。抗体またはペプチドがレグナーゼ１と結合することにより、レグナーゼ１と基質RNAとの結合を阻害することができる。レグナーゼ１と特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、レグナーゼ１に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Fab、F(Ab')2、Fab'、Fv、scFv等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。抗体およびペプチドは、いずれも公知の方法により製造することができる。本発明の医薬の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。
　本発明の医薬は、有効成分を0.001～50質量％、好ましくは0.01～10質量％、さらに好ましくは0.1～1質量％含有することができる。本発明の医薬の投与量は、目的、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約65～70ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり0.02mg～4000mg程度が好ましく、0.1mg～200mg程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
　本発明には、以下の各発明が含まれる。
（Ａ）レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする炎症性腸疾患の治療方法。
（Ｂ）炎症性腸疾患の治療に使用するための、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質。
（Ｃ）炎症性腸疾患の治療用医薬を製造するための、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質の使用。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実験材料および実験方法〕
（１）マウス
　Regnase-1fl/flマウスは、Uehataら（Uehata T, et al. (2013) Malt1-induced cleavage of regnase-1 in CD4(+) helper T cells regulates immune activation. Cell 153(5):1036-1049）に記載されており、腸特異的にVillin-Creを発現するトランスジェニックマウスは、el Marjouら（el Marjou F, et al. (2004) Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis 39(3):186-193.）に記載されている。腸管上皮細胞特異的レグナーゼ１欠損マウス（Regnase-1ΔIECマウス）は、Regnase-1fl/flマウスとVillin-Creマウスを交配してVillin-Cre＋Regnase-1fl/＋マウス（ヘテロ欠損）を得、これをRegnase-1fl/flマウスを再度交配してVillin-Cre＋Regnase-1fl/flマウス、すなわちRegnase-1ΔIECマウスを作製した。
　Regnase-1AA/AA変異マウスは、相同組換えにより作製した。すなわち、マウスRegnase-1のアミノ酸残基435番目と439番目のセリンをコードするコドンをアラニンに置換したターゲティングベクターを構築し、マウスES細胞にインジェクションをして、相同組換え体クローンを単離した。このクローンを元にキメラマウスを作製し、生殖系列への伝搬を確認して、Regnase-1AA/AA変異マウスを樹立した。
　すべてのマウスはSPF（specific pathogen free）条件下で飼育した。全ての動物実験は、大阪大学微生物病研究所動物実験委員会の承認を得て行われた。
（２）デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発大腸炎
　DSS誘発大腸炎の実験には、Regnase-1fl/fl（8～12週齢）、Regnase-1ΔIEC（8～12週齢）、Regnase-1WT/WT（20週齢）およびRegnase-1AA/AA（20週齢）を使用した。急性大腸炎は、2％（w/v％、以下同じ）または3％DSS（36～50kDa; MP Biomedicals）を含む飲料水を7日間与え、その後通常の水を2～3日間与えることにより誘導した。慢性大腸炎は、2％DSSを含む飲料水を7日間与えその後通常の水を14日間与えるサイクルを3サイクル行うことにより誘導した。マウスの体重と組織学的変化を分析した。薬剤を併用投与する場合、ラパマイシン（Sigma、10mg/kg）、EHNA（erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine、Sigma、0.3mg/kg）はDSS投与中毎日腹腔内注射した。アロプリノール（日医工、1mg/ml）は、DSS投与中に飲料水に補給して投与した。
（３）免疫組織化学、免疫蛍光およびTUNEL分析
　摘出したばかりの結腸をホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。免疫組織化学的染色は、一次抗体に対するDAKO Envision Systemを用いて、製造者のプロトコールに従って行った。TUNEL染色は、in situアポトーシス検出キット（Takara）を用いて行った。ヘマトキシリン－エオシン（HE）染色は定法に従って行った。BZ-9000顕微鏡（キーエンス）を用いて画像を記録した。使用した抗体を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（４）組織学的スコアリング
　Rathら（Rath HC, et al. (1996) Normal luminal bacteria, especially Bacteroides species, mediate chronic colitis, gastritis, and arthritis in HLA-B27/human beta2 microglobulin transgenic rats. J Clin Invest 98(4):945-953.）の方法を少し変更した方法で結腸炎症のスコアリングを行った。杯細胞、粘膜肥厚、炎症細胞、および粘膜下細胞浸潤について評価した。各基準は0～4としてスコアされ、各スコアの合計を組織学的スコアと定義した。
（５）FITC-デキストラン透過性アッセイ
　腸の透過性は、FITC-デキストラン4000（Sigma）の腸管腔内投与によって評価した。全てのマウスに、採血の4時間前に強制経口投与によりFITC-デキストラン（250mg/kg body weight）を与えた。1.5-2.0％のイソフルラン麻酔下で、心臓穿刺により全血を得、血漿中のFITC-デキストランの量を、蛍光光度計（ARVO、Perkin Elmer）を用いてデュプリケートで測定した。FITC-デキストランをPBSで希釈して標準曲線を作成し、蛍光光度計を用いて、波長488nmで25μlの血漿または標準液の吸光度を測定した。
（６）クリプト単離
　大腸組織片を、5mM EDTAおよび1mM DTTを含むPBSに浸漬し、氷上で30分間インキュベートした。EDTAを除去した後、冷PBSで激しく振盪して遠心分離することを繰り返すことにより、絨毛およびクリプトに富んだペレットを得た。
（７）ウエスタンブロット分析
　大腸から単離したクリプトをRIPA緩衝液中でホモジナイズした。ウエスタンブロットシグナルをデンシトメトリー測定によって分析し、続いてNational Institutes of Health Imageソフトウェアプログラムを用いて定量した。使用した抗体を上記表１に示した。
（８）代謝分析
　IECの代謝産物を測定するために、4匹のマウスから単離したIECをプールし、それぞれ独立に測定した（n=1）。抽出物は、～106細胞から内部標準液（Human Metabolome Technologies）を含むメタノールを用いて調製した。陽イオン性化合物はキャピラリー電気泳動接続飛行時間型質量分析計（CE-TOFMS）のポジティブモードで測定し、陰イオン性化合物はCE-MS/MSのポジティブおよびネガティブモードで測定した。
（９）生体エネルギーの評価
　Seahorse Extracellular Analyzer XFp（Agilent-Seahorse XF Technology）プレート上の培養液に、約500のクリプトから単離したIECを、マトリゲルと共に播種した。ミトコンドリア複合体V阻害剤であるオリゴマイシン（5μM）、ミトコンドリア脱共役剤であるFCCP（5μM）および呼吸鎖阻害剤であるアンチマイシンA／ロテノン（0.1μM）の存在下で、Seahorse XFp Analyzer （Agilent）を用いて酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定した。
（１０）定量PCR分析
　EpCAM+CD45-細胞集団からRNeasyプラスミニキット（Qiagen）を用いてトータルRNAを単離し、SuperScript III（Thermo Fishers Scientific）を用いて逆転写を行った。定量PCRのために、Thunderbird Probe One-step qRT-PCRキット（東洋紡）を用いてcDNA断片を増幅した。標的マウス遺伝子のTaqManプローブをApplied Biosystemsから購入した。ViiA-7 Real-Time PCRシステム（Applied Biosystems）を用いて蛍光を検出した。mRNAレベルは18S rRNAレベルに対して正規化された。
（１１）ルシフェラーゼアッセイ
　野生型またはヌクレアーゼ欠損（D141N）Regnase-1発現プラスミドまたは空のコントロールプラスミドと共に、目的のmRNAを挿入するためのpGL3-3'-UTRプラスミドまたはpGL3-emptyプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトした。培養2日後に細胞を溶解し、溶解物中のルシフェラーゼ活性をDual-luciferaseレポーターアッセイシステム（Promega）を用いて測定した。内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターを同時にトランスフェクトした。
（１２）統計解析
　実験データの統計解析はGraphPad Prismソフトウェアで行った。すべてのP値<0.05を有意とみなした。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
〔実験結果〕
（１）腸管上皮細胞特異的レグナーゼ１欠損マウス
　レグナーゼ１は、免疫細胞および大腸で発現される（図1）。腸管上皮におけるレグナーゼ１の機能を研究するために、Regnase-1fl/flマウスを、腸特異的にVillin-Creを発現するトランスジェニックマウスと繁殖させることにより、腸管上皮内のレグナーゼ１を欠くマウス（以下、「Regnase-1ΔIEC」と記す）を作製した。結腸および直腸においてレグナーゼ１が発現していないことを、RT-qPCRによって確認した（図2）。Regnase-1ΔIECマウスは健康であり、対照マウス（Regnase-1f1/fl）と区別がつかない。また、Regnase-1ΔIECマウスは自己免疫疾患の症状を示さない。この点は、従来のレグナーゼ１欠損マウス（Matsushita K, et al. (2009) Nature 458(7242):1185-1190）や、CD4特異的レグナーゼ１欠損マウス（Uehata T, et al. (2013) Cell 153(5):1036-1049）と異なる。
　SPF施設で飼育された対照マウス（Regnase-1f1/fl）と比較して、Regnase-1ΔIECマウスの結腸の長さは有意に長く（図3）、腸管上皮層は厚かった（図4）。免疫組織化学では、MUC2陽性およびアルシアンブルー陽性細胞の数が増加し、杯細胞マーカーGob5（Clca3によりコードされる）も発現していた（図4）。この結果は、Regnase-1ΔIECマウスは杯細胞数が増加していることを示すものである。Regnase-1ΔIECマウスの末梢血および脾臓細胞のFACS分析は、対照マウスとほぼ同数の単球、好中球およびマクロファージを示した（図5および図6）。したがって、免疫細胞の発生は正常であった。さらに、対照マウスおよびRegnase-1ΔIECマウスの糞便から、細菌の16SリボソームRNA遺伝子を調べ、微生物プロファイルを明らかにした。いずれの分類学的レベルにおいても、細菌集団の構成に有意差はなかった（図7）。これらのデータは、レグナーゼ１の非存在下の腸管上皮における杯細胞数の増加が内因性機構によって引き起こされることを示している。
（２）Regnase-1ΔIECマウスは実験的大腸炎に耐性である
　腸炎症におけるレグナーゼ１の機能を調べるために、2％DSSを含む飲料水を７日間与えて大腸炎を誘発した。対照マウス（Regnase-1f1/fl）は、Regnase-1ΔIECマウスよりも大幅に体重が減少した（図8）。Regnase-1ΔIECマウスの体重減少耐性は、性別による差異は無かった（図9）。また、3％DSSを与えた場合も、Regnase-1ΔIECマウスの体重減少は有意に抑制された（図9）。この結果は、レグナーゼ１がDSS誘発大腸炎に関与していることを示している。分解耐性レグナーゼ１（未発表データ）を生じるIκBキナーゼリン酸化部位の突然変異を有するRegnase-1AA/AA変異マウスは、逆に体重が有意に減少した（図10）。この結果は、レグナーゼ１が炎症性腸疾患（IBD）に大いに関与していることを示している。
　Regnase-1ΔIECマウスにおける9日目（2％DSS含有飲料水を7日間、DSS不含飲料水を2日間を与えた）の結腸の長さは、対照マウス（Regnase-1f1/fl）より有意に長かった（図11）。HE染色で大腸の形態学的構造を評価した（図12）。Regnase-1ΔIECマウスは対照マウスより、上皮びらん、クリプト損傷、および結腸粘膜への炎症細胞の浸潤の程度が低かった。組織学的スコアもまた、DSS投与Regnase-1ΔIECマウスにおける炎症の減弱を示している（図13）。
　アルシアンブルー染色はMuc2染色と一致し、Regnase-1ΔIECマウスにおけるムチン産生の増加を示した（図14）。レグナーゼ１の標的特異性を、そのリボヌクレアーゼ活性により調べるために、腸内分泌細胞、杯細胞および房細胞の腸細胞マーカー遺伝子の3'-UTRをクローニングし、ルシフェラーゼアッセイを行った（図15）。しかし、これらの中には非特異的な標的遺伝子が存在し、ムチン産生がレグナーゼ１欠損症の二次的影響であることが示唆された。TUNEL陽性細胞数の減少およびKi67陽性細胞数の増加も観察された（図14）。これらのデータは、レグナーゼ１欠損が結腸炎症の際に腸管上皮細胞の死を防ぎ増殖を亢進して正常治癒を促進し得ることを示唆している。FITC-デキストラン吸収アッセイは、Regnase-1ΔIECマウスでは上皮バリアーが保護されることが示され（図16）、タイトジャンクションタンパク質ZO-1の破壊が少ないこと（図14）と一致した。これらの結果は、腸管上皮にレグナーゼ１を欠くことが、マウスをDSS誘発性大腸炎に抵抗性を与えることを示している。
（３）レグナーゼ１は大腸炎および癌に関連するmTORシグナル伝達経路を標的とする
　DSSと、発癌物質であるアゾキシメタン（AOM）とを組み合わせて図17に示すプロトコールで投与すると、マウスに大腸炎関連大腸がんを誘発する。レグナーゼ１が大腸がんと関連しているかどうかを検討した。プロトコール（図17）の65日目に、Regnase-1ΔIECマウスおよび対照マウスの両方のAOM/DSS誘発マウスに、複数の結腸腫瘍が存在した（図18）。興味深いことに、結腸炎症および腫瘍進行の組織学的スコアは、対照マウスよりRegnase-1ΔIECマウスの方が低かった（図19）。これらの結果は、レグナーゼ１の発現は、急性期と慢性期の両方で増加した（図20）。レグナーゼ１の欠損が大腸炎だけでなく大腸炎が誘導する大腸がんも軽減したことを示している。
　腸の再生はmTORシグナル経路と関連しているが、mTORC1シグナル伝達は様々な細胞プロセスの調節において重要な役割を果たす。ラパマイシンは、mTOR機能およびシグナル伝達を研究するための阻害剤として使用されている。炎症性腸疾患モデルマウスへのラパマイシンの全身投与は、体重減少を伴う腸の再生を阻害することが報告されている（Guan Y, et al. (2015) J Immunol 195(1):339-346）。
　Regnase-1ΔIECマウスおよび対照マウスにラパマイシンと2％DSSを併用投与すると、両方のマウスにおいて、同様の体重減少が引き起こされた（図21）。これは、Regnase-1ΔIECマウスのDSS耐性はmTORシグナル伝達によって媒介されることを示している。ウエスタンブロッティングにより、mTORシグナル伝達タンパク質の発現レベルを評価した（図22）。mTORのリン酸化は、Regnase-1ΔIECマウスのIECにおいて上昇した。下流タンパク質S6Kおよび4E-BP1のレベルも上昇した（図23）。DSS処理後もmTORレベルの上昇が維持された（図21）。この結果は、mTORシグナル伝達がRegnase-1ΔIECマウスのIECにおいて構成的に活性化されていることを示している。
　レグナーゼ１の標的特異性を、そのリボヌクレアーゼ活性によって検討するために、mTORシグナル伝達タンパク質の3'-UTRをクローニングし、ルシフェラーゼアッセイを行った。mTORシグナル伝達タンパク質の3'-UTRルシフェラーゼアッセイにより、レグナーゼ１は、mTORC1の構成要素であるTsc1、Rheb、Akt1、mTor、mLst8およびRptorのルシフェラーゼ活性を有意に低下させた（図24）。この結果は、レグナーゼ１はmTORC2経路よりもmTORC1経路を制御することを示している（図25）。
（４）レグナーゼ１はプリン代謝経路に関与している
　炎症の始まりおよび解消の両方に代謝のリプログラミングが伴う。レグナーゼ１がIEC代謝を調節するかどうかを調べるために、DSS非投与マウスを用いてメタボローム分析を行った。その結果、Regnase-1ΔIECマウスにおいて、プリン代謝物レベルの変化を検出した。図26に示したように、Regnase-1ΔIECマウスから単離したIECにおける細胞内ATPの生成が顕著に増加したが、ADPおよびAMPの量は減少した。アデノシンのレベルも顕著に低下したが、イノシン酸（IMP）およびその分解産物のレベルは上昇した。
　いくつかの酵素がこのプリン代謝経路に関与している（図27）。キサンチンオキシダーゼ（Xod、キサンチンデヒドロゲナーゼとしても知られる）は、ヒポキサンチンをキサンチンに変換し、次いで尿酸に変換する。アデノシンデアミナーゼ（Ada）はアデノシンをイノシンに変換する。アデニル酸キナーゼ-1（Ak1）は、AMP/ADPをATPに変換する。これらの酵素のインビボでの効果を評価するために、DSS誘発大腸炎モデルにおいて、Ada阻害剤であるEHNA、およびXod阻害剤であるアロプリノールを使用した。EHNA投与は、Regnase-1ΔIECマウスおよび対照マウスにおいて体重の有意な減少を引き起こした（図28(A)）。これは、Regnase-1ΔIECマウスにおいてAda媒介酵素活性が上昇したことを示している。また、この結果は、EHNA投与がアデノシンの濃度を上昇させ、AMPを変換し、AMP活性化プロテインキナーゼの活性化およびmTORシグナル伝達の減弱をもたらし得ることを示す。アロプリノールも、Regnase-1ΔIECマウスにおいて体重減少を引き起こした（図28(B)）。これは、尿酸産生をブロックすることが、Regnase-1ΔIECマウスの炎症時の腸の損傷を増強する可能性があることを示している。逆に、イノシン投与は、以前に報告されているように（Mabley JG, et al. (2003) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 284(1):G138-144）、大腸炎を軽減する（図29）。イノシンレベルの増加は内因性抗酸化系を増強し得る。イノシンの抗炎症作用は、いくつかのマウス疾患モデルにおいて疾患の発症を防ぐアデノシン受容体の活性化によって媒介される（Hasko G, et al. (2000) J Immunol 164(2):1013-1019、Hasko G, et al. (2004) Trends Pharmacol Sci 25(3):152-157）。mTORはXod活性化に必須である（Abooali M, et al. (2014) Sci Rep 4:6307）。したがって、レグナーゼ１は、mTORをアップレギュレートすることによってプリン異化を調節する。
　次に、ルシフェラーゼアッセイを用いて標的特異性を調べた。レグナーゼ１は、Adaではなく、Ak1およびXodのルシフェラーゼ活性を有意に減少させ（図30）、レグナーゼ１がこれらの遺伝子を標的にしていることが示された。この結果は腸管上皮細胞におけるレグナーゼ１欠損がプリンの同化作用および異化作用を促進することを明らかにしている。
　DSS投与中のメタボローム分析では、Regnase-1ΔIECマウスのIECにおける尿酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの増加を確認した（図31）。これは、レグナーゼ１がプリン異化経路を負に調節することを示している。また、DSS傷害誘導の最初の7日間、基礎酸素消費速度および細胞外酸性化速度は徐々に変化し、高代謝状態にシフトした（図32）。レグナーゼ１のアブレーションは、炎症に応答する代謝状態の下方制御を妨げるようである。注目すべきことに、Regnase-1ΔIECマウスのIECにおけるミトコンドリア呼吸バイオエネルギーパラメータ、ATP連鎖呼吸、プロトンリーク、最大および予備呼吸能は、5日目および6日目より7日目が高かった（図33）。これは、レグナーゼ１がエネルギー代謝を調節することによって炎症後の再生を負に調節することを示している。これと一致して、Regnase-1ΔIECマウスのクリプト重量は、DSS損傷誘導期間中7日目まで有意に上昇した（図34）。低酸素も、アデノシンおよび低酸素誘導因子（HIF）シグナル伝達に影響する炎症微小環境における重要な因子である（Colgan SP & Eltzschig HK (2012) Annu Rev Physiol 74:153-175）。重度低酸素は炎症性腸疾患と関連している。しかし、Hif1aおよびEpas1（Hif2a）mRNAの発現は、どちらも対照マウスおよびRegnase-1ΔIECマウスの間で差がなかった（図35）。これらのデータは、Regnase-1ΔIECマウスのIECにおいて、プリン代謝が一貫して増加していることを示している。
（５）レグナーゼ１によるエクトヌクレオチダーゼの調節
　CD73（Nt5eによりコードされる）およびCD39（Entpd1）は、ATP触媒経路の細胞外受容体である（図36）。両方の転写産物は、Regnase-1ΔIECマウスのIECにおいて上昇した（図37）。Regnase-1ΔIECマウスのIECにおけるCD73の発現は、対照マウスと比較して一貫して高かった（図37および図38）。Regnase-1ΔIECマウスのIECにおけるCD39の発現は、DSS投与期間中、対照マウスと比較して徐々に減少した（図37および図38）。CD39ノックアウトマウスおよびCD73ノックアウトマウスは重度の大腸炎を有するので、両者の発現は炎症性ATPシグナル伝達の枯渇によるDSS誘発大腸炎に対して保護的である（Bynoe MS, et al. (2012) J Biomed Biotechnol 2012:260983、Friedman DJ, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(39):16788-16793）。これらのエクトヌクレオチダーゼは、アデノシンによって媒介される抗炎症状態に向かうATP駆動の前炎症性免疫細胞活性をシフトさせる（Antonioli L, et al. (2013) Trends Mol Med 19(6):355-367）。Regnase-1ΔIECマウスのIECにおける細胞外レセプターの数の増加は、炎症の解消に寄与する可能性がある。
　細胞外アデノシンはP1プリン作動性受容体と相互作用する（図36）。それらの中で、アデノシンに対する最も高い親和性を有するアデノシンA1受容体（A1R、Adora1によってコードされる）の発現は、DSS大腸炎誘発後5日目および7日目のRegnase-1ΔIECマウスにおいて有意に増加したが、A2AR（Adora2a）、A2BR（Adora2b）およびA3R（Adora3）ならびに平衡ヌクレオシド輸送体ENTs、Ent1（Slc29a1）およびEnt2（Slc29a2）のレベルは、大きく変化しなかった（図38）。
　CD73、CD39およびAdora1遺伝子の全長または欠失3'UTRについてルシフェラーゼアッセイを行った（図39）。ルシフェラーゼ活性は、野生型レグナーゼ１によって有意に減少し、これらの遺伝子がレグナーゼ１の標的であることが示された。A1Rレベルの増加は、CD73と協同して、上皮バリアーの完全性および炎症の阻害を維持し、腫瘍進行を防止し得る（Bowser JL, et al. (2016) J Clin Invest 126(1):220-238）。これらのデータは、レグナーゼ１欠損が、エクトヌクレオチダーゼの発現をアップレギュレートすることによって炎症を軽減することを示している。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (9)

  1. 　レグナーゼ１阻害剤を有効成分とする炎症性腸疾患の治療用医薬。
  2. 　レグナーゼ１阻害剤が、レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質である請求項１に記載の医薬。
  3. 　レグナーゼ１の発現を阻害する物質が、レグナーゼ１の発現を阻害する核酸である請求項２に記載の医薬。
  4. 　レグナーゼ１の機能を阻害する物質が、レグナーゼ１と特異的に結合する抗体またはペプチドである請求項２に記載の医薬。
  5. 　炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である請求項１～４のいずれかに記載の医薬。
  6. 　レグナーゼ１の発現を阻害する物質またはレグナーゼ１の機能を阻害する物質を選択することを含む、炎症性腸疾患治療薬のスクリーニング方法。
  7. 　レグナーゼ１と基質ＲＮＡと被験物質を接触させる工程と、基質ＲＮＡの分解レベルを測定する工程と、該分解レベルを、被験物質を加えずにレグナーゼ１と基質ＲＮＡを接触させた際の基質ＲＮＡの分解レベルと比較し、基質ＲＮＡの分解レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　被験物質とレグナーゼ１を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のレグナーゼ１発現レベルを測定する工程と、該発現レベルを、被験物質と接触させない前記細胞におけるレグナーゼ１の発現レベルと比較し、レグナーゼ１の発現レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項６に記載の方法。
  9. 　被験物質とレグナーゼ１を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のｍＴＯＲ関連分子または細胞外ＡＴＰ受容体の発現レベルを測定する工程と、該発現レベルを、被験物質と接触させない前記細胞におけるｍＴＯＲ関連分子または細胞外ＡＴＰ受容体の発現レベルと比較し、これらの発現レベルを上昇させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項６に記載の方法。
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