KR20150131260A - 결장직장암의 치료 방법 - Google Patents

결장직장암의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서 개시되는 것은 SMAD7 발현 또는 기능의 특이적 억제제를 사용한 결장직장암의 치료 및/또는 예방 방법이다. 역시 개시되는 것은 SMAD7의 억제제를 함유하는 결장직장암 치료 및/또는 예방용 제약 조성물, 그리고 결장직장암을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 SMAD7의 억제제를 함유하는 의약의 제조이다.

Description

결장직장암의 치료 방법{METHODS OF TREATING COLORECTAL CANCER}
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 2013년 3월 15일자 U.S. 가출원 61/790,488호 및 2013년 7월 17일자 U.S. 가출원 61/847,287호의 우선권을 주장하는 바, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로써 개재된다.
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 SMAD7 억제제, 특히 SMAD7에 대하여 유도된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여를 통한 결장직장암 및 결장직장암 세포 성장의 치료 및/또는 예방 방법은 물론, 결장직장암을 치료하는데 사용하기 위한 SMAD7 억제제를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
결장직장암은 결장 또는 직장의 세포를 포함한 대장 세포의 억제되지 않는 증식을 특징으로 하는 질환이다. 결장직장암 종양은 정상 점막에서 기원하는 것으로 여겨진다. 종양생성은 증식성의 생화학적 이상을 나타내는 확대된 움(crypt) 클러스터의 출현과 연관된다. 원인이 되는 돌연변이 또는 돌연변이들을 보유하는 상피 세포의 증식이 고도 형성이상을 특징으로 하는 초기 단계 종양이 될 수 있다. 더 이상의 증식은 근육 층으로의, 그리고 장 벽을 통과하는 침습성 성장을 초래할 수 있다. 치료되지 않을 경우, 이러한 종양은 부위 림프절로 확산된 다음, 원거리 부위로 전이될 수 있는데, 그 시점에는 그것이 현재 가용한 기술을 사용하여서는 거의 치료불가능하게 된다 (문헌 [Markowitz and Bertagnolli (2009) N. Engl. J. Med. 361(25):2449-2460]). 종양이 새로 발생할 수도 있기는 하지만, 증거상 암종 중 대략 60 %가 기존의 선종에서 기원하는 것으로 표시되고 있다 (문헌 [Soreide et al., (2011) Discov . Med . 12(66):393-404]). 따라서, 거의 대부분의 결장직장암 종양은 선암종으로 분류될 수 있으나, 더 작은 하위세트의 경우로써 림프종 및 편평 세포 암종도 관찰되고 있다. 발암을 초래하는 유전적 돌연변이에는 Wnt 신호전달 경로 구성원, TGF-β 세포 신호전달 경로 구성원 예컨대 TGF-β1 및 SMAD 계열 구성원, 세포 증식과 세포 사멸 사이의 균형을 조절하는 단백질 예컨대 TP53, 및 DCC와 같은 기타 단백질들에서의 돌연변이가 포함된다 (문헌 [Reya and Clevers (2005) Nature 434(7035):843-850]; [Baker et al., (1989) Science 244:217-221]; 전기한 [Markowitz and Bertagnolli]). 비정상적인 PI3K/Akt 활성화 및 하류 mTOR 신호전달은 결장직장암 종양생성과 연관된다 (문헌 [Rychahou et al., (2006) Ann. Surg. 243(6):833-842]). 결장암 세포주에서 높은 수준의 EGFR 발현이 관찰된 바도 있는데, 결장직장암 종양 진행과 상관된다 (문헌 [Ciardiello et al., (1991) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 88(17):7792-7796]). 계열 및 유전적 인자 이외에도, 결장직장암 위험 인자에는 낮은 신체 활동 수준, 알콜 소비, 지방 및 고기의 높은 식이 섭취, 및 섬유 및 야채의 낮은 섭취가 포함될 수 있다. 결장직장암의 증상에는 통상적으로 직장 출혈, 빈혈, 변비, 대변 중 혈액, 체중 손실, 열, 식욕 상실, 및 구역 또는 구토가 포함된다.
결장직장암은 미국 남성 및 여성 암 생존자 중 두 번째로 가장 흔한 암의 형태이다 (문헌 [Siegel et al., (2012) CA Cancer J. Clin . 62(4):220-41]). 또한, 결장직장암은 서구 세계 암 사망의 가장 흔한 원인 상위 3종에 속한다 (문헌 [Soreide et al., (2011) Discov . Med . 12(66):393-404]). 더 최근의 많은 아시아 국가에서의 서구 생활양식으로의 개편 역시 해당 인구에서의 결장직장암의 상당한 증가를 초래하고 있다 (문헌 [Yang et al., (2011) Dig. Surg. 28(5-6):379-385]). 2012년 미국에는 120만명의 사람들이 결장직장암 예비 진단을 받고 살아가고 있는 것으로 추정된 바 있다. 동일한 해에, 추가 143,460명이 해당 질환으로 진단될 것으로 예상되었었다. 결장직장암 진단 연령 중앙값은 남성의 경우 68세, 여성의 경우 72세이다 (문헌 [Howlader et al., (2011) SEER Cancer Statistics Review, 1975-2008. Bethesda, MD: National Cancer Institute]). 결장직장암의 발생률이 나이든 성인에서 드물지 않은데도, 50세가 넘은 사람들 중 59.1 %만이 지침에 따른 결장직장암 검진을 받고 있다 (문헌 [American Cancer Society (2012) Cancer Prevention & Early Detection Facts & Figures. Atlanta, GA: American Cancer Society]). 이와 같은 조기 검출의 부족은 환자들 중 39 %만이 암이 국소 단계를 지나 진행되지 않은 경우로 진단되는 결과로 이어진다 (상기 문헌 [Howlader et al.]). 점증하는 결장직장암에 걸린 환자 수로 볼 때, 특히 조기 검진에 의해 확인되지 않는 많은 수의 환자들을 위한 강력한 처리 방법 개발의 필요성이 존재한다.
본원에서 기술되는 발명은 TGF-β 신호전달 경로의 핵심 길항제로서의 SMAD7의 역할을 레버리징하는(leveraging) SMAD7의 억제를 통한 신규 결장직장암 치료 방법을 제공한다. 결장직장암의 치료 개재를 위한 다른 잠재적인 표적들이 제안되어 있기는 하지만, 본 발명은 결장직장 종양 세포 성장을 예방하거나, 지연하거나, 중지시키거나, 또는 반전시키는 것으로 나타난 새로운 치료를 제공한다.
본 발명은 SMAD7을 억제하는 것에 의해 결장직장암을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 환자의 결장직장 종양에서의 SMAD7의 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SMAD7을 억제하는 것에 의해 결장직장암 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 유효량의 SMAD7 억제제의 투여를 통한 SMAD7의 억제 방법, 결장직장암의 치료 방법, 및/또는 결장직장암 세포 성장의 억제 방법을 제공한다. 예를 들면, SMAD7의 억제제는 예컨대 항-SMAD7 안티센스 치료법, 즉 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 SMAD7에 대한 항체이다. 본원에서 사용될 때, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 단백질(예컨대 SMAD7)을 코딩하고 있는 전령 RNA (mRNA)에 대하여 상보성인 짧은 합성 올리고뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 mRNA에 혼성화되어 이중-가닥 혼성체를 생성시키는데, 이는 DNA/RNA 혼성체 가닥을 분해함으로써 단백질 번역을 막는 RNase H와 같은 편재성(ubiquitary) 촉매촉진 효소의 활성화로 이어질 수 있다.
SMAD7의 억제제는 SMAD7의 특이적 억제제, 예컨대 고도의 특이성을 가지는 표적 SMAD7의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 임의의 다른 수단일 수 있다. SMAD7의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제는 본원에서 기술되는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12의 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, SMAD7의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제는 서열 5 또는 서열 9를 포함할 수 있거나, 또는 서열 6 또는 서열 10을 포함할 수 있다. 본 발명의 대표적인 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모든 포스페이트 결합이 포스포로티오에이트 결합인 서열 6의 형태로 대표되는 서열이다 (서열 10, 본원에서는 GED-0301로 지칭됨).
본원에서 사용될 때, "억제제"는 유전자, 유전자의 RNA 생성물 또는 단백질 생성물, 또는 이러한 것들의 임의의 번역 형태와의 직접적인 것 또는 간접적인 것 중 어느 하나인 상호작용을 통하여, 유전자 또는 DNA 서열의 발현을 감소시키거나, 유전자 RNA 생성물의 생성, 활성 또는 단백질로의 번역을 방지 또는 억제하거나, 또는 유전자 단백질 생성물의 활성을 방지 또는 억제할 수 있는 작용제, 또는 그의 활성 또는 발현이 예정된 표적의 활성 또는 발현에 부정적인 영향을 주는 또 다른 분자 물질을 지칭한다. 그와 같은 억제제에는 예를 들면 항체, 특정 분자 표적에 결합하는 소형 분자, 및 특정 mRNA 전사체를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본원에서 사용될 때, "SMAD7의 억제제"는 SMAD7의 유전자, RNA 생성물 또는 단백질 생성물, 또는 이러한 것들의 임의의 번역 형태와의 직접적인 것 또는 간접적인 것 중 어느 하나인 상호작용을 통하여, SMAD7의 발현을 감소시키거나, SMAD7 RNA 생성물의 생성, 활성 또는 단백질로의 번역을 방지 또는 억제하거나, 또는 SMAD7 단백질 생성물의 활성을 방지 또는 억제할 수 있는 작용제, 또는 그의 활성 또는 발현이 SMAD7의 활성 또는 발현에 부정적인 영향을 주는 또 다른 분자 물질을 지칭한다.
본 발명은 또한 SMAD7의 특이적 억제제를 투여하는 것을 통해 결장직장암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용될 때, "특이적 억제제"는 그것이 일 분자 표적에 대하여 배제적으로 또는 고도의 선택성으로 작용하는 것을 가능케 하는 구조적 및/또는 기능적 특성을 가지고 있는 작용제를 지칭한다. 따라서, SMAD7의 특이적 억제제는 SMAD7 유전자, 그의 RNA 또는 단백질 생성물, 또는 그의 활성 또는 발현이 SMAD7 또는 그의 생성물의 활성 또는 발현에 배제적인 것 또는 고도의 선택성인 것 중 어느 하나로 영향을 주는 또 다른 분자 물질을 표적으로 하는 고유의 기능적 특성을 보유한다. SMAD7의 항체 억제제의 경우, 고도의 특이성으로 SMAD7 단백질 항원결정인자에 결합하는 것으로 알려져 있는 단백질 서열의 포함을 통하여 특이성이 항체에 조작될 수 있다. SMAD7의 소형 분자 억제제의 경우, SMAD7 단백질의 특정 형상부(feature)에 결합하는 것을 가능케 하는 화학 기가 소형 분자의 제제화에 포함될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입되는 뉴클레오티드 서열 중 표적화 부분이 SMAD7 mRNA 서열에 완전히 또는 거의 완전히 상보성이 되도록 설계될 수 있다. 그와 같은 상보성이거나 거의 상보성인 뉴클레오티드 서열의 도입은 해당 표적에 대하여 고도의 특이성을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 조작하는 것을 가능케 한다. 특이성은 해리 상수와 같은 파라미터, 또는 단백질 또는 RNA 발현 수준의 변화와 같은 다른 기준의 측정, 또는 SMAD7 활성 또는 발현을 측정하는 기타 검정법들을 통하여 평가될 수 있다.
특이적 SMAD7 억제제에는 예를 들면 결장직장암을 치료하고/거나 결장직장암 세포 성장을 억제하기 위한 소형 결합 분자, 예컨대 천연 또는 합성 화합물, 항체, 압타머, 인트라머, RNAi (이중 가닥 RNA, siRNA) 및 항-SMAD7 안티센스 분자가 포함될 수 있다. SMAD7 억제제에는 또한 SMAD7 활성, 결합 파트너 또는 기질을 방해함으로써 SMAD7 기능을 억제하는 감축되고/거나 돌연변이된 SMAD7 분자가 포함될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "유효량"은 환자에게 투여되었을 때 적어도 부분적으로 이상을 치료하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 이상, 성분 투여 경로, 및 치료되는 환자의 연령, 체중 등에 따라 달라지게 된다. 따라서, SMAD7 특이적 억제제의 유효량은 작용제의 투여가 결장직장암이 대상체에서 발생하는 것을 방지하거나, 결장직장암 진행을 방지하거나 (예컨대 종양생성, 종양 성장 또는 전이와 같은 사례의 발병을 방지함), 또는 결장직장암의 모든 관련 증상들을 완화하거나 완전히 개선하도록, 즉 질환의 퇴행을 야기하도록 환자에서 결장직장암을 치료하는데 필요한 억제제의 양이다.
본 발명은 또한 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물의 투여를 통해 결장직장암을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 결장직장암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 상기 제약 조성물은 SMAD7을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 SMAD7의 억제제, 및 제약상 허용되는 담체로 구성될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "제약 조성물"이라는 용어는 예를 들면 결장직장암을 치료하기 위하여 포유동물 예컨대 인간에 투여될 제약상 허용되는 담체 중에 특정 양의 치료용 화합물, 예컨대 치료적 유효량의 치료용 화합물을 함유하는 혼합물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 것은 고려되는 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의, 결장직장암을 치료하기 위한 의약 제조에서의 용도에 대해 개시한다. 본원에서 사용될 때, "약제"는 "제약 조성물"이라는 용어와 본질적으로 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용될 때, "제약상 허용되는 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 부합하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 상기 담체(들)는 제제 중 다른 성분들과 상용성이며 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용성"이어야 한다. 제약상 허용되는 담체에는 제약적 투여에 부합하는 완충제, 용매, 분산 매체, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 제약 활성 물질을 위한 이와 같은 매체 및 작용제들의 사용에 대해서는 업계에 알려져 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 경구로 투여되며, 소화기 계통 또는 장 내에서 캡슐화된 물질의 흡수 부위를 조절하는데 적합한 장용 코팅을 포함한다. 예를 들면, 장용 코팅에는 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체가 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 고려되는 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 임의의 제약 조성물은 경구, 국소, 비경구, 예컨대 피하 주사, 흡입 분무 또는 직장을 포함한 한 가지 또는 몇 가지 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때의 비경구라는 용어에는 피하 주사, 췌장내 투여, 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내 주사 또는 주입 기술이 포함된다. 예를 들면, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 피하로 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 경구로 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비경구 투여를 통하여 직접 결장직장 종양 또는 결장직장암 세포에 투여될 수 있다.
도 1 (A)는 산발성 결장직장암에 걸린 환자의 비-종양 (NT) 및 종양 (T) 영역 (각각 중간 및 우측 패널)에서의 IgG 동형 대조 (동형, 좌측 패널) 및 SMAD7 면역염색을 나타내며; 도 1 (B)는 산발성 결장직장암에 걸린 2명의 환자로부터의 NT 및 T 조직에서의 SMAD7 및 β-액틴 농도를 나타내는 웨스턴 블롯 (좌측 패널), 그리고 SMAD7 웨스턴 블롯 신호의 농도측정 분석 (우측 패널)이고; 도 1 (C)는 IEC 및 DLD-1 및 HCT-116 세포에서의 SMAD7 및 β-액틴 농도를 나타내는 웨스턴 블롯이며; 도 1 (D)는 HCT-116 (좌측) 및 DLD-1 세포 (우측)에서의 FITC-접합 IgG 동형 대조 (동형) 및 SMAD7 항체 신호의 FACS 분석을 나타내고; 도 1 (E)는 4종의 결장직장암 세포주 (HCT-116, HCT-115, HT-29 및 DLD-1) 및 1종의 간세포 암종 세포주 (HepG2)에서의 SMAD7 및 β-액틴의 발현 농도를 나타내는 웨스턴 블롯 (좌측 패널), 그리고 동일 블롯으로부터의 SMAD7 웨스턴 블롯 신호의 농도측정 분석 (우측 패널)이다.
도 2 (A)는 총 세포 수를 도시하는 일련의 점도표로써, 비표지 SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드 또는 점증 투여량의 FITC-접합 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 GED-0301 (GED-0301 FITC-접합) 중 어느 하나를 사용하여 형질감염된 프로피듐 요오다이드 (PI)- 및 형광 (FITC)-양성 HCT-116 세포의 백분율을 나타내며; 도 2 (B)는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용한 형질감염 후 HCT-116 세포에서의 SMAD7 및 β-액틴 농도를 나타내는 웨스턴 블롯이고; 도 2 (C)는 미처리 (Untr), 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용한 형질감염 후의 증식성 HCT-116 (흑색 막대) 또는 DLD-1 (백색 막대) 세포의 %을 나타내는 그래프 (좌측), 및 SMAD7 센스 (상단) 또는 GED-0301 (하단) 올리고뉴클레오티드를 사용한 형질감염 후의 증식성 HCT-116 세포의 %를 나타내는 히스토그램을 도시하며; 도 2 (D)는 미처리 (Untr), 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용한 형질감염 후의 상이한 세포 주기 단계에 있는 HCT-116 세포들의 %를 나타내는 그래프이고; 도 2 (E)는 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염되고 미처리로 유지되거나 과량의 TGF-β 단백질 (TGF-β) 또는 TGF-β 항체 (항-TGF-β)에 노출된 증식성 HCT-116 세포의 %를 나타낸다.
도 3 (A)는 미처리 (Untr), 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용한 형질감염 후 24시간 (상단) 또는 48시간 (하단)에서의 HCT-116 세포 사멸의 %를 도시하는 그래프, 그리고 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 형질감염 후의 PI 및 아넥신 V (AV) 염색을 도시하는 점도표 (하단)를 나타내며; 도 4 (B)는 미처리 (Untr), 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드의 형질감염 후 상이한 시점에서의 HCT-116 세포에서의 활성 카스파제-3을 정량하는 일련의 점도포를 나타내고; 도 4 (C)는 미처리, 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용한 형질감염 후의 활성 카스파제-3을 보유하는 N-(2-퀴놀릴)발릴-아스파르틸-(2,6-디플루오로페녹시)메틸 케톤 (Q-VD-OPH)에 노출된 세포의 %를 나타내는 그래프이며; 도 4 (D)는 Q-VD-OPH에 노출된 다음 미처리, 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용한 형질감염에 노출된 세포에서의 세포 사멸 %를 나타내는 그래프이고; 도 4 (E)는 Q-VD-OPH에 노출된 후 이어서 미처리, 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용한 형질감염 중 어느 하나에 노출된 증식성 세포의 %를 나타내는 그래프이다.
도 4 (A)는 형질감염되지 않거나 (Untr), 또는 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 후 인산화된 CDK2 (p-CDK2 (Thr-14/Tyr-15)), CDK2, 시클린 A 및 β-액틴에 대하여 탐색된 세포로부터의 HCT-116 세포 추출물의 웨스턴 블롯을 나타내며; 도 4 (B)는 형질감염되지 않거나 (Untr), 또는 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 후 CDC25A, CDC25B 및 CDC25C에 대하여 탐색된 세포로부터의 HCT-116 세포 추출물의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 4 (C)는 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 HCT-116 세포에서의 상이한 시점에서의 CDC25A mRNA 발현의 정량을 나타내며; 도 4 (D)는 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염되고 프로테아솜 억제제인 MG115 및 MG132에 노출된 후 CDC25A 또는 β-액틴에 대하여 탐색된 세포로부터의 세포 추출물의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 4 (E)는 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 후 상이한 시점에서 인산화된 EiF2α (p-EiF2α (Ser51)), 총 EiF2α, CDC25A, 시클린 A 및 β-액틴에 대하여 탐색된 세포로부터의 세포 추출물의 웨스턴 블롯이며; 도 4 (F)는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 또는 살루브리날에의 노출 후 p-EiF2α (Ser51), EiF2α, CDC25A 및 β-액틴에 대하여 탐색된 HCT-116 세포 추출물의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 4 (G)는 SMAD7 항체를 사용하여 면역침전된 후 단백질 포스파타제 1 (상단 패널), EiF2α (중간 패널) 또는 SMAD7 항체를 사용하여 탐색된, HCT-116 세포 추출물 (좌측 패널) 또는 원발성 결장직장암 세포 (우측 패널)로부터 작성된 웨스턴 블롯을 나타내며; 도 4 (H)는 PP1 또는 EiF2α 항체 면역침전 중 어느 하나에 적용된 후 대항 항체를 사용하여 탐색된, SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 세포로부터의 HCT-116 세포 추출물의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 5 (A)는 아족시메탄 및 덱스트란 술페이트 나트륨 (AOM+DSS) 처리 후 마우스로부터의 비-종양 또는 종양 조직에서의 SMAD7 면역염색을 나타내며, 도 5 (B)는 AOM+DSS 처리 후 마우스로부터의 비-종양 및 종양 조직에서의 상대적 SMAD7 mRNA 발현을 나타내는 그래프이다.
도 6 (A)는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용하여 형질감염된 결장직장암 조직 체외이식편의 헤마토크실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 증식성 세포 핵 항원 (PCNA) 면역염색을 나타내며; 도 6 (B)는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용하여 형질감염된 인간 결장직장암 조직 체외이식편의 SMAD7, PCNA, 시클린 A, p-EiF2α (Ser51) 및 CDC25A 면역염색을 나타낸다.
도 7 (A)는 HCT-116-집락형성 Rag1-/- 마우스에 주사된 후 PBS (CTR) 또는 FITC-접합 GED-0301 중 어느 하나의 단일 주사에 노출된 HCT-116-유래 이종이식편에서의 FITC 신호의 분포를 나타내며; 도 7 (B)는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나에 노출된 HCT-116-유래 이종이식편의 단백질 추출물에서의 SMAD7 및 β-액틴 발현을 나타내는 웨스턴 블롯이고; 도 7 (C)는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용하여 처리된 마우스로부터 유래하는 이종이식편의 종양 부피를 정량하는 그래프 (좌측), 및 동일 실험으로부터의 이종이식편의 대표적인 사진이며; 도 7 (D)는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용하여 처리된 이종이식편의 SMAD7, PCNA 및 시클린 A 면역염색을 나타낸다.
도 8 (A)는 AOM에 노출된 후 이어서 SMAD7 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 Apc (Min/+) 마우스로부터의 내시경 영상 (좌측 패널)은 물론, 종양 수 및 종양 점수의 내시경 분석 (그래프, 우측), 그리고 Apc (Min/+) 마우스의 결장 절편으로부터의 H&E 염색 (중간 패널)을 나타내며; 도 8 (B)-(F)는 각각 SMAD7, PCNA, 시클린 A, CDC25A 및 p-EiF2α (Ser51)에 대하여 면역염색된, SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 마우스로부터의 종양 (T) 및 비종양 (NT) 조직 절편을 나타내고; 도 8 (G)는 Apc (Min/+) 마우스에서의 장 조직에의 FITC-접합 안티센스 올리고뉴클레오티드의 국소화를 나타낸다.
결장직장암
본 발명은 결장직장암의 치료 방법을 제공한다. 본원에서 사용될 때, "결장직장암"은 결장 또는 직장의 세포를 포함하는 대장 세포의 억제되지 않는 증식을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 결장직장암은 통상적으로 대장의 상피 세포에서 기원하는데, 장 움 줄기 세포가 기원 세포일 가능성이 있다. 발암을 초래하는 유전적 돌연변이에는 Wnt 신호전달 경로 구성원 예컨대 β-카테닌, APC, AXIN1, AXIN2, TCF7L2 및 NKD1, TGF-β 세포 신호전달 경로 구성원 예컨대 TGF-β1 및 SMAD 계열 구성원, 세포 증식과 세포 사멸 사이의 균형을 조절하는 단백질 예컨대 TP53, 및 DCC와 같은 기타 단백질들에서의 돌연변이가 포함된다. 원인이 되는 돌연변이 또는 돌연변이들을 보유하는 상피 세포의 증식이 근육 층으로의, 그리고 장 벽을 통과하는 침습성 성장을 초래할 수 있다. 결장직장암의 증상에는 통상적으로 직장 출혈, 빈혈, 변비, 대변 중 혈액, 체중 손실, 열, 식욕 상실, 및 구역 또는 구토가 포함된다. 거의 대부분의 결장직장암 종양은 선암종으로 분류될 수 있지만, 더 작은 하위세트의 경우로써 림프종 및 편평 세포 암종이 관찰되고 있다. 따라서, 본원에서 사용될 때, "결장직장 종양"이라는 용어는 대장암 또는 결장직장암 병리에서 기원하는 세포와 연관되어 있는 조직의 임의의 비정상적인 악성 성장을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "결장직장암 세포"라는 용어는 결장직장암 또는 결장직장 종양을 발생시키는 임의의 기원 세포, 결장직장 종양의 종양생성, 성장, 진화, 유지 또는 지지와 연관되어 있는 세포, 또는 결장직장암의 병리학적 소견과 연관되는 임의의 기타 세포를 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "결장직장암 세포의 성장"은 결장직장암 기원 세포, 졀장직장 종양 세포, 또는 결장직장암 병리의 소견과 연관되는 임의의 세포와 연관되어 있는 세포들의 억제되지 않거나 비정상적인 증식을 지칭한다. 결장직장암 세포의 증식은 비정상적인 세포 주기 활성, 세포 주기 체크포인트(checkpoint) 유도의 실패, 세포자멸사 유도의 실패, 또는 기타 종양 억제인자 활성 상실의 결과일 수 있다.
치료 및 평가
"치료하다", "치료", "치료하는" 등의 용어는 본원에서 일반적으로 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하는데 사용된다. 상기 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/거나, 질환 및/또는 질환에 기인하는 부정적인 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용될 때의 "치료"라는 용어는 동물, 특히 인간에서의 임의의 질환 치료를 포괄하는데, 하기가 포함된다: (a) 질환 소인이 있을 수 있으나 아직 거기에 걸린 것으로 진단되지는 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발달을 중지시키는 것; 또는 (c) 질환을 완화하는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것.
치료의 효능은 결장직장암과 연관된 육안 증상들의 평가, 조직 조직학의 분석, 생화학적 검정, 영상화 방법 예를 들자면 자기 공명 영상화, 또는 기타 공지의 방법들에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료의 효능은 결장직장암 환자에 대한 SMAD7 억제제의 투여 후, 빈혈 상태, 직장 출혈, 종양 크기, 또는 결장직장암과 연관되어 있는 육안 병리의 기타 측면들을 분석하는 것에 의해 평가될 수 있다. 치료의 효능은 또한 예를 들면 조직 또는 종양 생검물을 수득하는 것, 및 육안 조직 또는 세포 형태구조 또는 염색 특성을 평가하는 것에 의해 조직 또는 세포 수준에서 평가될 수 있다. 단백질 또는 RNA 발현을 조사하는 생화학적 검정법들이 치료의 효능을 평가하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 면역세포화학, 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯팅 방법을 통하면, PCNA, p-CDK2 (Thr-14/Tyr-15), 또는 분리 세포 또는 비-분리 조직에서의 세포 증식 또는 세포 사멸 활성을 표시해주는 또 다른 단백질의 농도를 평가할 수 있다. 암 진행 및 치료의 효능을 평가하기 위하여 혈장 또는 종양 또는 비-종양 조직에서 발견되는 유용한 바이오마커들의 존재 또는 발현 수준을 평가할 수도 있다.
치료의 효능을 평가할 시, 유효한 평가를 보장하기 위하여, 적합한 대조가 선택될 수 있다. 예를 들면, SMAD7 억제제의 투여 후 결장직장암에 걸린 환자에서 평가된 증상을 치료 전의 동일 환자 또는 결장직장암에 걸린 것으로 진단되지 않은 또 다른 환자에서의 해당 증상과 비교할 수 있다. 대안적으로, SMAD7 억제제의 투여 후 종양 조직의 생화학적 또는 조직학적 분석의 결과를 동일 환자 또는 결장직장암에 걸린 것으로 진단되지 않은 개체 또는 SMAD7 억제제 투여 전의 동일 환자로부터의 비-종양 조직의 것과 비교할 수 있다.
SMAD7 억제의 유효성은 SMAD7 발현 수준 또는 활성의 직접적이거나 간접적인 평가에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, SMAD7 단백질 또는 RNA 발현을 측정하는 생화학적 검정법들이 전체적인 SMAD7 억제를 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 전체 SMAD7 농도를 평가하기 위하여 웨스턴 블롯에 의해 종양 조직에서 SMAD7 단백질 농도를 측정할 수 있다. 또한, 노던 블롯 또는 정량 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 SMAD7 mRNA 농도를 측정함으로써, 전체적인 SMAD7 억제를 확인할 수 있다. 면역세포화학적 또는 면역조직화학적 방법을 통하여, 분리된 세포 또는 비-분리 조직에서 SMAD7 단백질 농도, 또는 SMAD7 활성을 표시해주는 또 다른 단백질의 농도를 평가할 수도 있다. SMAD7 억제는 또한 세포 주기 단계 분포와 같은 파라미터를 측정하는 것, 아넥신 V 또는 카스파제 III과 같은 세포 사멸의 마커를 사용하여 염색하는 것, 또는 SMAD7 활성의 변화와 상관되는 다른 파라미터들의 변경을 측정하는 것에 의해 간접적으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 해당 세포에서의 SMAD7 활성의 지표로서, SMAD7 억제제로 치료된 종양의 세포에서 활성 카스파제-3의 농도를 측정할 수 있다. SMAD7 억제의 효능을 평가하기 위하여 혈장 또는 종양 또는 비-종양 조직에서 발견되는 유용한 바이오마커들의 존재 또는 발현 수준을 평가할 수도 있다.
SMAD7 녹다운(knockdown)의 효능을 평가할 시, 유효한 평가를 보장하기 위하여, 적합한 대조가 선택될 수 있다. 예를 들면, SMAD7 억제제의 투여 후 종양 조직의 생화학적 또는 조직학적 분석의 결과를 동일 환자 또는 결장직장암에 걸린 것으로 진단되지 않은 개체 또는 SMAD7 억제제 투여 전의 동일 환자로부터의 비-종양 조직의 것과 비교할 수 있다.
본원에서 기술될 때, "환자"는 결장직장암의 위험성이 있거나 그것에 걸려 있는, 비제한적으로 포유동물, 영장류 및 인간을 포함한 임의의 동물을 지칭한다. 예를 들면, 환자는 높은 결장직장암 발생 위험성을 가지고 있는 것으로 진단된 개체, 또는 결장직장암에 걸린 것으로 진단된 누군가일 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자는 예를 들면 고양이, 개 또는 말과 같은 비-인간 동물일 수 있다.
SMAD7의 억제제
특정 실시양태에서, 항-SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 SMAD7 mRNA의 부위 403, 233, 294, 295, 296, 298, 299 및/또는 533 (즉 각각 뉴클레오티드 403, 233, 294, 295, 296, 298, 299 및 533)을 표적으로 할 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 항-SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 SMAD7 mRNA의 핵산 403-423을 표적으로 한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 항-SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드
Figure pct00001
(서열 3)로부터 유래할 수 있다.
본원에서는, SMAD7을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 CpG 쌍의 시토신 잔기가 5'-메틸시토신 (약어로 Me-dC)으로 대체된 혼합-백본을 포함할 수 있을 것으로 생각한다. 메틸포스포네이트 연결은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단에도 위치될 수 있다 (약어로 MeP). 고려되는 항-SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드의 포스페이트 백본은 임의적으로 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수도 있다 (예컨대 포스포로티오에이트 결합이 포스포디에스테르 결합을 대체하게 됨). 한 실시양태에서는, 모든 포스페이트 결합이 포스포로티오에이트 결합일 수 있다.
SMAD7을 표적으로 하는 대표적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료법에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
Figure pct00002
(서열 4)로써, 여기에서 X는 시토신 및 5-메틸시토신 또는 2'-O-메틸시토신 뉴클레오시드로 이루어진 군에서 선택되는 질소성 염기를 포함하는 뉴클레오티드이며, Y는 구아닌 및 5-메틸구아닌 또는 2'-O-메틸구아닌 뉴클레오시드로 이루어진 군에서 선택되는 질소성 염기를 포함하는 뉴클레오티드이되, 단 뉴클레오티드 X 또는 Y 중 하나 이상은 메틸화된 질소성 염기를 포함함;
Figure pct00003
(서열 5)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트임;
Figure pct00004
(서열 6)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트임;
Figure pct00005
(서열 7)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트이며, Z는 2'-데옥시구아노신 메틸포스포네이트임;
Figure pct00006
(서열 8)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트이며, Z는 2'-데옥시구아노신 메틸포스포네이트임.
구체적인 실시양태에서, 고려되는 SMAD7 안티센스는 하기 중 하나를 포함하는 서열일 수 있다:
Figure pct00007
(서열 9)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스포로티오에이트임;
Figure pct00008
(서열 10)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스포로티오에이트임;
Figure pct00009
(서열 11)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트이며, Z는 2'-데옥시구아노신 메틸티오포스포네이트임;
Figure pct00010
(서열 12)로써, 여기에서 X는 5-메틸 2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트이며, Z는 2'-데옥시구아노신 메틸티오포스포네이트임.
예를 들면, 서열 9-12는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 한 실시양태에서는, 서열 9-12의 모든 O,O 포스포네이트 결합이 포스포로티오에이트 결합이다.
제약 조성물 및 투여 경로
본원에서 개시되는 것들과 같은 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 제약 조성물은 투약 단위 형태로 제공될 수 있으며, 어떠한 적합한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 예정된 투여 경로에 부합하도록 제제화되어야 한다. 유용한 제제는 제약 업계에 잘 알려져 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]을 참조하라.
제약 제제는 바람직하게는 멸균된 것이다. 멸균은 예를 들면 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 필터 멸균이 수행될 수 있다.
비경구 투여
본 발명의 제약 조성물은 비경구 투여용으로 제제화될 수 있는데, 예를 들면 정맥내, 근육내, 피하, 병변내 또는 복강내 경로를 통한 주사용으로 제제화될 수 있다. SMAD7 억제제를 함유하는 수성 제약 조성물과 같은 수성 조성물의 제조에 대해서는 본 개시에 비추어 통상의 기술자가 알 수 있을 것이다. 통상적으로, 그와 같은 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액 중 어느 하나로서 제조될 수 있으며; 주사 전에 액체의 첨가에 의해 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적합한 고체 형태가 제조될 수도 있고; 제제가 에멀션화될 수도 있다.
주사가능 용도에 적합한 제약 형태에는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일, 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사가능 용액 또는 현탁액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에서, 상기 형태들은 멸균된 것이어야 하며, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도까지 유동성이어야 한다. 그것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 제약상 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 수중에서 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 그리고 오일 중에서 제조될 수 있다. 또한, 멸균 고정된 오일이 용매 또는 현탁 매체로 사용될 수 있다. 이와 같은 목적으로는, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 무자극 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능제의 제조에 사용될 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 또한 비독성의 비경구용으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능 용액, 현탁액 또는 에멀션, 예를 들면 1,3-부탄디올 중 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능 비히클 및 용매로는 물, 링거 용액, U.S.P., 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액이 있다. 한 실시양태에서, SMAD7 억제제는 1 % (w/v) 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및 0.1 % (v/v) 트윈(TWEEN)™80을 포함하는 담체 유체 중에 현탁될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건하에서, 이러한 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
주사가능 제제, 예를 들면 멸균 주사가능 수성 또는 유질 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지의 기술에 따라 제제화될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매체 및 상기에서 열거한 것들에 속하는 기타 필요 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분들을 도입하는 것에 의해 제조된다. 본 발명의 멸균 주사가능 용액은 필요에 따라 상기에서 열거한 다양한 기타 성분들과 함께 SMAD7 억제제를 필요한 양의 적절한 용매에 도입한 후 이어지는 여과 멸균에 의해 제조될 수 있다. 멸균 주사가능 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균-여과된 해당 용액으로부터 활성 성분 더하기 임의의 추가적인 필요 성분의 분말을 산출하는 진공-건조 및 냉동-건조 기술이다. 주사가능 제제는 예를 들면 세균-저지 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
근육내 주사를 위한 더 농축되거나 고도로 농축된 용액의 제조 역시 고려된다. 이와 관련하여서는, 용매로서의 DMSO의 사용이 바람직한데, 이것이 작은 면적에 고농도의 SMAD7 억제제를 전달하는 극히 빠른 침투를 초래하게 되기 때문이다.
그와 같은 용액에서 사용하기에 적합한 보존제에는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살 등이 포함된다. 적합한 완충제에는 약 pH 6 내지 pH 8 사이, 바람직하게는 약 pH 7 내지 pH 7.5 사이로 pH를 유지하기에 충분한 양의 붕산, 나트륨 및 칼륨 비카르보네이트, 나트륨 및 칼륨 보레이트, 나트륨 및 칼륨 10 카르보네이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 비포스페이트 등이 포함된다. 적합한 장성 작용제는 안과 용액의 나트륨 클로라이드 당량이 0.9±0.2 % 범위가 되게 하는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로스, 글리세린, 칼륨 클로라이드, 프로필렌 글리콜, 나트륨 클로라이드 등이다. 적합한 항산화제 및 안정화제에는 나트륨 비술파이트, 나트륨 메타비술파이트, 나트륨 티오술파이트, 티오우레아 등이 포함된다. 적합한 습윤제 및 청정제에는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴이 포함된다. 적합한 점도-증가제에는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시메틸프로필셀룰로스, 라놀린, 메틸세룰로스, 바셀린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 등이 포함된다.
대표적인 실시양태에서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 피하 투여를 위한 제약 조성물은 서열 6으로 표시되는 것과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예컨대 나트륨염), 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
경구 투여
일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 것은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 전달에 적합한 조성물, 예를 들면 조성물이 안티센스 화합물을 예컨대 환자의 결장에 전달할 수 있도록 장용 코팅, 예컨대 위-내성 코팅을 포함하는 정제이다. 예를 들면, 이와 같은 투여는 직접 환자의 결장 부분에 영향을 주도록 안티센스 화합물을 실질적으로 국소적으로 적용하는 국소적 효과를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 투여는 안티센스 화합물의 원치 않는 전신 흡수를 실질적으로 회피할 수 있다.
예를 들면, 개시 안티센스 화합물, 예컨대 GED-0301 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 과립을 포함하는 (예컨대 적어도 부분적으로 과립으로부터 형성됨) 경구 투여용 정제가 제공된다. 그와 같은 정제는 장용 코팅에 의해 코팅될 수 있다. 고려되는 정제는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 충전재, 바인더, 붕해제 및/또는 윤활제는 물론, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 예컨대 윈터그린, 오렌지, 크실리톨, 소르비톨, 프럭토스 및 말토덱스트린, 및 가향제, 보존제 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제약 제제는 고려되는 안티센스 화합물, 예컨대 GED-0301 또는 제약상 허용되는 염, 예를 들면 GED-0301 및 제약상 허용되는 충전재를 포함하는 과립내 상(intragranular phase)을 포함한다. 예를 들면, GED-0301 및 충전재가 임의적으로 다른 부형제들과 함께 블렌딩되어 과립으로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 과립내 상은 습윤 과립화를 사용하여 형성될 수 있는데, 예를 들면 액체 (예컨대 물)가 블렌딩된 안티센스 화합물 및 충전재에 첨가된 다음, 조합이 건조, 제분 및/또는 체질됨으로써 과립을 생성시킨다. 통상의 기술자라면, 다른 공정들이 과립내 상을 달성하는데 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제는 과립-외 상(extra-granular phase)을 포함하는데, 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제가 여기에 포함될 수 있으며, 과립내 상과 블렌딩되어 개시되는 제제를 형성할 수 있다.
개시되는 제제는 충전재를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다. 대표적인 충전재에는 셀룰로스, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 미세결정질 셀룰로스, 펙틴, 폴리아크릴레이트, 덱스트로스, 셀룰로스 아세테이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 부분적으로 예비호화된 전분, 칼슘 카르보네이트, 및 이들의 조합을 포함한 기타가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 개시되는 제제는 일반적으로 제약 제제의 성분들을 함께 유지하는 기능을 할 수 있는 바인더를 포함하는 과립내 상 및/또는 과립외 상을 포함할 수 있다. 본 발명의 대표적인 바인더에는 하기가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 전분, 당, 셀룰로스 또는 개질 셀룰로스 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 락토스, 예비호화 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 저치환 히드록시프로필 셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 당 알콜, 및 이들의 조합을 포함한 기타.
예를 들면 과립내 상 및/또는 과립외 상을 포함하는 고려되는 제제는 붕해제 예컨대 비제한적으로 전분, 셀룰로스, 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 알기네이트, 옥수수 전분, 크로스멜로스 나트륨, 가교결합 카르복시메틸 셀룰로스, 저치환 히드록시프로필 셀룰로스, 아카시아, 및 이들의 조합을 포함한 기타를 포함할 수 있다. 예를 들면, 과립내 상 및/또는 과립외 상이 붕해제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제는 개시되는 안티센스 화합물, 및 만니톨, 미세결정질 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 및 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 이들의 조합에서 선택되는 부형제를 포함하는 과립-내 상; 그리고 미세결정질 셀룰로스, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 마그네슘 스테아레이트 또는 이들의 혼합물 중 1종 이상을 포함하는 과립-외 상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제는 윤활제를 포함할 수 있는데, 예를 들면 과립-외 상이 윤활제를 함유할 수 있다. 윤활제에는 활석, 실리카, 지방, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 포스페이트, 이산화 실리콘, 칼슘 실리케이트, 칼슘 포스페이트, 콜로이드성 이산화 규소, 금속 스테아레이트, 수소화 식물성 오일, 옥수수 전분, 나트륨 벤조에이트, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 아세테이트, 칼슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 나트륨 클로라이드, 마그네슘 라우릴 술페이트, 활석 및 스테아르산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 제약 제제는 장용 코팅을 포함한다. 일반적으로, 장용 코팅은 경구 의약에 대한 장벽을 생성시킴으로써, 약물이 소화관을 따라 흡수될 위치를 조절한다. 장용 코팅은 pH에 따라 상이한 속도로 붕해되는 중합체를 포함할 수 있다. 장용 코팅은 예를 들면 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체 유형 C, 폴리비닐 아세테이트-프탈레이트 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함할 수 있다.
대표적인 장용 코팅에는 오파드리(Opadry)® AMB, 아크릴(Acryl)-EZE®, 유드라지트(Eudragit)® 등급이 포함된다. 일부 실시양태에서, 장용 코팅은 중량 기준 고려되는 정제의 약 5 % 내지 약 10 %, 약 5 % 내지 약 20 %, 8 내지 약 15 %, 약 8 % 내지 약 18 %, 약 10 % 내지 약 12 % 또는 약 12 내지 약 16 %를 구성할 수 있다. 예를 들면, 장용 코팅은 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함할 수 있다.
예를 들면, 중량 기준 약 0.5 % 내지 약 70 %, 예컨대 약 0.5 % 내지 약 10 % 또는 약 1 % 내지 약 20 %의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예컨대 GED-0301)을 포함하거나 본질적으로 그것으로 이루어진 정제가 제공된다. 그와 같은 정제는 예를 들면 중량 기준 약 0.5 % 내지 약 60 %의 만니톨, 예컨대 중량 기준 약 30 % 내지 약 50 %의 만니톨, 예컨대 중량 기준 약 40 %의 만니톨; 및/또는 중량 기준 약 20 % 내지 약 40 %의 미세결정질 셀룰로스, 또는 중량 기준 약 10 % 내지 약 30 %의 미세결정질 셀룰로스를 포함할 수 있다. 예를 들면, 개시되는 정제는 중량 기준 약 30 % 내지 약 60 %, 예컨대 약 45 % 내지 약 65 %, 아니면 중량 기준 약 5 내지 약 10 %의 GED-0301, 중량 기준 약 30 % 내지 약 50 %, 아니면 약 5 % 내지 약 15 %의 만니톨, 약 5 % 내지 약 15 %의 미세결정질 셀룰로스, 약 0 % 내지 약 4 % 또는 약 1 % 내지 약 7 %의 히드록시프로필메틸셀룰로스, 및 중량 기준 약 0 % 내지 약 4 %, 예컨대 약 2 % 내지 약 4 %의 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 투여용 제약 정제 제제는 과립-내 상을 포함하며, 하기 과립-내 상은 GED-0301과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예컨대 나트륨염), 및 제약상 허용되는 충전재를 포함하는데, 그것은 붕해제와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있는 과립-외 상을 포함할 수도 있다. 상기 과립-외 상은 미세결정질 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트 및 이들의 혼합물에서 선택되는 성분을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 중량 기준 정제의 약 12 % 내지 16 %인 장용 코팅을 포함할 수 있다. 예를 들면, 경구 용도의 제약상 허용되는 정제는 중량 기준 약 5 % 내지 10 %의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 GED-0301 또는 그의 제약상 허용되는 염, 중량 기준 약 30 % 내지 50 %의 만니톨, 중량 기준 약 10 % 내지 30 %의 미세결정질 셀룰로스, 및 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 경구 용도의 제약상 허용되는 정제는 중량 기준 약 5 내지 약 10 %의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 GED-0301 또는 그의 제약상 허용되는 염, 중량 기준 약 40 %의 만니톨, 중량 기준 약 8 %의 미세결정질 셀룰로스, 중량 기준 약 5 %의 히드로프로필메틸 셀룰로스, 및 중량 기준 약 2 %의 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립-내 상; 중량 기준 약 17 %의 미세결정질 셀룰로스, 중량 기준 약 2 %의 나트륨 전분 글리콜레이트, 중량 기준 약 0.4 %의 마그네슘 스테아레이트를 포함하는 과립-외 상; 및 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 정제상의 장용 코팅을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 중량 기준 약 13 % 또는 약 15 %, 16 %, 17 % 또는 18 %의 예컨대 아크릴EZE® (예컨대 그 전체가 의거 참조로써 개재되는 PCT 공개 제WO2010/054826호 참조)를 포함하는 장용 코팅을 함유할 수 있다.
어느 시점에 코팅이 용해되어 활성 성분이 방출되는 속도가 그의 용해 속도이다. 한 실시양태에서, 예컨대 USP/EP 유형 2 장치 (패들)에서 7.2의 pH를 가지는 포스페이트 완충제 중 100 rpm 및 37 ℃로 시험하였을 때, 고려되는 정제는 약 120분 내지 약 240분 후에, 예를 들면 180분 후에 올리고뉴클레오티드 중 약 50 % 내지 약 100 %가 방출되는 용해 프로파일을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예컨대 USP/EP 유형 2 장치 (패들)에서 1.0의 pH를 가지는 희석된 HCl 중 100 rpm 및 37 ℃로 시험하였을 때, 고려되는 정제는 120분 후에 실질적으로 어떠한 올리고뉴클레오티드도 방출되지 않는 용해 프로파일을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예컨대 USP/EP 유형 2 장치 (패들)에서 6.6의 pH를 가지는 포스페이트 완충제 중 100 rpm 및 37 ℃로 시험하였을 때, 고려되는 정제는 30분 후에 올리고뉴클레오티드 중 약 10 % 내지 약 30 %, 또는 약 50 % 이하가 방출되는 용해 프로파일을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시되는 제제 예컨대 정제는 경구로 환자에게 투여되었을 때 환자에서 최소한의 올리고뉴클레오티드 혈장 농도를 초래할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시되는 제제는 경구로 환자에게 투여되었을 때 환자의 결장 또는 직장, 예컨대 영향을 받거나 질환에 걸린 환자의 부위에 국소적으로 전달된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 추가적으로 본원에서 개시되는 질환 및 장애의 치료를 위한 것인 1종 이상의 다른 작용제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 고려되는 다른 작용제는 (예컨대 순착적으로 또는 동시에) 공동-투여될 수 있다.
고려되는 작용제에는 글루코코르티코이드, 세포증식억제제, 항체, 이뮤노필린에 작용하는 작용제, 인터페론, 아편유사제, TNF 결합 단백질, 미코페놀레이트 및 소형 생물학 작용제를 포함한 면역억제제가 포함된다. 예를 들면, 고려되는 면역억제제에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 타크롤리무스, 시클로스포린, 피메크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 미코페놀산, 핑골리모드, 덱사메타손, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 레플루노미드, 테리플루노미드, 아나킨라, 항-흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 무로모납-CD3, 아푸투주맙, 리툭시맙, 테플리주맙, 에팔리주맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 아달리무맙, 인플릭시맙 및 에타너셉트.
투약량 및 투여 빈도
대표적인 제제에는 약 35 mg 내지 약 500 mg의 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 본질적으로 그것으로 이루어진 투약 형태가 포함된다. 예를 들면, 본원에서는 약 35 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg 또는 250 mg의 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제제가 고려된다. 한 실시양태에서, 제제는 약 40 mg, 80 mg 또는 160 mg의 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 100 ㎍ 이상의 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제제는 약 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg 또는 25 mg의 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 투여되는 양은 치료될 질환 또는 징후의 유형 및 정도, 환자의 전체적인 건강 및 크기, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능, 제약 제제 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라지게 된다. 원하는 혈중-농도 또는 조직 농도를 빠르게 달성하기 위해서는, 개시 투약량이 상위 수준을 넘어 증가될 수 있다. 대안적으로, 개시 투약량은 최적에 비해 더 작을 수 있으며, 치료 과정에서 투약량이 점차적으로 증가될 수도 있다. 인간 투약량은 예컨대 40 mg 내지 160 mg으로 전개하도록 설계되어 있는 통상적인 단계 I 투여량 점증 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투약량 및 치료될 질환과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 대표적인 투여 빈도는 일 당 1회, 주 당 1회, 및 2주마다 1회이다. 일부 실시양태에서, 투여는 7일 동안 일 당 1회이다.
[ 실시예 ]
하기의 실시예로써 본 발명을 추가 예시한다. 실시예는 예시 목적으로만 제공되는 것으로써, 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역 또는 내용을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니된다.
실시예 1: 결장직장암 세포에서의 SMAD7 단백질 발현 수준
결장직장암에 대한 결장 절제술을 받는 6명의 환자로부터 채취된 쌍을 이룬 결장직장암 종양 및 비-종양 결장 점막 시편에서, SMAD7 단백질 발현 수준을 평가하였다. 종양 (T) 및 비-종양 (NT) 조직의 SMAD7 면역염색은 비-종양 조직에 비교하였을 때의 종양에서의 현저한 SMAD7 단백질 축적을 나타내었는데, 결장직장암 절편이 IgG 동형 대조와 함께 인큐베이팅되었을 때에는 염색이 관찰되지 않았다 (동형; 도 1A, 결장직장암에 걸린 6명 환자의 절편이 분석된 3개 별도 실험의 대표). 또한, 웨스턴 블롯팅에 의해, 결장직장암 환자로부터의 종양 (T) 및 인접 비-종양 (NT) 조직의 14개 대응 쌍에서, SMAD7 단백질 농도를 평가하였다. 세포 추출물의 웨스턴 블롯팅은 비-종양 조직에 비해 종양 조직에서 눈에 띄게 더 높은 SMAD7 농도를 나타내었다 (도 1B, 대표적인 2개 환자 샘플로부터의 추출물의 웨스턴 블롯팅을 나타냄). 적재 대조로는 β-액틴을 사용하였다. 농도측정 분석에 의한 동일 블롯에서의 SMAD7 발현 수준의 정량은 동일 환자로부터의 비-종양 점막에 비해 결장직장암 샘플에서 SMAD7 농도가 상당히 증가되었음을 확인해 주었다 (도 1B).
결장직장암 세포주에서 SMAD7 단백질 발현도 조사하였다. 결장직장암 세포주 DLD-1 및 HCT-116은 물론, 정상 결장 상피 세포 (IEC)의 세포로부터 총 단백질 추출물을 수집한 후, 웨스턴 블롯팅에 의해 SMAD7 발현에 대하여 평가하였다 (도 1C). IEC는 산발성 결장직장암에 대한 결장절제술을 받는 환자의 육안 및 현미경상 영향을 받지 않은 점막로부터 분리하였다. 웨스턴 블롯팅은 IEC에 비해 DLD-1 및 HCT-116 세포에서의 현저하게 더 높은 SMAD7 단백질 발현을 나타내었다. FITC-접합 SMAD7 항체 (SMAD7) 또는 IgG 동형 대조 (동형; 도 1D)를 사용하여 표지된 HCT-116 및 DLD-1 세포의 FACS 분석에 의해, SMAD7 항체 신호의 특이성을 확인하였다. 또한, HCT-116, HT-115, HT-29 및 DLD-1을 포함한 일련의 결장직장암 세포주들로부터 수집된 추출물에서의 SMAD7 단백질 농도의 웨스턴 블롯 검출 및 농도측정 분석은 높은 SMAD7 발현 수준을 나타내었다 (도 1E). 동일한 실험으로, 높은 수준의 SMAD7 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있는 간세포 암종 세포주인 HepG2 세포에서, SMAD7 발현을 평가하였다. 양 웨스턴 블롯 실험 세트에서의 적재 대조로, 그리고 도 1E에 나타낸 밴드 밀도측정 분석을 위한 표준화 표준으로는, β-액틴을 사용하였다.
실시예 2: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 결장직장암 세포 SMAD7 단백질 농도의 녹다운
HCT-116 세포주의 세포에서 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 GED-0301을 사용한 암 세포의 형질감염을 평가하였다. 비표지 센스 (SMAD7 센스) 올리고뉴클레오티드 또는 점증 투여량 (0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 또는 2 ㎍/ml)의 FITC-접합 GED-0301 중 어느 하나를 사용하여 6시간 동안 HCT-116 세포를 형질감염시켰다. 도 2A는 PI-양성 및 FITC-양성 형질감염 HCT-116 세포의 백분율을 정량하는 대표적인 점도표를 나타낸다. PI 및 FITC 염색에 의해 평가하였을 때, 매우 낮은 수준의 세포 사멸을 동반한 높은 형질감염 효율이 달성되었다. 유사한 결과가 수득된 2개 대표 실험 중 하나를 도 2A에 나타내었다.
가변량 GED-0301 형질감염 후의 SMAD7 단백질 농도의 녹다운 역시 HCT-116 세포에서 평가하였다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드 (2 ㎍/ml) 또는 GED-0301 (0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 또는 2 ㎍/ml) 중 어느 하나를 사용하여 12시간 동안 HCT-116 세포를 형질감염시켰다. 이후 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 세포를 세척하고, 새로운 배지를 사용하여 6시간 동안 배양한 후, 다시 PBS로 세척하고, 추가 24시간 동안 배양하였다. 다음에, 웨스턴 블롯팅에 의해, SMAD7 및 β-액틴 농도를 분석하였다. 도 2B는 SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 세포와 비교하였을 때의 점증량의 GED-0301을 사용하여 형질감염된 세포에서의 SMAD7 단백질 농도의 눈에 띄는 녹다운을 입증하는 3개 대표 실험 중 하나를 나타낸다. 이러한 결과는 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GED-0301)가 결장직장암 세포로 형질감염될 수 있으며 SMAD7 단백질 농도의 강력한 녹다운을 유도할 수 있음을 입증하였다.
실시예 3: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여는 결장직장암 세포에서 세포 주기 동역학에 영향을 줌
SMAD7 센스 및 GED-0301 올리고뉴클레오티드의 투여 후, HCT-116 및 DLD-1 세포에서 세포 증식을 평가하였다. HCT-116 및 DLD-1 세포를 형질감염시키지 않거나 (Untr), 또는 1 ㎍/ml의 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 12시간 후, 세포를 PBS로 세척하여, 6시간 이상 배양한 후, PBS로 재-세척하고, 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)를 사용하여 30분 동안 표지하였다. 다음에, 표지된 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배지에서 추가 24시간 동안 재-배양하였다. 유동-세포측정법에 의해, 증식성 세포의 백분율을 평가하였다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 세포와 비교하였을 때, GED-0301을 사용하여 형질감염된 DLD-1 (백색 막대) 및 HCT-116 (흑색 막대) 세포 모두에서 유의성 있는 세포 증식의 감소가 관찰되었다 (도 2C; HCT-116: SMAD7 센스-형질감염 세포 대 GED-0301-형질감염 세포, * P<0.001; DLD-1: SMAD7 센스-형질감염 세포 대 GED-0301-형질감염 세포,
Figure pct00011
P<0.001). 그래프의 데이터는 3개 실험의 평균±표준 편차 (SD)를 나타낸다. 도 2C의 히스토그램은 단일 실험에서의 SMAD7 센스 (82 %) 또는 GED-0301 (47 %) 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나로 형질감염된 HCT-116 세포에서의 세포 증식의 총 %를 나타낸다. 따라서, 결장직장 암종 세포주 HCT-116 및 DLD-1에서, SMAD7 AS 올리고뉴클레오티드의 투여는 세포 증식의 유의성 있는 감소를 초래하였다.
GED-0301의 형질감염 후, HCT-116 세포에서, 상이한 세포 주기 단계에 있는 세포 분포도 분석하였다. HCT-116 세포를 형질감염시키지 않거나 (Untr), 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염시켰다. 1 ㎍/ml의 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여, HCT-116 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 12시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배지에서 추가 24시간 동안 배양하였다. 다음에, 유동 세포측정법에 의해, 상이한 세포 주기 단계에 있는 세포의 백분율을 평가하였다. 대조에 비해 GED-0301을 사용하여 형질감염된 세포에서 S 단계에 있는 세포 백분율의 통계적으로 유의성 있는 증가, 및 G0/G1 군집을 구성하는 세포 백분율의 동시적인 통계적으로 유의성 있는 감소가 관찰되었다 (도 2D; GED-0301-형질감염 세포 대 SMAD7 센스-형질감염 세포, S 단계의 경우 ** P=0.001; G0/G1 단계의 경우 * P=0.01). 유사한 결과가 수득된 3개 대표 실험 중 하나를 나타내었다. 이러한 결과는 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 GED-0301의 투여에 의해 촉진된 SMAD7 단백질의 녹다운이 결장직장암 세포에서 변경된 세포 주기 단계 군집 분포를 초래한다는 것을 입증하였다.
결장직장암 세포는 종종 그것이 TGF-β1 활성의 변화에 대하여 무반응성이 되게하는 TGF-β1 신호전달을 매개하는 유전자에서의 돌연변이를 보유한다. 따라서, 인간 결장직장암 세포주 HCT-116 및 DLD-1에서, SMAD7 활성의 변화에 의해 유도되는 세포 증식에 있어서의 관찰되는 효과와 TGF-β1 신호전달 활성 사이의 관계를 조사하였다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드 (S)를 사용하여 형질감염된 세포를 TGF-β1 단백질 또는 TGF-β1 중화 항체 중 어느 하나에 노출시켰다. 증가된 TGF-β1에의 노출 또는 항체 노출을 통한 TGF-β1 활성의 억제 중 어느 것도 눈에 띄는 세포 증식의 변화를 초래하지 않았다. 또한, GED-0301 (AS)을 사용하여 형질감염되고 동일한 처리에 노출된 세포 역시 미처리 GED-0301-형질감염 세포 대비 세포 증식의 변화를 나타내지 않았다 (도 2E, HCT-116 데이터를 나타냄). 이러한 결과는 결장직장암 세포에서 관찰되는 SMAD7 신호전달의 전-분열촉진(pro-mitogenic) 효과가 TGF-β1 활성과는 무관하다는 것을 입증하였다.
실시예 4: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여는 결장직장암 세포에서 세포 사멸의 증가를 야기함
관찰되는 세포 주기 분포의 변화가 세포 사멸 프로그램의 활성화와 상관되는지를 확인하기 위하여, SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 GED-0301의 투여 후, HCT-116 세포에서 세포 사멸을 평가하였다. 세포 사멸을 조사하기 위하여, HCT-116 세포를 미처리로 유지하거나 (Untr), 또는 1 ㎍/ml의 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 12시간 동안 형질감염시켰다. 다음에, 세포를 PBS로 세척하고, 추가 6시간 동안 배양한 후, PBS로 재-세척하고, 새로운 배지에서 다시 24 내지 48시간 동안 배양하였다 (도 3A, 각각 상단 및 중간 패널). 세포 사멸은 AV 및/또는 PI 염색의 유동 세포측정법 분석에 의해 평가하였다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 세포에 비해 GED-0301을 사용하여 형질감염된 HCT-116 세포의 48시간에서 조합된 AV-/PI+, AV+/PI+ 및 AV+/PI- 군집에 의해 평가하였을 때 세포 사멸 %의 유의성 있는 증가가 관찰되었다 (도 3A, 중간 패널; SMAD7 센스 대 GED-0301, P<0.001). 결과는 3개 실험의 평균±SD로 나타내었다. 대표적인 점도표 (도 3A, 하단 패널)는 형질감염 48시간 후 AV- 및/또는 PI-양성 HCT-116 세포의 백분율을 나타낸다.
SMAD7 녹다운 후 결장직장암 세포에서의 세포 사멸 경로의 활성화를 더 평가하기 위하여, GED-0301을 사용하여 형질감염된 세포에서 활성 카스파제-3을 발현하는 세포의 %를 조사하였다. HCT-116 세포를 미처리로 유지하거나 (Untr), 또는 1 ㎍/ml의 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 12시간 동안 형질감염시켰다. 다음에, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 완전 배지를 사용하여 또 다시 6시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하고, 새로운 배지에서 추가 16, 24 또는 36시간 동안 배양하였다. 다음에, 유동 세포측정법에 의해, 카스파제-3의 활성화를 평가하였다. 도 3B의 점도표는 SMAD7 센스-형질감염 및 미형질감염 세포에 비교한 GED-0301-형질감염 세포에서의 활성 카스파제-3의 눈에 띄는 증가를 나타낸다. 또한, GED-0301 형질감염은 각 시점에서 점진적으로 더 높은 활성 카스파제-3 세포의 백분율을 초래하였다. 이러한 결과는 HCT-116 결장직장암 세포주에서, GED-0301의 투여가 대조와 비교하였을 때 세포 사멸을 받거나 활성 카스파제-3을 발현하는 세포 %의 유의성 있는 증가를 초래한다는 것을 입증하였다.
GED-0301을 사용하여 형질감염된 세포에서 세포 사멸이 차단될 수 있는지를 확인하기 위하여, 세포를 정상 배지에서, 또는 전-카스파제 억제제 Q-VD-OPH 또는 DMSO의 존재하에 1시간 동안 배양한 다음, 미처리로 유지하거나, 또는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 36시간 동안 형질감염시켰다. 유동 세포측정법에 의해, 활성 카스파제-3을 발현하는 세포의 %를 평가하였다. 어떠한 비형질감염 또는 SMAD7 센스-형질감염 군에서도 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았지만, 약물에 노출되지 않거나 Q-VD-OPH에 노출된 GED-0301-형질감염 세포들 사이에서 활성 카스파제-3을 발현하는 세포 %의 유의성 있는 감소가 관찰되었다 (도 3C; 약물 없음 대 Q-VD-OPH, P=0.002).
형질감염 48시간 후에 세포를 평가하고 총 세포 군집 내의 조합된 AV- 및/또는 PI-양성 군집에서 관찰하는 것에 의해 세포 사멸 %를 평가한 것 이외에는, 동일한 프로토콜을 사용하여 세포 사멸 %를 평가하였다. 어떠한 비형질감염 또는 SMAD7 센스-형질감염 군에서도 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았지만, 약물에 노출되지 않거나 Q-VD-OPH에 노출된 GED-0301-형질감염 세포들 사이에서 세포 사멸을 받는 세포 %의 유의성 있는 감소가 관찰되었다 (도 3D; 약물 없음 대 Q-VD-OPH, P=0.008).
GED-0301-유도 HCT-116 세포 성장 중지가 세포 사멸의 유도에 부수하는 것인지를 확인하기 위하여, Q-VD-OPH에 노출된 GED-0301-형질감염 세포에서 세포 증식을 평가하였다. 세포를 정상 배지에서, 또는 Q-VD-OPH 또는 DMSO의 존재 또는 부재하에 1시간 동안 배양한 다음, 미처리로 유지하거나, 또는 SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드 또는 GED-0301을 사용하여 형질감염시켰다. 24시간 후, 유동 세포측정법에 의해 증식성 세포의 백분율을 평가하였다. Q-VD-OPH 노출에 관계없이, 모든 GED-0301-형질감염 세포 군집이 SMAD7 센스-형질감염 및 비형질감염 군에 비해 증식성 세포 %의 감소를 나타냄으로써, 세포 사멸이 SMAD7 단백질 녹다운에 적용된 결장직장암 세포에서 감소된 증식의 부수적인 효과라는 것을 입증하였다 (도 3E). 도 3C-E에 나타낸 결과는 3개 실험의 평균±SD이다.
실시예 5: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하류 TGFβ1 신호전달 구성요소들의 상호작용을 붕괴시키며 세포 주기 조절 단백질 발현 및 활성에 영향을 줌
세포 주기를 통한 진행은 세포 주기 진행에서 역할을 하는 단백질의 활성을 조절하는 시클린으로 알려져 있는 활성화 파트너와 연관되어 있는 시클린 의존성 키나제 (CDK)에 의해 조절된다. CDK 활성 자체는 억제 및 활성화 인산화 양자에 의해 조절된다. 예를 들어, CDK-시클린 복합체는 CDK의 ATP-결합 포켓 내 Thr-14 및 Tyr-15 잔기의 인산화에 의해 억제될 수 있다. CDK2는 S-단계의 조절에서 중심적인 역할을 하는데, 시클린 E 또는 시클린 A 중 어느 하나에 결합하여 각각 G1/S 전이 및 S 단계 진행을 조절한다.
결장직장암 세포에서의 CKD2/시클린 활성에 대한 SMAD7 발현의 영향을 분석하기 위하여, GED-0301을 사용한 형질감염 후, HCT-116 세포에서 CDK2의 인산화 상태를 분석하였다. HCT-116 세포를 미처리로 유지하거나 (Untr), 또는 1 ㎍/ml의 SMAD7 센스 (S) 또는 SMAD7 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배지를 사용하여 추가 16시간 동안 재-배양하였다. 세포 추출물의 웨스턴 블롯팅에 의해, p-CDK2 (Thr-14/Tyr-15), CDK2, 시클린 A 및 β-액틴 농도를 분석하였다. 유사한 결과가 수득된 3개 대표 실험 중 하나를 도 4A에 나타내었다. 도 4A의 블롯은 GED-0301을 사용한 HCT-116 세포의 형질감염이 대조에 비해 p-CDK2 (Thr-14/Tyr-15) 농도에 있어서의 눈에 띄는 증가는 물론, 시클린 A 농도의 감소를 초래함으로써, GED-0301 투여 후 S 단계에서의 세포의 축적을 설명하는 기작을 제공한다는 것을 입증하였다.
CDK2의 활성화는 CDK/시클린 복합체를 탈인산화하여 활성화하는 특화된 포스파타제인 CDC25의 활성에 전적으로 의존한다. 3종의 인간 CDC25 계열 구성원이 존재한다. CDC25A는 S 단계를 통한 진행을 조절하는 반면, CDC25B 및 CDC25C는 G2로부터 유사분열로의 전이의 조절에 연관되어 있다. SMAD7-결핍 세포에서의 CDK2의 불활성화/인산화가 CDC25 단백질의 발현 감소와 연관되어 있는지를 확인하기 위하여, CDC25 계열 구성원의 농도를 조사하였다. HCT-116 세포를 무-혈청 배지 중에서 미처리로 유지하거나 (Untr), 또는 1 ㎍/ml의 SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 20시간 동안 형질감염시켰다. 다음에, 세포를 PBS로 세척하고, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 배지에서 24시간 이상 동안 배양하였다. SMAD7의 녹다운은 CDC25A 단백질 발현의 현저한 감소는 동반한 반면, CDC25B 및 CDC25C 농도는 변함없이 유지되었다 (도 4B; 결과는 3개 실험의 대표임). 따라서, SMAD7 활성은 결장직장암 세포에서의 강력한 CDC25A 발현에 필수적인 것으로 보인다.
CDC25A의 세포내 농도는 다수의 수준에서 조절될 수 있다. SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드-유도 CDC25A 단백질 하향-조절이 CDC25A 전사의 억제에 기인하는 것인지를 확인하기 위하여, SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 HCT-116 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 상이한 시간 기간 동안 배양한 후, 실시간 PCR에 의해 CDC25A mRNA 농도에 대해 분석하였다. CDC25A 실시간 PCR 신호는 β-액틴 신호에 대하여 표준화하였다. 모든 세포를 무-혈청 배지 중에서 1 ㎍/ml의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 20시간 동안 형질감염시키고, PBS로 세척한 후, 10 % FBS를 함유하는 배지를 사용하여 배양하였다. 다음에, 4시간 후 세포를 재-세척하고, 무-혈청 배지 중에서 지정된 시점 동안 배양하였다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 세포 (백색 막대; 도 4C는 3개 실험의 평균±평균의 표준 오차 (SEM)를 나타냄)에 비해 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 세포 (흑색 막대)에서 CDC25A RNA 전사체 농도가 하향조절되기보다는 오히려 증가되었다. 이와 같은 데이터는 SMAD7-결핍 결장직장암 세포에서의 CDC25A 단백질과 RNA 농도 사이의 무연계성(decoupling)을 입증하였으며, SMAD7에 의한 CDC25A 단백질 발현의 조절이 번역 또는 번역후 (예컨대 프로테아솜-의존성) 기작을 통하여 이루어진다는 것을 암시하고 있다.
프로테아솜-의존성 기작이 SMAD7 녹다운 세포에서의 관찰된 CDC25A 감소의 원인인지를 확인하기 위하여, SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드-형질감염 세포를 형질감염 후 24시간 동안 프로테아솜 억제제인 MG115 및 MG132에 노출시켰다. 이들 프로테아솜 억제제를 사용한 결장직장암 세포의 처리는 CDC25A 단백질 발현의 억제를 방지하지 못하였다 (도 4D; 3개 실험 중 하나로부터의 대표적인 블롯).
CDC25A 단백질 발현은 다양한 단백질들의 번역 감쇠에 필수적인 진핵 개시 인자 2 알파 (EiF2α)에 의해서도 조절된다 (문헌 [Tomko and Lazo, (2008) Cancer Res. 68(18):7457-7465]). EiF2α 활성은 EiF2α 봉쇄(sequestration)를 초래하는 Ser51에서의 인산화에 의해 조절된다 (문헌 [Wek et al., (2006) Biochem . Soc . Trans. 34:7-11]). 따라서, EiF2α 과인산화는 CDC25A 단백질 발현의 현저한 감소를 초래한다. 이에 따라, EiF2α 활성의 변화가 관찰되는 CDC25A 농도 변화의 원인이 될 수 있는지를 확인하기 위하여, SMAD7 안티센스를 사용하여 처리된 결장직장암 세포에서의 EiF2α 인산화 상태를 조사하였다. 세포를 무-혈청 배지 중에서 1 ㎍/ml으로 20시간 동안 형질감염시키고, PBS로 세척한 후, 10 % FBS를 함유하는 배지를 사용하여 배양하였다. 다음에, 4시간 후 세포를 재-세척하고, 무-혈청 배지 중에서 지정된 시점 동안 (도 4E; 12, 18 또는 24시간) 배양하였다. SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AS)에의 노출을 통한 HCT116 및 DLD-1 세포 양자에서의 SMAD7의 침묵화는 EiF2α Ser51 인산화를 증가시켰으며, CDC25A 및 시클린 A 단백질 하향-조절이 이어졌다 (도 4E; 3개의 대표적인 블롯 중 하나를 나타냄).
결장직장암 세포에서의 EiF2α 활성과 CDC25A 발현 사이의 연계를 확인하기 위하여, EiF2α Ser51 탈-인산화를 방해하는 화합물인 살루브리날에 의해 HCT116 및 DLD-1 세포에서 EiF2α 기능을 특이적으로 억제하였다. HCT-116 세포를 DMSO 또는 살루브리날을 사용하여 6 내지 24시간 동안 처리한 다음, 세포 추출물을 웨스턴 블롯에 의해 p-EiF2α (Ser51), 총 EiF2α, CDC25A 또는 β-액틴에 대하여 탐색하였다. 살루브리날을 사용한 결장직장암 세포의 처리는 DMSO-처리 대조 대비 인산화된 EiF2α의 증가, 및 동시적인 CDC25A 단백질 농도의 감소를 초래하였다 (도 4F; 3개의 대표적인 블롯 중 하나를 나타냄). 이러한 결과는 SMAD7 녹다운이 EiF2α 인산화를 변경하고, 그것은 다시 결장직장암 세포에서의 CDC25A 발현 수준에 영향을 준다는 것을 입증하였다.
SMAD7은 또한 단백질 포스파타제 1 (PP1) 완전효소의 조절 서브유닛인 성장 중지 및 DNA 손상 단백질 (GADD34)과 상호작용함으로써, TGFβ 유형 I 수용체 신호전달을 촉진한다. GAD334/PP1 복합체는 EiF2α와도 상호작용하여 그의 탈-인산화를 촉진할 수 있다. 면역침전 및 웨스턴 블롯팅 실험을 수행함으로써, 결장직장암 세포에서의 이러한 상이한 분자 구성요소들 사이의 연관성을 조사하였다. 항-SMAD7 항체를 사용하여 HCT-116 (좌측 패널), DLD-1 세포 (미도시) 및 원발성 결장직장암 세포 (우측 패널)로부터의 전세포 추출물의 면역침전을 수행한 후, 이어서 항-PP1 (상단), 항-EiF2α (중간) 또는 항-SMAD7 (하단) 항체를 사용하여 웨스턴 분석을 수행하였다 (도 4G, 각 실험에 대하여 3개의 대표적인 블롯 중 하나를 나타냄; IP=면역침저, n.s.=비-특이적 밴드). 또한, 동형-특이적 대조 항체를 사용하여서도 블롯을 탐색하였다 (각 블롯의 우측 레인; ve-). 이와 같은 실험은 결장직장암 세포주 및 새로운 결장직장암 종양 조직에서 분리된 원발성 세포에서 내인성 SMAD7이 PP1 및 EiF2α와 상호작용한다는 것을 입증하였다.
SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 HCT-116 세포에서의 추가적인 면역침전/면역블롯팅 실험은 SMAD7의 침묵화가 PP1과 EiF2α 사이의 연관성을 현저하게 감소시킨다는 것을 보여주었다 (도 4H; 각 실험에 대하여 3개의 대표적인 블롯 중 하나를 나타냄; n.s.=비-특이적 신호). 형질감염된 세포로부터의 HCT-116 세포 추출물을 PP1 항체에 의한 면역침전에 적용하고, EiF2α 항체 (상단)를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 탐색하거나, 그 반대를 수행하였다 (하단). 대조로서 동형-특이적 항체 (Ve -)를 사용하여서도 블롯을 탐색하였다. 예컨대, SMAD7은 PP1 완전효소와 EiF2α 사이의 연관성을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 함으로써, EiF2α 활성에 영향을 준다. 또한, SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여는 이들 구성요소의 무연계성을 초래하며 시클린 A 및 CDC25A 발현의 감소를 초래함으로써, SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드에의 노출시 결장직장암 세포에서 관찰되는 변경된 세포 증식 및 세포 주기 진행을 설명하는 기작을 제공한다.
실시예 6: 결장직장암이 유도된 마우스 모델에서는 생체내 SMAD7 단백질 및 mRNA 발현이 증가됨
생체 내에서의 결장직장암의 유도가 SMAD7 농도의 증가와 연관되어 있는지를 확인하기 위하여, 결장염-연관 결장직장암에 걸린 마우스의 종양 및 비-종양 영역에서 SMAD7 단백질 및 mRNA 발현을 평가하였다. 본원에서 이용한 모델에서는, C57BL/6J 마우스에 AOM을 투여한 후 이어서 반복적으로 DSS를 섭취시킴으로써 (AOM+DSS), 결장 염증 및 이후의 다발성 결장 종양의 발생을 야기하였다. AOM+DSS 처리 84일 후, 동물을 희생시켰다. 결장염-연관 결장직장암에 걸린 마우스로부터 수집된 조직의 비-종양 및 종양 영역의 면역염색에 의해, SMAD7 단백질 농도를 평가하였다. 도 5A는 AOM+DSS-처리 마우스의 종양 영역에서의 SMAD7 면역염색의 분명한 증가를 보여준다. 영상은 수행된 3개 실험 중 하나로부터 수득하였다. 실시간 PCR에 의해 평가하였을 때, AOM+DSS-처리 마우스의 비-종양 영역에 비해 종양 영역에서 SMAD7 mRNA 발현도 증가되었다 (도 5B). 도 5B의 값들은 평균±SEM을 나타내는데, 각 군에는 6마리의 마우스가 포함되었다. 따라서, 증가된 SMAD7 mRNA, 특히 생체 내에서의 단백질 발현은 전적으로 종양 조직에서 결장직장암의 유도와 상관되었다.
실시예 7: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여는 조직 체외이식편 세포 증식의 감소를 초래함
조직에서의 세포 증식에 대한 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드-촉진 녹다운의 효과를 평가하기 위하여, 생체외 결장직장암 조직 체외이식편으로부터의 절편에서 H&E 염색 또는 PCNA 면역염색을 수행하였다. 새로운 조직 체외이식편을 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 36시간 동안 형질감염시킨 다음, 염색하였다. 도 6A는 새로 수득된 체외이식편으로부터의 H&E- 및 PCNA-염색 절편들의 대표적인 영상을 나타낸다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형질감염된 체외이식편에 비해 GED-0301을 사용하여 형질감염된 조직 체외이식편에서 H&E 염색 및 PCNA 면역염색 모두에서의 분명간 감소가 관찰됨으로써, GED-0301이 형질감염된 조직에서 세포 증식을 효율적으로 감소시킨다는 것을 입증하였다. 2개의 대표적인 실험 중 하나로부터의 영상을 나타내었다.
유사하게, SMAD7 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 인간 결장직장암 조직 체외이식편의 기관 배양물에 첨가하고, 24시간 후 세포 증식 및 세포 주기-관련 단백질들을 분석하였다. 결장직장암 조직 체외이식편의 일련의 절편에서의 면역조직화학은 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드가 SMAD7-, PCNA-, 시클린 A- 및 CDC25A-발현 결장직장암 세포의 분율을 감소시키고 p-EiF2α (Ser51)에 대하여 양성인 세포의 백분율을 증가시킨다는 것을 보여주었다 (도 6B). 영상은 5개의 대표적인 결과 중 하나를 나타내는데, 좌측 컬럼에는 동형 대조 염색 (동형)을 나타내었다.
실시예 8: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여는 이종이식편 마우스 모델에서 생체 내에서의 결장직장암 종양 성장 및 세포 증식을 감소시킴
HCT-116 이종이식편 모델을 사용하여 결장직장암 종양 발달 및 결장직장암 세포 증식에 대한 GED-0301 투여의 효과를 평가하였다. 그를 위하여, HCT-116 세포 (500 μl 마트리겔 중 5×105 세포)를 사용하여 Rag-1-/- 마우스를 접종하였다. 접종 1주 후, PBS (도 7A, CTR) 또는 100 ㎍의 FITC-접합 GED-0301 (도 7A, GED-0301 FITC-접합) 중 어느 하나의 단일 복강내 주사를 마우스에 제공하였다. 시약 주사 24시간 후 마우스를 희생시키고, 종양을 절제한 후, 면역형광 신호에 의해 FITC-접합 GED-0301 분포를 평가하였다. FITC 신호는 분명하게 이종이식편 세포로부터이 핵 신호와 공동-국소화되었다 (도 7A, Dapi/FITC 패널).
GED-0301 투여에 적용된 동물로부터의 이종이식편에서, SMAD7 단백질 신호도 평가하였다. HCT-116 세포를 Rag-1-/- 마우스에 접종하고, 동물을 SMAD7 센스 또는 GED-0301 중 어느 하나를 사용하여 복강내로 처리하였다. 양 올리고뉴클레오티드를 HCT-116 주사 7일 후에 시작하여 매일 100 ㎍/마우스로 투여하였다. HCT-116 세포 접종 21일 후, 마우스를 희생시켰다. 이종이식편 조직으로부터의 총 단백질 추출물의 웨스턴 블롯팅은 GED-0301-처리 마우스로부터의 샘플에서의 눈에 띄게 감소된 SMAD7 신호 수준을 나타내었으나, SMAD7 센스-처리 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 7B). 적재 대조로는 β-액틴을 사용하였다. 따라서, GED-0301은 생체 내의 결장직장암 이종이식편 세포에서의 SMAD7 단백질의 농도를 녹다운시킬 수 있다.
상기한 것과 동일한 프로토콜에 적용된 마우스로부터 수확된 이종이식편을 각 군에서 생성된 종양의 부피에 대하여 분석하였다. SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 마우스에 비해 GED-0301을 사용하여 처리된 HCT-116-접종 마우스에서 유의성 있는 종양 부피의 감소가 관찰되었다 (도 7C). 도 7C의 그래프는 SMAD7 센스 또는 GED-0301 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 마우스의 21일에서의 평균 종양 부피를 나타낸다 (도 7C, 좌측 패널; SMAD7 센스 대 GED-0301, P<0.001; 2개 개별 실험의 평균, 군 당 ≥12 마우스; 막대는 평균±SD를 표시함). 도 7C (우측 패널)는 SMAD7 센스-처리 (상단 열) 및 GED-0301-처리 (하단 열) 마우스에서 발달된 이종이식편의 대표적인 사진을 제공한다. 결과는 SMAD7의 GED-0301 녹다운이 이종이식편 모델에서 결장직장 종양 성장을 억제한다는 것을 분명하게 입증하고 있다.
상기한 것과 동일한 프로토콜에 적용된 마우스로부터 수확된 이종이식편 조직 절편에서, SMAD7, 세포 증식 마커 PCNA 및 CDK2 파트너인 시클린 A에 대한 면역염색도 수행하였다. SMAD7-, PCNA- 및 시클린 A-염색 이종이식편 절편의 대표적인 영상을 도 7D에 나타내었다. 6개 대표 실험 중 하나로부터의 영상을 나타내었다. 좌측 컬럼에는 동형 대조 염색을 나타내었다 (동형). SMAD7 센스-처리 마우스 (S)로부터의 것과 비교하였을 때, GED-0301-처리 마우스 (AS)에서 발달된 이종이식편으로부터 채취된 조직 절편에서 3종 전체 신호의 감소가 관찰됨으로써, SMAD7 단백질의 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드-매개 녹다운이 생체 내의 결장직장암 세포에서 세포 증식의 감소를 초래한다는 것을 입증하였다.
실시예 9: SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여는 자연발생 결장직장암 모델에서 종양생성을 억제함
자연발생 결장직장암의 마우스 모델을 사용하여, 생체 내에서 장 종양생성을 억제하는 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 조사하였다. 구체적으로, 이러한 실험에는 선종성 결장 폴립증 (Apc) 유전자에 우성 돌연변이를 보유하는 다발성 장 종양 (Min) 마우스를 사용하였다. 이와 같은 마우스 모델은 역시 APC 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기되는 가족 선종성 폴립증으로 알려져 있는 인간 질환과 유사하다. 발암물질인 AOM을 사용한 Apc (Min/+) 마우스의 처리는 특히 결장에서의 종양 발생률, 수 및 크기를 증가시킨다. 마우스를 2주 동안 주당 1회 AOM (10 mg/kg)으로 복강내 (i.p) 처리하고, 종양 형성에 대하여 모니터링하였다. 최종 AOM 주사 1주 후, 80일차에 희생될 때까지 주당 3회 125 ㎍/마우스의 SMAD7 안티센스 (AS) 또는 센스 (S) 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용하여 마우스를 경구 처리하였다. 병행하여, 올리고뉴클레오티드의 장 흡수를 평가하기 위해, 비표지 올리고뉴클레오티드 (CTR) 또는 FITC-접합 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드 (FITC-접합 AS; 125 ㎍/마우스)의 경구 투여를 마우스에 제공하고, 8시간 후에 희생시켰다 (도 8G). 장 조직 절편의 분석은 FITC 신호의 존재를 나타냄으로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 조직에 국소화된다는 것을 표시하였다.
72일차의 내시경검사는 SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 처리된 마우스는 다발성의 대형 종양을 발생시킨 반면, SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드-처리 마우스의 결장에서는 종양의 수 및 크기가 감소된다는 것을 보여주었다 (도 8A, 좌측 패널). 종양 수 및 종양 점수의 내시경검사 분석은 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드-처리 마우스 대 SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드-처리 마우스에서의 이들 파라미터의 유의성 있는 감소를 나타내었다 (도 8A, 그래프; 종양 수의 경우 S 대 AS, P=0.004; 종양 점수의 경우 S 대 AS, P=0.001; 양 그래프에 있어서, 막대는 평균±SEM을 표시, 3개 개별 실험, ≥5의 군 당 마우스). 이러한 결과는 80일차에 희생된 마우스에서의 종양의 직접 평가에 의해 확인되었다. 구체적으로, 결장 조직의 H&E 염색은 SMAD7 센스에서는 커다란 성장이 존재하나 안티센스 올리고뉴클레오티드-처리 마우스에서는 그렇지 않음을 나타내었다 (도 8A, 중간 패널).
종양 (T) 및 비-종양 (NT) 절편의 면역조직화학은 SMAD7 센스 올리고뉴클레오티드 (S)에 노출된 종양 영역에서는 SMAD7이 상향-조절되었으며, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 (AS, 도 8B)에 의해서는 억제되었음을 나타내었다. PCNA-염색은 SMAD7 안티센스 올리고뉴클레오티드의 항-증식 효과를 확인해 주었다 (도 8C). 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리는 종양 영역에서 시클린 A 및 CDC25A의 농도를 감소시키고 (도 8D, E), p-EiF2α (Ser51) 농도를 상향-조절하였다 (도 8F). 따라서, GED-0301은 다수의 결장직장암 동물 모델에서 생체내 종양 형성 및 성장을 성공적으로 억제하였다.
[참조 개재]
본원에서 언급된 특허 문헌 및 과학 논문들 각각의 전체 개시내용은 모든 목적에 있어서 참조로써 개재된다.
[등가물]
본 발명은 그의 본질적인 특징에서 벗어나 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 전기한 실시양태들은 본원에서 기술되는 본 발명에 대한 제한이라기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 영역은 전기한 상세한 설명에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 표시되므로, 청구범위의 의미 및 등가 영역에 속하는 모든 변화는 거기에 포괄되는 것으로 하고자 한다.
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Claims (25)

  1. 환자의 결장직장 종양에서 SMAD7을 억제하는 것을 포함하는, 결장직장암을 치료하는 방법.
  2. 결장직장암 세포에서 SMAD7을 억제하는 것을 포함하는, 결장직장암 세포의 성장을 억제하는 방법.
  3. SMAD7의 특이적 억제제의 유효량을 결장직장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 결장직장암을 치료하는 방법.
  4. SMAD7의 특이적 억제제의 유효량을 결장직장암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 결장직장암 세포의 성장을 억제하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 억제제가 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 5 또는 서열 9를 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 6 또는 서열 10을 포함하는 것인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 비경구로 투여하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 경구로 투여하는 것인 방법.
  11. 제3항 또는 제4항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 5 또는 서열 9를 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 6 또는 서열 10을 포함하는 것인 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 비경구로 투여하는 것인 방법.
  16. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 경구로 투여하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 제약 조성물이 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 및 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  19. 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 100 ㎍ 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 35 mg 내지 500 mg의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  21. SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 결장직장암을 치료하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
  22. SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의, 결장직장암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 용도.
  23. 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 SMAD7의 억제제.
  24. 결장직장암의 치료에 사용하기 위한, 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 SMAD7의 억제제.
  25. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같으며, 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 조성물 중에 제약상 허용되는 담체와 함께 존재하는, 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 SMAD7의 억제제.
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