CN105008394B

CN105008394B - 治疗结肠直肠癌的方法

Info

Publication number: CN105008394B
Application number: CN201480016188.7A
Authority: CN
Inventors: 乔瓦尼·蒙泰莱奥内; 塞尔瓦托·贝林薇雅; 维蒂·弗朗西斯卡
Original assignee: Nogra Pharma Ltd
Current assignee: Nogra Pharma Ltd
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: JP6502863B2; KR20150131260A; HK1219489A1; CA2903597C; KR102232623B1; EP2970419B8; EP2970419B1; EP2970419A1; RU2015140572A3; NZ711564A; CN105008394A; AU2014229985B2; WO2014140333A1; ES2673209T8; AU2014229985A1; JP2019026649A; ES2673209T3; MX2015013255A; MX363746B; RU2015140572A

Abstract

本文中公开了使用SMAD7表达或功能的特异性抑制剂来治疗和/或预防结肠直肠癌的方法。还公开了用于治疗和/或预防结肠直肠癌的含有SMAD7抑制剂的药物组合物，以及在治疗和/或预防结肠直肠癌中使用的含有SMAD7抑制剂的药物的制造。

Description

治疗结肠直肠癌的方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请61/790,488和2013年7月17日提交的美国临时申请61/847,287的利益，每个所述临时申请的整个内容通过参考并入本文。

技术领域

本发明总的来说涉及通过给药SMAD7抑制剂、特别是针对SMAD7的反义寡核苷酸来治疗和/或预防结肠直肠癌和结肠直肠癌细胞生长的方法，以及用于治疗结肠直肠癌的SMAD7抑制剂的药物组合物。

背景技术

结肠直肠癌是一种以大肠的细胞、包括结肠或直肠的细胞的未加抑制的增殖为特征的疾病。结肠直肠癌肿瘤被认为发源于正常粘膜。肿瘤发生与成簇的显示出增殖和生物化学异常的扩大隐窝(crypt)的出现相关。携带一个或多个病因性突变的上皮细胞的增殖，可以变成以高度异常增生为特征的早期肿瘤。进一步的生长可以导致进入肌肉层中并通过肠壁的侵入性生长。如果不治疗，这些肿瘤可以扩散到局部淋巴结，然后转移到远端位点，在所述位点处它们变得在很大程度上无法使用目前可用的技术治疗(Markowitz和Bertagnolli(2009)N.Engl.J.Med.361(25):2449-2460)。尽管肿瘤会重新产生，但证据表明约60％的癌源自于先前存在的腺瘤(Soreide等，(2011)Discov.Med.12(66):393-404)。因此，绝大部分结肠直肠癌肿瘤可以被分类为腺癌，但在较小部分病例中也观察到淋巴瘤和鳞状细胞癌。引起癌变的遗传突变，包括Wnt信号通路的成员、诸如TGF-β1和SMAD家族成员的TGF-β细胞信号通路的成员、诸如TP53的调控细胞增殖与细胞死亡之间的平衡的蛋白以及诸如DCC的其他蛋白的突变(Reya和Clevers(2005)Nature 434(7035):843-850；Baker等，(1989)Science 244:217-221；Markowitz和Bertagnolli，同上)。异常的PI3K/Akt激活和下游mTOR信号传导与结肠直肠癌肿瘤发生相关(Rychahou等，(2006)Ann.Surg.243(6):833-842)。也已在结肠癌细胞系中观察到高水平的EGFR表达，并将其与结肠直肠癌肿瘤发展相关联(Ciardiello等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(17):7792-7796)。除了家族和遗传因素之外，结肠直肠癌的风险因子可能包括低水平的体力活动、饮酒、脂肪和肉类的高膳食摄入及纤维和蔬菜的低摄入。结肠直肠癌的症状通常包括直肠出血、贫血、便秘、便血、体重减轻、发烧、食欲不振和恶心或呕吐。

结肠直肠癌是美国男性和女性癌症幸存者中第二常见的癌症形式(Siegel等，(2012)CA Cancer J.Clin.62(4):220-41)。此外，结肠直肠癌在西方世界位于前三种最常见的癌症死亡病因之列(Soreide等，(2011)Discov.Med.12(66):393-404)。更近些时候许多亚洲国家向西方生活方式的改变，也在那些人群中引起结肠直肠癌的显著增加(Yang等，(2011)Dig.Surg.28(5-6):379-385)。在2012年，据估计在美国生活着120万以前诊断为患有结肠直肠癌的个体。同一年，预测将有另外143,460人被诊断为患有该病。诊断为结肠直肠癌时的年龄中位数，对于男性来说为68岁，对于女性来说为72岁(Howlader等，(2011)SEER Cancer Statistics Review,1975-2008.Bethesda,MD:National CancerInstitute)。尽管结肠直肠癌的发病在老年人中并不罕见，但仅有59.1％的年龄超过50岁的个体按照指导纲要接受了结肠直肠癌筛查(American Cancer Society(2012)CancerPrevention&Early Detection Facts&Figures.Atlanta,GA:American Cancer Society)。这种早期诊断的缺乏，导致只有39％的患者在癌症尚未进展到超过局部阶段时被诊断(Howlader等，同上)。鉴于患有结肠直肠癌的患者数量的增加，对于开发稳健的治疗方法，特别是用于没有通过早期筛查鉴定的大量患者的治疗方法，存在着需求。

发明概述

本文中描述的发明提供了利用SMAD7作为TGF-β信号通路的关键拮抗剂的作用、通过抑制SMAD7来治疗结肠直肠癌的新方法。尽管已经提出了在结肠直肠癌中用于治疗性干预的其他潜在靶点，但本发明提供了显示出阻止、迟滞、停止或逆转结肠直肠肿瘤细胞生长的新疗法。

本发明提供了一种通过抑制SMAD7来治疗结肠直肠癌的方法。具体来说，本发明提供了一种在患者的结肠直肠肿瘤中抑制SMAD7的方法。本发明还提供了一种通过抑制SMAD7来抑制结肠直肠癌细胞生长的方法。本发明还提供了一种通过给药有效量的SMAD7抑制剂，来抑制SMAD7、治疗结肠直肠癌和/或抑制结肠直肠癌细胞生长的方法。例如，SMAD7的抑制剂(例如抗SMAD7反义疗法、即针对SMAD7的反义寡核苷酸，以及针对SMAD7的抗体)。当在本文中使用时，“反义寡核苷酸”是指与编码靶蛋白(例如SMAD7)的信使RNA(mRNA)互补的短的合成寡核苷酸序列。反义寡核苷酸序列与mRNA杂交产生双链杂交体，其可以引起诸如RNaseH的遍在催化酶的激活，所述酶降解DNA/RNA杂交体链，从而阻止蛋白质翻译。

SMAD7抑制剂可以是SMAD7的特异性抑制剂，例如以高度特异性靶向SMAD7的反义寡核苷酸或任何其他手段。SMAD7的反义寡核苷酸抑制剂可以选自但不限于本文中描述的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。例如，SMAD7的反义寡核苷酸抑制剂可能包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9，或者可能包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10。本发明的示例性SMAD7反义寡核苷酸是由SEQ ID NO：6的一种形式所代表的序列，其中所有磷酸酯键是硫代磷酸酯键(SEQ ID NO：10，在本文中被称为GED-0301)。

当在本文中使用时，“抑制剂”是指能够通过与基因、基因的RNA产物或蛋白质产物、或这些实体的任何过渡形式、或其活性或表达影响目标靶点的活性或表达的另一种分子实体的直接或间接相互作用，降低基因或DNA序列的表达，阻止或抑制基因的RNA产物向蛋白质的生产、活性或翻译，或阻止或抑制基因的蛋白质产物的活性的药剂。这样的抑制剂可以包括但不限于例如抗体、结合于特定分子靶的小分子和靶向特定mRNA转录物的反义寡核苷酸。因此，当在本文中使用时，“SMAD7的抑制剂”是指能够通过与SMAD7的基因、RNA产物或蛋白质产物或这些实体的任何过渡形式、或其活性或表达影响SMAD7的活性或表达的另一种分子实体的直接或间接相互作用，降低SMAD7的表达，阻止或抑制SMAD7的RNA产物向蛋白质的生产、活性或翻译，或阻止或抑制SMAD7的蛋白质产物的活性的药剂。

本发明还提供了通过给药SMAD7的特异性抑制剂来治疗结肠直肠癌的方法。当在本文中使用时，“特异性抑制剂”是指具有允许它专门地或以高度选择性作用于分子靶的结构和/或功能性质的药剂。因此，SMAD7的特异性抑制剂具有专门地或以高度特异性靶向SMAD7基因、它的RNA或蛋白质产物、或活性或表达影响SMAD7或其产物的活性或表达的另一种分子实体的固有功能性质。在SMAD7的抗体抑制剂的情形中，可以通过包含已知以高度特异性结合SMAD7蛋白的表位的蛋白质序列，将特异性工程化到抗体中。在SMAD7的小分子抑制剂的情形中，可以将允许结合于SMAD7蛋白的特定特征的化学基团包含在小分子的结构式中。可以对反义寡核苷酸进行设计，使得每个反义寡核苷酸的并入的核苷酸序列的靶向部分完全或基本上完全地与SMAD7mRNA序列互补。这样的互补或近似互补的核苷酸序列的并入，允许人们工程化制造对于给定靶具有高度特异性的反义寡核苷酸。可以通过诸如解离常数的参数的测量、或诸如蛋白质或RNA表达水平的变化的其他标准、或测量SMAD7活性或表达的其他测定法来评估特异性。

特异性SMAD7抑制剂可以包括例如用于治疗结肠直肠癌和/或抑制结肠直肠癌细胞生长的小的结合性分子，例如天然和合成的化合物、抗体、适体、内化体(intramer)、RNAi(双链RNA、siRNA)和抗SMAD7反义分子。SMAD7抑制剂也可以包含干扰SMAD7活性、结合配偶体或底物并因此抑制SMAD7功能的截短的和/或突变的SMAD7分子。

当在本文中使用时，“有效量”是指当给药于患者时足以至少部分治疗病症的药剂的量。治疗有效量将随着病症、组分的给药途径、被治疗患者的年龄、体重等而变化。因此，SMAD7的特异性抑制剂的有效量是在患者中治疗结肠直肠癌所必需的抑制剂的量，使得所述药剂的给药阻止结肠直肠癌在对象中发生，阻止结肠直肠癌进展(例如阻止诸如肿瘤发生、肿瘤生长或转移的事件发生)，或者缓解或完全减轻结肠直肠癌的所有相关症状，即引起疾病的消退。

本发明还提供了一种通过给药包含针对SMAD7的反义寡核苷酸的药物组合物来治疗结肠直肠癌的方法。另一方面，本发明提供了用于治疗结肠直肠癌的药物组合物。所述药物组合物可以包含诸如靶向SMAD7的反义寡核苷酸的SMAD7抑制剂，以及可药用载体。当在本文中使用时，术语“药物组合物”意味着例如在可药用载体中含有例如治疗有效量的治疗性化合物的特定量的治疗性化合物，将要给药于例如人类的哺乳动物的混合物。在一些实施方式中，本文中设想了包含所设想的针对SMAD7的反义寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。另一方面，本发明公开了将针对SMAD7的反义寡核苷酸在制造治疗结肠直肠癌的药品中的应用。当在本文中使用时，“药品”具有与术语“药物组合物”基本上相同的意义。

当在本文中使用时，“可药用载体”意味着适合与人类和动物的组织相接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。在与制剂的其他成分相容并且对受体无害的意义上，载体应该是“可接受的”。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药物活性物质，在本领域中是已知的。在一个实施方式中，药物组合物口服给药，并包括适用于调节被包封的物质在消化系统或肠内的吸收位点的肠溶包衣。例如，肠溶包衣可以包括丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。

在一个实施方式中，所设想的针对SMAD7的反义寡核苷酸及其任何药物组合物可以通过一种或几种途径给药，包括口服、局部、肠胃外例如皮下注射、通过吸入喷剂或直肠给药。当在本文中使用时，术语肠胃外包括皮下注射、胰腺内给药、静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内注射或输注技术。例如，可以将针对SMAD7的反义寡核苷酸皮下给药到对象。在另一个实例中，可以将针对SMAD7的反义寡核苷酸口服给药到对象。在另一个实例中，可以将针对SMAD7的反义寡核苷酸通过肠胃外给药直接给药到结肠直肠肿瘤或结肠直肠癌细胞。

附图简述

图1(A)示出了IgG同种型对照(同种型，左栏)和患有偶发性结肠直肠癌的患者的非肿瘤(NT)和肿瘤(T)区域中的SMAD7免疫染色(分别为中栏和右栏)；图1(B)是蛋白免疫印迹(Western blot)，示出了在来自于两位患有偶发性结肠直肠癌的患者的NT和T组织中的SMAD7和β-肌动蛋白水平(左栏)以及SMAD7的蛋白免疫印迹信号的密度测量分析(右栏)；图1(C)是蛋白免疫印迹，其示出了IEC和DLD-1以及HCT-116细胞中的SMAD7和β-肌动蛋白水平；图1(D)示出了在HCT-116(左侧)和DLD-1细胞(右侧)中FITC偶联的IgG同种型对照(同种型)和SMAD7抗体信号的FACS分析；并且图1(E)是蛋白免疫印迹(左栏)，其示出了在四个结肠直肠癌细胞系(HCT-116、HCT-115、HT-29和DLD-1)和一个肝细胞癌细胞系(HepG2)中SMAD7和β-肌动蛋白的表达水平，以及来自于同一印迹的SMAD7蛋白免疫印迹信号的密度测量分析(右栏)。

图2(A)是一系列点图，其描绘了细胞总数并标明了用未标记的SMAD7正义寡核苷酸或用不断增加剂量的FITC偶联的SMAD7反义寡核苷酸GED-0301(FITC-偶联的GED-0301)转染的碘化丙啶(PI)-和荧光(FITC)-阳性的HCT-116细胞的百分率；图2(B)是蛋白免疫印迹，其示出了在用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后，HCT-116细胞中的SMAD7和β-肌动蛋白水平；图2(C)描绘了图表，其示出了在未处理(Untr)或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后增殖的HCT-116(黑色条)或DLD-1(白色条)细胞的百分数(左侧)，以及柱状图，其示出了在用SMAD7正义(顶部)或GED-0301(底部)寡核苷酸转染后增殖的HCT-116细胞的百分数；图2(D)的图示出了在未处理(Untr)或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后，处于不同细胞周期阶段的HCT-116细胞的百分数；并且图2(E)示出了用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染并不加以处理或暴露于过量TGF-β蛋白(TGF-β)或TGF-β抗体(抗TGF-β)的HCT-116细胞的增殖百分数。

图3(A)示出了图表，其描绘了在未处理(Untr)或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后24(顶部)或48小时(底部)时HCT-116细胞死亡的百分数，以及点图(底部)，其示出了在SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后的PI和膜联蛋白V(AV)染色；图4(B)示出了一系列点图，其定量了未处理(Untr)或SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后不同时间点时HCT-116细胞中的活性半胱天冬酶-3；图4(C)是示出了在未处理或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后暴露于N-(2-喹啉基)缬氨酰基-天冬氨酰基-(2,6-二氟苯氧基)甲基酮(Q-VD-OPH)和活性半胱天冬酶-3的细胞的百分数的图表；图4(D)是示出了在暴露于Q-VD-OPH然后未进行处理或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的细胞中细胞死亡的百分数的图表；并且图4(E)是示出了暴露于Q-VD-OPH然后未处理或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的增殖细胞的百分数的图表。

图4(A)示出了来自于未转染(Untr)或用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染并探测磷酸化的CDK2(p-CDK2(Thr-14/Tyr-15))、CDK2、周期蛋白A和β-肌动蛋白的HCT-116细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(B)示出了来自于未转染(Untr)或用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染并探测CDC25A、CDC25B和CDC25C的HCT-116细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(C)示出了在用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染的HCT-116细胞中，在不同时间点时CDC25A mRNA表达的定量；图4(D)示出了来自于用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染并在暴露于蛋白酶体抑制剂MG115和MG132后探测CDC25A或β-肌动蛋白的细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(E)是来自于用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染并在不同时间点探测磷酸化的EiF2α(p-EiF2α(Ser 51))、总EiF2α、CDC25A、周期蛋白A和β-肌动蛋白的细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(F)示出了在暴露于二甲亚砜(DMSO)或salubrinal后探测p-EiF2α(Ser 51)、EiF2α、CDC25A和β-肌动蛋白的HCT-116细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(G)示出了从用SMAD7抗体免疫沉淀并用蛋白质磷酸酶1(顶栏)、EiF2α(中栏)或SMAD7抗体探测的HCT-116细胞提取物(左栏)或原代结肠直肠癌细胞(右栏)制作的蛋白免疫印迹；并且图4(H)示出了来自于用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染，经历PP1或EiF2α抗体免疫沉淀，并用相反抗体探测的HCT-116细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹。

图5(A)示出了来自于氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠(AOM+DSS)处理后的小鼠的非肿瘤或肿瘤组织中的SMAD7免疫染色，并且图5(B)是示出了来自于AOM+DSS处理后的小鼠的非肿瘤和肿瘤组织中的相对SMAD7mRNA表达的图。

图6(A)示出了用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的结肠直肠癌组织外植体的苏木精和伊红(H&E)染色和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色；并且图6(B)示出了用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的人类结肠直肠癌组织外植体的SMAD7、PCNA、周期蛋白A、p-EiF2α(Ser 51)和CDC25A免疫染色。

图7(A)示出了在注射到HCT-116定植(colonize)的Ragl^-/-小鼠中之后，暴露于PBS(CTR)或FITC偶联的GED-0301单次注射的源自HCT-116的异体移植物中FITC信号的分布；图7(B)是蛋白免疫印迹，其示出了在暴露于SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸的源自HCT-116的异体移植物的蛋白质提取物中的SMAD7和β-肌动蛋白表达；图7(C)是定量了源自于用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸处理的小鼠的异体移植物的肿瘤体积的图表(左侧)和来自于相同实验的异体移植物的代表性照片；并且图7(D)示出了用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸处理的异体移植物的SMAD7、PCNA和周期蛋白A免疫染色。

图8(A)示出了来自暴露于AOM并随后用SMAD7正义或反义寡核苷酸处理的Apc(Min/+)小鼠的内窥镜图像(左栏)，以及肿瘤数量和肿瘤评分的内窥镜分析(图表，右侧)和来自于Apc(Min/+)小鼠的结肠切片的H&E染色(中栏)；图8(B)-(F)示出了来自于用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸处理的小鼠，并分别对SMAD7、PCNA、周期蛋白A、CDC25A和p-EiF2α(Ser 51)免疫染色的肿瘤(T)和非肿瘤(NT)组织切片；并且图8(G)示出了在Apc(Min/+)小鼠中FITC偶联的反义寡核苷酸向肠组织的定位。

具体实施方式

结肠直肠癌

本发明提供了用于治疗结肠直肠癌的方法。当在本文中使用时，“结肠直肠癌”是指以大肠的细胞、包括结肠或直肠的细胞的未加抑制的增殖为特征的疾病。结肠直肠癌通常起源于大肠的上皮细胞，并且肠腺干细胞是可能的细胞起源。引起癌变的遗传突变包括诸如β-链蛋白、APC、AXIN1、AXIN2、TCF7L2和NKD1的Wnt信号通路的成员、诸如TGF-β1和SMAD家族成员的TGF-β细胞信号通路的成员、诸如TP53的调控细胞增殖与细胞死亡之间的平衡的蛋白和诸如DCC的其他蛋白例的突变。携带一个或多个病因性突变的上皮细胞的增殖，可以导致进入肌肉层中并通过肠壁的侵入性生长。结肠直肠癌的症状通常包括直肠出血、贫血、便秘、便血、体重减轻、发烧、食欲不振和恶心或呕吐。绝大部分结肠直肠癌肿瘤可以被分类为腺癌，但在较小部分病例中也观察到淋巴瘤和鳞状细胞癌。因此，当在本文中使用时，术语“结肠直肠肿瘤”是指与起源于大肠或结肠直肠癌症病理的细胞相关的任何异常的组织恶性生长。

当在本文中使用时，术语“结肠直肠癌细胞”是指引起结肠直肠癌或结肠直肠肿瘤的任何细胞来源，与结肠直肠肿瘤的肿瘤发生、生长、演化、维持或支持相关的细胞，或与结肠直肠癌的病理表现相关的任何其他细胞。当在本文中使用时，“结肠直肠癌细胞的生长”是指与结肠直肠癌细胞起源相关的细胞、结肠直肠肿瘤细胞或与结肠直肠癌病理表现相关的任何细胞的未加抑制的或异常的增殖。结肠直肠癌细胞的生长可能是异常细胞周期活性、诱导细胞周期检查点的失败、诱导凋亡的失败、或其他肿瘤抑制活性的丧失的结果。

治疗和评估

当在本文中使用时，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”等一般意味着获得所需的药理和/或生理效果。所述效果以完全或部分阻止疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或以部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的负面效应而言可以是治疗性的。当在本文中使用时，术语“治疗(treatment)”包括哺乳动物中、特别是人类的疾病的任何治疗，并包括：(a)在可能易感疾病但尚未被诊断为患有该疾病的对象中阻止疾病发生；(b)抑制疾病，即制止它的发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病减退。

治疗效能可以利用与结肠直肠癌相关的总体症状的评估、组织的组织学分析、生物化学测定法、诸如磁共振成像的成像方法或其他已知方法来评估。例如，可以通过在将SMAD7抑制剂给药于结肠直肠癌患者后分析贫血状态、直肠出血、肿瘤尺寸或与结肠直肠癌相关的总体病理的其他方面，来评估治疗效能。还可以在组织或细胞水平上评估治疗效能，例如通过获得组织或肿瘤活检样品并评估组织或细胞总体形态或染色性质的方法。检查蛋白质或RNA表达的生物化学测定法也可以用于评估治疗效能。例如，人们可以通过免疫细胞化学、免疫组织化学或蛋白免疫印迹方法，在解离的细胞或未解离的组织中评估PCNA、p-CDK2(Thr-14/Tyr-15)或指示细胞增殖或细胞死亡活性的其他蛋白的水平。人们还可以评估存在于血浆或肿瘤或非肿瘤组织中的有用生物标志物的存在或表达水平，以评估癌症进展和治疗效能。

在治疗效能的评估中，可以选择适合的对照来确保有效评估。例如，人们可以将在给药SMAD7抑制剂之后在患有结肠直肠癌的患者中评估的症状，与治疗之前在同一患者中或在未被诊断患有结肠直肠癌的另一位患者中的症状进行比较。或者，人们可以将给药SMAD7抑制剂后肿瘤组织的生物化学或组织学分析的结果，与来自于同一患者或来自于未被诊断为患有结肠直肠癌的个体或来自于同一患者的给药SMAD7抑制剂之前的非肿瘤组织的结果进行比较。

SMAD7抑制的验证可以通过直接或间接评估SMAD7的表达水平或活性来判定。例如，可以使用测量SMAD7蛋白或RNA表达的生物化学测定法来评估总体SMAD7抑制。例如，人们可以通过蛋白免疫印迹法(Western blot)来测量肿瘤组织中的SMAD7蛋白水平，以评估总体SMAD7水平。人们还可以利用RNA印迹法(Northern blot)或定量聚合酶链式反应来测量SMAD7mRNA水平，以确定总体SMAD7抑制。人们还可以通过免疫细胞化学或免疫组织化学方法在解离的细胞或未解离的组织中评估SMAD7蛋白水平或指示SMAD7活性的其他蛋白质的水平。也可以通过测量诸如细胞周期阶段分布的参数，用诸如膜联蛋白V或半胱天冬酶III的细胞死亡的标志物染色，或测量与SMAD7活性的改变相关联的其他参数的变化，来间接评估SMAD7抑制。例如，人们可以测量用SMAD7抑制剂治疗的肿瘤的细胞中活性半胱天冬酶-3的水平，作为所述细胞中SMAD7活性的指示。人们也可以评估存在于血浆或肿瘤或非肿瘤组织中的有用生物标志物的存在或表达水平，来评估SMAD7抑制的效能。

在SMAD7抑制(knockdown)效能的评估中，可以选择适合的对照来确保有效评估。例如，人们可以将给药SMAD7抑制剂后肿瘤组织的生物化学或组织学分析的结果，与来自于同一患者或来自于未被诊断为患有结肠直肠癌的个体或来自于同一患者的给药SMAD7抑制剂之前的非肿瘤组织的结果进行比较。

当在本文中使用时，“患者”是指有结肠直肠癌风险或患有结肠直肠癌的动物，包括但不限于哺乳动物、灵长类动物和人类。例如，患者可以是被诊断为具有发生结肠直肠癌的高风险的个体或已被诊断为患有结肠直肠癌的个体。在某些实施方式中，患者可以是非人类哺乳动物，例如猫、狗或马。

SMAD7的抑制剂

在某些实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸可以靶向人类SMAD7mRNA的403、233、294、295、296、298、299和/或533位点(即分别为403、233、294、295、296、298、299和533位核苷酸)。在示例性实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸靶向人类SMAD7mRNA的403-423位核酸。

在某些实施方式中，反义寡核苷酸可以源自于下列抗SMAD7反义寡核苷酸5’-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’(SEQ ID NO：3)。

在本文中设想了靶向SMAD7的反义寡核苷酸可以包含混合的骨架，其中CpG对中的胞嘧啶残基被5’-甲基胞嘧啶(缩写为Me-dC)代替。也可以在反义寡核苷酸的5’和/或3’末端设置甲基膦酸酯连键(缩写为MeP)。所设想的抗SMAD7反义寡核苷酸的磷酸酯骨架可以可选择地包括1、2、3、4或更多个硫代磷酸酯键(例如硫代磷酸酯键可以代替磷酸二酯键)。在一种实施方式中，所有磷酸酯键可以是硫代磷酸酯键。

靶向SMAD7的示例性的反义寡核苷酸疗法包括但不限于：

5’-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’(SEQ ID NO：4)，其中X是包含选自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或2’-O-甲基胞嘧啶核苷，并且其中Y是包含选自由鸟嘌呤和5-甲基鸟嘌呤所组成的组中的含氮碱基的核苷酸或2’-O-甲基鸟嘌呤核苷，前提是核苷酸X或Y中的至少一个包含甲基化的含氮碱基；

5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’(SEQ ID NO：5)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯；

5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3’(SEQ ID NO：6)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯；

5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’(SEQ ID NO：7)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯并且Z是2’-脱氧鸟苷甲基膦酸酯；

5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3’(SEQ ID NO：8)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯，并且Z是2’-脱氧鸟苷甲基膦酸酯。

在特定实施方式中，所设想的SMAD7反义寡核苷酸可以具有下列之一的序列：

5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’(SEQ ID NO：9)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单硫代磷酸酯；

5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3’(SEQ ID NO：10)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单硫代磷酸酯；

5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’(SEQ ID NO：11)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯并且Z是2’-脱氧鸟苷甲基硫代膦酸酯；

5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3’(SEQ ID NO：12)，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯并且Z是2’-脱氧鸟苷甲基硫代膦酸酯。

例如，SEQ ID NO 9-12包括1、2、3、4或更多个硫代磷酸酯键。在一种实施方式中，SEQ ID NO 9-12的所有O,O-膦酸酯键是硫代磷酸酯键。

药物组合物和给药途径

含有诸如本文中所公开的那些反义寡核苷酸的针对SMAD7的反义寡核苷酸的药物组合物，可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法来制备。药物组合物应该被配制成与其预期的给药途径相容。有用的制剂可以通过制药技术领域中公知的方法来制备。例如，参见《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第18版(MackPublishing Company,1990)。

药物制剂优选为无菌的。除菌可以通过例如经无菌过滤膜过滤来实现。在组合物被冻干的情况下，过滤除菌可以在冻干和重构之前或之后进行。

肠胃外给药

本发明的药物组合物可以被配制成用于肠胃外给药，例如配制成用于通过静脉内、肌肉内、皮下、病灶内或腹膜内途径注射。根据本公开，水性组合物、例如含有SMAD7抑制剂的水性药物组合物的制备，对于本领域技术人员来说将是已知的。通常，这样的组合物可以被制备成作为液体溶液或混悬液的注射剂；也可以制备适用于在注射之前添加液体制备溶液或混悬液的固体形式；并且也可以将剂型乳化。

适合于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散系，包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散系的无菌粉剂。在所有情况下，剂型必须是无菌的，并且在存在容易的注射性能的程度上，必须是流体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须针对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用而保存。

作为游离碱或药理上可接受的盐的活性化合物的溶液，可以在与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂适合地混合的水中制备。分散系也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。此外，可以使用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何无味的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，在注射剂的制备中可以使用诸如油酸的脂肪酸。无菌注射剂型也可以是无毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、混悬液或乳液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的介质和溶剂包括水、U.S.P.的林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。在一种实施方式中，可以将SMAD7抑制剂悬浮在包含1％(w/v)羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)TWEEN^TM 80的载体流体中。在常规储存和使用条件下，这些剂型含有防腐剂以防止微生物生长。

可注射剂型例如无菌可注射水性或油性混悬液，可以按照已知技术，使用适合的分散或润湿剂和悬浮剂来配制。一般来说，通过将各种无菌活性成分并入到含有基本分散介质和上面列举的所需其他成分的无菌介质中，来制备分散系。本发明的无菌注射溶液可以通过将适合溶剂中的所需量的SMAD7抑制剂并入到所需的上面列举的各种其他成分中，然后过滤除菌来制备。在制备用于无菌注射溶液的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前除菌过滤过的溶液得到活性成分加上任何其他所需成分的粉末。可注射制剂可以例如通过阻菌过滤器过滤来除菌。

还设想了用于肌肉内注射的更浓或高度浓缩的溶液的制备。就此而言，使用DMSO作为溶剂是优选的，因为这将导致极为快速的穿透，将高浓度的SMAD7抑制剂递送到小的区域。

适合在这样的溶液中使用的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等。适合的缓冲剂包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾10、乙酸钠、磷酸二氢钠等，其量足以将pH维持在约pH 6至pH 8之间，优选地在约pH 7至pH 7.5之间。适合的等渗剂是葡聚糖(dextran)40、葡聚糖70、右旋糖(dextrose)、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠等，使得眼用溶液的氯化钠当量在0.9±0.2％的范围内。适合的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、偏二亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等。适合的润湿剂和澄清剂包括聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊。适合的增粘剂包括葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿酯(petrolatum)、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等。

在示例性实施方式中，用于针对SMAD7的反义寡核苷酸的皮下给药的药物组合物包含诸如由SEQ ID NO：6表示的反义寡核苷酸或其可药用盐(例如钠盐)和可药用载体。

口服给药

在某些实施方式中，本文中设想了适用于反义寡核苷酸的口服递送的组合物，例如包含如抗胃包衣的肠溶包衣的片剂，使得组合物可以将反义化合物递送到例如患者的结肠。例如，这样的给药可以引起局部效应，直接将反义化合物基本上局部地施加与患者结肠的受影响部分。在某些实施方式中，这样的给药可以显著避免反义化合物的不必要的系统吸收。

例如，提供了一种用于口服给药的片剂，其包含包括所公开的诸如GED-0301的反义化合物和可药用赋形剂的颗粒(例如至少部分从颗粒形成)。这样的片剂可以用肠溶包衣包衣。所设想的片剂可以包含可药用赋形剂，例如填充剂、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、诸如冬青、橙子、木糖醇、山梨糖醇、果糖和麦芽糖糊精的增味剂、以及增香剂、防腐剂和/或抗氧化剂。

在某些实施方式中，所设想的药物制剂包括颗粒内相，其包含所设想的反义化合物例如GED-0301或可药用盐例如GED-0301和可药用填充剂。例如，可以将GED-0301和填充剂及可选择地与其他赋形剂一起掺混，并形成为颗粒。在某些实施方式中，颗粒内相可以使用湿法制粒来形成，例如向掺混的反义化合物和填充剂添加液体(例如水)，然后将组合物干燥、研磨和/或过筛以产生颗粒。本领域技术人员应该理解，可以使用其他过程来获得颗粒内相。

在某些实施方式中，所设想的制剂包括颗粒外相，其可以包括一种以上可药用赋形剂，并且可以将它与颗粒内相掺混以形成本公开的制剂。

本公开的制剂可以包括包含填充剂的颗粒内相。示例性的填充剂包括但不限于纤维素、明胶、磷酸钙、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、微晶体纤维素、果胶、聚丙烯酸酯、右旋糖、纤维素乙酸酯、羟丙基甲基纤维素、部分预胶化淀粉、碳酸钙等，并且包括其组合。

在某些实施方式中，本公开的制剂可以包括包含粘合剂的颗粒内相和/或颗粒外相，所述粘合剂一般可以起到将药物制剂的成分保持在一起的作用。本发明的示例性粘合剂可以包括但不限于下列粘合剂：淀粉，糖类，纤维素或诸如羟丙基纤维素的改性纤维素，乳糖，预胶化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，低取代羟丙基纤维素，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，乙基纤维素，糖醇类等，并且包括其组合。

所设想的制剂，例如包括颗粒内相和/或颗粒外相的制剂，可以包括崩解剂，例如但不限于淀粉、纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、藻酸盐、玉米淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、阿拉伯胶等，并且包括其组合。例如，颗粒内相和/或颗粒外相可以包含崩解剂。

在某些实施方式中，所设想的制剂包括包含本公开的反义化合物和赋形剂的颗粒内相，该赋形剂选自甘露糖醇、微晶体纤维素羟丙基甲基纤维素和羟基乙酸淀粉钠或其组合，以及颗粒外相，该颗粒外相包含一种以上的微晶体纤维素、羟基乙酸淀粉钠和硬脂酸镁或其混合物。

在某些实施方式中，所设想的制剂可以包括润滑剂，例如颗粒外相可以含有润滑剂。润滑剂包括但不限于滑石、二氧化硅、脂肪、硬脂精、硬脂酸镁、磷酸钙、硅氧烷二氧化物、硅酸钙、磷酸钙、胶体二氧化硅、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、聚乙二醇、乙酸钠、硬脂酸钙、月桂基硫酸钠、氯化钠、月桂基硫酸镁、滑石和硬脂酸。

在某些实施方式中，药物制剂包含肠溶包衣。一般来说，肠溶包衣为口服药物产生屏蔽层，其控制药物沿着消化道被吸收的位置。肠溶包衣可以包括根据pH以不同速率崩解的聚合物。肠溶包衣可以包括例如纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、纤维素乙酸琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物、C型甲基丙烯酸共聚物、聚乙酸乙烯酯-邻苯二甲酸酯和纤维素乙酸邻苯二甲酸酯。

示例性的肠溶包衣包括

AMB、

等级。在某些实施方式中，肠溶包衣可以包含所设想的片剂以重量计的约5％至约10％、约5％至约20％、8至约15％、约8％至约18％、约10％至约12％或约12至约16％。例如，肠溶包衣可以包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。

例如，提供了一种片剂，其包含以重量计约0.5％至约70％例如约0.5％至约10％或约1％至约20％的反义寡核苷酸或其可药用盐(例如GED-0301)，或基本上由其构成。这样的片剂可以包括例如以重量计约0.5％至约60％的甘露糖醇，如以重量计约30％至约50％的甘露糖醇，如约40重量％的甘露糖醇；和/或以重量计约20％至约40％的微晶体纤维素，或以重量计约10％至约30％的微晶体纤维素。例如，本公开的片剂可以包括颗粒内相，其包含以重量计约30％至约60％例如约45％至约65％、或者可替代地以重量计约5至约10％的GED-0301，以重量计约30％至约50％、或者可替代地约5％至约15％的甘露糖醇，约5％至约15％的微晶体纤维素，约0％至约4％或约1％至约7％的羟丙基甲基纤维素，以及以重量计约0％至约4％例如约2％至约4％的羟基乙酸淀粉钠。

在另一种实施方式中，针对SMAD7的反义寡核苷酸的用于口服给药的药物片剂制剂包含颗粒内相，其中所述颗粒内相包含诸如GED-0301的反义寡核苷酸或其可药用盐(例如钠盐)和可药用添加剂，并且所述制剂还可以包含颗粒外相，其可以包含诸如崩解剂的可药用赋形剂。颗粒外相可以包含选自微晶体纤维素、硬脂酸镁及其混合物的组分。药物组合物还可以包含以片剂的重量计约12％至16％的肠溶包衣。例如，用于口服使用的可药用片剂可以包含以重量计约0.5％至10％的反义寡核苷酸，例如GED-0301或其可药用盐，以重量计约30％至50％的甘露糖醇，以重量计约10％至30％的微晶体纤维素，以及包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。

在另一个实施例中，用于口服使用的可药用片剂可以包含：颗粒内相，其包含以重量计约5至约10％的反义寡核苷酸，例如GED-0301或其可药用盐，约40重量％的甘露糖醇，约8重量％的微晶体纤维素，约5重量％的羟丙基甲基纤维素和约2重量％的羟基乙酸淀粉钠；颗粒外相，其包含约17重量％的微晶体纤维素，约2重量％的羟基乙酸淀粉钠，约0.4重量％的硬脂酸镁；以及片剂上的肠溶包衣，其包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。

在某些实施方式中，药物组合物可以包含肠溶包衣，其包含以重量计约13％或约15％、16％、17％或18％的例如

(参见例如PCT公布号WO2010/054826，其全部内容通过参考并入本文)。

包衣溶解并且活性成分释放时的速率，是它的溶出度。在一种实施方式中，当例如在USP/EP 2型装置(桨叶式)中，在100rpm和37℃下并在pH为7.2的磷酸盐缓冲液中试验时，所设想的片剂在约120分钟至约240分钟后，例如在180分钟后，具有约50％至约100％的寡核苷酸释放的溶出曲线。在另一种实施方式中，当例如在USP/EP 2型装置(桨叶式)中，在100rpm和37℃下并在pH为1.0的稀HCl中试验时，所设想的片剂在120分钟后具有寡核苷酸基本上不释放的溶出曲线。在另一种实施方式中，当例如在USP/EP 2型装置(桨叶式)中，在100rpm和37℃下并在pH为6.6的磷酸盐缓冲液中试验时，所设想的片剂在30分钟后可能具有约10％至约30％或不超过约50％的寡核苷酸释放的溶出曲线。

在某些实施方式中，本公开的制剂例如片剂，在口服给药于患者时，可以在患者中产生极低的寡核苷酸血浆浓度。在另一种实施方式中，本公开的制剂在口服给药于患者时，局部递送到患者的结肠或直肠，例如递送到患者的受影响或患病的位点。

在某些实施方式中，本文中提供的方法还可以包括给药涉及本文中公开的疾病和障碍的治疗的至少一种其他药剂。在一种实施方式中，所设想的其他药剂可以共同给药(例如依次地或同时地)。

所设想的药剂包括免疫抑制剂，其包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于免疫亲和素的药剂、干扰素、阿片受体、TNF结合蛋白、麦考酚酯和小生物药剂。例如，所设想的免疫抑制剂包括但不限于：他克莫司、环孢霉素、吡美莫司、西罗莫司、依维莫司、麦考酚酸、芬戈莫德、地塞米松、氟达拉滨、环磷酰胺、氨甲喋呤、咪唑硫嘌呤、来氟米特、特立氟胺、阿那白滞素、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白、莫罗莫那(muromonab)-CD3、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、特普力珠单抗(teplizumab)、伊法利珠单抗(efalizumab)、达利珠单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infiximab)和依那西普。

给药剂量和频率

示例性制剂包括包含约35mg至约500mg针对SMAD7的反义寡核苷酸或基本上由其构成的剂型。例如，本文中设想了包含约35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg或250mg针对SMAD7的反义寡核苷酸的制剂。在一种实施方式中，制剂可以包含约40mg、80mg或160mg针对SMAD7的反义寡核苷酸。在某些实施方式中，制剂可以包含至少100μg针对SMAD7的反义寡核苷酸。例如，制剂可以包含约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg或25mg针对SMAD7的反义寡核苷酸。给药量取决于多种变量，诸如待治疗的疾病或适应症的类型和程度、患者的总体健康和身体尺寸、反义寡核苷酸的体内效能、药物制剂和给药途径。初始剂量可以被增加到超过上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。可任选地，初始剂量可以小于最适值，并且可以在治疗过程中逐渐提高剂量。人类的剂量可以在例如被设计为从40mg至160mg运行的常规I期剂量递增研究中进行优化。给药频率可以随着各种因素而变，诸如给药途径、剂量和待治疗的疾病。示例性的给药频率为每天一次、每周一次和每两周一次。在某些实施方式中，连续7天每天给药一次。

实施例

通过下面的实施例对本发明进行进一步说明。提供实施例仅仅是出于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1：结肠直肠癌细胞中的SMAD7蛋白表达水平

在从由于结肠直肠癌而经历结肠切除术的6位患者获取的成对的结肠直肠癌肿瘤和非肿瘤结肠粘膜样本中，评估SMAD7蛋白表达水平。肿瘤(T)和非肿瘤(NT)组织的SMAD7免疫染色揭示出当与非肿瘤组织相比时，肿瘤组织中的SMAD7蛋白显著积累，而在将结肠直肠癌切片与IgG同种型对照(同种型；图1A，代表性的三个分开的实验，其中对患有结肠直肠癌的6位患者进行分析)温育时，没有观察到染色。此外，通过蛋白免疫印迹法对来自于结肠直肠癌患者的14对匹配的肿瘤(T)和相邻的非肿瘤(NT)组织中的SMAD7蛋白水平进行评估。细胞提取物的蛋白免疫印迹证实，与非肿瘤组织相比，在肿瘤组织中的可观察到的更高的SMAD7水平(图1B，示出了来自于两个代表性患者样品的提取物的蛋白免疫印迹)。使用β-肌动蛋白作为载样对照。通过密度测量分析对同样的印迹中SMAD7的表达水平进行的定量证实，与来自于相同患者的非肿瘤粘膜相比，结肠直肠癌样品中的SMAD7水平显著增加(图1B)。

还在结肠直肠癌细胞系中研究了SMAD7蛋白表达。从结肠直肠癌细胞系DLD-1和HCT-116的细胞以及正常结肠上皮细胞(IEC)收集总蛋白提取物，并通过蛋白免疫印迹法评估SMAD7表达(图1C)。IEC从由于偶发性结肠直肠癌而经历结肠切除术的患者的宏观和微观上未受影响的粘膜中分离。蛋白免疫印迹揭示出与IEC相比，在DLD-1和HCT-116细胞中SMAD7蛋白的表达明显更高。SMAD7抗体信号的特异性，通过用FITC偶联的SMAD7抗体(SMAD7)或IgG同种型对照(同种型；图1D)标记的HCT-116和DLD-1细胞的FACS分析来验证。此外，在从一系列结肠直肠癌细胞系包括HCT-116、HT-115、HT-29和DLD-1收集的提取物中SMAD7蛋白水平的蛋白免疫印迹检测和密度测量分析，揭示出高水平的SMAD7表达(图1E)。在同一实验中，在一种已知表达高水平SMAD7蛋白的肝细胞癌细胞系HepG2细胞中评估了SMAD7表达。使用β-肌动蛋白在两套蛋白免疫印迹实验中作为载样对照，并且作为用于图1E中示出的条带密度测量分析的归一化标准。

实施例2：通过SMAD7反义寡核苷酸抑制结肠直肠癌细胞的SMAD7蛋白水平

在HCT-116细胞系的细胞中评估用SMAD7反义寡核苷酸GED-0301对癌细胞的转染。将HCT-116细胞用未标记的正义(SMAD7正义)寡核苷酸或用剂量逐渐增加(0.5μg/ml、1μg/ml或2μg/ml)的FITC偶联的GED-0301转染6小时。图2A示出了定量PI-阳性和FITC-阳性的被转染的HCT-116细胞的百分率的代表性点图。正如通过PI和FITC染色所评估的，获得了高的转染效率和非常低的细胞死亡水平。在图2A中示出了获得相似结果的两个代表性实验之一。

也在HCT-116细胞中评估了在用不同量GED-0301转染后SMAD7蛋白水平的抑制。将HCT-116细胞用SMAD7正义寡核苷酸(以2μg/ml)或GED-0301(以0.5μg/ml、1μg/ml或2μg/ml)转染12小时。随后将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，用新鲜培养基培养6小时，再次用PBS清洗，并培养另外24小时。然后通过蛋白免疫印迹法分析SMAD7和β-肌动蛋白水平。图2B示出了三个代表性实验之一，证实了与用SMAD7正义寡核苷酸转染的细胞相比，在用量逐渐增加的GED-0301转染的细胞中，SMAD7蛋白水平的可观察到的抑制。这些结果证实，SMAD7反义寡核苷酸(GED-0301)可以被转染到结肠直肠癌细胞中并能诱导SMAD7蛋白水平的稳健抑制。

实施例3：SMAD7反义寡核苷酸给药影响结肠直肠癌细胞中的细胞周期动力学

在SMAD7正义和GED-0301寡核苷酸给药后，评估了HCT-116和DLD-1细胞中的细胞增殖。将HCT-116和DLD-1细胞不转染(Untr)或用1μg/ml的SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染。转染后12小时，将细胞用PBS清洗，再培养6小时，用PBS重新清洗，并用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记30分钟。然后将标记的细胞用PBS清洗，并在新鲜培养基中重新培养另外24小时。通过流式细胞术评估增殖细胞的百分率。与用SMAD7正义寡核苷酸转染的细胞相比，在用GED-0301转染的DLD-1(白色条)和HCT-116(黑色条)细胞两者中观察到细胞增殖的显著降低(图2C；HCT-116：SMAD7正义转染的细胞相比于GED-0301转染的细胞，*P<0.001；DLD-1：SMAD7正义转染的细胞相比于GED-0301转染的细胞，

P<0.001)。图中的数据描绘了三个实验的平均值±标准偏差(SD)。图2C中的柱状图描绘了来自于单个实验的用SMAD7正义(82％)或GED-0301(47％)寡核苷酸转染的HCT-116细胞中，细胞增殖的总百分数。因此，在结肠直肠癌细胞系HCT-116和DLD-1中，SMAD7AS寡核苷酸的给药导致细胞增殖显著降低。

还在GED-0301转染后，在HCT-116细胞中分析了细胞在不同细胞周期阶段中的分布。将HCT-116细胞不转染(Untr)或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染。将HCT-116细胞用1μg/ml的SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染。转染后12小时，将细胞用PBS清洗并在新鲜培养基中培养另外24小时。然后通过流式细胞术评估处于细胞周期不同阶段的细胞的百分率。与对照相比，在用GED-0301转染的细胞中观察到存在于S期中的细胞的百分率统计学上显著地增加，并伴随着构成G0/G1群体的细胞的百分率统计学上显著地降低(图2D；GED-0301转染的细胞相比于SMAD7正义转染的细胞，对于S期来说，**P＝0.001；对于G0/G1期来说，*P＝0.01)。示出了获得相似结果的三个代表性实验之一。这些结果证实，由SMAD7反义寡核苷酸GED-0301的给药促进的SMAD7蛋白的抑制，引起结肠直肠癌细胞中细胞周期阶段群体数分布的改变。

结肠直肠癌细胞通常在介导TGF-β1信号传导的基因中携带突变，使它们对TGF-β1活性的变化没有反应。因此，在人类结肠直肠癌细胞系HCT-116和DLD-1中研究了观察到的由SMAD7活性的变化引起的细胞增殖的效应与TGF-β1信号传导活性之间的关系。将用SMAD7正义寡核苷酸(S)转染的细胞暴露于TGF-β1蛋白或TGF-β1中和抗体。暴露于逐渐增加的TGF-β1和通过抗体暴露来抑制TGF-β1活性，都不引起细胞增殖的可观察到的变化。此外，用GED-0301(AS)转染并暴露于相同处理的细胞相对于未处理的GED-0301转染的细胞，也没有显示出细胞增殖的变化(图2E，示出了HCT-116的数据)。这些结果证实，在结肠直肠癌细胞中观察到的SMAD7信号传导的促有丝分裂效应不依赖于TGF-β1活性。

实施例4：在结肠直肠癌细胞中SMAD7反义寡核苷酸给药引起细胞死亡增加

在给药SMAD7反义寡核苷酸GED-0301后，在HCT-116细胞中评估了细胞死亡，以判定观察到的细胞周期分布的变化是否与细胞死亡程序的激活相关。为了研究细胞死亡，将HCT-116细胞留置不处理(Untr)或用1μg/ml的SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染12小时。然后将细胞用PBS清洗，培养另外6小时，用PBS重新清洗，并在新鲜培养基中培养另外24至48小时(图3A，分别为顶栏和中栏)。细胞死亡通过AV和/或PI染色的流式细胞术分析来评估。与用SMAD7正义寡核苷酸转染的细胞相比，用GED-0301转染的HCT-116细胞在48小时时观察到通过组合的AV-/PI+、AV+/PI+和AV+/PI-群体所评估的细胞死亡百分数的显著增加(图3A，中栏：SMAD7正义相比于GED-0301，P<0.001)。结果被表示为三个实验的平均值±SD。代表性的点图(图3A，底栏)示出了转染后48小时AV-和/或PI-阳性的HCT-116细胞的百分率。

为了进一步评估SMAD7抑制后结肠直肠癌细胞中细胞死亡途径的激活，在用GED-0301转染的细胞中研究了表达活性半胱天冬酶-3的细胞的百分数。将HCT-116细胞留置不处理(Untr)或用1μg/ml的SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染12小时。然后将细胞用PBS清洗并用新鲜的完全培养基培养另外6小时，然后用PBS清洗，并在新鲜培养基中培养另外16、24或36小时。然后通过流式细胞术评估半胱天冬酶-3的激活。图3B中的点图显示，与SMAD7正义转染的和未转染的细胞相比，在GED-0301转染的细胞中活性半胱天冬酶-3显著增加。此外，GED-0301转染引起活性半胱天冬酶-3细胞的百分率在各个时间点的逐渐提高。这些结果证实，与对照相比，在HCT-116结肠直肠癌细胞系中，GED-0301的给药引起经历细胞死亡或表达活性半胱天冬酶-3的细胞百分数的显著增加。

为了判定在用GED-0301转染的细胞中是否可以阻断细胞死亡，将细胞在正常培养基中或在泛半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPH或DMSO存在下培养1小时，然后留置不处理或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染36小时。通过流式细胞术评估表达活性半胱天冬酶-3的细胞的百分数。尽管在任何未转染或SMAD7正义转染的组中没有观察到显著差异，但在未暴露于药物或暴露于Q-VD-OPH的GED-0301转染的细胞之间观察到表达活性半胱天冬酶-3的细胞百分数的显著降低(图3C；无药物相比于Q-VD-OPH，P＝0.002)。

将同样的方案用于评估细胞死亡的百分数，区别在于细胞在转染后48小时进行评估，并且细胞死亡的百分数通过检查总细胞群体内合并的AV-和/或PI-阳性群体来评估。尽管在任何未转染或SMAD7正义转染的组中没有观察到显著差异，但在未暴露于药物或暴露于Q-VD-OPH的GED-0301转染的细胞之间观察到经历细胞死亡的细胞百分数的显著降低(图3D；无药物相比于Q-VD-OPH，P＝0.008)。

为了判定GED-0301诱导的HCT-116细胞生长停止是否继发于细胞死亡的诱导，在暴露于Q-VD-OPH的GED-0301转染的细胞中评估了细胞增殖。将细胞在正常培养基中或在Q-VD-OPH或DMSO存在或不存在的情况下培养1小时，然后留置不处理或用SMAD7正义寡核苷酸或GED-0301转染。24小时后，通过流式细胞术评估增殖细胞的百分率。不论是否暴露于Q-VD-OPH，所有GED-0301转染的细胞群体与SMAD7正义转染和未转染的组相比显示出增殖细胞百分数的降低，证实了细胞死亡是经历SMAD7蛋白抑制的结肠直肠癌细胞中增殖降低的继发效应(图3E)。图3C-E中示出的结果是三个实验的平均值±SD。

实施例5：SMAD7反义寡核苷酸破坏下游TGFβ1信号传导组分的相互作用并影响细胞周期调控蛋白的表达和活性

细胞周期的进展受到周期蛋白依赖性激酶(CDK)调控，所述CDK与被称为周期蛋白的激活配偶体相结合，调控在细胞周期进展中发挥作用的蛋白质的活性。CDK活性本身受到抑制性和激活性磷酸化两者的调节。例如，CDK-周期蛋白复合物可以受到CDK的ATP结合口袋内Thr-14和Tyr-15残基的磷酸化的抑制。CDK2在S-期的控制中发挥中心作用，结合于周期蛋白E或周期蛋白A以分别调控G1/S转变和S期进展。

为了分析在结肠直肠癌细胞中SMAD7表达对CKD2/周期蛋白活性的影响，分析了在用GED-0301转染后HCT-116细胞中CDK2的磷酸化状态。将HCT-116细胞留置不转染(Untr)或用1μg/ml的SMAD7正义(S)或SMAD7反义(AS)寡核苷酸转谈。转染后6小时，将细胞用PBS清洗，并用新鲜培养基重新培养另外16小时。通过细胞提取物的蛋白免疫印迹分析p-CDK2(Thr-14/Tyr-15)、CDK2、周期蛋白A和β-肌动蛋白水平。在图4A中示出了获得相似结果的三个代表性实验之一。图4A中的印迹证实，用GED-0301转染HCT-116细胞导致与对照相比p-CDK2(Thr-14/Tyr-15)水平的可观察到的提高，以及周期蛋白A水平的降低，提供了解释GED-0301给药后细胞在S期中积累的机制。

CDK2的激活严格依赖于特化的磷酸酶CDC25的活性，所述磷酸酶去磷酸化并激活CDK/周期蛋白复合物。人类CDC25家族存在三个成员。CDC25A控制通过S期的进展，而CDC25B和CDC25C参与控制从G2向有丝分裂的转变。检查了CDC25家族成员的水平，以判定在SMAD7缺陷的细胞中CDK2的失活/磷酸化是否与CDC25蛋白的表达降低相关。将HCT-116细胞在无血清培养基中留置不处理(Untr)或用1μg/ml的SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染20小时。然后将细胞用PBS清洗，并在10％胎牛血清(FBS)培养基中继续培养24小时。SMAD7的抑制伴随有CDC25A蛋白表达的显著降低，而CDC25B和CDC25C水平保持不变(图4B；结果是三个实验的代表)。因此，SMAD7活性显得为结肠直肠癌细胞中稳健的CDC25A表达所必需。

CDC25A的细胞内浓度可以在多个水平上受到调控。为了判定SMAD7反义寡核苷酸诱导的CDC25A蛋白下调是否由CDC25A转录的抑制引起，从用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染并培养不同时间段的HCT-116细胞提取总RNA，并通过实时PCR分析CDC25A mRNA水平。将CDC25A实时PCR信号对β-肌动蛋白信号进行归一化。将所有细胞在无血清培养基中用1μg/ml寡核苷酸转染20小时，用PBS清洗，并用含有10％FBS的培养基培养。然后在4小时后将细胞重新清洗，并在无血清培养基中培养到指定的时间点。与用SMAD7正义寡核苷酸处理的细胞(白色条；图4C示出了三个实验的平均值±平均值的标准差(SEM))相比，在用SMAD7反义寡核苷酸处理的细胞(黑色条)中CDC25A RNA转录本水平增加而不是被下调。这个数据证实了在SMAD7缺陷的结肠直肠癌细胞中CDC25A蛋白质与RNA水平之间的解偶联，并指出CDC25A蛋白表达通过SMAD7的调控，通过翻译或翻译后(例如蛋白酶体依赖性的)机制来进行。

为了判定蛋白酶体依赖性机制是否造成了观察到的SMAD7抑制的细胞中CDC25A的降低，将SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染的细胞在转染后暴露于蛋白酶体抑制剂MG115和MG13224小时。用这些蛋白酶体抑制剂处理结肠直肠癌细胞不阻止CDC25A蛋白表达的抑制(图4D；来自于三个实验之一的代表性印迹)。

CDC25A蛋白表达也受到真核生物起始因子2α(EiF2α)调控，所述因子对各种不同蛋白的翻译弱化来说是必需的(Tomko和Lazo，(2008)Cancer Res.68(18):7457-7465)。EiF2α活性受到Ser 51上的磷酸化的调控，所述磷酸化引起EiF2α隔离(Wek等，(2006)Biochem.Soc.Trans.34:7-11)。因此，EiF2α过磷酸化导致CDC25A蛋白表达的显著降低。因此，研究了在用SMAD7反义寡核苷酸处理的结肠直肠癌细胞中EiF2α磷酸化的状态，以判定EiF2α活性的改变能否造成观察到的CDC25A水平的变化。将细胞在无血清培养基中用1μg/ml转染20小时，用PBS清洗，并用含有10％FBS的培养基培养。然后在4小时后将细胞重新清洗，并在无血清培养基中培养到指定时间点(图4E；12、18或24小时)。在HCT116和DLD-1细胞两者中通过暴露于SMAD7反义寡核苷酸(AS)使SMAD7沉默，提高了EiF2αSer 51磷酸化并且先于CDC25A和周期蛋白A蛋白下调(图4E；示出了三个代表性印迹之一)。

为了验证结肠直肠癌细胞中EiF2α活性与CDC25A表达之间的联系，在HCT116和DLD-1细胞中通过salubrinal这种干扰EiF2αSer51去磷酸化的化合物特异性抑制EiF2α功能。将HCT-116细胞用DMSO或salubrinal处理6至24小时，然后通过蛋白免疫印迹法探测细胞提取物的p-EiF2α(Ser 51)、总EiF2α、CDC25A或β-肌动蛋白。相对于DMSO处理的对照，用salubrinal处理结肠直肠癌细胞引起磷酸化的EiF2α增加和伴随的CDC25A蛋白水平的降低(图4F；示出了三个代表性印迹之一)。这些结果证实，SMAD7抑制改变EiF2α磷酸化，其进而影响结肠直肠癌细胞中的CDC25A表达水平。

SMAD7还与生长停止和DNA损伤蛋白(GADD34)这一蛋白磷酸酶1(PP1)全酶的调控亚基相互作用，由此促进TGFβI型受体信号传导。GAD334/PP1复合体也可以与EiF2α相互作用并促进它的去磷酸化。通过进行免疫沉淀和蛋白免疫印迹实验，检查了在结肠直肠癌细胞中这些不同分子组分之间的结合。使用抗SMAD7抗体进行来自于HCT-116(左栏)、DLD-1细胞(未示出)和原代结肠直肠癌细胞(右栏)的全细胞提取物的免疫沉淀，然后使用抗PP1(顶部)、抗EiF2α(中部)或抗SMAD7(底部)抗体进行蛋白免疫分析(图4G，对于每个实验示出了三个代表性印迹之一；IP＝免疫沉淀，n.s.＝非特异性条带)。印迹也用同种型特异性对照抗体进行探测(每个印迹中的右侧道；ve-)。这个实验证实了在结肠直肠癌细胞系和从新鲜结肠直肠癌肿瘤组织分离的原代细胞中内源SMAD7与PP1和EiF2α相互作用。

在用SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸转染的HCT-116细胞中进一步的免疫沉淀/免疫印迹实验中，显示了SMAD7的沉默显著降低PP1与EiF2α之间的结合(图4H；对于每个实验示出了三个代表性印迹之一；n.s.＝非特异性信号)。通过PP1抗体对来自于转染细胞的HCT-116细胞提取物进行免疫沉淀，并使用EiF2α抗体通过蛋白免疫印迹进行探测(顶部)，或与之相反(底部)。印迹还用同种型特异性抗体(Ve-)作为对照进行探测。因此，SMAD7在介导PP1全酶与EiF2α之间的结合中发挥重要作用，所述结合影响EiF2α活性。此外，SMAD7反义寡核苷酸给药引起这些组分的解偶联，并且引起周期蛋白A和CDC25A表达降低，提供了解释在暴露于SMAD7反义寡核苷酸后在结肠直肠癌细胞中观察到的细胞增殖和细胞周期进展的改变机制。

实施例6：在诱导的结肠直肠癌小鼠模型中体内SMAD7蛋白和mRNA表达提高

在具有结肠炎相关结肠直肠癌的肿瘤和非肿瘤区域中评估了SMAD7蛋白和mRNA表达，以判定体内结肠直肠癌的诱导是否与SMAD7水平提高相关。在本文中使用的模型中，向C57BL/6J小鼠给药AOM，然后重复摄入DSS(AOM+DSS)，引起结肠炎症和随后多个结肠肿瘤的发生。在AOM+DSS处理后84天，将动物处死。通过从患有结肠炎相关的结肠直肠癌的小鼠收集的组织的非肿瘤和肿瘤区域的免疫染色，来评估SMAD7蛋白水平。图5A示出了在AOM+DSS处理的小鼠的肿瘤区域中，SMAD7免疫染色的明显增加。图像从进行的三个实验之一获取。正如通过实时PCR所评估的，与AOM+DSS处理的小鼠的非肿瘤区域相比，在肿瘤区域中SMAD7mRNA表达也有提高(图5B)。图5B中的值代表了平均值±SEM，并且在每个组中包含6只小鼠。因此，体内SMAD7mRNA以及尤其是蛋白表达的提高，与在肿瘤组织中专有地诱导结肠直肠癌相关。

实施例7：SMAD7反义寡核苷酸给药引起组织外植体细胞增殖的降低

为了评估SMAD7反义寡核苷酸促进的抑制对组织中细胞增殖的影响，在来自于离体结肠直肠癌组织外植体的切片上进行H&E染色或PCNA免疫染色。将新鲜的组织外植体用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染36小时，然后染色。图6A示出了来自于新鲜获得的外植体的H&E-和PCNA-染色的切片的代表性图像。与用SMAD7正义寡核苷酸转染的外植体相比，在用GED-0301转染的组织外植体中观察到H&E染色和PCNA免疫信号两者的明显降低，证实了GED-0301在转染的组织中高效地减少细胞增殖。示出了来自于两个代表性实验之一的图像。

类似地，向人类结肠直肠癌组织外植体的器官培养物加入SMAD7正义(S)或反义(AS)寡核苷酸，并在24小时后分析细胞生长和细胞周期相关蛋白。结肠直肠癌组织外植体的连续切片的免疫组织化学显示，SMAD7反义寡核苷酸降低了表达SMAD7、PCNA、周期蛋白A和CDC25A的结肠直肠癌细胞的分数，并增加了对p-EiF2α(Ser51)阳性的细胞的百分率(图6B)。图像示出了5个代表性结果之一，同时将同种型对照染色(同种型)示出在左侧列中。

实施例8：在异种移植物小鼠模型中SMAD7反义寡核苷酸给药降低体内结肠直肠癌肿瘤生长和细胞增殖

将HCT-116异种移植物模型用于评估GED-0301给药对结肠直肠癌肿瘤发育和结肠直肠癌细胞增殖的影响。为此，将Rag-1^-/-小鼠用HCT-116细胞接种(在500μl基质胶中5x10⁵个细胞)。接种后一周，小鼠接受PBS(图7A，CTR)或100μg FITC偶联的GED-0301(图7A，FITC偶联的GED-0301)的单次腹膜内注射。在注射药剂后24小时将小鼠处死，将肿瘤切下，并通过免疫荧光信号评估FITC偶联的GED-0301的分布。FITC信号明显与来自于异种移植物细胞的核信号共定位(图7A，Dapi/FITC栏)。

也在来自于经历GED-0301给药的动物的异种移植物中评估了SMAD7蛋白信号。将HCT-116细胞接种到Rag-1^-/-小鼠中，并将动物用SMAD7正义或GED-0301腹膜内处理。在HCT-116注射后7天开始，以每天100μg/小鼠的量给药两种寡核苷酸。在HCT-116细胞接种后21天将小鼠处死。来自于异种移植物组织的总蛋白提取物的蛋白免疫印迹揭示出在来自于GED-0301处理的小鼠而不是SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠的样品中，SMAD7信号水平的可观察到的降低(图7B)。将β-肌动蛋白用作载样对照。因此，GED-0301能够在结肠直肠癌异种移植物细胞中体内抑制SMAD7蛋白水平。

对从经历上面描述的相同流程的小鼠获取的异种移植物，在每个组中进行产生的肿瘤的体积的分析。与用SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠相比，在用GED-0301处理的HCT-116接种的小鼠中观察到肿瘤体积的显著减小(图7C)。图7C中的图表示出了用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸处理的小鼠在21天时的平均肿瘤体积(图7C，左栏；SMAD7正义相比于GED-0301，P<0.001；两个独立实验的平均值，每组≥12只小鼠；条指示平均值±SD)。图7C(右栏)提供了在SMAD7正义寡核苷酸处理(顶部行)和GED-0301处理(底部行)的小鼠中发育的异种移植物的代表性照片。结果清楚地证实，SMAD7的GED-0301抑制在异种移植物模型中抑制结肠直肠肿瘤生长。

还在从经历上述相同流程的小鼠获取的异种移植物组织切片中进行SMAD7、细胞增殖标志物PCNA和CDK2配偶体周期蛋白A的免疫染色。图7D中示出了SMAD7、PCNA和周期蛋白A染色的异种移植物切片的代表性图像。示出了来自于6个代表性实验之一的图像。在左侧列中示出了同种型对照染色(同种型)。与来自于SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠(S)相比，在从GED-0301处理的小鼠(AS)中发育的异种移植物获取的组织切片中观察到所有三种信号的降低，证实了SMAD7反义寡核苷酸介导的SMAD7蛋白的抑制引起结肠直肠癌细胞中体内细胞增殖降低。

实施例9：在自发性结肠直肠癌模型中SMAD7反义寡核苷酸给药抑制肿瘤发生

使用自发性结肠直肠癌的小鼠模型，检查了SMAD7反义寡核苷酸在体内抑制肠肿瘤发生的能力。具体来说，将在腺瘤性结肠息肉病(Apc)基因中带有显性突变的多发性肠肿瘤(Min)小鼠用于这些实验。该小鼠模型类似于也由APC基因中的突变引起的被称为家族性腺瘤性息肉病的人类疾病。用致癌原AOM处理Apc(Min/+)小鼠提高肿瘤发生率、数目和尺寸，特别是在结肠中。将小鼠每周一次用AOM(10mg/kg)腹膜内(i.p)处理共两周，并监测肿瘤形成。在最后一次AOM注射后一周，将小鼠每周三次用125μg/小鼠的SMAD7反义(AS)或正义(S)寡核苷酸口服治疗，直至在第80天处死。并行地，向小鼠给药未标记的寡核苷酸(CTR)或FITC偶联的SMAD7反义寡核苷酸(FITC偶联的AS；125μg/小鼠)的口服药剂，并在8小时后处死，以便评估寡核苷酸的肠摄取(图8G)。肠组织切片的分析揭示出存在FITC信号，指示反义寡核苷酸定位到靶组织。

在第72天的内窥术显示，用SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠发生多个大的肿瘤，然而在SMAD7反义寡核苷酸处理的小鼠的结肠中肿瘤的数目和尺寸减小(图8A，左栏)。肿瘤数目和肿瘤评分的内窥术分析揭示，相比于SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠，在SMAD7反义寡核苷酸处理的小鼠中这些参数显著减小(图8A，图表；对于肿瘤数目来说，S相比于AS，P＝0.004；对于肿瘤评分来说，S相比于AS，P＝0.001；对于两个图表来说，条指示平均值±SEM，3个单个实验，每个组≥5只小鼠)。这些结果通过在第80天处死的小鼠中肿瘤的直接评估得到验证。具体来说，结肠组织的H&E染色揭示出，在SMAD7正义寡核苷酸而不是反义寡核苷酸处理的小鼠中存在大的生长(图8A，中栏)。

肿瘤(T)和非肿瘤(NT)切片的免疫组织化学显示，在暴露于SMAD7正义寡核苷酸(S)的肿瘤区域中，SMAD7被上调，并且由反义寡核苷酸处理抑制(AS，图8B)。PCNA染色证实了Smad7反义寡核苷酸的抗增殖效果(图8C)。此外，反义寡核苷酸处理在肿瘤区域中降低了周期蛋白A和CDC25A的水平(图8D、E)，并上调了p-EiF2α(Ser 51)水平(图8F)。因此，在结肠直肠癌的多个动物模型中，GED-0301在体内成功地抑制肿瘤形成和生长。

通过参考并入

本文中引用的每个专利文献和科学文章的全部公开内容，为所有目的通过参考并入本文。

等同性

本发明可以以其他特定形式体现而不背离其基本特征。因此，上述实施方式应该被当作是说明性的，而不是限制本文中描述的发明。本发明的范围由随附的权利要求书而不是由上面的描述指定，并且意欲将在权利要求书的等同性的意义和范围之内的所有变化包含在其中。

Claims

1.治疗上有效量的抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐在用于制备治疗需要治疗的患者的偶发性结肠直肠癌的药物中的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含选自由SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所组成的组中的寡核苷酸。

2.治疗上有效量的抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐在用于制备抑制偶发性结肠直肠癌细胞生长的药物中的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所组成的组中的寡核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9。

4.如权利要求1或2所述的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10。

5.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：10。

6.如权利要求5所述的用途，其中SEQ ID NO：10的抗SMAD7反义寡核苷酸的两个以上核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

7.如权利要求5所述的用途，其中SEQ ID NO：10的抗SMAD7反义寡核苷酸的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

8.如权利要求1或2所述的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸为肠胃外给药。

9.如权利要求1或2所述的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸为口服给药。

10.如权利要求1或2所述的应用，包括给药包含选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12所组成的组中的抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐，和可药用载体的药物组合物。

11.如权利要求10所述的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：5或SEQID NO：9，或其可药用盐。

12.如权利要求10所述的应用，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：6或SEQID NO：10，或其可药用盐。

13.如权利要求10所述的用途，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：10，或其可药用盐。

14.如权利要求13所述的用途，其中SEQ ID NO：10的抗SMAD7反义寡核苷酸的两个以上核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

15.如权利要求13所述的用途，其中SEQ ID NO：10的抗SMAD7反义寡核苷酸的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

16.如权利要求10所述的应用，其中所述药物组合物为肠胃外给药。

17.如权利要求10所述的应用，其中所述药物组合物为口服给药。

18.如权利要求17所述的应用，其中所述药物组合物包含含有丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。

19.如权利要求1或2所述的应用，其中所述患者是人类。

20.如权利要求1或2所述的应用，包括给药至少100μg所述抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐。

21.如权利要求1或2所述的应用，包括给药35mg至500mg所述抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐。

22.如权利要求10所述的应用，包括给药至少100μg所述抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐。

23.如权利要求10所述的应用，包括给药35mg至500mg所述抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐。

24.用于治疗偶发性结肠直肠癌的抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所组成的组中的寡核苷酸。

25.用于治疗偶发性结肠直肠癌的抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸如权利要求1至9中的任一项中所定义。

26.用于治疗偶发性结肠直肠癌的抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐，其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸如权利要求10至18中的任一项或权利要求22至23中的任一项中所定义，并且其中所述抗SMAD7反义寡核苷酸或其可药用盐与可药用载体一起，在如权利要求10至18中的任一项或权利要求22至23中的任一项中所定义的药物组合物中。