JP2021106625A - Il−34アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用方法の提供。【解決手段】本明細書には、IL−34の活性または発現の上昇に関連する、炎症性腸疾患などの炎症性疾患および/または線維症を処置するための、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および方法が開示されている。炎症性疾患および/または線維症の処置に有用な、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物、ならびに、炎症性疾患および/または線維症の処置における使用のための、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬の製造も開示されている。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2015年11月25日に出願された米国仮出願第62/260,076号に対する優先権を請求し、その全体の開示は、すべての目的について本明細書中に参照により組み込まれる。
本出願は、2015年11月25日に出願された米国仮出願第62/260,076号に対する優先権を請求し、その全体の開示は、すべての目的について本明細書中に参照により組み込まれる。
インターロイキン−34(IL−34)は、関節リウマチなどの骨変性疾患における炎症および破骨細胞形成のメディエーターであるマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF、MCSF1およびMCSF−1としても公知)と機能的に重複する、最近発見されたサイトカインである。炎症性疾患は、急性および慢性のどちらも、まだ完全には理解されていない重要な疾患カテゴリーである。
例えば、炎症性腸疾患は、胃腸管の慢性炎症性障害であり、米国ではおよそ140万名の患者が罹患している。炎症性腸疾患は、米国において最も蔓延している5つの胃腸疾患負荷のうちの1つであり、全体的な健康管理費用は17億ドルを超える。米国では毎年、炎症性腸疾患は、700,000件を超える受診、100,000件の入院、および119,000名の患者における能力障害の原因となっている。現在のところ医学的治癒法は存在せず、したがって、疾患管理には生涯にわたるケアが必要である。
クローン病および潰瘍性大腸炎は炎症性腸疾患の2つの最も一般的な形態である。クローン病は、胃腸管全体に影響を及ぼす可能性もあるが、主に回腸(小腸の遠位部または下部)および大腸に影響を及ぼす。潰瘍性大腸炎は、主に結腸および直腸に影響を及ぼす。炎症性腸疾患の病因は完全には理解されていないが、環境因子および遺伝因子の両方が当該疾患において役割を果たすと考えられている。環境構成成分は、摂取された食物および薬物への曝露の影響を受ける消化管の微生物叢の変更を含み得る。
炎症性腸疾患には、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、重度の痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、および貧血が伴う。炎症性腸疾患の患者は、皮膚病変、関節痛、眼炎、および肝障害にも罹患する可能性があり、また、潰瘍性大腸炎に罹患している小児では、成長不良を患う可能性がある。致死的であることは稀であるが、これらの症状は患者の生活の質を低下させるものである。
したがって、炎症性腸疾患などの炎症性障害を処置する、信頼できる方法を開発する差し迫った必要がある。広範囲の患者にわたって症状の有効かつ恒久的な軽減をもたらし、負の副作用または炎症および寛解のサイクルを伴わない処置方法を同定するさらなる必要がある。
本明細書には、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている。一部の実施形態では、本発明は、配列番号1〜9のいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含むIL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、本発明のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列5’−gctgggtgacgcttt−3’(配列番号1)、5’−tggtcactcagtcagg−3’(配列番号2)、5’−ccaagatagcgcagcc−3’(配列番号3)、5’−gtcaagggccacatct−3’(配列番号4)、5’−agctgctcagtgtgaa−3’(配列番号5)、5’−acagaggcctaagca−3’(配列番号6)、5’−ctcattctgcgtcaag−3’(配列番号7)、5’−tcggggcagcagag−3’(配列番号8)、または5’−ggagtgagcaggtgc−3’(配列番号9)、その一部、またはその相補物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列の少なくとも1つのヌクレオシド結合がホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、またはボラノホスフェート結合であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも1つがホスホロチオエート結合である。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である。
本明細書に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数は変動し得る。例えば、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチドから40ヌクレオチドまでの長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチドから22ヌクレオチドまでの長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、22ヌクレオチドから40ヌクレオチドまでの長さである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、10ヌクレオチドから20ヌクレオチドまで、20ヌクレオチドから30ヌクレオチドまで、または30ヌクレオチドから40ヌクレオチドまでの長さである。
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドがそれを必要とする患者に投与される処置方法も本明細書に記載する。例えば、炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、本明細書に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法を本明細書に記載する。炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する方法であって、有効量の、本明細書に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も本明細書に記載する。
炎症性疾患に罹患している患者の細胞におけるIL−34媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法であって、有効量の、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も本明細書に記載する。IL−34発現の変更に関連する炎症性疾患を処置することを必要とする患者においてIL−34発現の変更に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法も本明細書に記載する。
本明細書に記載の方法は、これだけに限定されないが、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、シェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患を含めた炎症性疾患を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、または特発性肺線維症(IPF)を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎(Crohn’s (granulomatous) colitis)、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、または分類不能大腸炎である。特定の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
一部の実施形態では、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与する。特定の実施形態では、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを経口投与する。
一部の実施形態では、処置を必要とする患者は、ヒトである。
本明細書に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む、医薬として許容される組成物も本明細書に記載する。一部の実施形態では、医薬組成物は、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与に適したものである。
医薬としての使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。
炎症性疾患を処置するための医薬の製造におけるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患である。喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、または特発性肺線維症(IPF)を処置するための医薬の製造におけるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、または分類不能大腸炎である。
炎症性疾患の処置における使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患である。喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、または特発性肺線維症(IPF)の処置における使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。一部の実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、または分類不能大腸炎である。
種々の実施形態では、本発明は、線維症、例えば腸線維症、肺線維症、もしくは肝臓線維症を処置もしくは防止するまたはコラーゲン沈着を防止する方法であって、線維症に罹患している患者においてIL−34を阻害することを含む方法である。本発明は、線維症を処置もしくは防止するまたはコラーゲン沈着を防止する方法であって、細胞、例えば腸細胞においてIL−34を阻害することを含む方法でもあり得る。一部の実施形態では、本発明は、患者において線維症を処置もしくは防止するまたはコラーゲン沈着を防止する方法であって、患者に、有効量のIL−34の特異的阻害剤、例えばIL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法であり得る。
線維症を処置するための医薬の製造におけるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も本明細書に記載する。一部の実施形態では、線維症は、腸線維症である。一部の実施形態では、線維症は、肺線維症である。他の実施形態では、線維症は、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症である。
線維症の処置における使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドも本明細書に記載する。一部の実施形態では、線維症は、腸線維症である。一部の実施形態では、線維症は、肺線維症である。他の実施形態では、線維症は、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症である。
一部の実施形態では、線維症、例えば腸線維症に罹患している患者は、炎症性腸疾患に以前罹患していた、もしくは、炎症性腸疾患に罹患している、または、患者において腸線維症に先立って炎症性腸疾患が生じていた。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病である。一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
一部の実施形態では、腸線維症に罹患している患者は、大腸炎に以前罹患していた、もしくは、大腸炎に罹患している、または、患者において腸線維症に先立って大腸炎が生じていた。一部の実施形態では、大腸炎は、急性大腸炎である。一部の実施形態では、大腸炎は、慢性大腸炎である。
本発明の一部の実施形態では、患者は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。
本明細書に記載の本発明の方法において線維症を有する患者に投与されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の投与経路によって投与することができることが理解されよう。種々の実施形態では、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、経口経路、局所経路、非経口経路、例えば、皮下注射によるもの、吸入噴霧によるもの、または直腸経路を含めた、1つまたはいくつかの経路によって投与することができる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、膵臓内投与、ならびに静脈内、筋肉内、腹腔内、および胸骨内注射または注入技法を含む。好ましい実施形態では、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、線維症、例えば腸線維症または肺線維症を有する患者に経口投与することができる。
本発明は、IL−34 RNAを分解の標的とすること、RNAスプライシングに干渉すること、またはIL−34遺伝子の発現もしくはタンパク質への翻訳を防止することが可能なIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を含む方法を提供することができる。本発明のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトIL−34 mRNAの種々の領域を結合の標的とし得る。ヒトIL−34 mRNA配列は、NCBI Reference Sequence:NM_001172771.1(配列番号10)、NM_001172772.1(配列番号11)、またはNM_152456.2(配列番号12)の配列である。
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、IL−34 RNAを標的とすることが可能な複数の配列から選択することができる。本発明の一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、すなわち、ヌクレオチド間結合の少なくとも一部が患者の細胞への送達に適したホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドである。さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、修飾された塩基、例えば5−メチル−2’−デオキシシチジンを含有するヌクレオチドを含み得る。
本発明の一部の実施形態では、患者において線維症、例えば腸線維症を処置する、腸線維症もしくは肺線維症を防止する、またはコラーゲン沈着を防止する方法は、医薬組成物、例えば、IL−34の特異的阻害剤、例えばIL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容されるキャリアとを含む医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、医薬組成物を非経口投与する。一部の実施形態では、医薬組成物を経口投与する。一部の実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティング、例えばアクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含む。
本発明の複数の実施形態では、患者において線維症(例えば、腸線維症または肺線維症)を処置する、線維症(例えば、腸線維症または肺線維症)を防止する、またはコラーゲン沈着を防止する方法は、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはIL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を様々な量で投与することを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも1μg、少なくとも5μg、少なくとも10μg、少なくとも、20μg、少なくとも、30μg、少なくとも、40μg、少なくとも、50μg、少なくとも、60μg、少なくとも、70μg、少なくとも、80μg、少なくとも、90または少なくとも100μgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、35mgから500mgまで、1mgから10mgまで、10mgから20mgまで、20mgから30mgまで、30mgから40mgまで、40mgから50mgまで、50mgから60mgまで、60mgから70mgまで、70mgから80mgまで、80mgから90mgまで、90mgから100mgまで、100mgから150mgまで、150mgから200mgまで、200mgから250mgまで、250mgから300mgまで、300mgから350mgまで、350mgから400mgまで、400mgから450mgまで、450mgから500mgまで、500mgから600mgまで、600mgから700mgまで、700mgから800mgまで、800mgから900mgまで、900mgから1gまで、1mgから50mgまで、20mgから40mgまで、または1mgから500mgまでのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
肝線維症、肺線維症、または腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、IL−34阻害剤、例えば、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含む方法も本明細書において提供される。腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および/または腎性全身性線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含む方法も提供される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
配列番号1〜9:5’−GCTGGGTGACGCTTT−3’(配列番号1)、5’−TGGTCACTCAGTCAGG−3’(配列番号2)、5’−CCAAGATAGCGCAGCC−3’(配列番号3)、5’−GTCAAGGGCCACATCT−3’(配列番号4)、5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’(配列番号5)、5’−ACAGAGGCCTAAGCA−3’(配列番号6)、5’−CTCATTCTGCGTCAAG−3’(配列番号7)、5’−TCGGGGCAGCAGAG−3’(配列番号8)、5’−GGAGTGAGCAGGTGC−3’(配列番号9)からなる群から選択される配列、その一部およびその相補物を含む、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目2)
前記配列のヌクレオシド結合の少なくとも1つが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、またはボラノホスフェート結合からなる群から選択される、項目1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目3)
前記配列のヌクレオシド間結合の少なくとも1つがホスホロチオエート結合である、項目1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目4)
前記配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である、項目1から3までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目5)
15ヌクレオチドから40ヌクレオチドまでの長さである、項目1から4までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目6)
15ヌクレオチドから22ヌクレオチドまでの長さである、項目1から5までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目7)
炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目8)
炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する方法であって、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目9)
炎症性疾患に罹患している患者の細胞におけるIL−34媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法であって、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目10)
IL−34発現の変更に関連する炎症性疾患を処置することを必要とする患者においてIL−34発現の変更に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目11)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、シェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、項目7から10までのいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、項目13に記載の方法。(項目15)
前記IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与する、項目7から14までのいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、経口投与する、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記患者がヒトである、項目7から16までのいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む、医薬として許容される組成物。
(項目19)
医薬組成物が、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与に適したものである、項目17に記載の方法。
(項目20)
炎症性疾患を処置するための医薬の製造における、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
(項目21)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、項目20に記載の使用。
(項目22)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目21に記載の使用。
(項目23)
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、項目22に記載の使用。
(項目24)
線維症を防止または処置するための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目25)
前記線維症が、腸線維症である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記線維症が、肺線維症である、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記線維症が、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症からなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目28)
腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を医薬として有効な量で投与することを含む方法。
(項目29)
前記医薬調製物を経口投与する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記患者がヒトである、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
前記患者が、クローン病、炎症性腸疾患、または潰瘍性大腸炎にも罹患している、項目28から30までのいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
肺線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を医薬として有効な量で投与することを含む方法。
(項目33)
前記医薬調製物を、経口投与する、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記患者がヒトである、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
前記IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’(配列番号5)の配列を含む、項目28から34までのいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
医薬としての使用のための、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目37)
炎症性疾患の処置における使用のための、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目38)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、項目37に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目39)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目38に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目40)
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、項目39に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目41)
線維症の処置における使用のための、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目42)
前記線維症が、腸線維症である、項目41に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目43)
前記線維症が、肺線維症である、項目41に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目44)
前記線維症が、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症からなる群から選択される、項目41に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
配列番号1〜9:5’−GCTGGGTGACGCTTT−3’(配列番号1)、5’−TGGTCACTCAGTCAGG−3’(配列番号2)、5’−CCAAGATAGCGCAGCC−3’(配列番号3)、5’−GTCAAGGGCCACATCT−3’(配列番号4)、5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’(配列番号5)、5’−ACAGAGGCCTAAGCA−3’(配列番号6)、5’−CTCATTCTGCGTCAAG−3’(配列番号7)、5’−TCGGGGCAGCAGAG−3’(配列番号8)、5’−GGAGTGAGCAGGTGC−3’(配列番号9)からなる群から選択される配列、その一部およびその相補物を含む、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目2)
前記配列のヌクレオシド結合の少なくとも1つが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、またはボラノホスフェート結合からなる群から選択される、項目1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目3)
前記配列のヌクレオシド間結合の少なくとも1つがホスホロチオエート結合である、項目1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目4)
前記配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である、項目1から3までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目5)
15ヌクレオチドから40ヌクレオチドまでの長さである、項目1から4までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目6)
15ヌクレオチドから22ヌクレオチドまでの長さである、項目1から5までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目7)
炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目8)
炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する方法であって、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目9)
炎症性疾患に罹患している患者の細胞におけるIL−34媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法であって、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目10)
IL−34発現の変更に関連する炎症性疾患を処置することを必要とする患者においてIL−34発現の変更に関連する炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目11)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、シェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、項目7から10までのいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、項目13に記載の方法。(項目15)
前記IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与する、項目7から14までのいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、経口投与する、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記患者がヒトである、項目7から16までのいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む、医薬として許容される組成物。
(項目19)
医薬組成物が、局所投与、非経口投与、経口投与、肺投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、または十二指腸内投与に適したものである、項目17に記載の方法。
(項目20)
炎症性疾患を処置するための医薬の製造における、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
(項目21)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、項目20に記載の使用。
(項目22)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目21に記載の使用。
(項目23)
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、項目22に記載の使用。
(項目24)
線維症を防止または処置するための方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
(項目25)
前記線維症が、腸線維症である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記線維症が、肺線維症である、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記線維症が、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症からなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目28)
腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を医薬として有効な量で投与することを含む方法。
(項目29)
前記医薬調製物を経口投与する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記患者がヒトである、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
前記患者が、クローン病、炎症性腸疾患、または潰瘍性大腸炎にも罹患している、項目28から30までのいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
肺線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を医薬として有効な量で投与することを含む方法。
(項目33)
前記医薬調製物を、経口投与する、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記患者がヒトである、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
前記IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドが、5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’(配列番号5)の配列を含む、項目28から34までのいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
医薬としての使用のための、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目37)
炎症性疾患の処置における使用のための、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目38)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症、歯周炎、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、結腸直腸がん、大腸炎関連結腸がん、散発性結腸直腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患からなる群から選択される、項目37に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目39)
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目38に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目40)
前記炎症性腸疾患が、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎からなる群から選択される、項目39に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目41)
線維症の処置における使用のための、項目1から6までのいずれか一項に記載のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目42)
前記線維症が、腸線維症である、項目41に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目43)
前記線維症が、肺線維症である、項目41に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(項目44)
前記線維症が、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、および腎性全身性線維症からなる群から選択される、項目41に記載の使用のためのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド。
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、標的タンパク質(例えば、IL−34)をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)と相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、mRNAにハイブリダイズし、それにより、DNA/RNAハイブリッド鎖を分解するRNase
Hなどの遍在する触媒酵素の活性化をもたらし得る二本鎖ハイブリッドを生じさせ、したがって、タンパク質への翻訳を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、2’−O−アルキルを含む修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、またはモルホリノオリゴマー化学物質を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、オリゴヌクレオチドの一方の鎖のみが標的配列と相補的である。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、標的タンパク質(例えば、IL−34)をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)と相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、mRNAにハイブリダイズし、それにより、DNA/RNAハイブリッド鎖を分解するRNase
Hなどの遍在する触媒酵素の活性化をもたらし得る二本鎖ハイブリッドを生じさせ、したがって、タンパク質への翻訳を防止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、2’−O−アルキルを含む修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、またはモルホリノオリゴマー化学物質を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、オリゴヌクレオチドの一方の鎖のみが標的配列と相補的である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み入れられるヌクレオチド配列の標的化部分が、IL−34 mRNA配列またはIL−34相互作用パートナーのmRNA配列と完全にまたはほぼ完全に相補的になるように設計することができる。そのような相補的なまたはほぼ相補的なヌクレオチド配列を組み入れることにより、所与の標的に対する特異性の程度が高いアンチセンスオリゴヌクレオチドを工学的に作製することが可能になる。特異性は、解離定数などのパラメータの測定またはタンパク質もしくはRNAの発現レベルの変化などの他の判定基準、あるいはIL−34の活性または発現を測定する他のアッセイによって評定され得る。
本明細書に開示されているようなIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5〜100オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、10〜40オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、14〜40オリゴヌクレオチドの長さ、10〜30オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、14〜30オリゴヌクレオチドの長さ、例えば、14〜25または15〜22オリゴヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド配列であり得る。IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL−34 mRNA配列の一部と相補的なオリゴヌクレオチド配列であり得る。
本開示の一部の実施形態では、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜9:5’−GCTGGGTGACGCTTT−3’(配列番号1)、5’−TGGTCACTCAGTCAGG−3’(配列番号2)、5’−CCAAGATAGCGCAGCC−3’(配列番号3)、5’−GTCAAGGGCCACATCT−3’(配列番号4)、5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’(配列番号5)、5’−ACAGAGGCCTAAGCA−3’(配列番号6)、5’−CTCATTCTGCGTCAAG−3’(配列番号7)、5’−TCGGGGCAGCAGAG−3’(配列番号8)、5’−GGAGTGAGCAGGTGC−3’(配列番号9)のいずれか1つから選択される配列を含む。
ある実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも1つまたは複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホロアミデート結合、およびアミノアルキルホスホロアミデート結合、チオホスホロアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、ならびに/またはボラノホスフェート結合などの、修飾された結合を有し得る。例えば、一部の実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの1つ、2つまたはそれより多く、例えば全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり得る。
特定の実施形態では、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号5(5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’)の配列を含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、IL−34に対するホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、IL−34に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号5(5’−AGCTGCTCAGTGTGAA−3’)の配列を含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合のうちの1つまたは複数がホスホロチオエート結合である、IL−34に対するホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
代替の実施形態では、開示される、IL−34を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意選択で、配列内に、例えば、5’末端もしくは3’末端の一方のみまたは5’末端および3’末端の両方またはオリゴヌクレオチド配列に沿ってのいずれかに配置された少なくとも1つの修飾された核酸塩基、例えば、5−メチルシトシン、および/または少なくとも1つのメチルホスホネートヌクレオチドを有し得ることが意図されている。
意図されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意選択で、少なくとも1つの修飾された糖を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分は、2’−OH基がOR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NR2、N3、CN、F、Cl、Br、およびI(ここで、Rはアルキルまたはアリールであり、R’はアルキレンである)からなる群から選択される任意の1つで置き換えられていてよいリボースである。
自己免疫疾患および炎症性疾患
自己免疫疾患および炎症性疾患
本開示は、一部において、IL−34活性に関連する炎症性障害を処置することを必要とする患者におけるIL−34活性に関連する炎症性障害の処置であって、開示されるアンチセンス化合物を投与することを含む処置を意図している。一部の実施形態では、炎症性疾患を処置することを必要とする患者において炎症性疾患を処置するための方法であって、開示されるアンチセンス化合物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。本開示の一部の実施形態では、有効量の、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者に投与して、炎症性疾患を処置する、例えば、炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカイン産生を阻害する、および/またはIL−34媒介性炎症反応を低減もしくは阻害することができる。
「炎症性疾患」は、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、糖尿病(I型およびII型)、組織もしくは臓器拒絶反応、多発性硬化症、歯周炎症(例えば、歯周炎)、色素性絨毛結節性滑膜炎、肝炎、副鼻腔炎、結腸がん、冠動脈疾患、またはシェーグレン症候群(SS)、肥満症、慢性炎症、肺サルコイドーシス、皮膚病変、CNS炎症性疾患、または自己免疫疾患を含めた、いくつもの急性および慢性炎症性障害を指す。
一部の実施形態では、ループスに関連する皮膚病変を処置することを必要とする患者においてループスに関連する皮膚病変を処置する方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ループスに関連する皮膚病変の処置は、皮膚病変の数の減少、皮膚病変の形成の速度の低下、および皮膚病変の重症度の低減から選択される少なくとも1つの効果を含む。ループスおよび/またはループス腎炎に罹患している患者に対する、ループスおよび/またはループス腎炎の処置方法であって、開示されるアンチセンス化合物を投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ループスに関連する腎臓の状態の進行を遅くする方法が提供される。
CNS炎症性疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせることを必要とする被験体においてCNS炎症性疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせる方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。方法は、例えば、CNS炎症性疾患が発生するリスクがある被験体を処置すること;例えば、被験体に、有効量の、開示されるIL−34アンチセンスを投与することを含む。このように処置することができるCNS炎症性疾患としては、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびパーキンソン病が挙げられる。
自己免疫疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせることを必要とする被験体において自己免疫疾患を処置する、それが発生するリスクを低下させる、またはその発症を遅らせる方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法も本明細書において提供される。方法は、自己免疫疾患を有するまたはそれが発生するリスクがある被験体を処置することを含む。このように処置することができる自己免疫疾患としては、関節リウマチ、I型糖尿病、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、および特発性肺線維症が挙げられる。
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患
本開示は、炎症性腸疾患を処置することを必要とする患者に対する、炎症性腸疾患を処置するための方法であって、開示される化合物を投与することを含む方法も提供する。「炎症性腸疾患」は、本明細書で使用される場合、クローン病、胃十二指腸クローン病、クローン(肉芽腫性)大腸炎、潰瘍性大腸炎、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、空回腸炎、左側大腸炎、全大腸炎、回結腸炎、回腸炎、および分類不能大腸炎を含めた、いくつもの慢性炎症性疾患を指す。クローン病および潰瘍性大腸炎が炎症性腸疾患の2つの最も一般的な形態である。炎症性腸疾患は、消化器系の自己免疫疾患である。クローン病は、回腸末端部を含めた胃腸管のあらゆる部分に局在し得、胃腸管の全ての細胞型に影響を及ぼし得る。潰瘍性大腸炎は、結腸および直腸に局在し、粘膜の細胞のみに影響を及ぼす。
環境因子および遺伝因子の両方が炎症性腸疾患において役割を果たすと考えられているが、そのような因子の実体は明確に定義されていない。環境構成成分は、摂取された食物および薬物への曝露の影響を受ける消化管の微生物叢の変更を含み得る。
炎症性腸疾患には、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、重度の痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、貧血、皮膚病変、関節痛、眼炎、肝障害、関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎、および非甲状腺疾患症候群を含めた症状が伴い、開示されるアンチセンス化合物を使用してこれらの症状を処置することも、ある実施形態において、例えば、潰瘍性大腸炎に罹患しており、成長不良を患う可能性もある小児を処置することも意図されている。
腸線維症
腸線維症
腸線維症は、一般に、IBDによって引き起こされる慢性炎症などの炎症に対する腸組織の反応の結果生じる。IBDでは、SMAD7のレベルの上昇により、TGF−β経路の活性化およびSmad2/3リン酸化によって媒介される抗炎症性遺伝子の発現が遮断される。TGF−βシグナル伝達の増加に曝露した筋線維芽細胞ではコラーゲンの産生量が増加する。クローン病に関しては、持続的な慢性炎症により線維化プロセスが促進され、その結果、小腸および結腸狭窄を含めた狭窄が形成される。
腸線維症は、造影超音波検査などの、いくつものイメージング技法のいずれかによって同定することができる。例えば、Quaiaら、The value of small bowel wall contrast enhancement after sulfur hexafluoride-filled microbubble injection to
differentiate inflammatory from fibrotic strictures in patients with Crohn's disease. Ultrasound Med. Biol.、38巻、1324〜1332頁(201
2年);Nylundら、Quantitative contrast-enhanced ultrasound comparison between inflammatory and fibrotic lesions in patients with Crohn's disease.
Ultrasound Med. Biol.、39巻、1197〜1206頁(2013年);Stidhamら、Ultrasound elasticity imaging for detecting intestinal fibrosis and inflammation in rats and humans with Crohn's disease. Gastroenterology、141巻、819〜826頁(2011年)を参照されたい。磁化移動MRIなどのMRI技法も使用することができる。例えば、Maccioniら、Value of T2-weighted magnetic
resonance imaging in the assessment of wall inflammation and fibrosis
in Crohn's disease. Abdom. Imaging、37巻、944〜957頁(2012年);Adlerら、Magnetization transfer helps detect intestinal fibrosis in an
animal model of Crohn disease. Radiology、259巻、127〜135頁(2
011年);Pazahrら、Magnetization transfer for the assessment of bowel fibrosis in patients with Crohn's disease: initial experience. Magn. Reson. Mat. Phys. Biol. Med.、26巻、291〜301頁(2013年)を参照されたい。
線維症
differentiate inflammatory from fibrotic strictures in patients with Crohn's disease. Ultrasound Med. Biol.、38巻、1324〜1332頁(201
2年);Nylundら、Quantitative contrast-enhanced ultrasound comparison between inflammatory and fibrotic lesions in patients with Crohn's disease.
Ultrasound Med. Biol.、39巻、1197〜1206頁(2013年);Stidhamら、Ultrasound elasticity imaging for detecting intestinal fibrosis and inflammation in rats and humans with Crohn's disease. Gastroenterology、141巻、819〜826頁(2011年)を参照されたい。磁化移動MRIなどのMRI技法も使用することができる。例えば、Maccioniら、Value of T2-weighted magnetic
resonance imaging in the assessment of wall inflammation and fibrosis
in Crohn's disease. Abdom. Imaging、37巻、944〜957頁(2012年);Adlerら、Magnetization transfer helps detect intestinal fibrosis in an
animal model of Crohn disease. Radiology、259巻、127〜135頁(2
011年);Pazahrら、Magnetization transfer for the assessment of bowel fibrosis in patients with Crohn's disease: initial experience. Magn. Reson. Mat. Phys. Biol. Med.、26巻、291〜301頁(2013年)を参照されたい。
線維症
肝線維症、肺線維症、および/または腸線維症などの線維症を防止または処置する方法は本開示の一部を形成する。そのような方法は、それを必要とする患者またはリスクがある患者に、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含み得る。例えば、肝線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法が提供される。あるいは、腸線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法が提供される。あるいは、肺線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法が提供される。
上記の方法を使用して処置される患者は、検出可能な線維症を有していても有していなくてもよい。一部の実施形態では、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後、例えば、1日後、2日後、1週間後、1カ月後または6カ月後もしくはそれよりも後に患者に存在する線維症の量が少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%またはさらには50%もしくはそれより大きく減少する。そのようなIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、例えば、少なくとも毎日であり得る。化合物は、経口投与することができる。本明細書で開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の結果としての患者における線維症の臨床症状の遅延は、本明細書に開示されているものなどのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を受けていない患者と比較して、少なくとも、例えば、6カ月、1年、18カ月またはさらには2年もしくはそれよりも長い可能性がある。
必要とする患者は、硬変症に発展した肝線維症を有し得る。肝線維症のリスクがある患者としては、B型肝炎、C型肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の患者を挙げることができる。NASHは、脂肪症および硬変症を含めた非アルコール性脂肪肝疾患の範囲に含まれる。NASHは、肥満症、2型糖尿病、および脂質異常症によって特徴付けられるメタボリックシンドロームの構成要素であり、最終的に肝細胞癌に至る可能性がある。
肝線維症に関連する障害を処置する方法、例えば、以下:ある特定の蓄積症および先天性代謝異常、例えば、アルファ1−アンチトリプシン欠損症、銅蓄積症(例えば、ウイルソン病)、フルクトース血症、ガラクトース血症、糖原病(例えば、III型、IV型、VI型、IX型およびX型)、鉄過剰症候群(例えば、ヘモクロマトーシス)、脂質異常(例えば、ゴーシェ病)、ペルオキシソーム障害(例えば、ツェルウェガー症候群)、およびチロシン血症;細菌感染症(例えば、ブルセラ症);寄生虫感染症(例えば、エキノコックス症);NASH;ウイルス感染症(例えば、慢性B型肝炎またはC型肝炎を含めたB型肝炎またはC型肝炎);バッド・キアリ症候群;心不全;肝静脈閉塞症;ならびに門脈血栓症のうちの少なくとも1つの処置も提供される。先天性肝線維症を処置する方法も意図されている。組成物は、経口投与することができる。
薬物および/またはアルコールの乱用が肝線維症の症例に関係付けられている。薬物および/またはアルコールの乱用の履歴を有する患者において肝線維症を処置する方法が本明細書において意図されている。例えば、以下:アルコール、アミオダロン、クロルプロマジン、イソニアジド、メトトレキサート、メチルドパ、オキシフェニサチン、およびトルブタミドの少なくとも1つの乱用の履歴がある患者。
腸線維症のリスクがある患者としては、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病の患者を挙げることができる。リスクがある患者としては、クローン病もしくは大腸炎、広範囲かつ/もしくは重症の結腸疾患と診断されたときが低年齢である患者、原発性硬化性胆管炎が存在する患者、および/またはがんの家族歴を有する患者も挙げることができる。
腸線維症に関連する障害を処置する方法、例えば、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病のうちの少なくとも1つの処置も提供される。
腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症を防止または処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示されているIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬調製物を投与することを含む方法が本明細書において意図されている。
本発明のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で、または本発明のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも2つを単一の組成物もしくは処置レジメンの一部として一緒に使用することによって互いと組み合わせて使用することができる。本発明のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬物および/もしくはアルコールの乱用、腎線維症、心臓線維症、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、または腎性全身性線維症、薬物および/もしくはアルコールの乱用を処置するための他の薬物と組み合わせて使用することもできる。
処置および評価
処置および評価
「患者」とは、本明細書に記載される場合、これだけに限定されないが、哺乳動物、霊長類、およびヒトを含めた、炎症性疾患のリスクがある、それに罹患している、またはその診断を受けた任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、患者は、例えば、ネコ、イヌ、またはウマなどの非ヒト哺乳動物であり得る。患者は、炎症性疾患が発生するリスクが高いと診断された個体、炎症性疾患と診断された人、炎症性疾患に以前罹患していた人、または炎症性疾患の症状もしくは指標、例えばIL−34発現シグナルについて評価された個体であり得る。
「必要とする患者」とは、本明細書で使用される場合、炎症性疾患の症状もしくは徴候のいずれかが生じている患者、炎症性疾患の症状もしくは徴候のいずれかが生じる可能性がある患者、または炎症性疾患を処置するための本開示の方法が有益である可能性がある任意の患者を指す。必要とする患者とは、炎症性疾患が発生するリスクがあると診断されている患者、過去に炎症性疾患に罹患していた患者、または以前に炎症性疾患に対する処置を受けていた患者を含み得る。特に関連性があるのは、IL−34発現または活性のレベルの増加に関連する炎症性疾患に罹患している個体である。
「処置する(treat)」、「処置(treatment)」、「処置すること(treating)」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味するように使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的なものであり得、かつ/または、疾患および/もしくは疾患に起因する有害作用を部分的にもしくは完全に治癒するという点で治療的であり得る。「処置(treatment)」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特
にヒトにおける疾患に対するあらゆる処置を包含し、(a)疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない被験体において疾患が生じるのを防止すること;(b)疾患を阻害する、すなわち、疾患の重症度もしくは範囲が増加するのを防止すること;(c)疾患を軽減する、すなわち、疾患の部分的もしくは完全な好転を引き起こすこと;または(d)疾患の再発を防止する、すなわち、以前の上首尾の疾患の症状の処置もしくは疾患の処置の後に疾患が活動的な状態に戻るのを防止することを含む。
にヒトにおける疾患に対するあらゆる処置を包含し、(a)疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない被験体において疾患が生じるのを防止すること;(b)疾患を阻害する、すなわち、疾患の重症度もしくは範囲が増加するのを防止すること;(c)疾患を軽減する、すなわち、疾患の部分的もしくは完全な好転を引き起こすこと;または(d)疾患の再発を防止する、すなわち、以前の上首尾の疾患の症状の処置もしくは疾患の処置の後に疾患が活動的な状態に戻るのを防止することを含む。
「有効量」は、本明細書で使用される場合、患者に投与したときに状態が少なくとも部分的に処置されるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、状態の重症度、構成成分の投与経路、および処置される患者の年齢、体重などに応じて変動する。したがって、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量は、患者において炎症性疾患を処置する、したがって、薬剤の投与により、被験体において炎症性疾患が生じるのを防止する、炎症性疾患の進行を防止する(例えば、直腸出血、貧血、または胃腸炎などの炎症性腸疾患の症状の発症または重症度の増加を防止する)、または炎症性疾患の関連する症状の全てを軽減するもしくは完全に好転させる、すなわち、疾患の退縮を引き起こすために必要なIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの量である。
処置の有効性は、炎症性疾患に関連する全般的な症状の評価、組織の組織学的分析、生化学的アッセイ、例えば磁気共鳴画像法などのイメージング方法、または他の公知の方法によって評価することができる。例えば、処置の有効性は、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを炎症性疾患に罹患している患者に投与した後の、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、痙攣、筋痙縮、体重減少、栄養不良、発熱、貧血または炎症性疾患に関連する全般的な病状の他の側面の変化などの全般的な疾患の症状を分析することによって評価することができる。
処置の有効性は、組織レベルまたは細胞レベルで、例えば、組織生検材料(例えば、胃腸組織生検材料)を得、全般的な組織または細胞の形態または染色性を評価することによって評価することもできる。タンパク質またはRNAの発現を検査する生化学的アッセイを使用して処置の有効性を評価することもできる。例えば、解離細胞または非解離組織における炎症性疾患、炎症性サイトカイン産生、またはIL−34媒介性炎症反応を示す、IL−34、IL−6、IL−8、TNF−アルファ、または別のタンパク質もしくは遺伝子産物のレベルを、免疫細胞化学的方法、免疫組織化学的方法、ウエスタンブロット方法、もしくはノーザンブロット方法、または、定量的もしくは半定量的ポリメラーゼ連鎖反応などの、RNAレベルを評価するのに有用な方法によって評価することができる。糞便、血漿、または血清において見いだされる有用なバイオマーカーの存在または発現レベルを評価して、病態および処置の有効性を評価することもできる。
処置の有効性の評価では、有効な評定を確実にするために、適切な対照を選択することができる。例えば、炎症性疾患の患者において開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後に評価された症状と、同じ患者における処置前もしくは処置の過程中の早期の時点の症状または炎症性疾患と診断されていない別の患者における症状を比較することができる。あるいは、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の胃腸組織の生化学的分析または組織学的分析の結果と、同じ患者由来または炎症性疾患と診断されていない個体由来またはIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する前の同じ患者由来の胃腸組織の生化学的分析または組織学的分析の結果を比較することができる。さらに、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の血液、血清、細胞、または糞便試料と、炎症性疾患と診断されていない個体由来またはIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する前の同じ患者由来の同等の試料を比較することができる。
IL−34阻害の検証は、IL−34の発現レベルまたは活性の直接または間接的な評定によって決定することができる。例えば、IL−34タンパク質またはRNAの発現を測定する生化学的アッセイを使用して、全体的なIL−34阻害を評価することができる。例えば、胃腸組織におけるIL−34タンパク質レベルをウエスタンブロットによって測定して、全体的なIL−34レベルを評価することができる。IL−34 mRNAレベルをノーザンブロットまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定して、全体的なIL−34阻害を決定することもできる。解離細胞、非解離組織、血液、血清、または糞便におけるIL−34タンパク質レベルまたはIL−34シグナル伝達活性を示す別のタンパク質のレベルを免疫細胞化学的方法または免疫組織化学的方法によって評価することもできる。
IL−34阻害は、マクロファージもしくは単球の生成もしくは増殖などのパラメータを測定すること、または、MAPキナーゼリン酸化およびIL−34受容体−マクロファージコロニー刺激因子受容体(M−CSFR−1、MCSFR−1、M−CSFR1、およびCSF1Rとしても公知)のシグナル伝達活性化の他の指標を含めた、IL−34活性の変化と相関する他のパラメータの変更を測定することによって間接的に評価することもできる。例えば、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置された患者の細胞における活性なMAPK1またはMAPK3リン酸化のレベルを前記細胞におけるIL−34活性の指標として測定することができる。血漿、血液、糞便または組織において見いだされる有用なバイオマーカーの存在または発現レベルを評価してIL−34阻害の有効性を評価することもできる。
本明細書に開示されている処置方法は、炎症性サイトカイン産生を阻害する方法を含む。「炎症性サイトカイン産生」は、炎症性サイトカイン応答を開始させるおよび/または促進するサイトカインの発現を指す。「炎症性サイトカイン応答」は、顆粒球動員、リンパ球動員、全身性炎症(特に胃腸管またはその一部分(複数可)の炎症)、発熱、組織破壊、ショック、および/または死亡によって特徴付けられ得る免疫応答を指す。炎症性サイトカイン応答は、個々のサイトカインとそれらの同種の細胞表面受容体との結合(例えば、IL−34のCSF1Rへの結合)ならびにその後の細胞機能および遺伝子発現を変更させる細胞内シグナル伝達のカスケードによって特徴付けられ得る。炎症性サイトカインとしては、これだけに限定されないが、IL−1、IL−6、IL−8、IL−34、およびTNF−アルファが挙げられる。炎症性サイトカインの発現は、例えば、マクロファージ、単球、粘膜固有層(propia lamina)単核細胞、または胃腸管の他の細胞もしくは免疫系の細胞において起こり得る。炎症性サイトカイン産生を阻害する方法は、炎症性疾患に罹患している患者において炎症性サイトカインの一部または全部の発現レベルを低下させる方法を含む。炎症性サイトカイン産生を阻害する方法は、炎症性疾患に罹患している患者の細胞における炎症性サイトカインの一部または全部の発現レベルを低下させる方法も含む。
炎症性サイトカイン産生を阻害するための本開示の方法は、IL−34媒介性炎症反応を低減させるまたは阻害する方法を含む。「IL−34媒介性炎症反応」は、本明細書で使用される場合、IL−34発現またはIL−34シグナル伝達活性によって開始される、容易になる、または促進される炎症反応を指す。IL−34媒介性炎症反応により、これだけに限定されないが、IL−34、IL−6、IL−8、またはTNF−アルファを含めた炎症性サイトカインの発現、および炎症性サイトカインシグナル伝達の活性化がもたらされ得る。さらに、IL−34媒介性炎症反応は、顆粒球動員、リンパ球動員、全身性炎症(特に胃腸管またはその一部分(複数可)の炎症)、発熱、組織破壊、ショック、および/または死亡によって特徴付けられ得る。IL−34媒介性炎症反応は、IL−34シグナル伝達の活性化、例えば、IL−34のCSF1Rへの結合および下流のMAPキナーゼのリン酸化によっても特徴付けられ得る。IL−34媒介性炎症反応の低減または阻害は、IL−34媒介性炎症反応に関連する細胞変化および全身変化のいずれかまたは全ての緩和を指す。例えば、炎症性サイトカイン産生、免疫細胞動員、または組織炎症の低減により、IL−34媒介性炎症反応の低減または阻害が示される。
本開示は、炎症性疾患に罹患している患者の細胞においてIL−34を阻害する方法も提供する。IL−34は、胃腸管、免疫系、および血液の細胞を含めた、IL−34発現または活性が生じる任意の細胞において阻害することができる。胃腸管の細胞(胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸および肛門管の細胞を含む)としては、円柱上皮細胞、粘膜上皮細胞、酵素原細胞、頸部粘液細胞、壁細胞、ガストリン細胞、杯細胞、パネート細胞、オリゴ粘液細胞(oligomucus cell)、および絨毛吸収細胞(villus absorptive cell)が挙げられる。免疫系の細胞としては、白血球(leukocyte)、食細胞(例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞)、単球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、固有細胞(innate cell)、リンパ球、B細胞、およびT細胞が挙げられる。血液細胞としては、赤血球(red blood cell)(赤血球(erythrocyte))お
よび白血球(white blood cell)(白血球(leukocyte)、単球、および血小板)が挙
げられる。
医薬組成物および投与経路
よび白血球(white blood cell)(白血球(leukocyte)、単球、および血小板)が挙
げられる。
医薬組成物および投与経路
本開示は、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の投与によって炎症性疾患を処置するための方法も提供する。別の態様では、本開示は、炎症性疾患の処置において使用するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、IL−34を標的とする開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとで構成されるものであってよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、例えば、炎症性疾患を処置するために、哺乳動物、例えばヒトに投与される、医薬として許容されるキャリア中に指定量の治療用化合物、例えば、治療有効量の治療用化合物を含有する混合物を意味する。一部の実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドと医薬として許容されるキャリアとを含む医薬組成物が本明細書において意図されている。別の態様では、本開示は、炎症性疾患を処置するための医薬の製造における、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。「医薬」は、本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語と基本的に同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、「医薬として許容されるキャリア」とは、妥当なベネフィット/リスク比に見合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適したバッファ、キャリア、および賦形剤を意味する。キャリア(複数可)は、製剤の他の成分と適合し、レシピエントにとって有害ではないという意味で、「許容される」ものであるべきである。医薬として許容されるキャリアとしては、医薬投与に適合するバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張化剤(isotonic agent)および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的
に活性な物質に対するそのような媒体および剤の使用は当技術分野で公知である。一実施形態では、医薬組成物は、経口投与され、封入されている物質の消化器系または消化管内での吸収部位を調節するのに適した腸溶コーティングを含む。例えば、腸溶コーティングとしては、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体が挙げられる。
に活性な物質に対するそのような媒体および剤の使用は当技術分野で公知である。一実施形態では、医薬組成物は、経口投与され、封入されている物質の消化器系または消化管内での吸収部位を調節するのに適した腸溶コーティングを含む。例えば、腸溶コーティングとしては、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体が挙げられる。
一実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび任意のその医薬組成物は、局所経路、非経口経路、経口経路、肺経路、気管内経路、鼻腔内経路、経皮経路、または十二指腸内経路を含めた1つまたはいくつかの経路によって投与することができる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、膵臓内投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射または注入技法を含む。例えば、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを被験体に皮下投与することができる。別の例では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを被験体に経口投与することができる。別の例では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを胃腸系、または胃腸系の特定の領域(例えば、回腸、結腸、または直腸)に非経口投与によって直接投与することができる。
本明細書に開示されているものなどの開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、単位剤形で提示されてよく、また、任意の適切な方法によって調製することができる。医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化されるべきである。有用な製剤は、製薬技術分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版(Mack
Publishing Company、1990年)を参照されたい。
Publishing Company、1990年)を参照されたい。
医薬製剤は、例えば、滅菌されたものである。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって実現することができる。組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥および再構成の前またはその後にフィルター滅菌を行うことができる。
非経口投与
非経口投与
本開示の医薬組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、病巣内経路、または腹腔内経路による注射用に製剤化することができる。開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する水性医薬組成物などの水性組成物の調製は、本開示を考慮すれば当業者であればわかっている。一般には、そのような組成物は、液剤または懸濁剤としてのいずれかの注射剤として調製することができ、注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態も調製することができ、また、調製物を乳化させることもできる。
注射による使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液;ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤;および滅菌注射液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、当該形態は滅菌されなければならず、また、容易な注射可能性(syringability)が存在する程度に流体でなけれ
ばならない。当該形態は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
ばならない。当該形態は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の液剤をヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物で、ならびに油で分散液剤を調製することもできる。さらに、滅菌された不揮発性油を溶媒または懸濁媒として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製において使用することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射液剤、懸濁剤、またはエマルション、例えば、1,3−ブタンジオール中の液剤としてであってもよい。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液である。一実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを1%(w/v)カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび0.1%(v/v)TWEEN(商標)80を含むキャリア流体中に懸濁させることができる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用し、公知の技術に従って製剤化することができる。一般に、分散液剤は、種々の滅菌した活性成分を、基礎分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。本開示の滅菌注射液剤は、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを、必要量の適切な溶媒中に、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分と共に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。滅菌注射液剤を調製するための滅菌粉剤の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技法であり、それにより、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る。注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって滅菌することができる。
筋肉内注射用のより多くまたは高度に濃縮された液剤の調製も意図されている。この点について、溶媒としてDMSOを使用することが好ましく、これは、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの非常に迅速な透過がもたらされ、高濃度で狭い面積に送達されるからである。
そのような液剤に使用するための適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切な緩衝液としては、pHを約pH6からpH8の間、および例えば、約pH7からpH7.5の間に維持するために十分な量の、ホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム(potassium 10
carbonate)、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。適切な張
度調整剤(tonicity agent)は、デキストラン40、デキストラン70、デキストロー
ス、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどであり、溶液の塩化ナトリウム当量が0.9プラスマイナス0.2%の範囲内になるようにする。適切な抗酸化剤および安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム(sodium thiosulfite)、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿
潤剤および清澄剤としては、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー282およびチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラン40、デキストラン70、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
経口投与
carbonate)、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。適切な張
度調整剤(tonicity agent)は、デキストラン40、デキストラン70、デキストロー
ス、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどであり、溶液の塩化ナトリウム当量が0.9プラスマイナス0.2%の範囲内になるようにする。適切な抗酸化剤および安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム(sodium thiosulfite)、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿
潤剤および清澄剤としては、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー282およびチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラン40、デキストラン70、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
経口投与
一部の実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの経口送達に適した組成物、例えば、組成物がIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを例えば患者の胃腸管に送達することができるように、腸溶コーティング、例えば胃耐性(gastro-resistant)コーティングを含む錠剤が本明細書において意図されている。例えば、そのような投与により、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者の胃腸管の影響を受けている部分に直接、実質的に局所的に適用して、局所的な効果をもたらすことができる。そのような投与により、一部の実施形態では、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの望ましくない全身的吸収を実質的に回避することができる。
例えば、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号1で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容される賦形剤とを含む顆粒を含む(例えば、少なくとも部分的に顆粒から形成される)経口投与用の錠剤が提供される。そのような錠剤は、腸溶コーティングでコーティングされていてよい。意図されている錠剤は、充填剤、結合剤、崩壊剤、および/または滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、ウインターグリーン、オレンジ、キシリトール、ソルビトール、フルクトース、およびマルトデキストリンなどの香味剤、ならびに香料、防腐剤ならびに/または抗酸化剤などの医薬として許容される賦形剤を含み得る。
一部の実施形態では、意図されている医薬製剤は、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号1で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容される塩とを含む、例えば、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号1で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬として許容される充填剤とを含む粒内相を含む。例えば、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび充填剤を、任意選択で、他の賦形剤と一緒に混和し、顆粒に形成することができる。一部の実施形態では、粒内相は、湿式造粒を使用して形成することができ、例えば、混和させたIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物および充填剤に液体(例えば、水)を添加し、次いで、配合物(combination)を乾燥させ、破砕し、かつ/またはふるいにかけて顆粒を作製す
る。粒内相を実現するために他のプロセスを使用することができることが当業者には理解されよう。
る。粒内相を実現するために他のプロセスを使用することができることが当業者には理解されよう。
一部の実施形態では、意図されている製剤は、粒外相を含み、粒外相は、1つまたは複数の医薬として許容される賦形剤を含んでよく、粒内相と混和して、開示される製剤を形成することができる。
開示される製剤は、充填剤を含む粒内相を含んでよい。例示的な充填剤としては、これだけに限定されないが、セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、微結晶セルロース、ペクチン、ポリアクリレート、デキストロース、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、部分アルファ化デンプン、炭酸カルシウム、およびこれらの組合せを含めたものなどが挙げられる。
一部の実施形態では、開示される製剤は、一般に医薬製剤の成分が一緒に保持されるように機能し得る結合剤を含む粒内相および/または粒外相を含んでよい。本開示の例示的な結合剤としては、これだけに限定されないが、以下:例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ラクトース、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、糖アルコールおよびこれらの組合せを含めたものなどのデンプン、糖、セルロースまたは変性セルロースを挙げることができる。
意図されている製剤、例えば、粒内相および/または粒外相を含む製剤は、これだけに限定されないが、例えば、デンプン、セルロース、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギネート、トウモロコシデンプン、クロスメロースナトリウム(crosmellose sodium)、架橋結カルボ
キシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、およびこれらの組合せを含めたものなどの崩壊剤を含んでよい。例えば、粒内相および/または粒外相が崩壊剤を含んでよい。
キシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、およびこれらの組合せを含めたものなどの崩壊剤を含んでよい。例えば、粒内相および/または粒外相が崩壊剤を含んでよい。
一部の実施形態では、意図されている製剤は、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドと、マンニトール、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびデンプングリコール酸ナトリウムまたはこれらの組合せから選択される賦形剤とを含む粒内相、ならびに、微結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムまたはそれらの混合物のうちの1つまたは複数を含む粒外相を含む。
一部の実施形態では、意図されている製剤は、滑沢剤を含んでよく、例えば、粒外相が滑沢剤を含有してよい。滑沢剤としては、これだけに限定されないが、タルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、二酸化ケイ素(silicone dioxide)、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、ス
テアリン酸金属塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、タルク、およびステアリン酸が挙げられる。
テアリン酸金属塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、タルク、およびステアリン酸が挙げられる。
一部の実施形態では、医薬製剤は、腸溶コーティングを含む。一般に、腸溶コーティングにより、経口薬に対して、消化路に沿って薬物が吸収される場所を制御するバリアが生じる。腸溶コーティングは、pHに応じて異なる速度で崩壊するポリマーを含んでよい。腸溶コーティングは、例えば、酢酸フタル酸セルロース、アクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、酢酸コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシルプロピルメチルセルロース(hydroxylpropylmethyl cellulose phthalate)、メタクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体、メタクリル酸共重合体C型、ポリビニルアセテートフタレート、および酢酸フタル酸セルロースを含んでよい。
例示的な腸溶コーティングとしては、Opadry(登録商標)AMB、Acryl−EZE(登録商標)、Eudragit(登録商標)グレードが挙げられる。一部の実施形態では、腸溶コーティングは、重量で、意図されている錠剤の約5%〜約10%、約5%〜約20%、8〜約15%、約8%〜約20%、約10%〜約20%、もしくは約12〜約20%、または約18%を構成し得る。例えば、腸溶コーティングは、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含んでよい。
例えば、意図されている実施形態では、重量で約0.5%〜約70%、例えば、約0.5%〜約10%、または約1%〜約20%の開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容されるその塩を含むまたはそれから本質的になる錠剤が提供される。そのような錠剤は、例えば、重量で約0.5%〜約60%のマンニトール、例えば、重量で約30%〜約50%のマンニトール、例えば、重量で約40%のマンニトール;および/または重量で約20%〜約40%の微結晶セルロース、もしくは重量で約10%〜約30%の微結晶セルロースを含んでよい。例えば、開示される錠剤は、約30%〜約60%、例えば重量で約45%〜約65%、またはあるいは、重量で約5〜約10%の開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、約30%〜約50%、またはあるいは重量で約5%〜約15%のマンニトール、約5%〜約15%の微結晶セルロース、約0%〜約4%、または約1%〜約7%のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および約0%〜約4%、例えば重量で約2%〜約4%のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相を含んでよい。
別の意図されている実施形態では、開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを経口投与するための医薬錠剤製剤は、開示されるIL−34アンチセンスまたは医薬として許容されるその塩(例えば、ナトリウム塩)と、医薬として許容される充填剤とを含む粒内相を含み、また、崩壊剤などの医薬として許容される賦形剤を含み得る粒外相も含んでよい。粒外相は、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、およびそれらの混合物から選択される構成成分を含んでよい。医薬組成物は、重量で錠剤の約12%〜20%である腸溶コーティングも含んでよい。例えば、経口使用のための、医薬として許容される錠剤は、重量で約.5%〜10%の開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容されるその塩、重量で約30%〜50%のマンニトール、重量で約10%〜30%の微結晶セルロース、およびアクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含んでよい。
別の例では、経口使用のための、医薬として許容される錠剤は、重量で約5〜約10%の開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬として許容されるその塩、重量で約40%のマンニトール、重量で約8%の微結晶セルロース、重量で約5%のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および重量で約2%のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相;重量で約17%の微結晶セルロース、重量で約2%のデンプングリコール酸ナトリウム、重量で約0.4%のステアリン酸マグネシウムを含む粒外相;ならびに錠剤を覆う、アクリル酸エチル−メタクリル酸共重合体を含む腸溶コーティングを含んでよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、重量で約13%または約15%、16%、17%もしくは18%の、例えばAcyrlEZE(登録商標)(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT公開第WO2010/054826号を参照されたい)を含む腸溶コーティングを含有してよい。
コーティングが溶解し、活性成分が放出される点での率がそれの溶解率である。ある実施形態では、意図されている錠剤は、例えば、USP/EP 2型器具(パドル)において100rpmおよび37℃、pH7.2のリン酸緩衝液中で試験した場合に、約120分〜約240分後、例えば180分後にIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの約50%〜約100%が放出されるという溶解プロファイルを有し得る。別の実施形態では、意図されている錠剤は、例えば、USP/EP 2型器具(パドル)において100rpmおよび37℃、pH1.0の希釈したHCl中で試験した場合に、120分後に放出されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドが実質的に存在しないという溶解プロファイルを有し得る。別の実施形態では、意図されている錠剤は、例えば、USP/EP
2型器具(パドル)において100rpmおよび37℃、pH6.6のリン酸緩衝液中で試験した場合に、30分後に、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの約10%〜約30%、または約50%以下が放出されるという溶解プロファイルを有し得る。
2型器具(パドル)において100rpmおよび37℃、pH6.6のリン酸緩衝液中で試験した場合に、30分後に、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの約10%〜約30%、または約50%以下が放出されるという溶解プロファイルを有し得る。
一部の実施形態では、意図されている製剤、例えば錠剤は、患者に経口投与した場合に、患者において、最小のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿中濃度をもたらし得る。別の実施形態では、開示される製剤は、患者に経口投与した場合、患者の結腸または直腸、例えば、患者の影響を受けているまたは疾患にかかっている部位に局所的に送達される。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、本明細書に開示されている疾患および障害の処置を対象とする少なくとも1つの他の薬剤を投与することをさらに含んでよい。一実施形態では、意図されている他の薬剤を共投与すること(例えば、逐次的にまたは同時に)ができる。
意図されている薬剤としては、グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤、インターフェロン、オピオイド、TNF結合性タンパク質、ミコフェノレート、および低分子生物学的製剤を含めた免疫抑制剤が挙げられる。例えば、意図されている免疫抑制剤としては、これだけに限定されないが、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、デキサメタゾン、フルダラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、テリフルノミド、アナキンラ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、ムロモナブ−CD3、アフツズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、エファリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ナタリズマブ、およびエタネルセプトが挙げられる。他の意図されている薬剤としては、抗生物質、止瀉薬、緩下剤、鎮痛剤、鉄補給剤、およびカルシウムまたはビタミンDもしくはB−12補給剤が挙げられる。
投与量および投与の頻度
投与量および投与の頻度
例示的な製剤は、約35mg〜約500mgの開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むまたはそれから本質的になる剤形を含む。例えば、約35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、または250mgの開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤が本明細書において意図されている。一実施形態では、製剤は、約40mg、80mg、または160mgの開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも100μgの開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、製剤は、約0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、または25mgの開示されるIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。投与される量は、処置される疾患または適応症の型および程度、患者の全体的な健康状態およびサイズ、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivoにおける効力、医薬製剤、ならびに投与経路などの変数に左右される。所望の血中レベルまたは組織中レベルを迅速に実現するために、最初の投与量を、上位レベルを超えて増加させることができる。あるいは、最初の投与量を最適よりも少なくし、処置の過程中に投与量を次第に増加させることができる。ヒトへの投与量は、例えば、40mgから160mgまでにわたって実施するようデザインされた従来の第I相用量漸増試験において最適化することができる。投薬頻度は、投与経路、投薬量および処置される疾患などの因子に応じて変動し得る。例示的な投薬頻度は、1日1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。一部の実施形態では、投薬は、1日1回、7日間である。
診断方法
診断方法
本開示は、患者の1つまたは複数の生体試料中のIL−34発現シグナルのレベルを検出することに依拠する、炎症性疾患を有すると患者を診断する方法も提供する。本明細書で使用される場合、「IL−34発現シグナル」という用語は、IL−34遺伝子発現、または遺伝子もしくは遺伝子産物の活性の任意の指標を指し得る。IL−34遺伝子産物は、RNA(例えば、mRNA)、ペプチド、およびタンパク質を含む。評定することができるIL−34遺伝子発現を指し示すものとしては、これだけに限定されないが、IL−34遺伝子もしくはクロマチンの状態、IL−34遺伝子と遺伝子発現を調節する細胞構成成分との相互作用、IL−34遺伝子産物の発現レベル(例えば、IL−34 RNA発現レベル、IL−34タンパク質発現レベル)、またはIL−34 RNAもしくはタンパク質と転写機構、翻訳機構もしくは翻訳後プロセシング機構との相互作用が挙げられる。IL−34遺伝子産物の活性を指し示すものとしては、これだけに限定されないが、IL−34シグナル伝達活性の評定(例えば、CSF1R活性化またはMAPK1/MAPK3リン酸化の評定)およびIL−34受容体結合(例えば、CSF1R結合)の評定が挙げられる。
IL−34発現シグナルの検出は、in vivo、in vitro、またはex vivoにおける方法によって実現することができる。好ましい実施形態では、本開示の方法は、in vitroで行うことができる。検出方法は、患者の血液、血清、糞便、組織、または細胞における検出を伴い得る。検出は、全組織、組織外植片、細胞培養物、解離細胞、細胞抽出物、または血液もしくは血清を含めた体液におけるIL−34発現シグナルを測定することによって実現することができる。意図されている検出方法としては、IL−34遺伝子産物発現レベルを測定するアッセイ、例えば、ウエスタンブロッティング、FACS、ELISA、他の定量的結合アッセイ、細胞もしくは組織成長アッセイ、ノーザンブロット、定量的もしくは半定量的ポリメラーゼ連鎖反応、医用画像方法(例えば、MRI)、または免疫染色方法(例えば、免疫組織化学的検査または免疫細胞化学的検査)が挙げられる。
本開示を以下の実施例によってさらに例示する。実施例は、例示する目的でのみ提供され、本開示の範囲または内容をいかなる形でも限定するものとは解釈されない。
(実施例1)
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドによりHT−29細胞およびポリ(I:C)により刺激したPBMCにおけるIL−34 mRNA発現が低減する
(実施例1)
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドによりHT−29細胞およびポリ(I:C)により刺激したPBMCにおけるIL−34 mRNA発現が低減する
HT−29細胞におけるIL−34 mRNA発現に対するIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調査した。リポフェクタミン3000(Life Technologies)を使用してIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(表1)をHT−29細胞にトランスフェクトした。HT−29細胞を、それぞれ10%FBSを補充したマッコイ培地およびRPMI1640培地で培養し、漸増濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド(0.5μg/mL、1μg/mL、または2μg/mL)を24時間にわたってトランスフェクトした。IL−34発現を、β−アクチンを参照として使用し、リアルタイムPCR(RT−PCR)によって評価した。
図1Aは、0.5μg/mLのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、および9)をトランスフェクトしたHT−29細胞では無刺激対照(U)と比較してIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。図1Bは、1μg/mLの、配列番号1、2、3、4、5、6、7、および8のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHT−29細胞ではIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。1μg/mLの配列番号9のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞ではIL−34 mRNA発現の低減は観察されなかった。図1Cは、2μg/mLのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、および9)をトランスフェクトしたHT−29細胞ではIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。これらの結果を表2に要約し、そこでは、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHT−29細胞における無刺激対照(U)と比較したIL−34 mRNAの低減の百分率を示している。結果から、試験したIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのトランスフェクションにより、HT−29細胞におけるIL−34 mRNA発現を低減させることができることが実証される(1μg/mLの濃度の配列番号9のアンチセンスオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを例外として)。
ポリ(I:C)で刺激した正常な末梢血単核細胞(PBMC)におけるIL−34 mRNA発現に対するIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調査した。リポフェクタミン3000(Life Technologies)を使用してIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(表1)をPBMCにトランスフェクトした。PBMCを、それぞれ10%FBSを補充したマッコイ培地およびRPMI1640培地で培養し、漸増濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド(0.5μg/mL、1μg/mL、または2μg/mL)を24時間にわたってトランスフェクトした。IL−34発現を、β−アクチンを参照として使用し、RT−PCRによって評価した。PBMCにおけるIL−34発現を誘導するために、細胞を、トランスフェクション後に8mg/mLのポリ(I:C)を用いて6時間にわたって処理した。
図2Aは、0.5μg/mLの、配列番号1、2、3、4、5、6、7、または8のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCにおいて、トランスフェクトしていない、ポリ(I:C)で刺激したPBMC(ポリ)と比較してIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。0.5μg/mLの配列番号9のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現レベルの低減は観察されなかった。図2Bは、1μg/mLのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、および9)をトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。図2Cは、2μg/mLの配列番号1、3、4、5、6、7、および8のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。2μg/mLの配列番号2または9のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現レベルの低減は観察されなかった。ポリ(I:C)で刺激したPBMCにIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを0.5μg/mLおよび1μg/mLの濃度でトランスフェクトした結果を表3に要約し、そこでは、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCにおける、対照(ポリ)と比較したIL−34 mRNAの低減の百分率を示している。結果から、試験したIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのトランスフェクションにより、試験したトランスフェクション濃度のほぼ全てで、ポリ(I:C)で刺激したPBMCにおけるIL−34 mRNA発現を低減させることができることが実証される。
(実施例2)
結腸直腸がん(CRC)腫瘍組織ではIL−34発現が増加する
図2Aは、0.5μg/mLの、配列番号1、2、3、4、5、6、7、または8のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCにおいて、トランスフェクトしていない、ポリ(I:C)で刺激したPBMC(ポリ)と比較してIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。0.5μg/mLの配列番号9のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現レベルの低減は観察されなかった。図2Bは、1μg/mLのIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、および9)をトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。図2Cは、2μg/mLの配列番号1、3、4、5、6、7、および8のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現が低減したことを示す。2μg/mLの配列番号2または9のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCではIL−34 mRNA発現レベルの低減は観察されなかった。ポリ(I:C)で刺激したPBMCにIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドを0.5μg/mLおよび1μg/mLの濃度でトランスフェクトした結果を表3に要約し、そこでは、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした、ポリ(I:C)で刺激したPBMCにおける、対照(ポリ)と比較したIL−34 mRNAの低減の百分率を示している。結果から、試験したIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのトランスフェクションにより、試験したトランスフェクション濃度のほぼ全てで、ポリ(I:C)で刺激したPBMCにおけるIL−34 mRNA発現を低減させることができることが実証される。
結腸直腸がん(CRC)腫瘍組織ではIL−34発現が増加する
IL−34発現の増加が結腸直腸腫瘍組織に関連するかどうかを決定するために、散発性CRCの患者12名の非腫瘍(NT)領域および腫瘍(T)領域から対の結腸外植片を採取した。RT−PCRを実施して、外植片におけるIL−34 mRNA発現レベルを分析した。β−アクチンmRNAレベルを参照として使用してIL−34 mRNAレベルを正規化した。RT−PCR分析の結果が図3に示されている。図3のグラフ上の各点は単一の患者におけるIL−34 mRNA発現レベルを表し、同じ患者に由来する腫瘍組織および非腫瘍組織から収集したデータ点を線で結んでいる。NT欄およびT欄の水平のバーは、各群におけるIL−34 mRNA発現値の中央値を示す。結果から、IL−34発現が、個々の腫瘍組織試料の全てにおいて、同じ患者に由来する非腫瘍組織試料と比較して増加したことが実証される。結果から、腫瘍組織では、CRC患者に由来する非腫瘍組織と比較して、IL−34 mRNAの中央レベル(medial level)が全体とし
て有意に増加したことも実証される(図3;NT対T、p=0.01)。
(実施例3)
散発性CRC腫瘍組織ではIL−34発現が増加する
て有意に増加したことも実証される(図3;NT対T、p=0.01)。
(実施例3)
散発性CRC腫瘍組織ではIL−34発現が増加する
散発性CRC腫瘍組織においてIL−34タンパク質発現が増加するかどうかを決定するために、散発性CRC患者の結腸組織試料を結腸組織の非腫瘍(NT)領域および腫瘍(T)領域から採取し、免疫組織化学的検査によって分析した。凍結組織試料をアイソタイプ対照抗体(IgG)(図4A、上のパネル)またはIL−34抗体(図4A、下のパネル)のいずれかに曝露させた。アイソタイプ対照に曝露させた組織およびIL−34検出用抗体に曝露させた非腫瘍組織では、可視のIL−34抗体シグナルはわずかに示されたか全く示されなかった。IL−34検出用抗体に曝露させた腫瘍組織では、非腫瘍組織およびアイソタイプ対照試料と比較してIL−34抗体シグナルの明らかな増加が示された(図4A)。代表的な顕微鏡写真は、200倍の画像が挿入された40倍の倍率のIL−34検出用抗体およびアイソタイプ対照の染色を示している(図4A)。非腫瘍(NT)組織と比較した、腫瘍(T)組織におけるIL−34陽性細胞の数の定量により、高倍率視野(hpf;すなわち、200×)当たりのIL−34陽性細胞の数の有意な増加が実証された(図4B;n=8名の患者;NT対T、p<0.0001;バーはSEMを表す)。
散発性CRCの患者8名の非腫瘍(NT)領域および腫瘍(T)領域から取得した結腸外植片組織についてELISAも実施してIL−34タンパク質レベルを測定した(図4C)。腫瘍(T)組織におけるIL−34タンパク質濃度の非腫瘍(NT)組織と比較した定量により、腫瘍組織におけるIL−34タンパク質濃度の有意な増加が実証された(図4C;n=8名の患者;NT対T、p=0.002;バーはSEMを表す)。
散発性CRC患者の腫瘍結腸組織においてIL−34タンパク質レベルが増加するかどうかを決定するために、ウエスタンブロッティングも実施した。散発性CRCの患者5名の非腫瘍(NT)領域および腫瘍(T)領域に由来する組織抽出物を含有するウエスタンブロットをプローブするためにIL−34検出用抗体を使用した。ブロットをβ−アクチン抗体でプローブして対照を提供した。図4Dは、IL−34抗体およびβ−アクチン対照抗体でプローブした、散発性CRC患者2名からの腫瘍結腸組織抽出物および非腫瘍結腸組織抽出物の代表的なウエスタンブロットを示す。IL−34抗体でプローブしたウエスタンブロットの分析では、散発性CRC患者からの腫瘍結腸組織において、非腫瘍結腸組織と比較してIL−34抗体シグナルのレベルの明らかな増加が示された。
これらの結果から、散発性CRCの患者の腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較してIL−34タンパク質レベルが有意に増加したことが実証される。
(実施例4)
IL−34により、ERK1/2依存性経路を通じた細胞増殖が誘導される
(実施例4)
IL−34により、ERK1/2依存性経路を通じた細胞増殖が誘導される
IL−34により細胞増殖が刺激されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1がん細胞を、48時間ににわたり、刺激せずにおいたか(Unst)または漸増用量の組換えヒトIL−34タンパク質(25ng/ml、50ng/ml、または100ng/ml)を用いて刺激した。DLD−1細胞増殖を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)染色を用いてフローサイトメトリーによって評価した。50ng/mlおよび100ng/mlでのDLD−1細胞の刺激では、どちらも、無刺激対照試料と比較して細胞増殖の有意な増加がもたらされた(図5A;n=4;50ng/ml対Unst、p=0.006;100ng/ml対Unst、p=0.02;バーはSEMを表す)。これらの結果から、IL−34により、血清を欠乏させたDLD−1細胞の細胞増殖の有意な増加が刺激されたことが実証される。
IL−34により、ERK1/2またはp38依存性経路を介して細胞増殖が刺激されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1細胞を、ERK1/2もしくはp38のいずれかの特異的阻害剤(それぞれPD98059もしくはSB202190)またはビヒクルDMSOと一緒に1時間プレインキュベートし、次いで、組換えヒトIL−34タンパク質を50ng/mLの濃度で用いて48時間にわたって刺激した。DLD−1細胞増殖を、CFSE染色を用いてフローサイトメトリーによって評価した。IL−34タンパク質による、血清を欠乏させたDLD−1細胞の刺激により、ビヒクル単独に曝露させた細胞の増殖と比較して、細胞増殖の有意な増加がもたらされた(図5B;n=4;IL−34+DMSO対DMSO、p=0.01;バーはSEMを表す)。p38遮断薬であるSB202190と一緒にプレインキュベートした細胞のIL−34による刺激により、ビヒクルと一緒にプレインキュベートした無刺激対照と比較して細胞増殖の有意な増加がもたらされたが(IL−34単独に曝露させた細胞の細胞増殖の増加と同等)、ビヒクルと一緒にプレインキュベートし、IL−34単独を用いて刺激した細胞との比較では有意な増加はなかった(図5B、DMSO対IL−34+SB202190、p=0.01;バーはSEMを表す)。しかし、IL−34を用いて刺激し、ビヒクルと一緒にプレインキュベートしたDLD−1細胞の増殖は、ERK1/2遮断薬であるPD98059と一緒にプレインキュベートし、その後、IL−34タンパク質を用いて刺激したDLD−1細胞の増殖よりも有意に大きかった(図5B;DMSO+IL−34対PD98059+IL−34、p=0.006;バーはSEMを表す)。これらの結果から、IL−34タンパク質により、細胞の増殖を、ERK1/2依存性経路を通じて刺激できたことが実証される。
(実施例5)
IL−34により、CRC細胞株におけるTNF−αにより誘導されるアポトーシスが増加する
(実施例5)
IL−34により、CRC細胞株におけるTNF−αにより誘導されるアポトーシスが増加する
IL−34によりCRC細胞のアポトーシスが刺激されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1細胞を、48時間にわたり、刺激せずにおいたか(Unst)または漸増用量の組換えヒトIL−34(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)を用いて刺激した。細胞を、PIおよびAVについてフローサイトメトリーによって分析して、各試料における細胞死のパーセントを決定した。IL−34で刺激した試料において、無刺激対照と比較して細胞死の有意な増加は観察されなかった(図6A;n=4;バーは平均±SEMを表す)。
IL−34によりFasリガンド媒介性細胞死が増強されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1細胞を、48時間にわたり、刺激せずにおいたか(Unst)または組換えヒトIL−34を50ng/mlの濃度で用いて、および/もしくはFasリガンド(Fas L)を200ng/mlの濃度で用いて刺激した。細胞を、PIシグナルおよび/またはAVシグナルについてフローサイトメトリーによって分析して各試料における細胞死のパーセントを決定した。図6Bは、AV+PI+染色、AV+PI−染色、およびAV−PI+染色によって評定した細胞死のパーセントを示す。図6Cは、AV+PI−染色単独で評定した細胞死のパーセントを示す。IL−34およびFasLでのDLD−1細胞の刺激により、FasL刺激単独と比較して、細胞死の有意な増加はもたらされなかった(図6Bおよび6C;n=4;バーは平均±SEMを表す)。
IL−34によりTNFα媒介性細胞死が増強されるかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1細胞を、48時間にわたり、刺激せずにおいたか(Unst)または組換えヒトIL−34を50ng/mlの濃度で用いて、および/もしくはTNFαを100ng/mlの濃度で用いて刺激した。細胞を、PIシグナルおよび/またはAVシグナルについてフローサイトメトリーによって分析して各試料における細胞死のパーセントを決定した。図6Dは、AV+PI+染色、AV+PI−染色、およびAV−PI+染色によって評定した細胞死のパーセントを示す。図6Eは、AV+PI−染色単独で評定した細胞死のパーセントを示す。IL−34およびTNFαでのDLD−1細胞の刺激により、IL−34またはTNFαによる刺激単独のいずれかと比較して細胞死の有意な増加がもたらされた(図6Dおよび6E;n=4;IL−34対IL34+TNFα、p=0.03;TNFα対IL34+TNFα、p=0.05;バーは平均±SEMを表す)。これらの結果から、IL−34により、TNFα単独での刺激によって引き起こされるCRC細胞の細胞死の量を増強することができたことが実証される。
(実施例6)
ヒト散発性CRCではIL−34受容体が増加している
(実施例6)
ヒト散発性CRCではIL−34受容体が増加している
ヒト散発性CRCにおいてIL−34受容体タンパク質の発現が増加するかどうかを決定するために、対照患者(CTR)3名および散発性CRCの患者3名から結腸組織試料を採取し、切片作製し、IL−34受容体であるマクロファージコロニー刺激因子−1受容体(M−CSFR−1)に特異的な抗体またはアイソタイプ対照IgGを用いて染色した。対照アイソタイプIgGで染色した組織切片の顕微鏡写真からは有意なシグナルは示されなかった(図7A、上部のパネル)。M−CSFR−1で染色した、対照患者のパラフィン包埋組織切片(図7A、左下のパネル)では、散発性CRC患者由来の組織切片と比較してより少ない量のM−CSFR−1シグナルが示された(図7A、右下のパネル;顕微鏡写真は、全ての試料の代表である;元の倍率、200倍;挿入図、400倍)。
ヒト散発性CRCにおいてIL−34受容体mRNAの発現が増加するかどうかを決定するために、散発性CRCの患者6名由来の非腫瘍(NT)結腸組織および腫瘍(T)結腸組織から採取した結腸外植片を、M−CSFR−1 mRNA発現についてRT−PCRによって分析した。結腸組織を、代替IL−34受容体PTP−ζをコードするmRNAの発現についても分析した。結果を、β−アクチンmRNAレベルを参照として使用して正規化した。図7Bは、散発性CRCを有する個体6名由来のNT結腸組織およびT結腸組織における正規化されたM−CSFR−1 mRNAレベルを示す。図7Cは、散発性CRCを有する個体6名由来のNT結腸組織およびT結腸組織における正規化されたPTP−ζ mRNAレベルを示す。各グラフ上の同じ患者からのNTデータ点とTデータ点を線で結んでいる。図7Bおよび7Cの各欄の水平のバーは、それぞれ、NT群およびT群のそれぞれにおけるM−CSFR−1 mRNA値の中央値またはPTP−ζ mRNA値の中央値を表す。図7Bは、各個体において、M−CSFR−1 mRNAのレベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して高かったこと、およびM−CSFR−1の中央値レベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かったことを示す(図7B、p=0.01)。図7Cは、各個体において、PTP−ζ mRNAのレベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して高かったこと、およびPTP−ζの中央値レベルが腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かったことを示す(図7C、p=0.03)。
これらの結果から、散発性CRC患者の腫瘍組織ではIL−34受容体のmRNAレベルおよびタンパク質レベルがどちらも増加していることが実証される。
(実施例7)
マクロファージコロニー刺激因子−1はCRC細胞の細胞成長または細胞死に影響を及ぼさない
(実施例7)
マクロファージコロニー刺激因子−1はCRC細胞の細胞成長または細胞死に影響を及ぼさない
M−CSFR−1リガンドであるマクロファージコロニー刺激因子−1(MCSF−1)がCRC細胞成長に影響を及ぼすかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1細胞を、刺激せずにおいたか(Unst)または漸増用量の組換えヒトMCSF−1(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)を用いて刺激した。DLD−1細胞の細胞増殖を、5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)陽性細胞を計数することによって分析した。MCSF−1を用いた刺激後に細胞増殖の有意な増加は検出されなかった(図8A、n=11;バーは平均±SEMを表す)。
血清を欠乏させたDLD−1細胞をまた、刺激せずにおいたか(Unst)または漸増用量の組換えヒトIL−34(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)を用いて刺激した。DLD−1細胞の細胞増殖を、BrdU陽性細胞を計数することによって分析した。全ての濃度で、IL−34による刺激により、無刺激対照と比較して細胞増殖の有意な増加がもたらされた(図8B、n=7;Unst対25ng/ml、p=0.001;Unst対50ng/ml、p=0.001;Unst対100ng/ml、p=0.001;バーは平均±SEMを表す)。
M−CSFR−1リガンドであるマクロファージコロニー刺激因子−1(MCSF−1)がCRC細胞死に影響を及ぼすかどうかを決定するために、血清を欠乏させたDLD−1細胞を、刺激せずにおいたか(Unst)または漸増用量の組換えヒトMCSF−1(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)を用いて刺激した。細胞を、PIシグナルおよび/またはAVシグナルについてフローサイトメトリーによって分析して各試料における細胞死のパーセントを決定した。MCSF−1を用いた刺激後に細胞死の有意な増加は検出されなかった(図8C、n=6;バーは平均±SEMを表す)。
これらの結果から、IL−34とは異なり、M−CSFR−1リガンドであるMCSF−1はCRC細胞の細胞増殖または成長に対して認められるほどの効果を有さないことが実証される。
(実施例8)
HT−29 CRC細胞株はIL−34を高レベルで発現する
(実施例8)
HT−29 CRC細胞株はIL−34を高レベルで発現する
ヒトCRC細胞株におけるIL−34発現を評価するために、DLD−1、HT−29、およびHCT−116ヒトCRC細胞株における、およびNCM−460正常腸上皮細胞株におけるIL−34 mRNA発現をRT−PCRによって分析した。IL−34 mRNA発現レベルを、β−アクチンmRNAレベルを参照として使用して正規化した。図9に示されている通り、IL−34 mRNA発現はHT−29細胞において豊富であった。
(実施例9)
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、IL−34のレベルがノックダウンされ、ERK1/2依存性機構を通じてCRC細胞増殖が阻害される
(実施例9)
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、IL−34のレベルがノックダウンされ、ERK1/2依存性機構を通じてCRC細胞増殖が阻害される
IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドによりDLD−1 CRC細胞株におけるIL−34タンパク質発現を下方制御することができるかどうかを決定するために、DLD−1細胞に、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド(NC AS)またはIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(IL−34 AS;配列番号5のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド)を2μg/mlの濃度で48時間にわたってトランスフェクトした。タンパク質をDLD−1細胞から抽出し、ウエスタンブロットを、IL−34抗体を用いてまたは対照をもたらすためにβ−アクチン抗体を用いてプローブした。IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにより、IL−34抗体シグナルの認められるほどの減少がもたらされた(図10A;4回の実験のうちの1回からの代表的な画像が示されている)。この結果から、IL−34アンチセンスオリゴヌクレオチドによりCRC細胞株におけるIL−34レベルを認められるほどにノックダウンすることができたことが実証される。
DLD−1細胞におけるIL−34レベルの低下により細胞死の増加がもたらされるかどうかを決定するために、DLD−1細胞に、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド(NC AS)またはIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(IL−34 AS;配列番号5のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド)を2μg/mlの濃度で72時間にわたってトランスフェクトした。細胞死の百分率をフローサイトメトリー分析によってAV陽性細胞および/またはPI陽性細胞のパーセントとして評定した。IL−34
AS試料においてNC AS試料と比較してDLD−1細胞死の有意な増加は観察されなかった(図10B;n=4;データは平均±SEMとして表されている)。これらの結果から、IL−34ノックダウンはDLD−1細胞株における細胞死に対して有意な効果を有さなかったことが実証される。
AS試料においてNC AS試料と比較してDLD−1細胞死の有意な増加は観察されなかった(図10B;n=4;データは平均±SEMとして表されている)。これらの結果から、IL−34ノックダウンはDLD−1細胞株における細胞死に対して有意な効果を有さなかったことが実証される。
DLD−1細胞におけるIL−34レベルの低下により細胞増殖の増加がもたらされるかどうかを決定するために、DLD−1細胞に、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチド(NC AS)またはIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド(IL−34 AS;配列番号5のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド)を2μg/mlの濃度で72時間にわたってトランスフェクトした。細胞増殖を、CFSEを用いて染色した後にフローサイトメトリーによって評価した。IL−34 ASを用いたトランスフェクションにより、NC ASでのトランスフェクションと比較してDLD−1細胞増殖の有意な低減がもたらされた(図10C;n=4;NC AS対IL−34 AS、p=0.01;データは平均±SEMとして表されている)。この結果から、IL−34ノックダウンにより、DLD−1細胞増殖が有意に低減したことが実証される。
IL−34ノックダウンがERK1/2タンパク質の発現に影響を及ぼすかどうかを決定するために、DLD−1細胞に、NC ASまたはIL−34 AS(配列番号5のIL−34アンチセンスオリゴヌクレオチド)のいずれかを2μg/mlの濃度で72時間にわたってトランスフェクトした。タンパク質をDLD−1細胞から抽出し、ウエスタンブロットを、IL−34、総ERK1/2(ERK1/2)、リン酸化ERK1/2(pERK1/2)、またはβ−アクチンについてプローブした。IL−34 ASを用いたトランスフェクションにより、IL−34ならびにpERK1/2のレベルの認められるほどのノックダウンがもたらされたが、総ERK1/2ではそうではなかった(図10D;画像は、4回の実験の代表である)。これらの結果から、IL−34ノックダウンにより、DLD−1細胞におけるpERK1/2のレベルの低下も引き起こされたことが実証される。これらの結果から、高レベルのpERK1/2を維持するためにIL−34発現が必要であること、およびCRC細胞増殖に対するIL−34の効果はERK1/2依存性経路を通じて起こり得ることも示唆される。
(実施例10)
大腸炎関連結腸がん腫瘍ではIL−34およびその受容体が発現する
(実施例10)
大腸炎関連結腸がん腫瘍ではIL−34およびその受容体が発現する
大腸炎関連結腸がん(CAC)腫瘍組織においてM−CSFR−1が発現しているかどうかを決定するために、CAC患者3名から採取した腫瘍結腸組織および非腫瘍結腸組織を切片作製し、パラフィンに包埋し、M−CSFR−1抗体を用いて染色した。M−CSFR−1シグナルは、結腸の腫瘍組織において結腸非腫瘍組織と比較してより豊富であるようであった(図11A;40倍の倍率で取得した代表的な顕微鏡写真;挿入図、200倍の倍率)。
CAC腫瘍組織においてIL−34が発現しているかどうかを決定するために、AOMおよびDSSに曝露させることによってCACを誘導した野生型C57BL/6Jマウスから腫瘍結腸組織および非腫瘍結腸組織を採取した。AOM+DSS処置後84日目に屠殺したマウス7匹由来の結腸組織の非腫瘍領域および腫瘍領域から対の外植片を採取し、IL−34 mRNA発現についてRT−PCRによって分析した。IL−34 mRNAレベルをβ−アクチンmRNAレベルに対して正規化した。図11Bは、マウス7匹由来の非腫瘍(NT)結腸組織および腫瘍(T)結腸組織における正規化されたIL−34
mRNAレベルを示す。同じ動物からのNTデータ点とTデータ点を線で結んでいる。各欄の水平のバーは、NT群およびT群におけるIL−34 mRNA値の中央値を表す。IL−34の中央値レベルは、CACマウス由来の腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かった(図11B、p=0.01)。
mRNAレベルを示す。同じ動物からのNTデータ点とTデータ点を線で結んでいる。各欄の水平のバーは、NT群およびT群におけるIL−34 mRNA値の中央値を表す。IL−34の中央値レベルは、CACマウス由来の腫瘍結腸組織において非腫瘍結腸組織と比較して有意に高かった(図11B、p=0.01)。
これらの結果から、IL−34およびその受容体であるM−CSFR−1のレベルがどちらもCAC腫瘍組織において上昇していることが実証される。
(実施例11)
線維狭窄性クローン病ではIL−34発現が上昇している
(実施例11)
線維狭窄性クローン病ではIL−34発現が上昇している
線維狭窄性クローン病(FS CD)に罹患している個体の腸組織においてIL−34
RNA発現が上昇しているかどうかを評価するために、炎症性クローン病(I CD)またはFS CDに罹患していない対照患者(Ileal CTR)5名、I CDの患者5名、およびFS CDの患者5名から回腸生検材料を採取した。各生検材料におけるIL−34 mRNA発現レベルをRT−PCRによって評価した。β−アクチンmRNA発現シグナルを使用してIL−34 mRNAレベルを正規化した。IL−34 mRNA発現レベルはI CD試料およびFS CD試料において対照試料と比較して有意に高かった(図12A;I CD対Ileal CTR、p=0.002;FS CD対Ileal CTR、p=0.03;データは平均±SEMとして表されている)。
RNA発現が上昇しているかどうかを評価するために、炎症性クローン病(I CD)またはFS CDに罹患していない対照患者(Ileal CTR)5名、I CDの患者5名、およびFS CDの患者5名から回腸生検材料を採取した。各生検材料におけるIL−34 mRNA発現レベルをRT−PCRによって評価した。β−アクチンmRNA発現シグナルを使用してIL−34 mRNAレベルを正規化した。IL−34 mRNA発現レベルはI CD試料およびFS CD試料において対照試料と比較して有意に高かった(図12A;I CD対Ileal CTR、p=0.002;FS CD対Ileal CTR、p=0.03;データは平均±SEMとして表されている)。
FS CDに罹患している個体の腸組織においてIL−34タンパク質レベルが防火している上昇しているかどうかを評価するために、I CDまたはFS CDに罹患していない対照患者(Ileal CTR)、I CDの患者、およびFS CDの患者から回腸生検材料を採取した。生検組織のタンパク質抽出物を、IL−34に対する抗体およびローディング対照としてERK1/2に対する抗体を使用してウエスタンブロット分析によって分析した。IL−34タンパク質シグナルは、I CD試料およびFS CD試料において対照試料と比較して高いようであった(図12B;Ileal CTR患者2名、I CD患者2名、およびFS CD患者2名からの抽出物のプローブの結果を示す代表的なブロット)。
FS CDにおいてIL−34タンパク質レベルが上昇しているかどうかをさらに分析するために、正常対照(Ileal CTR)1名およびFS CDに罹患している患者1名から採取した外科的腸試料のパラフィン包埋切片を、IL−34検出用抗体を使用して染色した。染色された切片の分析により、FS CD患者の腸の固有層および間質区画の両方にIL−34陽性細胞が存在することが明らかになった。IL−34陽性細胞の数は、FS CD患者由来の組織切片において対照個体由来の同等の切片よりも多いようであった(図12C;100倍の倍率の顕微鏡写真は、Ileal CTR個体3名およびFS CD患者3名からの画像の代表である)。
FS CDの患者の腸線維芽細胞においてIL−34 mRNAおよびタンパク質発現が上昇しているかどうかを決定するために、対照患者(CTR)5名およびFS CD患者5名から腸線維芽細胞を収集した。線維芽細胞におけるIL−34 RNA mRNA発現をRT−PCRによって評価した。IL−34 mRNA発現レベルを、β−アクチンmRNA発現シグナルを使用して正規化した。RT−PCR分析により、IL−34 mRNA発現レベルがFS CD患者の腸線維芽細胞においてCTR患者と比較して有意に上昇していることが実証された(図12D;CTR対FS CD、p=0.003;データは平均±SEMとして表されている)。CTR患者およびFS CD患者の腸線維芽細胞からの総タンパク質抽出物をウエスタンブロットによって分析した。線維芽細胞抽出物のブロットを、IL−34に対する抗体およびβ−アクチン(ローディング対照)に対する抗体を用いてプローブした。IL−34検出シグナルはFS CD患者の腸線維芽細胞抽出物において対照患者由来の試料と比較して上昇しているようであった(図12E;CTR患者2名およびFS CD患者2名からのプローブした抽出物を示す代表的な画像)。
これらの結果から、IL−34 mRNAおよびタンパク質発現レベルが、FS CDに罹患している患者の回腸組織および個々の腸線維芽細胞の細胞において、健康な患者におけるIL−34 mRNAおよびタンパク質発現レベルと比較して上昇していたことが実証される。これらの結果から、IL−34 mRNAおよびタンパク質発現レベルがI
CDに罹患している患者の回腸組織において、健康な患者におけるIL−34 mRNAおよびタンパク質発現レベルと比較して上昇していたことも実証される。
(実施例12)
炎症性クローン病および線維狭窄性クローン病ではIL−34受容体であるM−CSFR−1の発現が上昇している
CDに罹患している患者の回腸組織において、健康な患者におけるIL−34 mRNAおよびタンパク質発現レベルと比較して上昇していたことも実証される。
(実施例12)
炎症性クローン病および線維狭窄性クローン病ではIL−34受容体であるM−CSFR−1の発現が上昇している
FS CDではIL−34受容体であるM−CSFR−1の発現が上昇しているかどうかを評価するために、正常対照患者(Ileal CTR)5名、I CDに罹患している患者5名、およびFS CDの患者5名から回腸生検材料を採取した。各試料中のM−CSFR−1 mRNAレベルをRT−PCRを使用して評価した。M−CSFR−1 mRNAレベルを、β−アクチンmRNA発現シグナルを使用して正規化した。M−CSFR−1 mRNA発現レベルは、I CD試料およびFS CD試料において対照試料と比較して有意に上昇していた(図13A;Ileal CTR対I CD、p=0.03;Ileal CTR対FS CD、p=0.006;データは平均±SEMとして表されている)。対照患者(Ileal CTR)、I CDに罹患している患者、およびFS CDの患者由来の回腸生検組織のタンパク質抽出物をウエスタンブロットによって分析して、FS CDにおけるM−CSFR−1タンパク質発現のレベルを評価した。回腸生検組織抽出物のブロットを、M−CSFR−1に対する抗体およびERK1/2(ローディング対照)に対する抗体を用いてプローブした。M−CSFR−1検出シグナルはI CD患者の抽出物およびFS CD患者の抽出物において対照患者由来の試料と比較して上昇していると思われた(図13B;Ileal CTR患者2名、I CD患者2名、およびFS CD患者2名からのプローブした抽出物を示す代表的な画像)。
これらの結果から、I CD患者およびFS CD患者の腸組織においてIL−34受容体であるM−CSFR−1のタンパク質発現レベルおよびmRNA発現レベルが上昇していることが実証される。
(実施例13)
IL−34により正常線維芽細胞におけるコラーゲン産生が刺激される
(実施例13)
IL−34により正常線維芽細胞におけるコラーゲン産生が刺激される
IL−34への曝露がコラーゲン産生に影響を及ぼすかどうかを評価するために、対照患者から正常線維芽細胞を単離し、6〜48時間にわたり、処理せずにおいたか(Unst)または組換えヒトIL−34タンパク質に50ng/mlの濃度で曝露させた。6時間後に、1型コラーゲンアルファ1鎖(Col1A1;図14A)およびIII型コラーゲンアルファ1鎖(Col3A1;図14B)mRNAレベルをRT−PCRによって評価した。Col1A1 mRNAレベルおよびCol3A1 mRNAレベルをβ−アクチンmRNA発現シグナルに対して正規化した。Col1A1 mRNA発現レベルはIL−34で処理した試料において無処理の試料と比較して上昇していた(図14A;n=4;データは平均±SEMとして表されている)。Col3A1 mRNA発現レベルは、IL−34で処理した試料において無処理の試料と比較して有意に上昇していた(図14B;Unst対IL−34、p=0.03;n=4;データは平均±SEMとして表されている)。48時間後に、細胞の上清中のコラーゲン分泌をSircolアッセイによって評価した。48時間の時点で、コラーゲンレベルはIL−34で処理した試料において無処理の試料と比較して有意に上昇していた(図14C;Unst対IL−34、p=0.01;n=4;データは平均±SEMとして表されている)。これらの結果から、IL−34により線維芽細胞におけるコラーゲン発現が刺激されたことが実証される。
参照による組み込み
参照による組み込み
本明細書において引用されている特許文書および科学論文のそれぞれの開示全体は、全ての目的に関して参照により組み込まれる。
等価物
等価物
本開示は、その本質的な特性から離れて他の特定の形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている開示に対する限定ではなく、例示的なものとみなされるべきである。本開示の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と同等の意味および範囲の中に入る変化は全て特許請求の範囲に包含されるものとする。
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- 明細書に記載の発明。
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