JP2002528391A - 組合せ治療による遺伝子発現の修飾 - Google Patents

組合せ治療による遺伝子発現の修飾

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Abstract

(57)【要約】 本発明は遺伝子発現の修飾に関する。特に、本発明は、その遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと作動可能に会合したその遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、およびそれを用いる方法に関する。加えて、本発明はメチル化によって調製された哺乳動物遺伝子発現の修飾に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子発現の修飾、およびメチル化によって調節された哺乳動物遺伝
子発現の修飾に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の発現の修飾は研究者によって長い間追求されてきた。例えば、多くの
哺乳動物病気はある種の遺伝子の過剰もしくは過小発現と関連付けられる。その
異常な発現が病気（またはそのような病気を発病する素因）と関連する遺伝子の
発現を修飾することによって、病気の兆候は軽減することができる。
【０００３】 例えば、哺乳動物ＤＮＡのメチル化を媒介する酵素であるＤＮＡメチルトラン
スフェラーゼ（ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ）を修飾するのは望ましいであろう。
【０００４】 哺乳動物ＤＮＡのメチル化はＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンのピリミ
ジン環の５番目の炭素位置の共有結合修飾によって酵素的に媒介される。ＤＮＡ
メチル化のパターンの変化は、真核生物における多数のプロセスと関連付けられ
ている。Ｈｏｌｌｉｄａｙ （１９９０）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏ
ｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３２６:３２９−３３８は親インプリン
ティングにおけるメチル化の役割を議論している。 Ａｎｔｅｑｕｅｒａら，（
１９８９ Ｃｅｌｌ ５８:５０９−５１７は発生調節におけるメチル化の重要
性を議論している。Ｆｅｄｏｒｏｆｆら，（１９８９） Ｃｅｌｌ ５６:１８
１−１９１はメチル化が転位に関与することを開示している。ＨａｒｅおよびＴ
ａｙｌｏｒ （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ：Ｕ
ＳＡ ８２: 有効相乗量の：７３５０−７３５４は、メチル化がＤＮＡ修復にも
関与することを開示している。加えて、ＧａｒｔｌｅｒおよびＲｉｇｇｓ （１
９８３） Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１７:１５５−１９０はメチル化をＸ
染色体の不活化と関連づけ、他方、 Ｂｉｒｄら （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ
３２１:２０９−２１３は、メチル化がクロマチン組織化における中枢的な役
割を演じることを開示している。
【０００５】 いくつかの観察は癌病因におけるＤＮＡメチル化の役割を示唆しているが、関
連するメカニズムに関して大きな不一致がある。Ｓｚｙｆら，（１９９６）Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７０（１）：１−３７は、メチル化および脱メチル
化の活性がいくつかの腫瘍形成増殖形態の非常に重要な要素であることを開示し
ている。ＭａｃＬｅｏｄおよびＳｚｙｆ（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０：８０３７−８０４３は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性のレベ
ルが腫瘍形成増殖に対する結節性制御点であり得ることを開示している。他方、
他のものは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが癌形成において原因となる役割
を演じるという理論を捨てた。
【０００６】 メチル化の役割の調査に対する重要な障害は、メチル化それ自体を修飾する利
用可能な方法の欠点にある。現在、ほとんどの研究は、ＤＮＡメチルトランスフ
ェラーゼとで安定なアダクトを形成することによってＤＮＡのメチル化を阻害す
る５−アザ−Ｃおよび／または５−アザーｄＣに頼っており、メチル化の間に形
成されると考えられる一過的共有結合中間体複合体を模倣する（例えば、Ｗｕお
よびＳａｎｔｉ（１９８７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４７７８−４
７８６参照）。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を減少させるのに、および
腫瘍形成阻害と相関させるのに有効なにもかかわらず、このアプローチは治療的
に欠陥がある。あいにくと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するの
に経験的に必要な５−アザＣまたは５−アザ−ｄＣの閾値濃度は哺乳動物に対し
て毒性であることが判明している（Ｊｕｔｔｅｒｍａｎｎら（１９９４） Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１７９７−１１８０１；
Ｌａｉｒｄ（１９９７） Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ３：２２３−２２９）
。
【０００７】 より最近では、Ｓｚｙｆら（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
１２８３１−１２８３６は、癌細胞に対するメチル化の効果を研究するためにＤ
ＮＡメチルトランスフェラーゼｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現を
用いるＤＮＡメチル化の修飾に対するより有望なアプローチを開示している。米
国特許第５，５７８，７１６号は、遺伝子発現を阻害するためのＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼ遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開
示している。これらの開発は、多数の細胞プロセスにおけるメチル化の役割を探
るための強力な新しい道具を提供した。加えて、それらは、メチル化のレベルを
修飾できる治療化合物を開発するための有望な新しいアプローチを提供した。
【０００８】 アンチセンス阻害の効果は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の半減期の
ため即時的ではない。かくして、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現は修飾
されるが、残存する酵素はかかる酵素が分解されるまでＤＮＡをメチル化し続け
ることができる。さらに、ポリソーム−会合ＤＮＡメチルトランスフェラーゼｍ
ＲＮＡはしばらくの間執拗に存在でき、さらなる翻訳がさらなる酵素を生産する
のを可能とする。加えて、オリゴヌクレオチドの薬力学特性は、現在使用されて
いるものよりも低い用量が有益であろうことを示唆する。（Ａｇｒａｗａｌら（
１９９５） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ２８：７
−１６； Ｚｈａｎｇら（１９９５） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ およびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ５８：４４−５３）。
【０００９】 従って、同時に遺伝子発現の阻害を効果的に達成しつつ、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチド、遺伝子産物の特異的阻害剤、または現在使用されている他の剤の
必要投与量を減少させるであろう、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのような遺
伝子の発現の修飾のためのより効果的な方法を開発する要望が依然として存在す
る。 発明の概要 本発明者らは、それによって、哺乳動物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄ
ＮＡ ＭｅＴａｓｅ）のごとき遺伝子が、遺伝子レベルにおいてならびに蛋白質
レベルにおいて阻害される組合せアプローチを考案した。驚くべきことに、この
組合せアプローチは、遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに
遺伝子産物の小分子阻害剤双方の効率のための必要な投与量を低下させることを
見いだした。
【００１０】 本発明は、また遺伝子レベルにおけるならびに蛋白質レベルにおける哺乳動物
ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの修飾およびメチル化によって調節された哺乳動物遺伝子
発現の修飾のための改良された方法および組成物を提供する。本発明の方法およ
び組成物は、トランスジェニック研究のための分析ツールとして、および治療ツ
ールとして有用である。
【００１１】 第１の態様において本発明は、細胞を、有効相乗量の遺伝子の発現を阻害する
アンチセンスオリゴヌクレオチド、および有効相乗量の遺伝子の産物の蛋白質エ
フェクターと接触させることを特徴とする細胞中の遺伝子の発現を阻害する方法
を提供する。
【００１２】 本発明の第１の態様の具体例において、細胞は、効果的な間、有効相乗量の少
なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる。ある具体例にお
いて、細胞は、効果的な間、有効相乗量の少なくとも１つの蛋白質エフェクター
と接触させる。ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋
白質エフェクターの各々は、細胞と接触させるに先だって医薬上許容される担体
媒体と混合する。ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび
蛋白質エフェクターは細胞に接触させるに先だって混合される。
【００１３】 本発明の第１の態様のある好ましい具体例において、細胞は、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの各々と別々に接触させる。ある具
体例において、細胞は、蛋白質エフェクターに接触させるに先だってアンチセン
スオリゴヌクレオチドと接触させる。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチ
ルトランスフェラーゼをコードし、蛋白質エフェクターと接触させるに先だって
アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた細胞を誘導してアポトーシスを受
けさせるか、あるいは細胞周期のＳ相に留まらせる。ある具体例において、細胞
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるに先だって蛋白質エフェクタ
ーと接触させる。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトランスフェラー
ゼをコードし、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるに先だって蛋白質
エフェクターと接触させた細胞は細胞周期のＧ1相に留まらせる。
【００１４】 本発明の第１の態様のある好ましい具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼをコードし、細胞は、その発現がメチル化によって不活化され
ている遺伝子を含む。ある具体例において、その発現がメチル化によって不活化
されている遺伝子の発現は接触させた細胞において再度活性化される。好ましい
具体例において、その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子はｐ１６ ink4 腫瘍サプレッサー遺伝子である。
【００１５】 第２の態様において、本発明は、遺伝子の阻害に対して応答性の病気を治療す
る方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、治療上有効な相乗量の遺伝
子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および治療上有効な相乗
量の遺伝子の産物の蛋白質エフェクターを、病気によって影響される少なくとも
一つの細胞を有するヒトを含めた哺乳動物に投与することを含む。
【００１６】 本発明の第２の態様の具体例において、治療上有効な時間、治療上有効な相乗
量の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与する。
ある具体例において、治療上有効な時間、治療上有効な相乗量の少なくとも１つ
の蛋白質エフェクターを哺乳動物に投与する。ある具体例において、アンチセン
スオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの各々は、哺乳動物への投与に
先だって医薬上許容される担体媒質と混合される。ある具体例において、アンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターは哺乳動物への投与に先だ
って混合される。
【００１７】 本発明の第２の態様のある好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび蛋白質エフェクターは別々に哺乳動物に投与される。ある具体例
において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、蛋白質エフェクターの投与に先
だって哺乳動物に投与される。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトラ
ンスフェラーゼをコードし、アンチセンスオリゴヌクレオチドが蛋白質エフェク
ターの投与に先だって投与される哺乳動物において病気によって影響される細胞
を誘導してアポトーシスを受けさせるか、あるいは細胞周期のＳ相に留まらせる
。ある具体例において、蛋白質エフェクターを、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの投与に先だって哺乳動物に投与する。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡ
メチルトランスフェラーゼをコードし、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与
に先だって蛋白質エフェクターが投与される哺乳動物において病気によって影響
される細胞は細胞周期のＧ1相に留まらせる。
【００１８】 本発明の第２の態様のある好ましい具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼをコードし、病気によって影響された細胞は、その発現がメチ
ル化によって不活化されている遺伝子を含む。ある具体例において、その発現が
メチル化によって不活化されている遺伝子の発現は、治療上有効な相乗量のアン
チセンスオリゴヌクレオチドおよび治療上有効な相乗量の蛋白質エフェクターが
投与された哺乳動物中の細胞で再度活性化される。好ましい具体例において、そ
の発現がメチル化によって不活化されている遺伝子はｐ１６ink4腫瘍サプレッサ
ー遺伝子である。
【００１９】 第３の態様において、本発明は哺乳動物において腫瘍増殖を阻害する方法を提
供する。本発明のこの態様による方法は、腫瘍形成に関与する遺伝子の発現を阻
害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療上有効な相乗量、および遺伝子の
産物の蛋白質エフェクターの治療上有効な相乗量を、その身体中に存在する少な
くとも１つの新形成細胞を有するヒトを含めた哺乳動物に投与することを含む。
【００２０】 本発明の第３の態様の具体例において、治療上有効な時間、治療上有効な相乗
量の１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与する。ある具体
例において、治療上有効な時間、治療上有効な相乗量の少なくとも１つの蛋白質
エフェクターを哺乳動物に投与する。ある具体例において、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの各々は、哺乳動物への投与に先だって
医薬上許容される担体媒体と混合される。ある具体例において、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターは哺乳動物への投与に先だって混合
される。
【００２１】 本発明の第３の態様のある好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび蛋白質エフェクターは別々に哺乳動物に投与される。ある具体例
において、蛋白質エフェクターの投与に先だってアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは哺乳動物に投与される。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトラン
スフェラーゼをコードし、蛋白質エフェクターの投与に先だってアンチセンスオ
リゴヌクレオチドが投与される哺乳動物中の新形成細胞を誘導してアポトーシス
を受けさせるか、あるいは細胞周期のＳ相で留まらせる。ある具体例において、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に先だって蛋白質エフェクターは哺乳動
物に投与される。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトランスフェラー
ゼをコードし、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に先だって蛋白質エフェ
クターが投与される哺乳動物中の新形成細胞は細胞周期のＧ1相に留まらせる。
【００２２】 本発明の第３の態様のある好ましい具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼをコードし、新形成細胞はその発現がメチル化によって不活化
されている遺伝子を含む。ある具体例において、その発現がメチル化によって不
活化されている遺伝子の発現は、治療上有効な相乗量のアンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび治療上有効な相乗量の蛋白質エフェクターが投与された哺乳動物
中の新形成細胞中で再度活性化される。好ましい具体例において、その発現がメ
チル化によって不活性化されている遺伝子はｐ１６ink4腫瘍サプレッサー遺伝子
である。
【００２３】 本発明の最初の３つの態様のある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトラ
ンスフェラーゼをコードする。ある具体例において、蛋白質エフェクターは５−
アザ−シチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロー２’−デ
オキシシチジンおよび５、６−ジヒドロ−５−アザシチジンよりなる群から選択
される。第１、第２および第３の態様のある具体例において、遺伝子はヒストン
デアセチラーゼをコードする。ある具体例において、蛋白質エフェクターはトリ
コスタチンＡ、デプデシン、トラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸
、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウム
よりなる群から選択される。最初の３つの態様のある具体例において、遺伝子は
チミジレートシンターゼをコードする。ある具体例において蛋白質エフェクター
は５−フルオロウラシル、トムデックス、ラルティトレキセド、ゼネカＺＤ１６
９４、ゼネカＺＤ９３３１、チミタク、ＡＧ３３１、Ｌｙ２３１５１４およびＢ
Ｗ１８４３Ｕ８９よりなる群から選択される。
【００２４】 本発明の最初の３つの態様の種々の具体例において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドは蛋白質エフェクターと作動可能に会合している。ある具体例において
、アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル
、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル
、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、
架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオチ
ド間結合よりなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有す
る。ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエー
ト、ホスホジエステルもしくはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホ
ネートもしくはアルキルホスホロチオエート領域を含むキメラオリゴヌクレオチ
ドである。ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはリボヌクレ
オチドもしくは２’Ｏ−置換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオ
チド領域を含む。
【００２５】 第４の態様において、本発明は、遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと作動可
能に会合した遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺
伝子の阻害剤を提供する。本発明のこの態様のある具体例において、アンチセン
スオリゴヌクレオチドは２以上の蛋白質エフェクターと作動可能に会合する。
【００２６】 本発明の第４の態様のある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトランスフ
ェラーゼをコードする。ある具体例において、蛋白質エフェクターは５−アザ−
シチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロー２’−デオキシ
シチジンおよび５，６−ジヒドロ−５−アザーシチジンよりなる群から選択され
る。ある具体例において、遺伝子はヒストンデアセチラーゼをコードする。ある
具体例において、蛋白質エフェクターはトリコスタチンＡ、デプデシン、トラポ
キシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−
２７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウムよりなる群から選択される。ある具
体例において、遺伝子はチミジレートシンターゼをコードする。ある具体例にお
いて、蛋白質エフェクターは５−フルオロウラシル、トムデックス、ラルティト
レキセド、ゼネカＺＤ１６９４、ゼネカＺＤ９３３１、チミタク、ＡＧ３３１、
Ｌｙ２３１５１４およびＢＷ１８４３Ｕ８９よりなる群から選択される。
【００２７】 本発明の第４の態様のある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチド
はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキ
ルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン
、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート
、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホ
スホロチオエートおよびスルホンヌクレオチド間結合よりなる群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有する。ある具体例において、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート、ホスホジエステルもしくはホス
ホロジチオエート領域およびアルキルホスホネートもしくはアルキルホスホロチ
オエート領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。ある具体例において、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドもしくは２’−Ｏ−置換リボ
ヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。
【００２８】 第５の態様において、本発明は、遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと作動可
能に会合した遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺
伝子の阻害剤を含む医薬組成物を提供する。ある具体例において、該組成物はさ
らに医薬上許容される担体を含む。
【００２９】 第６の態様において、本発明は、腫瘍細胞の増殖を含めた細胞増殖における、
遺伝子の役割および／または遺伝子の産物を調べる方法を提供する。本発明のこ
の態様の方法において、注目する細胞型は、本発明の第１の態様について記載し
たごとく、相乗量の遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドお
よび相乗量の遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと接触させ、その結果、細胞中
の遺伝子の発現が阻害される。ある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトラ
ンスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼおよびチミジレートシンターゼよりな
る群から選択される産物をコードする。本明細書中に記載した組合せを、細胞周
期における異なる時点において、あるいは細胞増殖のプロモーターまたは阻害剤
と組み合わせて投与して、注目する細胞型の増殖における、遺伝子の役割および
／または遺伝子の産物を決定することができる。
【００３０】 遺伝子および／または遺伝子産物の発現および／または活性を阻害する本発明
の方法、阻害剤および組成物を用いて、遺伝子の阻害に応答性の病気を有する、
または該病気を発症する素因がある患者を治療することができる。例えば、本発
明の阻害剤または組成物は、いずれかの結果としての病気兆候を軽減する試みに
おいて、遺伝子の阻害に応答性の病気に罹った患者へのいずれかの経路の投与を
介して、医薬上許容される担体（例えば、生理滅菌食塩水）と共に投与すること
ができる。例えば、本発明の阻害剤または組成物を用いて、癌、１つの例示的な
非限定的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害に対して応答性の病気に罹っ
た患者において癌の兆候を軽減することができる。医薬上許容される担体および
それらの処方はよく知られており、一般に、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎ
ａｒｏ編， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐ
Ａ，１９９０）に記載されている。
【００３１】 好ましい具体例の詳細な記載
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、遺伝子の発現が遺伝子レベルにおいてならびに蛋白質レベルに
おいて阻害される組合せアプローチを考案した。驚くべきことに、この組合せア
プローチは、遺伝子それ自体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに
遺伝子の産物に対する蛋白質エフェクター双方の効率についての必要な投与量を
低下させることが判明した。
【００３３】 本発明は、遺伝子レベルにおけるならびに蛋白質レベルにおける遺伝子発現の
修飾のための改良された方法、化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドおよび蛋白質エフェクターのごとき阻害剤）および組成物を提供する。加えて
、遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ）である場
合、本発明はメチル化によって調節された哺乳動物遺伝子発現の修飾のための方
法、化合物および組成物を提供する。本発明による方法および組成物は、トラン
スジェニック研究用の分析ツールとして、および遺伝子治療ツールを含めた治療
ツールとして有用である。本発明は、より少ない副作用しか生じさせないように
しつつ、治療すべき状態適合するように操作し、微妙に調整することができる方
法および組成物を提供する。組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記載する標準的参
考文献は、（Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， 第２版、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）； Ｋａｕｆｍａｎ
ら編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ ｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ， Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５）； ＭｃＰｈｅｒｓｏ
ｎ編、 Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９１）を
含む。当業者の知識をここに確立するのに言及するＧｅｎＢａｎｋデータベース
配列に対する受託番号を含めた特許および科学文献を、あたかも各々が引用によ
り具体的かつ個々に示されて取り込まれるのと同程度に、引用によってその全体
が取り込まれる。ここに引用したいずれかの文献および本明細書の具体的教示の
間のいずれのコンフリクトも後者に都合よく解決されるべきである。同様に、用
語またはフレーズの当該分野で理解されている定義および本明細書中で具体的に
教示された用語もしくはフレーズの定義の間のいずれのコンフリクトも後者に都
合よく解決されるべきである。
【００３４】
【課題を解決するための手段】
第１の態様において、本発明は、細胞を、有効な相乗量の遺伝子の発現を阻害
するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび有効な相乗量の遺伝子の産物の蛋白
質エフェクターと接触させることを特徴とする細胞における遺伝子の発現を阻害
する方法を提供する。本発明の第１の態様のある具体例において、細胞を、有効
な相乗量の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または少
なくとも１つの蛋白質エフェクターと、有効な時間接触させる。
【００３５】 本発明のすべての態様についてここに使用されるごとく、「蛋白質エフェクタ
ー」は、蛋白質レベルにおいて示された蛋白質または遺伝子の産物を阻害するこ
とができる活性な部位を示す。例えば、「ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェク
ター」又は「ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ遺伝子の産物の蛋白質エフェクター」は蛋白
質レベルにおいてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを阻害する。「遺伝子の産物」とは、該
遺伝子によってコードされた、二次修飾を問わず（例えば、グリコシル化、脂質
化またはリン酸化）、蛋白質またはポリペプチドを意味する。用語蛋白質エフェ
クターは、従って、限定することなく、示された蛋白質または遺伝子の産物の活
性を阻害することができる特異的酵素阻害剤を含む。蛋白質エフェクターは、示
された蛋白質の活性を、それがいずれかの無関係蛋白質の発生を阻害するよりも
大きな程度阻害する分子である。好ましくは、蛋白質エフェクターは、それがい
ずれかの無関係蛋白質を阻害するよりも少なくとも５倍、より好ましくは少なく
とも１０倍、なおより好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも
１００倍大きく示された蛋白質を阻害する。
【００３６】 用語「有効な相乗量」および「有効な時間」を用いて、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドおよび蛋白質エフェクターの既知の濃度および求められる結果を達成
するための効果的な時間を示す。有効な相乗量のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドおよび／または有効な相乗量の蛋白質エフェクターは、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドまたは蛋白質エフェクターのいずれかを個々に用いた場合に遺伝子を
阻害するのに必要だと経験的に見いだされた量未満である。好ましい具体的にお
いて、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクター
の組み合わせた阻害効果は加算されたものよりも大きく、すなわち、組み合わさ
れた阻害効果は、個々の阻害効果の合計に基づいて計算された予測全阻害効果よ
りも大きい。
【００３７】 本発明の全ての態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子の産物
をコードする二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの領域（またはＤＮＡまたはＲＮＡのイ
ントロン／エクソン境界における領域）に相補的である。本発明の目的では、用
語「オリゴヌクレオチド」は２以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオ
シド、または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド残基のポリマー、あるいはそのい
ずれかの組合せを含む。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、約６な
いし約１００ヌクレオシド残基、より好ましくは約８ないし約５０ヌクレオシド
残基、最も好ましくは約１２ないし約３０ヌクレオシド残基を有する。ヌクレオ
シド残基は、多数の公知のヌクレオシド間結合のいずれかによって相互に結合さ
せることができる。そのようなヌクレオシド間結合は、限定されるものではない
がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキ
ルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン
、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート
、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホ
スホロチオエートおよびスルホンヌクレオチド間結合を含む。ある好ましい具体
例において、これらのヌクレオシド間結合はホスホジエステル、ホスホトリエス
テル、ホスホロチオエート、またはホスホルアミデート結合、あるいはその組合
せであり得る。用語オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾された塩基または糖を
有するおよび／または限定されるものではないが親油性基、インターカレーティ
ング剤、ジアミンおよびアダマンタンを含めたさらなる置換基を有するそのよう
なポリマーも含む。本発明の目的では、用語「２’−Ｏ−置換」は、ペントース
部位の２’位置の、１−６の飽和もしくは不飽和炭素原子を含有するーＯ−低級
アルキル基での、あるいは２−６の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリ
ル基での置換を意味し、ここに、そのようなアルキル、アリールまたはアリル基
は置換されていなくても良く、あるいは、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフル
オロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ
ル、カルバルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよく；あるいはそのよ
うな２’置換は（リビボヌクレオシドを生じさせるための）ヒドロキシ基、アミ
ノもしくはハロ基でのものであって良く、２’−Ｈ基でのものではない。
【００３８】 本発明のこの態様で利用される特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド
はキメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】 本発明の目的では、「キメラオリゴヌクレオチド」とは１以上のタイプのヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを言う。そのようなキメラオリゴヌ
クレオチドの１つの好ましい例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまた
はホスホロジチオエート領域を含む、好ましくは約２ないし約１２ヌクレオシド
、およびアルキルホスホネートもしくはアルキルホスホノチオエート領域を含む
キメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Ｐｅｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５
，６３５，３７７号および第５，３６６，８７８号参照）。好ましくは、そのよ
うなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエスエルおよびホスホロチオエート
結合、またはその組合せから選択される少なくとも３つの連続ヌクレオシド間結
合を含有する。
【００４０】 本発明の目的では、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」とは、１を超えるタ
イプのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを言う。そのようなハイブリッ
ドオリゴヌクレオチドの１つの好ましい例は、好ましくは約２ないし約１２の２
’−Ｏ−置換ヌクレオチドを含むリボヌクレオチドもしくは２’−Ｏ−置換リボ
ヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。好ましくはそ
のようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは少なくとも３つの連続デオキシリボ
ヌクレオシドを含有し、また、リボヌクレオシド、２’−Ｏ−置換リボヌクレオ
シド、またはその組合せを含有する（例えば、ＭｅｔｅｌｅｖおよびＡｇｒａｗ
ａｌの米国特許第５，６５２，３５５号参照）。
【００４１】 オリゴヌクレオチドが注目する遺伝子の発現を阻害するその能力を保持する限
り、本発明で利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド
配列および化学構造は変化し得る。これは、その全てが本明細書またはＲａｍｃ
ｈａｎｄａｒｕら（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ ９４：６８４−６８９に詳細に記載されている、遺伝子の産物をコ
ードするｍＲＮＡを定量することによって、あるいは遺伝子の産物のためのウエ
スタンブロッティング分析アッセイにおいて、あるいは酵素的に活性な遺伝子産
物のための活性アッセイにおいて、軟寒天増殖アッセイにおいて、あるいは受容
体遺伝子構築体アッセイにおいて、あるいはイン・ビボ腫瘍増殖アッセイにおい
て特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性であるか否かをテストすること
によって容易に決定される。
【００４２】 本発明で利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、便宜には、Ｈ−ホス
ホネート化学、ホルホルアミダイト化学、またはＨ−ホスホネート化学およびホ
スホルアミダイト化学の組合せ（すなわち、いくつかのサイクルのためのＨ−ホ
スホネート化学および他のサイクルのためのホスホルアミダイト化学）を含めた
良く知られた化学アプローチを用いて適当な固体支持体上で合成できる。適当な
固体支持体は、制御されたポアのガラス（ＣＰＧ）のごとき固相オリゴヌクレオ
チド合成で使用される標準的な固体支持体を含む（例えば、Ｐｏｎ， Ｒ．Ｔ．
（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２０：４６５
−４９６参照）。
【００４３】 本発明の全ての態様のある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチド
のいずれも１以上の蛋白質エフェクターと作動可能に会合させることができる。
好ましい作動可能な結合は加水分解可能な会合である。好ましくは、加水分解可
能な会合はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの間の共
有結合である。好ましくは、そのような共有結合はエステラーゼおよび／または
アミダーゼによって加水分解可能である。そのような加水分解可能な結合の例は
引用して援用する、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０７３９２に示される。ホスフェート
エステルは特に好ましい。
【００４４】 ある好ましい具体例において共有結合は蛋白質エフェクターを骨格に一体化さ
せるようにアンチセンスオリゴヌクレオチドと蛋白質エフェクターとの間で直接
的であって良い。別法として、共有結合は拡大された構造を通じるものであって
良い。このタイプの結合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフ
ェクター双方の、炭水化物、ペプチド、または脂質または糖脂質のごとき担体分
子へのカップリングを通じて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを蛋白質エフェ
クターに共有結合させることによって形成させることができる。他の好ましい作
動可能な結合は、親油性分子に共有結合した、かくして、リポソームと会合した
オリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターを含有したリポソームの形成のご
とき親油性会合を含む。そのような親油性分子は、限定されるものではないが、
ホスホチジルコリン、コレステロールおよびホスファチジルエタノールアミン、
およびシアリラックＮａｃ−ＨＤＰＥのごとく合成ネオグリコリピドを含む。あ
る好ましい具体例において、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１つの
リポソームと会合し、かつ蛋白質エフェクターがもう１つのリポソームと会合す
る場合、作動可能な会合は物理的会合でなくて、単に身体中に同時に存在するの
であって良い。
【００４５】 本発明による方法および組成物は種々の目的で有用である。例えば、それらは
、実験細胞培養または動物系における遺伝子産物の活性および／または発現を阻
害するのに、およびそのような活性および／または発現を阻害する効果を評価す
るのに使用することによって、遺伝子産物の生理学的機能の「プローブ」として
使用することができる。これは、本発明および肉眼で観察による遺伝子の発現お
よび遺伝子の産物の蛋白質エフェクターを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを細胞または動物に投与することによって達成される。本発明によるこの方
法は、伝統的な「遺伝子ノックアウト」アプローチに対して好ましい。なぜなら
ば、使用するのが容易であって、それを用いて発生または分化の選択された段階
において遺伝子および／または遺伝子の産物を阻害するのに用いることができる
からである。例えば、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする場合、本発明
による該方法は、発生の種々の段階におけるＤＮＡのメチル化の役割をテストす
るためのプローブとして働くことができる。
【００４６】 最後に本発明による方法および組成物は、遺伝子発現の修飾および／または抑
制に関与する良性および悪性の腫瘍を含めたヒトの病気に対する治療アプローチ
で有用である。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗−腫瘍利用性
は本明細書中の他の箇所で詳細に記載する。
【００４７】 本明細書中で開示する本発明の態様のすべては、いずれの標的遺伝子の相乗的
阻害にも適用することができ、いずれかの特定の遺伝子または遺伝子産物には限
定されない。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子レベルにおいて（すなわち、Ｄ
ＮＡまたはｍＲＮＡレベルいずれかにおいて）および蛋白質レベルにおいての双
方において同一の標的遺伝子の同時もしくは順次の阻害によるいずれかの標的遺
伝子の阻害に関する。ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ、ヒストンデアセチラーゼおよびチ
ミジレートシンターゼにつきここで例示するごとく、そのような方法および組成
物は種々の目的で有用である。本発明の結果、改良された阻害効果がもたらされ
、それにより、阻害剤が個々に使用された場合に必要なものと比較して、所与の
阻害効果を得るのに必要な阻害剤の遺伝子レベルおよび蛋白質レベルのいずれか
または双方の有効な濃度を低下させる。
【００４８】 かくして、本発明の全ての態様による方法および組成物は、特定の標的遺伝子
の遺伝子発現の修飾および／または抑制に関与するヒトの病気に対する治療的ア
プローチで有用である。特に好ましい病気標的は限定されるものではないが、種
々の癌を含む。また、本発明による方法および組成物を用いてサイレンス遺伝子
を活性化し、失われた遺伝子機能を供し、かくして、所与の状態を改良すること
ができる。例えば、本発明の方法および組成物は、異常オンコジーンの発現およ
び活性を下降調節および／または抑制するのに有用であり、それにより、腫瘍形
成を阻害する。
【００４９】 ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェク
ターの各々は細胞との接触に先だって医薬上許容される担体と混合される。ある
具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターは
細胞との接触に先だって一緒に混合される。
【００５０】 本発明の第１の態様のある好ましい具体例において、細胞は別々にアンチセン
スオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターと接触させる。例えば、細胞は
蛋白質エフェクターと接触させるに先だってアンチセンスオリゴヌクレオチドと
接触させることができる。細胞は、有効相乗量の本発明の１以上のアンチセンス
オリゴヌクレオチドと接触させ、続いて有効相乗量の本発明の１以上の蛋白質エ
フェクターと接触させることができる。これは、特に、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅをコードする場合、および接触させた細胞がアポトーシスを受けるのがあ
るいは細胞周期のＳ相に留められるのが望ましい場合に有用である。
【００５１】 もう１つの例において、細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる
に先だって蛋白質エフェクターと接触させることができる。これは、特に、遺伝
子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードし、接触された細胞が細胞周期のＧ1相に留
められる場合に有用である。
【００５２】 さらに、遺伝子が例えばＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする場合、本発明によ
る方法および組成物を用いてサイレント遺伝子を活性化し、失われた遺伝子の機
能を供し、かくして、病気の兆候を軽減することもできる。例えば、病気ベータ
ーサラセミアおよび釜状細胞貧血は、成人ベーターグロビン遺伝子の、または突
然変異した遺伝子の異常発現によって引き起こされる。これらの病気に罹ったほ
とんどの個体はベーターグロビンについての胎児遺伝子の正常なコピーを有する
。しかしながら、胎児遺伝子は過剰メチル化されており、サイレントである。胎
児グロビン遺伝子の活性化は必要なグロビン機能を供し、かくして、病気の兆候
を軽減し得る。加えて、本発明による方法および組成物は、そうでなければメチ
ル化による阻害を受けやすい外因性配列の発現を維持し、活性化しおよび／また
は修飾する遺伝子治療のツールとして用いることができる。
【００５３】
【発明の実施の態様】
従って、本発明の第１の態様のある具体例において、遺伝子はＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅをコードする。本発明による方法で利用されるＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコ
ードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの特に好ましい非限定的な例は表１に示す。ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ＲＮ
Ａ（例えば、Ｙｅｎら， （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９ ： ２２８７−２２９１； Ｙｏｄｅｒら， （１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２７１： ３１０９２−３１０９７； Ｂｅｓｔｅｒら， （１
９８８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２０３（４）： ９７１−９８３参照）
または二本鎖ＤＮＡ領域は、限定されるものではないが、イントロン配列、非翻
訳５’および３’領域、イントロン−エクソン境界ならびにＤＮＡ ＭｅＴａｓ
ｅ遺伝子からのコーディング配列を含む（Ｒａｍｃｈａｎｄａｎｉら， （１９
９８） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７９（４−５）： ５３５−５４０参照）
。
【００５４】 特に好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示されたヌクレオチド配列を含む
約１３ないし約３５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。なおさらなる特
に好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示されたヌクレオチド配列うちの約１
３ないし約１９ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。
【００５５】
【表１】 本明細書中で用いるごとく、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクターは、好
ましくは、それがいずれかの無関係蛋白質を阻害するよりも少なくとも５倍、よ
り好ましくは少なくとも１０倍、なおより好ましく５０倍、最も好ましくは少な
くとも１００倍大きくＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを阻害する。
【００５６】 好ましい具体例において、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクターはＤＮＡ
メチルトランスフェラーゼとで安定なアダクトを形成することができ、かくして
、メチル化の間に形成されると考えられる一過的共有結合中間体複合体を模倣す
ることができる部位である（例えば、ＷｕおよびＳａｎｔｉ （１９８７） Ｊ
． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４７７８−４７８６）。ＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅ蛋白質エフェクターの好ましい例は、限定されるものではないが、５−ア
ザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）、５−フルオロ−２’−デオキ
シシチジン、５−アザ−シチジン（５−アザ−Ｃ）、または５，６−ジヒドロ−
５−アザシチジンまたはその医薬上許容される塩のごときヌクレオシドアナログ
を含む。５’−アザ−シチジンから５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンを合成
する方法は、出典明示して本明細書のその全体を一部とみなす米国特許第４，０
５８，６０２号に記載されている。さらなるＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェ
クターは、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／４４３４６ （ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／Ｉ
Ｂ９７／００８７９）に記載されているヘアピンオリゴヌクレオチドを含めたＤ
ＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素を含む。
【００５７】 本発明の全ての態様の特に好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドは蛋白質エフェクターと作動可能に会合する。用語「作動可能な会合」
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ遺伝子発現を阻害
するのを可能とし、蛋白質エフェクターがＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ酵素活性を阻害
するのを可能とする、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクタ
ーの間のいずれの会合も含む。
【００５８】 本発明の第１の態様の好ましい具体例において、本発明は、細胞を、有効な相
乗量のＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ発現を阻害するオリゴヌクレオチドおよび有効な相
乗量のＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクターと接触させることを特徴とする
細胞中にてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを阻害する方法を提供する。
【００５９】 本発明の第１の態様のある好ましい具体例において、遺伝子はＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅをコードし、細胞は、その発現がメチル化によって不活化されている遺伝
子を含む。かくして、遺伝子の発現は接触した細胞において促進されるおよび／
再度活性化される。好ましくは、本発明は、新形成細胞または新形成となる素因
のある細胞のごとき細胞においてメチル化によって不活化されている腫瘍サプレ
ッサー遺伝子の再活性化のための組成物および方法を提供する。本発明の全ての
態様につき本明細書中で用いる「新形成細胞」とは、増加した細胞増殖のごとき
異常な細胞増殖を示す細胞を意味する。新形成細胞は過剰形成細胞、イン・ビト
ロで増殖の接触阻止の欠如を示す細胞、イン・ビボで転移できない腫瘍細胞、ま
たはイン・ビボで転移できる癌細胞であり得る。転移性であるかまたは良性であ
るかを問わず、新形成細胞のいずれの増殖もここでは腫瘍または腫瘍増殖という
。
【００６０】 ある好ましい具体例において、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする場
合、本発明は、メチル化によって不活化されている腫瘍サプレッサー遺伝子の不
活化のための組成物および方法を提供する。特に好ましい具体例において、本発
明はメチル化によって阻害されているｐ１６腫瘍サプレッサー遺伝子の再活性化
のための方法を提供する。
【００６１】 本発明のこの態様のある好ましい具体例において、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅに限定されない産物をコードする場合、例えば、７５％もと多いヒト膵臓癌
に関連付けられてきたＲＡＳオンコジーンファミリーの突然変異形態（例えば、
Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓら（１９９２） Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．
３（４）；２４１−２４７； Ｂｒｅｎｔｎａｌｌら （１９９５） Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（１９）；４２６４−４２６７参照）のごとき標的オン
コジーンの修飾のための方法および組成物が提供される。
【００６２】 また、本発明による方法および組成物を用いていずれの数の標的遺伝子および
／またはこれらの遺伝子の産物も阻害することができる。その結果、本発明の方
法および組成物は、本明細書中で議論するごとく炎症または喘息のごとき種々の
ヒト疾患に対する治療アプローチで有用である。
【００６３】 従って、本発明の第１の態様のある具体例において、遺伝子はヒストンデアセ
チラーゼ（ＨＤＡＣ）をコードする。ヒストンデアセチラーゼにはいくつかの関
連形態のヒストンデアセチラーゼファミリーがある。該ファミリーはＨＤＡＣ−
１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５およびＨＤＡＣ
−６を含む。ヒストンデアセチラーゼ活性は、転写因子のエンハンサーおよびプ
ロモーターエレメントへの接近性を修飾すると考えられ、機能的ヒストンデアセ
チラーゼは正常および新形成細胞の双方において細胞周期の進行の要件として関
連付けられてきた。かくして、本発明のこの態様のある具体例において、本発明
は、少なくとも１つのＨＤＡＣをコードする遺伝子、および例えば、トリコスタ
チンＡ（ＴＳＡ）、デプデシン、トラポキシン、スベロイルアミニドヒドロキサ
ム酸（ＳＨＨＡ）、ＦＲ９０１２２８ （Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ），ＭＳ−２７−２７５ （Ｍｉｔｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ）、ＣＩ−９９４ （Ｐａｒｋｅ Ｄｅｖｉｓ）オキサムフラチン （
Ｓｈｉｏｎｏｇｉ ａｎｄ Ｃｏ．）および酪酸ナトリウムのごとき少なくとも
１つのＨＤＡＣの活性および／または発現を阻害することができる阻害できるＨ
ＤＡＣ蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いるヒストンデア
セチラーゼ （例えば、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ
−４、ＨＤＡＣ−５およびＨＤＡＣ−６）の阻害剤を提供する。ＨＤＡＣ蛋白質
エフェクター、好ましくは、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤ
ＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５および／またはＨＤＡＣ−６をそれがいずれかの無関係
蛋白質を阻害するよりも少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、よ
り好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍大きく阻害
する。本発明の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＤＡＣ−１、
ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５および／またはＨＤ
ＡＣ−６をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的である（例えば
、ＨＤＡＣ−１についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５００７９、ＨＤＡＣ−２
についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３１８１４、およびＨＤＡＣ−３について
はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７５６９７参照）。特に、好ましいオリゴヌクレオ
チドは、表２および３に示されたヌクレオチド配列を含む約１３ないし約３５ヌ
クレオチドのヌクレオチド配列を有する。さらなる特に好ましいオリゴヌクレオ
チドは、表２および３に示されたヌクレオチド配列の約１５ないし約２６ヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を有する。
【００６４】
【表２】
【００６５】
【表３】 もう１つの具体例において、本発明の標的化遺伝子はチミジレートシンターゼ
をコードする。チミジレートシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、ヌクレ
オシドアナログ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＴｏｍｕｄｅｘTM （Ｒａ
ｌｔｉｔｒｅｘｅｄまたはＺｅｎｅｃａ ＺＤ１６９４）、Ｚｅｎｅｃａ ＺＤ
９３３１、ＴｈｙｍｉｔａｑTM（ＡＧ３３７、Ａｇｏｕｒｏｎ）、ＡＧ３３１（
Ａｇｏｕｒｏｎ）、Ｌｙ２３１５１４ （Ｌｉｌｌｙ）、およびＢＷ１８４３Ｕ
８９のごとき、チミジレートシンターゼおよびチミジレートシンターゼを阻害で
きるチミジレートシンターゼ蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌクレオチド
を用いて標的化することができる。チミジレートシンターゼ蛋白質エフェクター
は、好ましくは、チミジレートシンターゼを、それがいずれかの無関係蛋白質を
阻害するよりも少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、最も好まし
くは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍大きく阻害する。本
発明のこの態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、チミジレートシンタ
ーゼ （例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２３０８参照）をコードするＲＮ
Ａまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的である。特に、好ましいオリゴヌクレオチ
ドは、表４に示されたヌクレオチド配列を含む約１５ないし約３５ヌクレオチド
のヌクレオチド配列を有する。なおさらなる特に好ましいオリゴヌクレオチドは
、表４に示されたヌクレオチド配列の約１３ないし約２０ヌクレオチド配列を有
する。
【００６６】
【表４】 さらにもう１つの標的は、例えば、（例えば、腫瘍および／または自己免疫炎
症疾患治療のための）メトトレキセート（ＭＤＸ）のごときジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ＤＨＦＲ）活性を阻害できるＤＨＦＲ発現またはＤＨＦＲ蛋白質エフェ
クターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ
ＦＲ）である。ＤＨＦＲ蛋白質エフェクターは、好ましくは、それがいずれかの
無関係蛋白質を阻害するよりも少なくとも５倍、より好ましくは１０倍、最も好
ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍大きく阻害する
。
【００６７】 本発明のこの態様による（例えば、炎症の治療のための）さらなる好ましい標
的は、例えば、Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ （ＳＣ５８６３５）のごとき、（ＣＯＸ−
２）発現および（ＣＯＸ−０２）活性を阻害するＣＯＸ−２蛋白質エフェクター
を阻害するオリゴヌクレオチドを用いるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２
）；例えば、３−アジド−３−デオキシチミジンのごとき、テロメラーゼ発現お
よびテロメラーゼ活性を阻害する蛋白質エフェクターを阻害するオリゴククレオ
チドを用いるテロメラーゼ； 例えば、Ｔｏｐｏｔｏｃａｎ（ＳｍｉｔｈＫｌｉ
ｎｅ）またはＣａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎのごとき、トポイソメラーゼＩ発現およ
びトポイソメラーゼＩ活性を阻害するトポイソメラーゼＩ蛋白質エフェクターを
阻害するオリゴヌクレオチドを用いるトポイソメラーゼＩ；例えば、Ｅｔｏｐｏ
ｓｉｄｅ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）のごとき、トポイソメ
ラーゼＩＩ発現およびトポイソメラーゼＩＩ活性を阻害するトポイソメラーゼＩ
Ｉ蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いるトポイソメラーゼ
ＩＩ； 例えば、Ａｒａ−Ｃのごとき、ＤＮＡポリメラーゼα発現およびＤＮＡ
ポリメラーゼα活性を阻害するＤＮＡポリメラーゼα蛋白質エフェクターを阻害
するオリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡポリメラーゼα； 例えば、Ｌｅｔｒｏ
ｚｏｌｅ （Ｆｅｍａｒａ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、アナストロゾール （Ａｒｉ
ｍｉｄｅｘ、Ｚｅｎｅｃａ）、ボロゾール（Ｒｉｚｉｖｏｒ）のごときアロマタ
ーゼ発現およびアロマターゼ活性を阻害する蛋白質エフェクターを阻害するオリ
ゴヌクレオチドを用いるアロマターゼ； 例えば、ＦＫ１４３（Ｆｕｊｉｓａｗ
ａ）、Ｌｙ３００５０２ （Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）のごとき、
５−αレダクターゼ発現および５−αーレダクターゼ活性を阻害する５−αーレ
ダクターゼ蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いる５−αー
レダクターゼ； 例えば、ＯＮＯ−５０４６.Ｎａのごとき好中球エラスターゼ
発現および好中球エラスターゼ活性を阻害する好中球エラスターゼ蛋白質エフェ
クターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いる（例えば、炎症を治療するための
）好中球エラスターゼ；例えば、Ｌ７４４８３２（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＭＳ１
８６５１１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）のごとき、ファルメ
シルトランスフェラーゼ発現およびファルメシルトランスフェラーゼ活性を阻害
するファルメシルトランスフェラーゼ蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌク
レオチドを用いるファルメシルトランスフェラーゼ；例えば、Ｆｌａｖｏｐｉｒ
ｉｄｏｌのごとき、ＣＤＫ発現およびＣＤＫ活性を阻害するＣＤＫ蛋白質エフェ
クターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いるサイクリンキナーゼ（ＣＤＫ）；
例えば、ＰＤ１５３０３５（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）のごときＥＧＦＲ発現お
よびＥＧＦＲ活性を阻害するＰＧＦＲ蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌク
レオチドを用いる表皮成長因子受容体 （ＰＧＦＲ）；例えば、Ｔｙｒｐｈｏｓ
ｔｉnまたはＡＧ８２５（Ａｇｏｕｒｏｎ）のごときＨｅｒ−２／Ｎｅｕ発現お
よびＨｅｒ−２／Ｎｅｕ活性を阻害するＨｅｒ−２／Ｎｅｕ蛋白質エフェクター
を阻害するオリゴヌクレオチドを用いるＨｅｒ−２／Ｎｅｕ；例えば、ＭＫ５７
１（Ｍｅｒｃｋ）のごとき、ロイコトリエン受容体ＬＴＤ４発現およびロイコト
リエン受容体ＬＴＤ４活性を阻害するロイコトリエン受容体ＬＴＤ４蛋白質エフ
ェクターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いる（例えば、喘息の治療のための
）ロイコトリエン受容体ＬＴＤ４；例えば、ＰＳＣ８３３、シクロスポリンＡア
ナログのごとき、Ｐ−糖蛋白質発現およびＰ−糖蛋白質活性を阻害するＰ−糖蛋
白質蛋白質エフェクターを阻害するオリゴヌクレオチドを用いるＰ−糖蛋白質を
含む。
【００６８】 第２の態様において、本発明は遺伝子の阻害に応答性の病気を治療する方法を
提供する。本発明のこの態様の方法は、遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオ
リゴヌクレオチド、および治療上有効な相乗量の遺伝子の産物の蛋白質エフェク
ターを、当該病気によって影響された少なくとも一種の細胞を有するヒトを含め
た哺乳動物に投与することを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白
質エフェクターは本発明による第１の態様について記載されている［遺伝子の阻
害に応答性の病気］は、遺伝子および／または遺伝子の産物の変化した活性、レ
ベルまたは機能と関連するものである。そのような病気の兆候は、遺伝子または
該遺伝子の産物の活性の修飾によって軽減および／または排除される。「病気に
よって影響された細胞」は、遺伝子および／または該遺伝子の産物の変化した活
性、レベルまたは機能を有する細胞である。
【００６９】 例えば、「ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ阻害に応答性の病気」は変化したメチル化パ
ターンまたは変化したＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ活性、レベルまたは機能に関連する
ものである。そのような病気の兆候はＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ活性の修飾によって
軽減および／または排除される。「ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ阻害に応答性によって
影響された病気の細胞」は変化したメチル化パターンまたは変化したＤＮＡ Ｍ
ｅＴａｓｅ活性または機能を有する細胞である。
【００７０】 本発明の第２の態様のある具体例において、治療上有効な相乗量の少なくとも
１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの蛋白質
エフェクターを、治療上有効な時間、哺乳動物に投与する。
【００７１】 用語「治療上有効な相乗量」および「治療上有効な時間」は、求められた治療
効果を達成するのに有効な投与量および時間での試料を示すのに用いる。治療上
有効な相乗量のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または治療上有効な相
乗量の蛋白質エフェクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは蛋白質エ
フェクターのいずれかを個々に用いた場合に遺伝子を阻害するのに必要だと経験
的に見いだされた量より少ない。好ましい具体例において、本発明によるアンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの組み合わされた阻害効果
は相加的よりも大きく、すなわち、組み合わされた阻害効果は個々の効果の合計
を基礎として計算された予測される全効果よりも大きい。当業者であれば、アン
チセンスオリゴヌクレオチド、蛋白質エフェクターまたはその双方いずれかのよ
り低い有効濃度をもたらすそのような相乗効果は、組織、器官、または本発明に
従って治療すべき特定の哺乳動物または患者に依存してかなり変化し得る。さら
に、当業者であれば、他の成分の量を微妙に調整し変化させることによって、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは蛋白質阻害剤のいずれかの治療上有効な相
乗量を低下させるか増加させることができる。従って、本発明は、所与の哺乳動
物または患者に特異的な特定の緊急性に対して投与／治療を調整する方法を提供
する。以下の実施例に説明されるごとく、治療上有効な相乗範囲は、例えば、比
較的低い量で出発することによって、および阻害の同時評価を段階的に増加させ
ることによって、経験的に容易に決定できる。特に好ましい具体例において、本
発明の治療組成物は、約０．０１μＭないし約２０μＭのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの血中レベルおよび約０．０１μＭないし約１０μＭの蛋白質エフェ
クターの血中レベルを達成するのに十分な投与量にて全身投与される。特に好ま
しい具体例において、治療組成物は、約０．０５μＭないし約１５μＭのアンチ
センスオリゴヌクレオチドの血中レベルおよび約０．０５μＭないし約１０μＭ
の蛋白質エフェクターの血中レベルを達成するのに十分な投与量にて投与される
。なおより好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中レ
ベルは約０．１μＭないし約１０μＭであって、蛋白質エフェクターの血中レベ
ルは約０．１μＭないし約７μＭである。局所投与では、これよりもかなり低い
濃度で有効であり得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全投与
量は一日当たり体重１ｋｇにつき約０．１ｍｇないし約３０ｍｇのオリゴヌクレ
オチドの範囲であり、他方、蛋白質エフェクターの全投与量は１日当たり体重１
ｋｇあたりにつき約０．０１ｍｇないし約５ｍｇ蛋白質エフェクターの範囲であ
る。より好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全投与量
は１日当たり体重１ｋｇ当たりにつき約１ｍｇないし約２０ｍｇオリゴヌクレオ
チドの範囲であって、他方、蛋白質エフェクターの全投与量は１日につき体重１
ｋｇ当たり約０．１ｍｇないし約４ｍｇ蛋白質エフェクターの範囲である。最も
好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全投与量は１日当
たり体重１ｋｇ当たりにつき約２ｍｇないし約１０ｍｇオリゴヌクレオチドの範
囲であって、他方、蛋白質エフェクターの全投与量は１日当たり体重１ｋｇ当た
りにつき約０．１ｍｇないし約１ｍｇ蛋白質エフェクターの範囲である。特に好
ましい具体例について、治療上有効な相乗量のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は１日当たり体重１ｋｇにつき０．５ｍｇオリゴヌクレオチドであって、蛋白質
エフェクターの効果的な相乗量は１日当たり体重１ｋｇにつき０．１ｍｇである
。
【００７２】 ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェク
ターの各々は哺乳動物への投与に先立って医薬上許容される担体と混合される。
ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクタ
ーは哺乳動物への投与に先立って一緒に混合される。
【００７３】 本発明の全ての態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフ
ェクターの各々は、所望により、よく知られた医薬上許容される担体または希釈
剤とのいずれかとで処方することができる。医薬上許容される担体およびそれら
の処方はよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０）
に一般的に記載されている。本発明の処方はさらに、１以上のＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅ阻害剤および／または１以上のさらなるＤＮＡ ＭｅＴａｓｅアンチセンス
オリゴヌクレオチド、および／または１以上の蛋白質エフェクターを含有するこ
とができるか、あるいはそれはいずれかの他の薬理学的に活性な剤を含有するこ
とができる。もしアンチセンスオリゴヌクレオチドが蛋白質エフェクターと共に
投与されれば、両者は医薬上許容される担体と一緒に混合することができる。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは蛋白質エフェクターから別々に投与される場合
、各々は医薬上許容される担体と混合することができる。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドおよび蛋白質エフェクターは別々に投与される場合、同一の医薬上許
容される担体は記載したものと同一である必要はない。むしろ、医薬上記載され
る担体はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの投与の程
度に依存する。
【００７４】 本発明の組成物は、いずれかの適当な手段によって投与することができる。例
えば、本発明の組成物は、慣用的な医薬プラクティスに従って単位投与量にて医
薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤内にて哺乳動物に投与することができ
る。投与は、遺伝子の阻害に応答性の病気について哺乳動物が兆候にある前に開
始することができる。例えば、病気が癌のごときＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ阻害に応
答性である場合、投与は動物が兆候がでる前に開始することができる。
【００７５】 限定されるものではないが、非経口静脈内、動脈内、皮下、舌下、経皮、局
所、肺内、筋肉内、腹腔内、吸入、鼻孔内、アエロゾル、直腸内、膣内、または
経口投与を含めた投与のいずれかの適当な経路を用いることができる。治療剤は
液状溶液もしくは懸濁物の形態とでき；経口投与では、処方は錠剤またはカプセ
ル剤の形態とすることができ； 鼻孔内処方では、粉末、点鼻薬、またはアエロ
ゾルの形態にできる。組成物は、遺伝子の阻害に応答性の病気によって影響され
た領域に局所投与することができる。例えば、病気がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ阻害
に応答性であり、癌である場合、組成物は腫瘍塊に直接投与することができる。
本発明の組成物は全身投与することができる。
【００７６】 本発明の第２の態様のある好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび蛋白質エフェクターは別々に哺乳動物に投与される。例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、蛋白質エフェクターの哺乳動物への投与に先
立って哺乳動物に投与することができる。哺乳動物は１以上の投与量の蛋白質エ
フェクターを摂取するに先立って１以上の投与量のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを摂取することができる。遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする場合
、この投与スケジュールは、病気によって影響された細胞がアポトーシスを受け
るか、あるいは細胞周期のＳ相に留めるのが望ましい場合に特に有用である。そ
のような投与スケジュールは、例えば、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコード
し、病気が転移性癌のごとき攻撃的細胞増殖病である場合に有用であり得る。
【００７７】 もう１つの例において、蛋白質エフェクターはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの投与に先立って哺乳動物に投与することができる。哺乳動物は１以上の投与
量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを摂取するに先立って１以上の投与量の蛋
白質エフェクターを摂取することができる。遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコ
ードする場合、この投与スケジュールは、病気によって影響された細胞が細胞周
期のＧ1相に留められるのが望ましい場合に特に有用である。そのような投与ス
ケジュールは、例えば、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする場合、およ
び病気が、死滅よりもむしろその増殖阻止が望まれる細胞と関係する場合に有用
であり得る。そのような病気の１つの限定的例は移植片拒絶であり、ここに宿主
の免疫細胞（例えば、リンパ球および白血球）は移植片における外来性細胞に応
答して増殖する。アポトーシスによるこれらの細胞の死滅よりもむしろ宿主免疫
細胞の増殖の阻止が望ましい。
【００７８】 本発明の第２のある好ましい具体例において、遺伝子はＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ
をコードし、病気によって影響された細胞は、その発現がメチル化によって不活
化されている遺伝子を含む。ある具体例において、遺伝子の発現は、治療中有効
な相乗量のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび治療中有効な相乗量の蛋白質
エフェクターが投与された哺乳動物中の細胞にて促進され、回復され、および／
または再活性化される。好ましい具体例において、遺伝子はｐ１６ink4腫瘍サプ
レッサー遺伝子である。
【００７９】 本発明のこの態様のある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトランスフェ
ラーゼをコードする。ある具体例において、蛋白質エフェクターは５−アザ−シ
チジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシ
チジンおよび５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンよりなる群から選択される。
【００８０】 この態様のある具体例において、遺伝子はヒストンデアセチラーゼをコードす
る。ある具体例において、蛋白質エフェクターは、トリコスタチンＡ、デプデシ
ン、トラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＦＲ９０１２２８、Ｍ
Ｓ−２７−２７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウムよりなる群から選択され
る。
【００８１】 この態様のある具体例において、遺伝子はチミジレートシンターゼをコードす
る。ある具体例において蛋白質エフェクターは５−フルオロウラシル （５−Ｆ
Ｕ）、トムデックス、ラルティトレキセド、ゼネカＺＤ１６９４、ゼネカＺＤ９
３３１、チミタク、ＡＧ３３１、Ｌｙ２３１５１４およびＢＷ１８４３Ｕ８９よ
りなる群から選択される。
【００８２】 第３の態様において、哺乳動物において腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
本発明のこの態様による方法は、その身体中に存在する少なくとも１つの新形成
細胞を有するヒトを含めた哺乳動物に、治療上有効な相乗量の腫瘍形成に関与す
る遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および治療上有効
な相乗量の遺伝子の産物の蛋白質エフェクターを投与することを含む。本明細書
中で用いるごとく、「腫瘍形成に関与する遺伝子」は、その異常発現が腫瘍形成
に関連する遺伝子である。腫瘍形成に関与する例示的遺伝子は、ＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（全ての形態）およびチミジレート
シンターゼをコードする遺伝子を含む。「腫瘍形成」は、新形成細胞となる正常
細胞の進行に関与する遺伝子的および表現型的事象を意味する。アンチセンスオ
リゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターは本発明による第１の態様で記載し
た通りである。投与および投与量は本発明の第２の態様で記載した通りである。
【００８３】 本発明のこの態様のある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトランスフェ
ラーゼをコードする。ある具体例において、蛋白質エフェクターは５−アザ−シ
チジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシ
チジンおよび５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンよりなる群から選択される。
【００８４】 この態様のある具体例において、遺伝子はヒストンデアセチラーゼをコードす
る。ある具体例において、蛋白質エフェクターはトリコスタチンＡ、デプデシン
、トラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ
−２７−２７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウムよりなる群から選択される
。
【００８５】 この態様のある具体例において、遺伝子はチミジレートシンターゼをコードす
る。ある具体例において、蛋白質エフェクターは５−フルオロウラシル、トムデ
ックス、ラルティトレキセド、ゼネカＺＤ１６９４、ゼネカＺＤ９３３１、チミ
タク、ＡＧ３３１、Ｌｙ２３１５１４およびＢＷ１８４３Ｕ８９よりなる群から
選択される。
【００８６】 本発明の第３の態様の具体例において、治療上有効な相乗量の少なくとも１つ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの蛋白質エフ
ェクターを、治療上有効な時間、哺乳動物に投与する。用語「治療上有効な相乗
量」および「治療上有効な時間」は本発明の第２の態様に記載された通りである
。第３の態様のある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋
白質エフェクターの各々は、哺乳動物への投与に先立って医薬上許容される担体
と混合される。ある具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋
白質エフェクターは哺乳動物への投与に先立って混合される。
【００８７】 本発明の第３の態様のある好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび蛋白質エフェクターは別々に哺乳動物に投与される。例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは蛋白質エフェクターの投与に先立って哺乳動物
に投与することができる。これは、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする
場合、および哺乳動物中の新形成細胞がアポトーシスを受けるか、細胞周期のＳ
相に留まるのが望ましい場合に望ましい。この投与スケジュールは、例えば、メ
ラノーマのごとき攻撃的な転移性腫瘍の治療で特に有用である。
【００８８】 別法として、蛋白質エフェクターはアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に
先立って哺乳動物に投与することができる。このスケジュールは、遺伝子がＤＮ
Ａ ＭｅＴａｓｅをコードする場合、および哺乳動物中の新形成細胞が細胞周期
のＧ1相に増殖捕獲されるのが望まれる場合に望ましい。この投与スケジュール
は、例えば、より遅い増殖腫瘍 （例えば、前立腺癌）の治療において、あるい
はアポトーシス細胞の存在が望ましくない場合に弱い患者の治療で特に有用であ
る。
【００８９】 本発明の第３の態様のある好ましい具体例において、遺伝子がＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅをコードする場合、新形成細胞は、さらに、その発現がメチル化によって
不活化されている遺伝子を含む。ある具体例において、遺伝子の発現は、治療上
有効な相乗量のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび治療上有効な相乗量の蛋
白質エフェクターが投与されている哺乳動物中の新形成細胞において促進され、
回復されおよび／または再活性化される。好ましい具体例において、遺伝子はｐ
１６ink4腫瘍サプレッサー遺伝子である。
【００９０】 第４の態様において、本発明は、遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと作動可
能に会合した遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺
伝子の阻害剤を提供する。本発明のこの態様のある具体例において、アンチセン
スオリゴヌクレオチドは２以上の蛋白質エフェクターと作動可能に会合している
。
【００９１】 本発明のこの態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクタ
ーは本発明による第１の態様につき記載した通りである。
【００９２】 本発明の第４の態様のある具体例において、遺伝子はＤＮＡメチルトランスフ
ェラーゼをコードする。ある具体例において、蛋白質エフェクターは５−アザ−
シチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシ
シチジンおよび５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンよりなる群から選択される
。ある具体例において、遺伝子はヒストンデアセチラーゼをコードする。ある具
体例において、蛋白質エフェクターはトリコスタチンＡ、デプデシン、トラポキ
シン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２
７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウムよりなる群から選択される。ある具体
例において、遺伝子はチミジレートシンターゼをコードする。ある具体例におい
て、蛋白質エフェクターは５−フルオロウラシル、トムデックス、ラルティトレ
キセド、ゼネカＺＤ１６９４、ゼネカＺＤ９３３１、チミタク、ＡＧ３３１、Ｌ
ｙ２３１５１４およびＢＷ１８４３Ｕ８９よりなる群から選択される。
【００９３】 第５の態様において、本発明は、蛋白質エフェクターと作動可能に会合したア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺伝子の阻害剤を含む医薬組成物を提供す
る。ある具体例において組成物は医薬上許容される担体を含む。
【００９４】 第６の態様において、本発明は、腫瘍細胞の増殖を含めた細胞増殖における遺
伝子および／またはその遺伝子の産物の役割を調べる方法を提供する。この態様
による方法において、本発明による第１の態様で記載したごとく、注目する細胞
型 （例えば、新形成細胞）を、相乗量の遺伝子の発現を阻害するアンチセンス
オリゴヌクレオチドおよび相乗量の遺伝子の産物の蛋白質フェクターと接触させ
、その結果細胞中の遺伝子の発現が阻害される。本明細書中で記載する組合せは
、細胞周期における異なる地点で（例えば、Ｃ1相、Ｓ相またはＧ2／Ｍ相におい
て）、あるいは細胞増殖のプロモーターまたは阻害剤と一緒に投与して、注目す
る細胞型の増殖における遺伝子（例えば、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅをコードする遺
伝子）の役割を決定することができる。ある具体例において、細胞は新形成細胞
である。
【００９５】 以下の実施例は本発明のある好ましい具体例をさらに説明し、その性質上非限
定的である。当業者であれば、ルーチン的実験、本明細書に記載された特異的物
質および手法と多数の同等のものにすぎないものを用いて認識し、または確認で
きる。そのような同等なものは本発明の範囲内にあるものと考えられ、以下の請
求の範囲によってカバーされる。
【００９６】 実施例１ 新形成においてＭｅＴａｓｅ発現を制限できるアンチセンスオリゴヌクレオチ ドの選択 ヒト新形成細胞においてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ遺伝子発現を阻害できるアンチ
センスオリゴヌクレオチドを同定するために、ヒトＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲ
ＮＡの５’および３’領域に相補的な配列およびイントロンーエクソン境界に相
補的な配列を担う８５ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（各々、
長さが２０塩基対）を合成し、アンチセンス活性につきスクリーニングした。図
１に示すごとく、アンチセンス阻害に対して高度に感受性があると同定される２
つのＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡ領域を、配列５’−ＡＡＧ ＣＡＴ ＧＡ
Ｇ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＵ ＣＣ−３’（配列番号：４８）（このオリゴヌク
レオチドはヌクレオチド５３２ないし５１３においてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍ
ＲＮＡ ５’ＵＴＲ に対して標的化される）を有するＭＧ８８および配列、５
’−ＵＵＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＣ−３’（配列番号
：４９）（このオリゴヌクレオチドはヌクレオチド５２１８ないし５１９９にお
いてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲに対して標的化されている）
を有するＭＧ９８によって標的化された。これらのオリゴヌクレオチドは以下の
ごとく化学的に修飾された：Ａは２’−デオキシリボアデノシンに等しく；Ｃは
２’−デオキシリボアシチジンに等しく；Ｇは２’−デオキシリボグアノシンに
等しく；Ｔは２’−デオキシリボチミジンに等しく；Ａはリボアデノシンに等し
く；Ｕはウリジンに等しく；Ｃはリボシチジンに等しく；Ｇはリボグアノシンに
等しい。下線を施した塩基は２’−メトキシリボース置換ヌクレオチドであった
。非置換塩基はデオキシリボースヌクレオシドであった。各オリゴヌクレオチド
の骨格は隣接するヌクレオチドの間のホスホロチオエート結合よりなるものであ
った。ＭＧ８８およびＭＧ９８は、各々、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡの阻
害について４０ｎＭおよび４５ｎＭのＩＣ50値を有する。
【００９７】 次に、２つのヒト新形成細胞、Ａ５４９（ヒト非−小細胞肺癌細胞を）およ
びＴ２４（ヒト膀胱癌細胞）においてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡを阻害す
る能力につきＭＧ８８をテストした。細胞をリポフェクチンのみ（６．２５ μ
ｇ／ｍｌ）、またはリポフェクチン＋２０、４０または８０ｎＭのＭＧ８８また
は配列５’−ＡＡＣ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＴＧＵ ＣＣ−３’（
配列番号：４）を有する対照オリゴヌクレオチドＭＧ２０８でトランスフェクト
した。ＭＧ２０８は以下のごとく修飾した：Ａは２’−デオキシリボアデノシン
に等しく；Ｃは２’−デオキシリボシチジンに等しく；Ｇは２’−デオキシリボ
グアノシンに等しく；Ｔは２’−デオキシリボチミジンに等しく；Ａはリボアデ
ノシンに等しく；Ｕはウリジンに等しく；Ｃはリボシチジンに等しく；およびＧ
はリポグアノシンに等しい。下線を施した塩基は２’−メトキシリボース置換ヌ
クレオチドであった。下線を施していない塩基はデオキシリボースヌクレオシド
を示す。ＭＧ２０８の骨格は隣接するヌクレオチドの間のホスホロチオエート結
合よりなるものであった。
【００９８】 ＭＧ８８およびＭＧ２０８オリゴヌクレオチドを、トランンスフェクション培
地中の０．１ｍＭストック溶液から所望の濃度まで希釈した。第０日に４時間お
よび第１日に４時間、細胞をオリゴヌクレオチド＋リポフェクチン（またはリポ
フェクチンのみ）に暴露した（各４時間の処理の後細胞を完全な培地に戻した）
。第２日に（すなわち、第０日での最初の処理の４８時間後）、細胞を収穫し、
全細胞溶解物を調製し、（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ蛋白質からの最初の
１０ｋＤａアミノ末端を含有するグルタチオンＳ−トランンスフェラーゼ融合蛋
白質の標準技術に従って作成した）ＤＮＡＭｅＴａｓｅ蛋白質レベルは、ＤＮＡ
ＭｅＴａｓｅ−特異的ウサギポリクローナル抗体でのウエスタンブロッティン
グによって分析した。図２に示されたごとく、対照ＭＧ２０８ではなくＭＧ８８
での処理は、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質レベルの用量−依存性低下を生じた。
全てのレーンの等しい負荷は、α−アクチン蛋白質レベルにつき（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡから商業的に入
手可能な）アクチン−特異的ウサギポリクローナル抗体でブロッティングするこ
とによって確認した。
【００９９】 実施例２ ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを標的化することによるｐ１６腫瘍サプレッサーの阻害
サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）ｐ１６ink4Aは、細胞周期の Ｇ1からＳ−相への転移を調節する（Ｓｅｒｒａｎｏら，（１９９３）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６６：７０４−７０７）。ｐ１６ink4Aの不活化は、ヒト癌における最
も頻繁に観察された異常のうちの１つである（Ｓｅｒｒａｎｏら，前掲）。ｐ１
６ink4Aプロモーター領域の転写不活化および関連する過剰メチル化もまた癌の
実質的に全てタイプで観察されている（Ｂｏｎｚａｌｅｓ−Ｚｕｌｕｅｔａら（
１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：４５３１−４５３５； Ｍｅｒｌｏ
ら（１９９５） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７：６８６−６９２； Ｃｏｓｔｅｌｌ
ｏら （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２４０５−２４１０； Ｌ
ｏら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６： ２７２１−２７２５）。サイレント化
ｐ１６ink4A遺伝子の発現およびメチル化状態に対する特異的に減少する細胞Ｄ
ＮＡ ＭｅＴａｓｅレベルの効果を調べるために、過剰メチル化されたサイレン
ト化ｐ１６ink4A遺伝子を含有するＴ２４ヒト膀胱癌細胞を、毎日４時間、１０
連続日、４０ｎＭまたは７５ｎＭ ＭＧ８８または６．２５μｇ／ｍｌリポフェ
クチンを含む対照オリゴヌクレオチドＭＧ２０８でトランスフェクトした。第３
日、第５日、第８日および 第１０日に、次いで、免疫沈殿、ｐ１６ink4A蛋白質
−特異的抗体（ＰｈａｒＭｉｍｇｅｎ）でのウエスタンブロッティング分析によ
って分析した。ＨｅＬａ細胞を、ｐ１６ink4A蛋白質発現のための陽性（＋）対
照として用いた。
【０１００】 図３Ａに示すごとく、ｐ１６ink4A蛋白質の発現の誘導は、ＭＧ２０８での処
の後ではなく、４０ ｎＭまたは７５ｎＭいずれかのＭＧ８８での処理の５日後
に検出した。ＭＧ８８は抗増殖効果を有するので、ｐ１６ink4Aレベルを細胞数
に対して正規化した（図３Ｂ）。かくして、ＭＧ８８によるｐ１６ink4A蛋白質
の誘導は用量−依存性であると共に時間依存性であった。４０ｎＭまたは７５ｎ
Ｍいずれかのミスマッチ対照ＭＧ２０８あるいはリポフェクチン単独で処理した
細胞でｐ１６ink4Aは検出されなかった（図３Ａ）。
【０１０１】 さらに、ＭＧ８８によるｐ１６ink4A蛋白質発現の再活性化は、低リン酸化ｐ
Ｒｂの蓄積および細胞増殖の阻害を引き起こした。Ｒｂの低リン酸化形態がＧ1
／Ｇ0増殖阻止に関連するように、ｐＲＢのサイクリン−依存性キナーゼＣＤＫ
４−媒介リン酸化を阻害することによって、ｐ１６ink4Aは細胞周期のＧ1相を通
って進行する（Ｓｅｒｒａｎｏら、前掲）。ＭＧ８８でのトランスフェクション
後にｐ１６ink4A蛋白質を発現するように再活性化されたＴ２４細胞の細胞溶解
物は、リン酸化ｐＲｂにつきウエスタンブロッティング分析によって分析し、ｐ
Ｒｂのリン酸化形態の量の減少が示され、かくして、ｐＲｂのリン酸化形態の相
対的豊富さを増大させる（図４）。これらの結果は、高レベルのＴ２４細胞中の
ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅがｐ１６ink4A遺伝子発現を能動的に抑制し、ｐ１６ink4A 発現機能性の回復はｐＲｂのごとき下流分子標的を調節する。
【０１０２】 次に、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅが正常レベルまで復帰した場合に再度発現された
ｐ１６ink4A遺伝子のｄｅ ｎｏｖｏメチル化およびサイレンシングが起こった
か否かを判断するために、Ｔ２４細胞を４０または７５ｎＭのＭＧ８８またはＭ
Ｇ２０８いずれかで１０連続日トランスフェクトした。７５ｎＭ ＭＧ８８での
細胞のトランスフェクションは有意な抗増殖および細胞死滅誘導効果を有してい
たので、低用量（４０ｎＭ）ＭＧ８８で処理した細胞のみを実験の残りで用いた
。１０日間トランスフェクトしたＴ２４細胞の細胞溶解物を、ＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅ蛋白質、ｐ１６ink4A蛋白質および（同等負荷のための対照としてのアクチ
ン蛋白質の発現につきウエスタンブロッティング分析によって、ＭＧ８８トラン
スフェクションの３．５および７日後分析した。図５に示すごとく、ＤＮＡ Ｍ
ｅＴａｓｅ蛋白質レベルがＭＧ８８処理の不存在下で増加し、処理の５ないし７
日後の間に対照レベルまで復帰した（中央のパネル）。ｐ１６ink4A蛋白質のレ
ベルは、それが処理の７日後にほとんど検出できなくなるまで処理後の期間にわ
たって定常的に減少した（図５．上方パネル）。図６は、ＭＧ８８での処理の間
および処理後における、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅレベルおよびｐ１６ink4A蛋白質
レベルの間の逆関係を示す。興味深いことには、ｐ１６ink4A蛋白質発現の喪失
は、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅレベルが対照レベル近くまで復帰してから１４日後に
開始した。この遅延は、数ラウンドの複製にわたるＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの上昇
したレベルが、ｐ１６ink4A遺伝子発現をメチル化し、不活化するのに必要であ
ることを示唆する。ｐ１６ink4Aの不活化およびｄｅ ｎｏｖｏメチル化がＤＮ
Ａ ＭｅＴａｓｅ （Ｄｎｍｔｌ）の上昇したレベルと一致することは、それが
ｄｅ ｎｏｖｏメチル化活性それ自体に寄与できることを示唆する。
【０１０３】 ＭＧ８８処理によって誘導されたｐ１６ink4Aプロモーターのメチル化状態の
変化を確認するために、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）およびビスルファイト
ゲノム配列決定を従前に記載されているごとく行った（Ｃａｌｄａｓら，（１９
９４） Ｎａｔ． Ｇｅｎ． ８：２７−３２； Ｆｒｏｍｍｅｒら（１９９１
） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８２７−
２８３１）。ｐ１６ink4AプロモーターのＭＳＰは、４０ μＭまたは７５ μ
ＭのＭＧ８８またはＭＧ２０８で処理したＴ２４細胞につき３、５、９または１
０日間行った。略言すれば、（Ｏｎｃｏｒ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍ
Ｄから商業的に入手可能な）Ｏｎｃｏｒ ｐ１６検出系を用いた。ＰＣＲは、以
下の条件；１００ｎｇビスルフェート−処理ＤＮＡ（Ｏｎｃｏｒ），１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ ｎＭ ＫＣｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ2．
２５０μＭ ｄＮＴＰ．８０ｎｇの以下の各プライマー： （５’−ＧＴＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴ−３’センス（配列
番号：７９）および５’−ＴＣＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＣＴＡＡ−
３’アンチセンス（配列番号：８０））および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏ
ｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の下で２５μｌの合計容量中で行った。変性
サイクルは１２分間の９５℃、続いての４５秒間の９５℃、４５秒間の６５℃お
よび６０秒間の７２℃の３５サイクル、および１０分間の７２℃伸長サイクルで
あった。ＰＣＲ産物（５μｌ）を２％アガロースゲルで分析した。未メチル化（
Ｕ）および脱メチル化（Ｄ）プライマー（Ｏｎｃｏｒから商業的に入手可能）を
特異的プライマーと同一条件で用いた。ＰＣＲ産物を（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから商業的に入手可能な）ＰＣＲ２．１にサブクロ
ーンし、配列決定してｐ１６基部側プロモーター中のＣｐＧ部位の脱メチル化を
測定した。
【０１０４】 図７に示すごとく、メチル化ｐ１６ink4A （Ｍ）または未メチル化ｐ１６ink 4A （Ｕ）に特異的なＰＣＲプライマーでのＭＳＰ分析は、ｐ１６ink4Aプロモー
ター領域の脱メチル化がＭＧ８８処理から３日と早い時期に起こったことを明ら
かにした。ＭＧ２０８またはリポフェクチン単独での処理はｐ１６ink4A遺伝子
のメチル化に対して影響を有しなかった（図７）。図８は、ＭＧ８８またはＭＧ
２０８での処理の０．３および５日におけるビスルファイトゲノム配列決定を使
用することによって、ｐ１６ink4Aプロモーター内の１５のＣｐＧ部位は、未処
理Ｔ２４細胞でメチル化されたことが判明した。ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの阻害は
、処理から３日までの１５のうちの５つのＣｐＧ部位の脱メチル化および処理か
ら５日までの１５全てのＣｐ部位の脱メチル化に導き、他方、対照ＭＧ２０８で
の処理はｐ１６ink4Aメチル化状態に対して効果を有しなかった（図８）。ＭＧ
８８処理の中止から３日後にｐ１６ink4Aプロモーターは１５のうちの１３の部
位において有意な再メチル化を示し、これらの部位のｄｅ ｎｏｖｏメチル化ま
たは影響が少ない集団の迅速な拡大いずれかを反映する（図８、底部パネル）。
【０１０５】 細胞増殖に対するＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの特異的阻害の効果を調べるために、
処理の間および処理後の間双方でモニターして、効果の持続を測定した。Ｔ２４
細胞をリポフェクチンのみ、７５ｎＭ ＭＧ８８または７５ｎＭ ＭＧ２０８で
０−５日間処理した。処理の間および処理後に、細胞を計数した。図９Ｂから分
かるように、処理の間、ＭＧ８８は劇的に細胞増殖を阻害し、他方、細胞の対照
ＭＧ２０８での処理はリポフェクチン処理細胞に対して最小の増殖阻害を引き起
こしたのに過ぎなかった。細胞増殖の阻害は、処理後ほぼ１週間継続し、ｐ１６ ink4A 発現がＭＧ８８の最後の用量の７日後まで維持された（図５および６）と
いう知見と合致する。ｐ１６ink4Aの一過性再発現およびＭＧ８８での短期間処
理によって誘導された増殖−阻害効果は、処理集団内の細胞の影響が少ない（脱
メチル化度が少ない）集団の増殖によるものであるか、あるいはＭＧ８８撤去後
のｐ１６ink4Aの迅速な不活化によるものであるかを判断するために、単一細胞
クローンを処理後に単離した。いくつかのＭＧ８８クローンは、事実、ｐ１６in k4A 陰性であり、ＭＧ８８処理はｐ１６ink4A陽性および陰性細胞の混合された集
団であることが確認された。ＭＧ８８での５日間処理から３０日後、ＭＧ８８陽
性クローン、クローン４−５のうちの１つのｐ１６ink4Aプロモーターのビスル
ファイト配列決定によるメチル化分析は、ｐ１６ink4Aプロモーター領域が、評
価した全くメチル化されていないＣｐＧ部位である（図９Ａ）ことを明らかとし
、ＭＧ８８によるＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの短期間（５日間）処理でさえ、サイレ
ント化腫瘍サプレッサー遺伝子の延長された再発現を誘導し得ることを示す。図
９Ｂおよび９Ｃに示されるごとく、クローンＭＧ８８ Ｃ４−５は、リポフェク
チンクローンＣ−５（リポフェクチンで５日間処理）およびＭＧ２０８Ｃ ２−
４（ＭＧ２０８で５日間処理）と比較して、ＭＧ８８での５日間処理後にゆっく
りと増殖した；しかしながら、処理後４０日および４５日の間に、ＭＧ８８ Ｃ
４−５細胞の増殖速度は劇的に増加した（図９Ｃ）。ＭＧ８８ Ｃ４−５細胞に
おけるｐ１６ink4A蛋白質レベルの測定は、４９日における有意な増加を明らか
とした（図９Ｃ、挿入されたウェスタンブロッティング分析）。ＭＧ８８処理不
存在下での延長された培養後のｐ１６ink4A発現の喪失は、（維持ＤＮＡ Ｍｅ
Ｔａｓｅ活性をコードすると考えられる）標的化ＤＮＡ ＭＧ８８がｄｅ ｎｏ
ｖｏメチルトランスフェラーゼ活性を有することができ、経時的に、従前にメチ
ル化されなかった能動的発現遺伝子をメチル化し、不活化できることを示唆する
。
【０１０６】 実施例３ ＭｅＴａｓｅの阻害はｐ２１WAF1を迅速に誘導する。
【０１０７】 サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）ファミリーのもう１つのメン
バーであるｐ２１WAF1は、Ｇ1およびＳ相進行に関与する広い範囲のサイクリン
／ＣＤＫ複合体を阻害する（Ｔａｍら， （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
． ５４:５８１６−５８２０；ＢａｇｈｄａｓｓａｒｉａｎおよびＦｒｅｎｃ
ｈ（１９９６） Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．８８:３１３−３２
３； Ｇｏｔｚら（１９９６） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：３９１−３９８）。
ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅおよびｐ２１WAF1蛋白質レベルが調節経路にリンクされて
いるかを調べるために、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅレベルがＭＧ８８処理によって徐
々に低下されているＴ２４細胞において、ｐ２１WAF1蛋白質レベルを測定した。
これを行うために、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ、ｐ２１WAF1およびα−アクチン蛋白
質レベルを、４０ｎＭまたは７５ｎＭいずれかのＭＧ８８またはＭＧ２０８いず
れかで２４時間（すなわち、１つの４時間トランスフェクション時間）または４
８時間（すなわち、２４時間離れた２つの５時間トランスフェクション）いずれ
かで処理されているＴ２４細胞においてウェスタンブロッティング分析によって
測定した。図１０Ａに示すごとく、ｐ２１WAF1はＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの減少に
伴い直接的に増加し、他方、リポフェクチンもＭＧ２０８もＤＮＡ ＭｅＴａｓ
ｅまたはｐ２１WAF1レベルに影響を有しなかった。
【０１０８】 また、Ｔ２４細胞をリポフェクチンのみ、あるいはリポフェクチン＋２０、４
０または８０ｎＭのＭＧ８８またはＭＧ２０８で２４時間（すなわち、４時間ト
ランスフェクション）処理した。処理後、細胞溶解物を調節し、α−アクチン−
特異的抗体またはｐ−２１−特異的抗体でのウェスタンブロッティング分析によ
って分析した。図１０Ｂに示すごとく、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ阻害は、ＭＧ８８
処理の２４時間後と早期に用量依存的にｐ２１WAF1を誘導し、ＭＧ８８処理で観
察された抗リポフェクチン効果におけるｐ２１WAF1の役割に合致する（例えば、
図３Ｂおよび９Ｂ）。
【０１０９】 次に、ｐ２１WAF1が転写レベルで誘導されるかを判断するために、４０ｎＭの
ＭＧ８８またはＭＧ２０８で処理した細胞につき、２４時間または４８時間、Ｒ
Ｎａｓｅ保護アッセイを行った。全細胞ＲＮＡを細胞から単離し、ＰｈａｒＭｉ
ｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから商業的に入手可能なヒト細胞周期
−２（ｈｃｃ−２）マルチプローブＲＮａｓｅ保護キットを用いてｐ２１ ｍＲ
ＮＡ、ｐ２７ ｍＲＮＡおよびｐ１８ ｍＲＮＡにつき分析した。２つのハウス
キーピング遺伝子Ｌ３２およびＧＡＰＤＨからのシグナルを用い、ＲＮＡ負荷は
同等であると判断された。図１１に示すごとく、ＭＧ８８での処理に応答してｐ
２１WAF1 ｍＲＮＡの増加は観察されず、ｐ２１WAF1蛋白質の翻訳後調節が関与
することを示唆する。
【０１１０】 本実施例は、細胞増殖につきＤＮＡ ＭｅＴａｓｅおよびｐ２１WAF1の間の機
能的拮抗が存在することを示す。かくして、形質転換された細胞で見いだされる
高レベルのＤＮＡ ＭｅＴａｓｅは、細胞ｐ２１WAF1レベルを低下させることに
よって増殖を調節するできる。また、形質転換された細胞における高レベルのＤ
ＮＡ ＭｅＴａｓｅは下流標的ＰＣＮＡに対し直接的に競合することができる。
というのは、ヒトＤＮＡ ＭｅＴａｓｅはＰＣＮＡ結合につきｐ２１WAF1と競合
できるからである（Ｃｈｕａｎｇら （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：
１９９６−２０００）。
【０１１１】 実施例４ ｐ１６腫瘍サプレッサーの相乗的再活性化 本実施例の目的は、例えば、ここに説明するｐ１６腫瘍サプレッサーのごとき
、メチル化によって不活化される遺伝子の発現を回復する本発明の方法および組
成物の能力を説明することである。この目的で、トランスフェクションの１日前
に、Ｔ２４細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−４）を４×１０5細胞／皿にて１０ｃｍ
のプレート上に平板培養した。トランスフェクションの時点において、リン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、６．２５μｌ／ｍｌのリポフェクチ
ントランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有する５ｍｌの最適培
地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加した。使用したオリゴヌクレオチドは配列５’
−ＡＡＧ ＣＡＴ ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＵ ＣＣ−３’ （配列番号
：４８）（このオリゴヌクレオチドはヌクレオチド５３２ないし５１３において
ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡ ５ＵＴＲに対して標的化されている）を有す
るＭＧ８８および配列５’−ＵＵＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＣＣ
ＡＣ−３’（配列番号：４９）（このオリゴヌクレオチドはヌクレオチド５２
１８ないし５１９９においてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡ ３ＵＴＲに対し
て標的化されている）を有するＭＧ９８であった。用いた陰性対照は、配列５’
−ＵＵＡ ＡＴＧ ＴＡＡ ＣＣＴ ＡＡＧ ＧＵＣ ＡＡ−３’（配列番号：
３）を有するＭＧ２０７および配列５’−ＡＡＣ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＡＣ Ｃ
ＣＴ ＴＧＵ ＣＣ−３’（配列番号：４）を有するＭＧ２０８であった。これ
らのオリゴヌクレオチドは以下のごとく化学的に修飾されていた：Ａは２’−デ
オキシリボアデノシンと等しく；Ｃは２’−デオキシリボシチジンと等しく；Ｇ
は２’−デオキシリボグアノシンと等しく、Ｔは２’−デオキシリボチミジンと
等しく；Ａはリボアデノシンと等しく；Ｕはウリジンと等しく；Ｃはリボシチジ
ンと等しく；およびＧはリボグアノシンと等しい。下線を施した塩基は２’−メ
トキシリボース置換ヌクレオチドであった。下線を施していない塩基はデオキシ
リボースヌクレオシドを示す。各オリゴヌクレオチドの骨格は隣接ヌクレオチド
の間のホスホロチオエート結合よりなるものであった。オリゴヌクレオチドは、
トランスフェクション培地中の０．１ｍＭストック溶液から所望の濃度に希釈し
た。５％ＣＯ2インキュベート中の３７℃での４時間のインキュベーション後に
、平板をＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌの新鮮な細胞培養培地を添加した。３７℃で
のさらに２時間のインキュベーションの後、あらたに調製した５−アザー２’−
デオキシチジンを組織培養培地に添加した。細胞を合計３日間トランスフェクト
し、１日おきに分割して最適トランスフェクション条件を確認した。示された時
点において、トリプシン処理によって細胞を収穫し、１１００ｒｐｍおよび４℃
にて５分間の遠心によってペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、
コールター粒子カウンターで計数して全細胞数を決定した。第２の遠心に続き、
ＰＢＳを細胞ペレットから吸引し、ペレットを７０℃で凍結した。
【０１１２】 プロテアーゼ阻害剤：アプロチミン、ロイペプチン、ペプスタチン、ＴＬＣＫ
およびＰＭＳＦを補足した２００μｌの細胞溶解緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ
７．５、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび１％
トリトン×１００）に細胞ペレットを再懸濁した。溶解した細胞を氷上で１０分
間インキュベートし、４℃での１０，０００ｒｐｍ における１０分間の遠心に
よって細胞の粒状物質を除去した。各試料についての蛋白質濃度は、Ｂｉｏ Ｒ
ａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ を用いて測定し、６００μｇの蛋白質を各
免疫沈殿で用いた。抗−ｐ１６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を添加し（２．５
μｇ／ｍｌ）、各試料を回転震盪機で４℃において１時間インキュベートした。
２０μｌの平衡化プロテインＧの添加の後に、各試料を４℃にてさらに４５分間
インキュベートし、プロテアーゼ阻害剤を含有しない溶解緩衝液で３回洗浄した
。プロテインＧペレットを、β−メルカプトエタオールを含有する１５μｌの２
×ゲル負荷緩衝液に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。５分間沸騰
した後、４−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル上でのゲル電気泳動によって試
料を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｏｈｉｏ）上にブロットした。各膜を、５％乳を補足し
た１×ＴＢＳＴ洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で一晩インキュベートした。マウス抗−ヒ
トｐ１６抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒ
ｉｏ）と（１μｇ／ｍｌ）と共に膜を室温で６０分間インキュベートした。１×
ＴＢＳＴ中での３回の洗浄、および二次抗体であるヤギ抗−マウスＩｇＧとの１
時間のインキュベーションの後、膜を１×ＴＢＳＴ中で２回、および１×ＴＢＳ
中で２回洗浄し、化学ルミネセンスを行った。図１２は、０．１μＭないし０．
７５μＭの５−アザ−ｄＣの種々の濃度で処理したＴ２４細胞のウエスタンブロ
ット分析を示し、これは０．３μＭないし０．７５μＭの５−アザ−ｄＣの範囲
のｐ１６の再活性化を示す。図１３は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＭＧ８
８および５−アザ−ｄＣを用いる本発明の方法によって処理されたＴ２４細胞の
ウエスタンブロット分析を示す。図１３中でのバンドの存在および強度の比較は
、オリゴヌクレオチドまたは蛋白質エフェクターいずれも単独では効果的でない
濃度にて（例えば、４０ ｎＭオリゴヌクレオチドＭＧ８８および０．１μＭの
５−アザ−ｄＣと低い濃度）本発明によるオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフ
ェクターの組合せを用い、ｐ１６遺伝子の再活性化が首尾よく達成されることを
示す。
【０１１３】 図１４は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＭＧ９８および５−アザ−ｄＣを
用いて本発明の方法によって処理したＴ２４細胞のウエスタンブロット分析を示
す。再度、図１４におけるバンドの存在および強度の比較は、使用したオリゴヌ
クレオチドまたは蛋白質エフェクター単独は効果的でない濃度にて（例えば、４
０ｎＭオリゴヌクレオチドＭＧ９８および０．１μＭの５−アザーｄＣと低い濃
度）本発明によるオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターの組合せを用い
てｐ１６遺伝子の再不活化が首尾よく達成されることを示す。
【０１１４】 図１４におけるウエスタンブロッティング分析をデンシトメトリー分析に付し
、ＨｅＬａ細胞におけるｐ１６発現のレベルに正規化した。デンシトメトリー分
析の結果は図１５に示す。
【０１１５】
【表５】 表５が示すごとく、ＭＧ９８＋５−アザ−ｄＣ双方の組合せは、ＭＧ９８また
は５−アザ−ｄＣ単独いずれかと比較してＴ２４細胞におけるｐ１６再活性化に
対してかなり大きな効果を有する。
【０１１６】 図１５は、より低い濃度のオリゴヌクレオチドＭＧ８８さえ用い、アンチセン
スオリゴヌクレオチドＭＧ８８および５−アザ−ｄＣを用いる本発明の方法によ
って処理したウエスタンブロット分析Ｔ２４細胞を示す。図１５におけるバンド
の存在および強度の比較は、使用したオリゴヌクレオチドまたは蛋白質エフェク
ター単独が効果的ではない濃度にて（例えば、２０ｍＭオリゴヌクレオチドＭＧ
８８および０．２μＭの５−アザ−ｄＣと低い濃度にて）本発明によるオリゴヌ
クレオチドおよび蛋白質エフェクターの組合せを用いて、ｐ１６遺伝子の再活性
化が首尾よく達成されることを示す。
【０１１７】 実施例５ イン・ビトロにおける新形成細胞増殖の相乗的阻害 ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを阻害し相乗的様式にてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを阻害し
、新形成細胞増殖を阻害する本発明の方法および組成物の能力を説明するために
、Ｔ２４膀胱癌細胞（ＡＴＣＣ番号、ＨＴＢ−４； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）また
はＡ５４９ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣ番号、 ＣＣＬ−１８５）を本発明に従って
処理し、それらの増殖パターンを観察し、未処理対照細胞のそれと比較した。こ
の目的で、トランスフェクションの１日前に細胞を４×１０5／皿にて１０ｃｍ
のプレート上に平板培養した。トランスフェクションの時点において、リン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、６．２５μｌ／ｍｌリポフェクチン
トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，
Ｏｎｔａｒｉｏ）を含有する５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を添加した。使用したオリゴ
ヌクレオチドは配列（５’−ＵＵＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＣＣ
ＡＣ−３’（配列番号：４９）（このオリゴヌクレオチドはヌクレオシド５２
１８ないし５１９９においてＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ ｍＲＮＡ ３ＵＴＲに標的
化されている）を有するＭＧ９８および配列５’−ＵＵＡ ＡＴＧ ＴＡＡ Ｃ
ＣＴ ＡＡＧ ＧＵＣ ＡＡ−３’（配列番号：３）を有する陰性対照ＭＧ２０
７であった。これらのオリゴヌクレオチドは以下のごとき化学的に修飾されてい
た：Ａは２’−デオキシリボアデノシンと等しく；Ｃは２’−デオキシリボシチ
ジンに等しく；Ｇは２’−デオキシリボグアノシンと等しく；Ｔは２’−デオキ
シリボチミジンと等しく；Ａはリボアデノシンと等しく；Ｕはウリジンと等しく
；Ｃはリボシチジンと等しく；およびＧはリボグアノシンと等しい。下線を施し
た塩基は２’−メトキシリボース置換ヌクレオチドであった。下線を施していな
い塩基はデオキシリボースヌクレオシドを示す。各オリゴヌクレオチドの骨格は
隣接するヌクレオチドの間のホスホロチオエート結合よりなるものであった。
【０１１８】 オリゴヌクレオチドは、トランスフェクション培地中の０．１ｍＭストック溶
液から所望の濃度に希釈した。５％ＣＯ2インキュベーター中にて３７℃の４時
間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで洗浄し、１０ｍｌの新鮮な培
養培地を添加した。３７℃におけるさらに２時間のインキュベーションの後、新
たに調製した５−アザ−２’−デオキシシチジンを組織培養培地に添加した。細
胞を合計３日間トランスフェクトし、１日置きに分割して最適なトランスフェク
ション条件を確認した。示された時点において、細胞をトリプシン処理によって
収穫し、１１００ｒｐｍにおいて４℃で５分間の遠心によってペレット化した。
細胞ペレットＰＢＳに再懸濁し、コールター粒子カウンターで計数して全細胞数
を決定した。第２の遠心の後、ＰＢＳを細胞ペレットから吸引し、ペレットを７
０℃で凍結した。処理および未処理細胞を、標準的方法に従って細胞を計数する
ことによって分析した。代表的な実験の結果を図１６、１７および１８に示す。
図１６は、リポフェクチンのみ（菱形）；０．０５μＭ ５−アザ−ｄＣ（四角
）；４０ｎＭ ＭＧ９８（三角）；０．０５μＭ ５−アザ−ｄＣ＋４０ｎＭ
ＭＧ９８（十字形）；４０ｎＭ ＭＧ２０７（星印）；または０．０５μＭ ５
−アザ−ｄＣ＋４０ｎＭ ＭＧ２０７（丸印）で１ないし７日間処理してあるＴ
２４細胞の増殖曲線を示す。図１７は、リポフェクチンのみ、０．１μＭ ５−
アザ−ｄＣ、４０ｎＭ ＭＧ２０７、４０ｎＭ ＭＧ９８、０．１μＭ ５−ア
ザ−ｄＣ＋４０ｎＭ ＭＧ２０７、または０．１μＭ ５−アザ−ｄＣ＋４０ｎ
Ｍ ＭＧ９８で７日間細胞を処理した後残るＴ２４細胞の数を示す。図１８は、
リポフェクチンのみ（菱形）；４０ｎＭ ＭＧ９８（四角）；０．０５μＭ ５
−アザ−ｄＣ＋４０ｎＭ ＭＧ９８（三角）；４０ｎＭ ＭＧ２０７（×）；ま
たは０．０５μＭ ５−アザ−ｄＣ＋４０ｎＭ ＭＧ２０７（星印）で１−７日
間処理されたＡ５４９細胞の増殖曲線を示す。これらの結果は、本発明によるオ
リゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターが、相乗的様式にて、ＭｅＴａｓｅ
酵素活性および新形成細胞増殖を阻害でき、その結果、オリゴヌクレオチドのみ
または蛋白質エフェクターのみいずれかを用いて観察されたものと比較して阻害
効果の増加がもたらされることを示す。従って、結果は、本発明による有効相乗
量のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または蛋白質エフェクターを用い
てＤＮＡ ＭｅＴａｓｅを阻害する本発明の能力を証明する。
【０１１９】 実施例６ イン・ビボにおける新形成細胞に対する相乗効果 本実施例の目的は、哺乳動物におけるＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ阻害に対する応答
性の病気を本発明の方法および組成物の能力を示す。本実施例は、さらに、哺乳
動物において腫瘍増殖を阻害する本発明の方法および組成物の能力の証拠を提供
する。８ないし１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂ
ｓ， Ｇｒｅａｔ Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）に、２×１０6予備条件化
Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸癌細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２２２）を横腹領域
に皮下注射した。これらの細胞の予備条件化は、ヌードマウスの同一株における
最小３連続腫瘍移植によってなした。引き続いて、ほぼ３０ｍｇの腫瘍断片を切
り出し、Ｆｏｒｅｎｅ麻酔（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ， Ｇｅｎｅｖａ，スイス
国）下でマウスの横腹領域に皮下移植した。腫瘍が１００ｍｍ3の平均容量に達
したら、０．１−６ ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／ま
たは５−アザ−ｄＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するオリ
ゴヌクレオチド生理食塩水および本発明により生理食塩水調製物にて、尾静脈へ
の毎日のボーラス注入によってマウスを７連続日静脈内処理した。オリゴヌクレ
オチドの最適最終濃度は、標準的なプロトコルにより用量依存性実験によって達
成される。腫瘍容量は標準的な方法に従い、注入後２日置きに計算した（例えば
、Ｍｅｙｅｒら（１９８９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４３：８５１−
８５６中の方法参照）。本発明の方法によるオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エ
フェクターでの処理は、図１９、２０Ａおよび２０Ｂに示されるごとく、生理食
塩水で処理した対照と比較して腫瘍重量および容量の有意な減少を引き起こした
。図１９は、生理食塩水のみ（菱形）または０．５ｍｇ／ｋｇのＭＧ９８（四角
）を７日間摂取した動物が腫瘍容量増加を示し、他方、０．１ｍｇ／ｋｇ ５−
アザ−ｄＣのみ（三角）のみを摂取する動物がより小さい腫瘍容量を示すことを
示す。腫瘍容量の最も劇的な減少は、０．５ｍｇ／ｋｇ ＭＧ９８および０．１
ｍｇ／ｋｇ ５−アザ−ｄＣ（図１９、Ｘ）双方を７日間摂取する動物で観察
された。
【０１２０】 図２０Ａおよび２０Ｂは、腫瘍容量を２５日間記録した同様の実験の結果を示
す（すなわち、最終処理後さらに１９日）。図２０Ａは腫瘍容量増殖曲線−対−
時間を示し、他方、図２０Ｂは第２５日におけるこれらのマウスにおける腫瘍容
量を示す。図２０Ｂに示すごとく、０．５ｍｇ／ｋｇ ＭＧ９８および０．１
ｍｇ／ｋｇ ５−アザ−ｄＣ双方を摂取したマウスは、生理食塩水のみまたは５
−アザ−ｄＣのみで処理したマウスよりも統計学的に小さな腫瘍を有していた（
ｐ＜０．０５）。加えて、測定した場合、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ酵素の活性は、
生理食塩水処理対照と比較して有意に減少すると予測される。これらの結果は、
本発明の方法によるオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクターが相乗様式に
て腫瘍増殖を阻害できることを示す。
【０１２１】 実施例７ スケジューリング差異を持つ細胞周期進行阻害に対する異なる相乗効果 この実施例の目的は、本発明の蛋白質エフェクターと組み合わせた本発明のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞周期進行の阻害に対する相乗効果が異
なるスケジューリングルーチンによって達成できることを示すことにある。本実
施例において、Ｔ２４細胞を用いた。
【０１２２】 スケジュールＡにおいて、細胞を第０日において７５ｍＭ ＭＧ８８で４時間
トランスフェクトした。翌日、それらを７５ｍＭ ＭＧ８８で再度４時間トラン
スフェクトした。翌日、それらを１μＭ ５−アザ−ｄＣで処理した。２４時間
後、培地を、１μＭ ５−アザ−ｄＣを含有する新鮮な培地で置き換えた。対照
については、細胞は、無処理、アザ−ｄＣのみでの処理（ここに、細胞は最初の
２日間接触させなかった）、またはＭＧ８８のみでの処理（ここに、細胞は第３
および第４日に接触させなかった）を摂取させた。
【０１２３】 スケジュールＢにおいて、細胞を１μＭ ５−アザ−ｄＣで処理した。２４時
間後、培地を、１μＭ アザ−ｄＣを含有する新鮮な培地で置き換えた。２４時
間後、細胞を、７５ｍＭ（ＭＧ８８）で４時間トランスフェクトした。翌日、そ
れらを７５ｍＭ ＭＧ８８で再度４時間トランスフェクトした。対照では、細胞
は、無処理、アザ−ｄＣのみでの処理（ここに、細胞は第３および第４日に接触
させなかった）．またはＭＧ８８のみでの処理（ここに、細胞は第１および第２
日に接触させなかった）を摂取させた。
【０１２４】 第５日に、細胞を収穫し、固定し、氷冷７０％エタノール中で浸透化させ、標
準的な技術に従ってヨウ化プロピジウムで染色した（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
，前掲；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲参照）。染色した細胞を蛍光活性化細胞ソー
ター分析（ＦＡＣＳ分析）によって次に分析した。ヨウ化プロピジウムで染色し
た細胞のＦＡＣＳ分析によると、細胞は、典型的には、ヨウ化プロピジウムで染
色させたそれらが保持するＤＮＡ量に応じて４つの群に分けることができる。典
型的には、４Ｎ細胞（すなわち、分裂しつつあるＧ2／Ｍ相細胞）はヒストグラ
ムの最も右側にある。最高の染色に対して２番目である細胞の次の組はＳ相にあ
る細胞である。第３の最も明るい細胞の組は細胞周期のＧ1段階にある２Ｎ細胞
である。最後に、最も明るくない細胞（すなわち、ＦＡＣＳヒストグラムの最も
左にある細胞）はアポトーシス細胞死滅を受けつつあるものである。
【０１２５】 図２１に示すごとく、スケジュールＡにおけるＭＧ８８および５−アザ−ｄＣ
双方を摂取する細胞（上側パネル、最も右側）は、細胞周期のＳ相にある細胞の
パーセントの減少（セクションＭ２において２７％）およびアポトーシスしつつ
ある細胞のパーセントの増加（セクションＭ１において１６％）およびＳ相にあ
る細胞のパーセントの増加（セクションＭ３において２２％）を示した。対照的
にスケジュールＢにおけるＭＧ８８および５−アザ−ｄＣ双方を摂取する細胞（
図２１、下側パネル、最も右側）はより顕著なＧ1ブロック（図２１におけるセ
クションＭ２における５５％）およびＧ2／Ｍ集団におけるより少ない４Ｎ細胞
（セクションＭ４における１３％）を示した。しかしながら、注目すべきことに
は、スケジュールＡまたはスケジュールＢいずれかの結果、ＭＧ８８のみまたは
５−アザ−ｄＣのみを摂取する細胞と比較して（スケジュールＡにつき上方パネ
ルおよびスケジュールＢにつき下方パネルにおける中央のセクションと最も右側
のセクションを比較）、ＭＧ８８および５−アザ−ｄＣ双方を摂取した場合に細
胞周期の進行がより阻害された。
【０１２６】 実施例８ ＴＳアンチセンスオリゴヌクレチドおよびＴＳ蛋白質エフェクターの組合せで のチミジレートシンターゼの阻害に対する相乗効果 酵素チミジレートシンターゼ（ＴＳ）はＤＮＡの合成において非常に重要な工
程で触媒し、特に、制御されない増殖を受ける新形成細胞に対して非常に重要で
ある。本実施例はＴＳ蛋白質発現を阻害し、細胞周期進行においてＴＳの役割を
阻害する細胞において相乗的に作用するＴＳアンチセンスオリゴヌクレオチドお
よびＴＳ蛋白質エフェクターの能力を示す。本実施例において用いた本発明の代
表的な非限定的オリゴヌクレオチドは、以下の配列５’ＵＵＣ ＡＴＡ ＡＣＣ
ＴＣＡ ＧＣＡ ＴＵＧ ＵＣ３’（配列番号：８８；このオリゴヌクレオチ
ドはヌクレオチド１２６７−１２８６においてＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２３
０８に提供されたチミジレートシンターゼｍＲＮＡ配列に標的化されている）を
有するＭＧ２６０５および以下の配列：５’ＧＵＣ ＵＴＡ ＡＧＣ ＴＣＡ
ＡＣＡ ＴＵＣ ＵＡ３’（配列番号：８１）を有する対照オリゴヌクレオチド
ＭＧ２６０６であった。これらのオリゴヌクレオチドが以下のごとく化学的に修
飾されていた；Ａは２’−デオキシリボアデノシンと等しく；Ｃは２’−デオキ
シリボシチジンと等しく；Ｇは２’−デオキシリボグアノシンと等しく；Ｔは２
’−デオキシリボチミジンと等しく；Ａはリボアデノシンと等しく；Ｕはウリジ
ンと等しく；Ｃはリボシチジンと等しく；およびＧはリボグアノシンと等しい。
下線を施した塩基は２’−メトキシリボース置換ヌクレオチドであった。下線を
施していない塩基はデオキシリボースヌクレオシドを示す。各オリゴヌクレオチ
ドの骨格は隣接ヌクレオチドの間のホスホロチオエート結合よりなるものであっ
た。
【０１２７】 本実施例で用いた代表的な非限定的ＴＳ蛋白質エフェクターはヌクレオシドア
ナログ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である。
【０１２８】 ＴＳ蛋白質発現を阻害するＭＧ２６０５の能力を調査するために、培養で増殖
するＴ２４細胞をリポフェクチンのみ（６．２５μｇ／ｍｌ）またはリポフェク
チン＋１０ｎＭ、２５ｎＭまたは５０ｎＭのＭＧ２６０５またはＭＧ２６０６で
７２時間処理した（すなわち、３連続日の間の１日当たり４時間のトランスフェ
クション）。処理後、細胞を溶解し、（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔ．， Ｔｅｍ
ｅｃｕｌａ， ＣＡから商業的に入手可能である）チミジレートシンターゼ特異
的抗体を用い、チミジレートシンターゼ蛋白質レベルにつきウエスタンブロッテ
ィング分析によって分析した。
【０１２９】 図２２に示すごとく、対照ＭＧ２６０６は示さなかったが、２５または５０ｎ
Ｍ ＭＧ２６０５で７２時間トランスフェクトしたＴ２４細胞は、リポフェクチ
ンのみで処理した細胞と比較して低下したレベルのチミジレートシンターゼ蛋白
質を示した。全てのウェルの同等負荷は同等な量のアクチンによって示される（
図２２）。
【０１３０】 細胞周期進行におけるＴＳの役割を阻害するＭＧ２６０５の能力を調べるため
に、培養中の増殖するＴ２４細胞をリポフェクチンのみ（６．２５μｇ／ｍｌ）
またはリポフェクチン＋２５ｎＭのＭＧ２６０５またはＭＧ２６０６、またはリ
ポフェクチン＋２５ｎＭのＭＧ２６０５またはＭＧ２６０６＋５００ｎＭ ５−
ＦＵで７２時間処理した（すなわち、３連続日の間の一日当たり４時間のトラン
スフェクション、各トランスフェクションに続き５００ｎＭの５−ＦＵでのイン
キュベーション）。処理後、細胞を、実施例７に記載したＦＡＣＳ分析によって
細胞周期分析のために加工した。
【０１３１】 図２３は、ＭＧ２６０５と組み合わせて５００ｎＭ ５−ＦＵで処理したＴ２
４細胞が、ＭＧ２６０５のみ（頂部から３番目のパネル）または５−ＦＵのみ（
頂部から４番目のパネル）で処理した細胞と比較して、Ｓ相に留められたより大
きな細胞数を示したことを示す（セクションＭ３； 底部パネル）。
【０１３２】 同様の実験において、Ｔ２４細胞を、２５ｎＭのＴＳアンチセンスオリゴヌク
レオチドＭＧ２６０５または対照オリゴヌクレオチドＭＧ２６０６で０および２
４時間において４時間トランスフェクトした。オリゴヌクレオチドへの各４時間
の暴露後、細胞を血清含有培地に戻した。細胞のいくらかは、５μＭの５−ＦＵ
を添加した血清含有培地に戻した。７２時間において、細胞を収穫し、計数し、
固定し、氷冷７０％エタノール中で浸透化した。次いで、細胞をヨウ化プロピジ
ウムで染色し、実施例７に記載したフローサイトメトリー分析によって細胞周期
分析を行った。
【０１３３】 図２４Ａは、無処理、ＭＧ２６０６のみ、ＭＧ２６０５のみ、５−ＦＵのみ、
ＭＧ２６０６＋５−ＦＵ、またはＭＧ２６０５＋５−ＦＵでの処理後のＧ1相（
セクションＭ１）、Ｓ相（セクションＭ２）およびＧ2／Ｍ相（セクションＭ３
）における細胞のパーセントを示す。ＭＧ２６０５＋５−ＦＵ双方での処理の結
果、ＭＧ２６０５単独または５−ＦＵ単独での処理と比較して、細胞周期のＳ相
に留められた細胞の数が多くなり、細胞周期のＧ1相にある細胞がより少なくな
った（図２４Ａ）。さらに、ＭＧ２６０５＋５−ＦＵの組合せでの処理の結果、
５０ＦＵのみまたはＭＧ２６０５のみでの処理に続き、存在する細胞の数と比較
して細胞の数が低くなった（図２４Ｂ）。
【０１３４】 この実施例は、チミジレートシンターゼの発現、および細胞周期進行における
その役割が、ＴＳアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＴＳ蛋白質エフェクタ
ー単独いずれかを摂取するＴ２４で観察されたものよりも大きな程度、ＴＳアン
チセンスオリゴヌクレオチド＋ＴＳ蛋白質エフェクターの組合せによってＴ２４
細胞において阻害されることを示す。
【０１３５】 実施例９ ＨＤＡＣアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＨＤＡＣ蛋白質エフェクター でのＨＤＡＣ活性の阻害に対する相乗効果 機能的ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、正常および新形成細胞双方に
おける細胞周期進行の要件として関連付けられてきた。本実施例は、ＨＤＡＣ蛋
白質発現を阻害し、サイクリン−依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩファミリー、
ｐ２１WAF1を誘導するように細胞において相乗的に作用するＨＤＡＣアンチセン
スオリゴヌクレオチドおよびＨＤＡＣ蛋白質エフェクターの能力を示す）。
【０１３６】 これを行うために、ＨＤＡＣ−１およびＨＤＡＣ−２双方を標的化する以下の
代表的な非限定的アンチセスオリゴヌクレオチドを用いた： ５’−ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＡＵ Ｕ Ｇ −３’ （配列番号：８２）； ５’−ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＡＵ Ｕ Ｇ −３’（配列番号：８９）； ５’−ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＡＵ Ｕ Ｇ −３’（配列番号：９０）； ５’−ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＡＵ Ｕ Ｇ −３’ （配列番号：８３）。このＨＤＡＣ−１，２アンチセンスオリゴヌク
レオチド（ＭＧ２６１０）は理想的には各オリゴヌクレオチドの１：１：１：１
混合物であった（すなわち、各々が２５％）。対照オリゴヌクレオチド（ＭＧ２
６３７）は同様に以下の４つの異なるオリゴヌクレオチドの１：１：１：１混合
物であった： ５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＣＧ ＣＡＵ Ｕ Ｇ −３’ （配列番号：８４）および５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ
ＡＡＴ ＧＡＴ ＧＣＧ ＣＡＵ ＵＧ−３’ （配列番号：８５）。 ５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＡＴ ＧＡＴ ＧＣＧ ＣＡＵ Ｕ Ｇ −３’ （配列番号：８６）および５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＴＧ
ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＣＧ ＣＡＵ ＵＧ−３’ （配列番号：８７）。これらの
オリゴヌクレオチドは以下のごとく化学的に修飾されていた：Ａは２’−デオキ
シリボアデノシンと等しく；Ｃは２’−デオキシリボシチジンと等しく；Ｇは２
’−デオキシリボグアノシンと等しく；Ｔは２’−デオキシリボチミジンと等し
く；Ａはリボアデノシンと等しく；Ｕはウリジンと等しく；Ｃはリボシチジンと
等しく；およびＧはリボグアノシンと等しい。下線を施した塩基は２’−メトキ
シリボース置換ヌクレオチドであった。下線を施していない塩基はデオキシリボ
ースヌクレオシドを示す。各オリゴヌクレオチドの骨格は隣接ヌクレオチドの間
のホスホロチオエート結合よりなるものであった。
【０１３７】 Ｔ２４細胞はリポフェクチンのみ、リポフェクチン＋５０ ｎＭのＭＧ２６１
０（すなわち、ＨＤＡＣ−１，２アンチセンスオリゴヌクレオチド）またはＭＧ
２６３７対照オリゴヌクレオチド、またはリポフェクチン＋ＨＤＡＣアンチセン
スオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチド＋１０ ｎｇ／ｍｌまたは
２５ ｎｇ／ｍｌ ＴＳＡで２４時間処理した（すなわち、４時間、続いて２０
時間の新鮮な培地中でのインキュベーション）。次いで、処理した細胞を溶解さ
せ、細胞溶解物をｐ２１WAF1蛋白質レベルにつきウエスタンブロッティング分析
によって分析した。図２５に示すごとく、ＨＤＡＣ−１，２アンチセンスオリゴ
ヌクレオチド＋ＴＳＡの組合せで処理した細胞は、ＨＤＡＣ−１，２アンチセン
スオリゴヌクレオチドまたはＴＳＡ単独いずれかで処理した細胞と比較してｐ２
１WAF1蛋白質レベルのより大きな増加を示した。
【０１３８】 本実施例は、ＨＤＡＣ−１，２アンチセンスオリゴヌクレオチド＋ＨＤＡＣ蛋
白質エフェクターの組合せでの細胞の処理は、ＨＤＡＣ１，２アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド単独またはＨＤＡＣ蛋白質エフェクター単独での細胞の処理と比
較して、ｐ２１WAF1蛋白質レベルを増強する相乗能力を有したことを示す。
【０１３９】 実施例１０ イン・ビボにおける腫瘍細胞に対するヒストンデアセチラーゼアンチセンスオ リゴヌクレオチドおよびＨＤＡＣ蛋白質エフェクターの相乗的抗−新形成効果 本実施例の目的は、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する、本発明のヒストン
デアセチラーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＨＤＡＣ蛋白質エフェク
ターの能力を示すことにある。本実施例は、さらに、家畜化された哺乳動物にお
ける腫瘍増殖を阻害する本発明の方法および組成物の能力の証拠を提供する。８
ないし１０週齢メスＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ，
Ｇｒｅａｔ Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）に、２×１０6予備条件化Ａ５４
９ヒト肺癌細胞を脇腹に皮下注射した。これらの細胞の予備条件化は、ヌードマ
ウスの同一株における最小３つの連続腫瘍移植によってなされる。引き続いて、
ほぼ３０ｍｇの腫瘍断片を切り出し、Ｆｏｒｅｎｅ麻酔下で（Ａｂｂｏｔｔ Ｌ
ａｂｓ．， Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）マウスに左横腹に皮下
移植する。腫瘍が１００ｍｍ3の平均用量に達すれば、マウスの１つの群を、ヒ
ストンデアセチラーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドの体重１ｋｇ当たり約０
．１ ｍｇないし約３０ ｍｇを含有するオリゴヌクレオチド生理食塩水調製物
で毎日処理する。第２の群のマウスは、ＨＤＡＣ蛋白質エフェクターの体重１ｋ
ｇ当たり約０．０１ ｍｇないし約５ ｍｇを含有する医薬上許容される調製物
で毎日処理する。さらにもう１つの群のマウスにはアンチセンスオリゴヌクレオ
チドおよびＨＤＡＣ蛋白質エフェクターを摂取させる。
【０１４０】 この第３の群のうち、群Ａには尾を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドお
よびＨＤＡＣ蛋白質エフェクターを一緒に同時に静脈内摂取させる。群Ｂは、第
１日および第２日に尾静脈を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドの２回注射
を摂取させ、第３日および第４日にＨＤＡＣ蛋白質エフェクターの２回の静脈内
注入を摂取させる。群ＣはＨＤＡＣ蛋白質エフェクターの２回注入を摂取させ、
続いて、第３日および第４日にアンチセンスオリゴヌクレオチドの２回の注入を
摂取させる。
【０１４１】 無処理（例えば、生理食塩水のみ）、ミスマッチアンチセンスオリゴヌクレオ
チドのみ、ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害しない対照化合物、および対照化
合物と共にミスマッチアンチセンスオリゴヌクレオチドを摂取させる対照群のマ
ウスを同様に確立する。
【０１４２】 腫瘍容量はカリパスで測定する。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド＋ＨＤＡＣ蛋白質エフェクターでの処理は、対照に対して腫瘍の重量および容
量の有意な低下を引き起こす。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドお
よびＨＤＡＣ蛋白質エフェクターは同ヒストンデアセチラーゼの発現および活性
を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＤＮＡメチルトランスファーゼ遺伝子（前記）および該
遺伝子上の種々の２０量体ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド
の位置（塗り潰した丸で示す）を、ハイライトをつけた２つの非限定的合成オリ
ゴヌクレオチドＭＧ８８およびＭＧ９８の位置と共に示す模式図である。
【図２】 図２は、Ａ５４９およびＴ２４細胞双方においてＭｅＴａｓｅ蛋
白質発現の阻害をもたらす、４０ ｎＭまたは８０ ｎＭの代表的な非限定的ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドＭＧ８８での処理を示すウエスタンブロッティン
グ分析のオートラジオグラフの模式図である。
【図３Ａ】 図３Ａは、４０または７５ ｎＭの本発明の代表的な非限定的
アンチセンスオリゴヌクレオチドＭＧ８８での３、５、８または１０日間の細胞
の処理に続いてのＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質レベル（下方パネル）の減少とし
てのｐ１６ink4蛋白質レベル（上方パネル）の増加を示す、一連の免疫沈殿、続
いてのＴ２４細胞溶解物の一連の免疫沈殿、続いてのウエスタンブロッティング
分析のオートラジオグラフの模式図である（ここに、ＨｅＬａ細胞はｐ１６ink4 蛋白質発現についての陽性対照として働く）。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、４０ ｎＭまたは７５ ｎＭ ＭＧ８８で３、５、
８および１０日間処理したＴ２４細胞の細胞数に正規化されたｐ１６ink4蛋白質
レベルのグラフ表示である。
【図４】 図４は、Ｒｂの全てのリン酸化形態を認識する抗体を用いる、４
０ ｎＭまたは７０ｎＭの本発明の代表的な非限定的アンチセンスオリゴヌクレ
オチドＭＧ８８で処理したＴ２４細胞のウエスタンブロッティング分析のオート
ラジオグラフの模式図である。
【図５】 図５は、リポフェクチンのみ、４０ ｎＭのＭＧ８８、または４
０ ｎＭまたは７５ｎＭの対照オリゴヌクレオチドＭＧ２０８での細胞の１０日
間処理の停止から３、５または７日後に調製したＴ２４細胞溶解物の一連のウエ
スタンブロッティング分析のオートラジオグラフの模式図であり、これは処理後
５−７日間に、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ 蛋白質発現が回復し、ｐ１６ink4蛋白質
発現が低下することを示す。
【図６】 図６は、ＭＧ８８での処理の１０日間および７日間の（すなわち
、１１−１７日）処理後期間の間におけるＴ２４細胞でのＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ
およびｐ１６ink4蛋白質レベルの定量のグラフ表示であり、これは、これらの
細胞におけるｐ１６蛋白質レベルおよびＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質レベルの間
の逆関係を示す。
【図７】 図７は、メチル化ｐ１６ink4（Ｍレーン）または未メチル化ｐ１
６ink4（Ｕレーン）につき特異的なＰＣＲプライマーを用いて４０または７５
ｎＭのＭＧ８８またはＭＧ２０８で３、５、８または１０日間処理したＴ２４細
胞からのｐ１６ink4遺伝子プロモーターの２％アガロースゲル上で解像されたメ
チル化−特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）産物を示す一連の写真の表示であり、これは、
ｐ１６ink4の脱メチル化が処理の少なくとも３日後にＭＧ８８処理細胞において
のみ起こったことを示す。
【図８】 図８は、ＭＧ８８（左側）または対照オリゴヌクレオチドＭＧ２
０８（右側）での細胞の処理から０、３または５日後におけるメチル化パターン
を示すＴ２４細胞からのｐ１６ink4基部側プロモーターの模式図であり、これは
、減少したメチル化がＭＧ８８処理でのみ起こったことを示す。処理後３日のメ
チル化パターンは図面の底部に示す。
【図９Ａ】 図９Ａは、７５ｎＭ ＭＧ８８での５日処理の停止後３０日に
おけるｐ１６ink4−発現クローンＭＧ８８ Ｃ４−５中のｐ１６ink4遺伝子プロ
モーターのビスルファイト配列決定の結果の写真表示であり、これは、評価した
すべてのＣｐＧ部位が、培養後−ＭＧ８８処理において３０日後でさえこのクロ
ーンでメチル化されていなかったことを示す。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、リポフェクチンのみ（四角）、７５ｎＭ ＭＧ８８
、本発明の非限定的な代表的アンチセンスオリゴヌクレオチド（丸印）、または
７５ ｎＭまたは対照オリゴヌクレオチドＭＧ２０８（三角形）での処理（０−
５日）および処理後（６−１８日）の間におけるＴ２４細胞の増殖曲線を示すグ
ラフ表示であり、これはＭＧ８８の抗−増殖効果を示す。
【図９Ｃ】 図９Ｃは、ＭＧ８８（クローン４−５、三角形）、ＭＧ２０８
（クローン２−４、四角形）、またはリポフェクチンのみ（クローン５、菱形）
での５日処理後におけるＴ２４細胞クローンの処理後の間における増殖曲線を示
すグラフ表示である。２つのオートラジオグラフの挿入された表示は３６日およ
び４９日後処理のクローンの各々におけるｐ１６ink4蛋白質レベルを示す。
【図１０Ａ】 図１０Ａはリポフェクチンのみ、または４０ ｎＭまたは７
５ ｎＭのＭＧ８８またはＭＧ２０８で２４時間（左側パネル）または４８時間
（右側パネル）処理したＴ２４細胞におけるｐ２１WAF1、ＭｅＴａｓｅおよびα
−アクチン蛋白質レベルのウエスタンブロッティング分析のオートラジオグラフ
の表示であり、これは、ｐ２１WAF1蛋白質発現がＭｅＴａｓｅ発現の阻害によっ
て誘導されることを示す。
【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、２０ｎＭ、４０ｎＭまたは８０ｎＭのＭＧ８８
またはＭＧ２０８で２４時間処理したＴ２４細胞におけるｐ２１WAF1蛋白質レベ
ルの用量−応答を示すウエスタンブロッティング分析のオートラジオグラフの表
示である。アクチン蛋白質レベルは蛋白質負荷についての対照として示す。
【図１１】 図１１は、ＭＧ８８またはＭＧ２０８で２４または４８時間処
理したＴ２４細胞からのＲＮＡのノーザンブロッティング分析を示すオートラジ
オグラフの模式図である。
【図１２】 図１２は、増大させる濃度の代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅ蛋白質エフェクターである５−アザ−ｄＣでの３日間の処理後におけるＴ
２４細胞でのｐ１６発現の再活性化を示すウエスタンブロッティング分析のオー
トラジオグラフの模式図である。
【図１３】 図１３は、本発明による代表的な非限定的合成アンチセンスオ
リゴヌクレオチド（ＭＧ８８）および／または代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅ蛋白質エフェクター（５−アザ−ｄＣ）での３日間の処理後におけるＴ２
４細胞でのｐ１６発現の相乗的再活性化を示すウエスタンブロット分析のオート
ラジオグラフの模式図であり；３つのパネルは、本発明による変化させた組合せ
および能動の代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅ蛋白質エフェクターを示す。
【図１４】 図１４は、本発明による代表的な非限定的合成アンチセンスオ
リゴヌクレオチド（ＭＧ９８）および／または代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴ
ａｓｅ蛋白質エフェクター（５−アザー−ｄＣ）での３日間の処理後におけるＴ
２４細胞でのｐ１６発現の相乗的再活性化を示すウエスタンブロット分析のオー
トラジオグラフの模式図出あり；３つのパネルは、変化させた組合せおよび濃度
の本発明による代表的なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質
エフェクターを示す。
【図１５】 図１５は、低濃度の本発明による代表的な非限定的合成オリゴ
ヌクレオチド（ＭＧ８８）および／または代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴａｓ
ｅ蛋白質エフェクター（５−アザ−ｄＣ）での３日間の処理後におけるＴ２４細
胞でのｐ１６発現の相乗的再活性化を示すウエスタンブロット分析のオートラジ
オグラフの模式図であり；３つのパネルは、変化させた組合せおよび濃度の本発
明の代表的なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクタ
ーを示す。
【図１６】 図１６は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのみまたはＤＮＡ
ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクターのみいずれかを用いて観察されたものと比較
して、増大した阻害効果をもたらす、相乗的様式でＴ２４ヒト膀胱癌細胞増殖を
阻害する、本発明による代表的非限定的合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（
ＭＧ９８）および代表的非限定的ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクター（５
−アザ−ｄＣ）の能力を示すグラフ表示である。
【図１７】 図１７はリポフェクチンのみ（左側から最初の棒線）１μＭの
代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクターである５−アザ−ｄ
Ｃ（左側から第２の棒線）；４０ｎＭの対照合成オリゴヌクレオチドＭＧ２０７
（左側から第３の棒線）；４０ｎＭの代表的な非限定的合成ＭｅＴａｓｅアンチ
センスオリゴヌクレオチドであるＭＧ９８（左側から第４の棒線）；ＭＧ２０７
＋５−アザ−ｄＣ（左側から第５の棒線）；またはＭＧ９８＋５−アザ−ｄＣ（
左側から第６の棒線）での７日間の処理の後におけるＴ２４ヒト膀胱癌細胞増殖
の相乗的阻害を示すグラフ表示である。
【図１８】 図１８は、オリゴヌクレオチドのみまたはＤＮＡ ＭｅＴａｓ
ｅ蛋白質エフェクターのみいずれかを用いて観察されたものと比較して増大した
阻害効果をもたらす、相乗様式にて、Ａ５４９ヒト非小細胞肺癌細胞増殖を阻害
する本発明による代表的な非限定的合成オリゴヌクレオチド（ＭＧ９８）および
代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクター（５−アザ−ｄＣ）
の能力を示すグラフ表示である。
【図１９】 図１９は、オリゴヌクレオチドのみまたはＤＮＡ ＭｅＴａｓ
ｅ蛋白質エフェクターのみいずれかを用いて観察されたものと比較して増大した
阻害効果をもたらす、相乗様式で、Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸癌細胞増殖（経時的
に腫瘍用量として表す）を阻害する本発明による代表的な非限定的合成オリゴヌ
クレオチド（ＭＧ９８）および代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エ
フェクター（５−アザ−ｄＣ）の能力を示すグラフ表示である。
【図２０Ａ】 図２０Ａは、生理食塩水（菱形）；０．５ｍｇ／ｋｇの代表
的な非限定的合成ＭｅＴａｓｅオリゴヌクレオチドであるＭＧ９８（菱形）；０
．１ｍｇ／ｋｇの代表的な非限定的ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクターで
ある５−アザ−ｄＣ（三角形）；またはＭＧ９８＋５−アザ−ｄＣ双方の組合せ
（Ｘ）でのマウスの処理後におけるヌードマウスでのＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞増
殖の阻害を示すグラフ表示である。
【図２０Ｂ】 図２０Ｂは、オリゴヌクレオチド、蛋白質エフェクターまた
は生理食塩水いずれかのみを用いて観察されたものと比較して統計学的に増大し
た阻害効果をもたらす（ｐ＜０．０５）、相乗様式での、本発明による代表的な
非限定的合成オリゴヌクレオチド（ＭＧ９８）によるおよび代表的な非限定的Ｄ
ＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクター（５−アザ−ｄＣ）によるＣｏｌｏ２０
５ヒト結腸癌細胞増殖（最終腫瘍用量で表す）の阻害を示すグラフ表示である。
【図２１】 図２１は、異なるスケジュールにおける、本発明による代表的
非限定的合成オリゴヌクレオチド（ＭＧ８８）および／または代表的非限定的Ｄ
ＮＡ ＭｅＴａｓｅ蛋白質エフェクター（５−アザ−ｄＣ）で処理したＴ２４細
胞の一連のＦＡＣＳヒストグラム分析を示す模式的ダイアグラムである。該ヒス
トグラムの上方パネルはスケジュールＡで処理された細胞を示し、ここに、ＭＧ
８８は５−アザ−ｄＣの前に投与される。ヒストグラムの下方パネルはスケジュ
ールＢで処理された細胞を示し、ここに、５−アザ−ｄＣはＭＧ８８の前に投与
される。
【図２２】 図２２は、本発明による代表的な非限定的合成アンチセンスオ
リゴヌクレオチド（ＭＧ２６０５）および代表的な非限定的ＴＳ蛋白質エフェク
ター（５−ＦＵ）の組合せを用いるＴ２４細胞におけるチミジレートシンターゼ
蛋白質発現の相乗的阻害を示すウエスタンブロッティング分析のオートラジオグ
ラフの模式図である。
【図２３】 図２３は、本発明による代表的な非限定的合成チミジレートシ
ンターゼアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または代表的な非限定的ＴＳ
蛋白質エフェクター（５−ＦＵ）で処理したＴ２４細胞の一連のＦＡＣＳヒスト
グラム分析を示す模式的ダイアグラムである。頂部ヒストグラムはリポフェクチ
ンのみで処理された細胞を示し；第２のヒストグラムは２５ｎＭミスマッチ対照
オリゴヌクレオチドで処理した細胞を示し；頂部から第３のヒストグラムは２５
ｎＭのＴＳアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＭＧ２６０５で処理した細胞
を示し；頂部から第４のヒストグラムは５００ｎＭの５−ＦＵで処理した細胞を
示し；頂部から第５のヒストグラムは５−ＦＵ＋ミスマッチオリゴヌクレオチド
で処理した細胞を示し；第６のヒストグラム（すなわち、底部ヒストグラム）は
５−ＦＵ＋ＴＳアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＭＧ２６０５で処理した
細胞を示す。
【図２４Ａ】 図２４Ａは、２５ｎＭの代表的な非限定的ＴＳアンチセンス
オリゴヌクレオチドＭＧ２６０５、２５ｎＭの対照オリゴヌクレオチドＭＧ２６
０６、５μＭの代表的な非限定的ＴＳ蛋白質エフェクターである５−ＦＵまたは
オリゴヌクレオチド＋５−ＦＵの組合せでの処理の後におけるＧ1相（灰色の棒
線；挿入されたヒストグラム上のセクションＭ２）、Ｓ相（黒色の棒線；挿入さ
れたヒストグラム上のセクションＭ３）、およびＧ2／Ｍ相（白色棒線；挿入さ
れたヒストグラム上のセクションＭ４）におけるＴ２４細胞のパーセントを示す
グラフ表示である。
【図２４Ｂ】 図２４Ｂは、無処理；２５ｎＭの代表的な非限定的ＴＳアン
チセンスオリゴヌクレオチドＭＧ２６０５；２５ｎＭの対照オリゴヌクレオチド
ＭＧ２６０６；５μＭの代表的な非限定的ＴＳ蛋白質エフェクターである５−Ｆ
Ｕ；またはＭＧ２６０５またはＭＧ２６０６＋５−ＦＵの組合せでの処理後に残
るＴ２４細胞の数のグラフ表示である。
【図２５】 図２５は、本発明による代表的な非限定的合成ＨＤＡＣアンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび代表的な非限定的ＨＤＡＣ蛋白質エフェクター
（ＴＳＡ）の組合せによるｐ２１WAF1の相乗的誘導を示すウエスタンブロッティ
ング分析のオートラジオグラフの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/706 Ａ６１Ｋ 31/706 31/7068 31/7068 31/7088 31/7088 31/7125 31/7125 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 サイダース，ウイリアム，エム アメリカ合衆国 02472 マサチューセッ ツ州，ウォータータウン，アムハースト ロード 12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA01 CA29 CA44 4C084 AA02 AA13 AA18 BA32 BA34 BA35 BA44 CA59 MA02 NA05 NA14 ZB262 4C086 AA01 AA02 BC43 BC45 EA11 EA16 GA03 GA07 MA02 MA04 NA05 NA14 ZB26 4C206 AA01 AA02 DA02 HA16 KA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZB26

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞を、遺伝子の発現を阻害する有効相乗量のアンチセンス
    オリゴヌクレオチドおよび有効相乗量の遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと接
    触させることを特徴とする細胞における遺伝子の発現を阻害する方法。
  2. 【請求項２】その身体中に存在する病気によって影響された少なくとも１つ
    の細胞を有するヒトを含めた哺乳動物に、治療上有効な相乗量の遺伝子の発現を
    阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および治療上有効な相乗量の遺伝子
    の産物の蛋白質エフェクターを投与することを特徴とする哺乳動物において遺伝
    子の阻害に対して応答性の病気を治療する方法。
  3. 【請求項３】 その身体中に存在する少なくとも１つの新形成細胞を有する
    ヒトを含めた哺乳動物に、治療上有効な相乗量の腫瘍形成に関与する遺伝子の発
    現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および治療上有効な相乗量の遺
    伝子の産物の蛋白質エフェクターを投与することを特徴とする哺乳動物において
    腫瘍成長を阻害する方法。
  4. 【請求項４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが蛋白質エフェクターと作
    動可能に会合している請求項１、２または３記載の方法。
  5. 【請求項５】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする請求
    項１、２または３記載の方法。
  6. 【請求項６】 蛋白質エフェクターが５−アザ−シチジン、５−アザー２’
    デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジンおよび５，６−ジヒ
    ドロ−５−アザシチジンよりなる群から選択される請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 遺伝子がヒストンデアセチラーゼをコードする請求項１、２
    または３記載の方法。
  8. 【請求項８】 蛋白質エフェクターがトリコスタチンＡ、デプデシン、トラ
    ポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７
    −２７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウムよりなる群から選択される請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】 遺伝子がチミジレートシンターゼをコードする請求項１、２
    または３記載の方法。
  10. 【請求項１０】 蛋白質エフェクターが５−フルオロウラシル、トムデック
    ス、ラルティトレキセド、ゼネカＺＤ１６９４、ゼネカＺＤ９３３１、チミタク
    、ＡＧ３３１、Ｌｙ２３１５１４およびＢＷ１８４３Ｕ８９よりなる群から選択
    される請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート、
    ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、
    ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボ
    キシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホ
    スホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよび
    スルホンヌクレオチド間結合よりなる群から選択される少なくとも１つのヌクレ
    オチド間結合を有する請求項１、２または３記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート、
    ホスホジエステルもしくはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホネー
    トもしくはアルキルホスホロチオエート領域を含むキメラオリゴヌクレオチドで
    ある請求項１、２または３記載の方法。
  13. 【請求項１３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドもし
    くは２’Ｏ−置換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を
    含む請求項１、２または３記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該細胞を有効な時間、有効相乗量の少なくとも１つのアン
    チセンスオリゴヌクレオチドと接触させる請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 治療上有効な時間、治療上有効な相乗量の少なくとも１つ
    のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与する請求項２または３記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 該細胞を有効な時間、有効相乗量の少なくとも１つの蛋白
    質エフェクターと接触させる請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 治療上有効な時間、治療上有効な相乗量の少なくとも１つ
    の蛋白質エフェクターを哺乳動物に投与する請求項２または３記載の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞との接触に先立って、アンチセンスオリゴヌクレオチ
    ドおよび蛋白質エフェクターの各々を医薬上許容される担体と混合する請求項１
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 哺乳動物への投与に先立って、アンチセンスオリゴヌクレ
    オチドおよび蛋白質エフェクターの各々を医薬上許容される担体と混合する請求
    項２または３記載の方法。
  20. 【請求項２０】 細胞への接触に先立って、アンチセンスオリゴヌクレオチ
    ドおよび蛋白質エフェクターを混合する請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】 哺乳動物への投与に先立って、アンチセンスオリゴヌクレ
    オチドおよび蛋白質エフェクターを混合する請求項２または３記載の方法。
  22. 【請求項２２】 細胞を、別々に、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび
    蛋白質エフェクターの各々と接触させる請求項１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 蛋白質エフェクターと接触させるに先立って、細胞をアン
    チセンスオリゴヌクレオチドと接触させる請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、接
    触した細胞を誘導してアポトーシスを受けさせるか、細胞周期のＳ相に留めてお
    く請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるに先立って
    、細胞を蛋白質エフェクターと接触させる請求項２２記載の方法。
  26. 【請求項２６】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、接
    触された細胞が細胞周期のＧ1相に留められる請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質エフェクタ
    ーを別々に哺乳動物に投与する請求項２または３記載の方法。
  28. 【請求項２８】 蛋白質エフェクターの投与に先立って、アンチセンスオリ
    ゴヌクレオチドを哺乳動物に投与する請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、蛋
    白質エフェクターの投与に先だってアンチセンスオリゴヌクレオチドが投与され
    る哺乳動物中の細胞を誘導してアポトーシスを受けさせ、または細胞周期のＳ相
    に留める請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に先だって、蛋白
    質エフェクターが哺乳動物に投与される請求項２７記載の方法。
  31. 【請求項３１】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、ア
    ンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に先だって蛋白質エフェクターが投与され
    る哺乳動物中の細胞が細胞周期のＧ1相に留められる請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、細
    胞が、その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子を含む請求項１記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子の発
    現が、接触された細胞中で再度活性化される請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子がｐ
    １６ink4腫瘍サプレッサー遺伝子である請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、細
    胞が、その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子を含む請求項２また
    は３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子の発
    現が、治療上有効な相乗量のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび治療上有効
    な相乗量の蛋白質エフェクターが投与されている哺乳動物中で再度活性化される
    請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 その発現がメチル化によって不活化されている遺伝子がｐ
    １６ink4腫瘍サプレッサー遺伝子である請求項３５記載の方法。
  38. 【請求項３８】 遺伝子の産物の蛋白質エフェクターと作動可能に会合する
    該遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む該遺伝子の阻
    害剤。
  39. 【請求項３９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが２以上の蛋白質エフェ
    クターと作動可能に会合する請求項３８記載の阻害剤。
  40. 【請求項４０】 遺伝子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする請
    求項３８記載の阻害剤。
  41. 【請求項４１】 蛋白質エフェクターが５−アザ−シチジン、５−アザ−２
    ’−デオキシシチジン、５−フルオロー２’−デオキシシチジンおよび５，６−
    ジヒドロ−５−アザシチジンよりなる群から選択される請求項４０記載の阻害剤
    。
  42. 【請求項４２】 遺伝子がヒストンデアセチラーゼをコードする請求項３８
    記載の阻害剤。
  43. 【請求項４３】 蛋白質エフェクターがトリコスタチンＡ、デプデシン、ト
    ラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２
    ７−２７５、ＣＩ−９９４および酪酸ナトリウムよりなる群から選択される請求
    項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 遺伝子がチミジレートシンターゼをコードする請求項３８
    記載の阻害剤。
  45. 【請求項４５】 蛋白質エフェクターが５−フルオロウラシル、トムデック
    ス、ラルティトレキセド、ゼネカＺＤ１６９４、ゼネカＺＤ９３３１、チミタク
    、ＡＧ３３１、Ｌｙ２３１５１４およびＢＷ１８４３Ｕ８９よりなる群から選択
    される請求項４４記載の阻害剤。
  46. 【請求項４６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート、
    ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、
    ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボ
    キシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホ
    スホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよび
    スルホンヌクレオチド間結合よりなる群から選択される少なくとも１つのヌクレ
    オチド間結合を有する請求項３８記載の阻害剤。
  47. 【請求項４７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート、
    ホスホジエステルもしくはホスホロジチオエート領域およびアルキルホスホネー
    トまたはアルキルホスホノチオエート領域を含むキメラオリゴヌクレオチドであ
    る請求項３８記載の阻害剤。
  48. 【請求項４８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドもし
    くは２’Ｏ−置換リボヌクレオチド領域およびデオキシリボヌクレオチド領域を
    含む請求項３８記載の阻害剤。
  49. 【請求項４９】 請求項３８記載の阻害剤を含む医薬組成物。
  50. 【請求項５０】 さらに医薬上許容される担体を含む請求項４９記載の組成
    物。
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