KR20170031245A - 염증성 장 질환을 진단 및 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

염증성 장 질환을 진단 및 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20170031245A
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Abstract

본원에서는 IL-34의 활성 또는 발현 상승과 연관된 염증성 장 질환을 진단 및/또는 치료하는 방법을 개시한다. 염증성 장 질환을 치료하는 데 유용한 IL-34의 억제제를 함유하는 제약 조성물, 및 염증성 장 질환 치료에서 사용되는 IL-34의 억제제를 함유하는 의약의 제조 또한 개시한다.

Description

염증성 장 질환을 진단 및 치료하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING AND TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISORDERS}
본 발명은 일반적으로 IL-34의 억제제 투여를 통한, 염증성 시토카인 생산과 연관된 염증성 장 질환을 치료하는 방법 뿐만 아니라, 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한, IL-34의 억제제를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IL-34 발현 신호를 검출함으로써 염증성 장 질환을 진단하는 방법도 개시한다.
염증성 장 질환은 미국에서 대략 140 만명의 환자가 앓고 있는 위장관의 만성 염증성 장애이다. 이는 미국에서 가장 일반적인 5대 위장 질병 부담 중 하나로, 전체 건강 관리 비용은 17억을 초과한다. 미국에서는 매년 염증성 장 질환이 700,000회 초과의 의사 방문, 100,000건 초과의 입원 사례, 및 119,000명 초과의 환자에서 장애의 원인이 된다. 현재 의학적 치료 방법은 존재하지 않으며, 이에 질병 관리는 평생 치료를 필요로 한다.
염증성 장 질환 중 가장 흔한 두 형태는 크론병 및 궤양성 결장염이다. 비록 크론병이 위장관 전체를 이환시킬 수 있기는 하지만, 이는 주로 회장 (소장의 원위부 또는 하위 부분) 및 대장을 이환시킨다. 궤양성 결장염은 주로 결장 및 직장을 이환시킨다. 비록 환경적 요인 및 유전적 요인, 이 둘 모두가 염증성 장 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고는 있지만, 상기 질환에 대한 병인에 대해서는 완전히 이해되지 않고 있다. 환경적 구성 요소로는 섭취한 식품과 약물에의 노출에 영향을 받는 소화관의 세균총의 변경을 포함할 수 있다.
염증성 장 질환은 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 심한 경련, 근육 연축, 체중 감소, 영양실조, 발열, 및 빈혈과 연관이 있다. 염증성 장 질환 환자는 또한 피부 병변, 관절 통증, 안구 염증, 및 간 장애로 고생할 수 있으며, 궤양성 결장염을 앓는 소아의 경우, 성장 결함으로 고생할 수 있다. 그보다는 덜 일반적이지만, 환자는 관절염, 괴저성 농피증, 원발성 경화성 담관염, 및 비-갑상선 질병 증후군을 앓을 수도 있다. 비록 치명적인 경우는 거의 없지만, 이들 증상은 환자의 삶의 질을 하락시킨다. 그러나, 일부 경우에서, 독성 거대결장, 장 천공, 및 수술 합병증을 비롯한, 염증성 장 질환의 합병증은 사망에 이르게 할 수 있다. 추가로, 환자는 결장직장암에 걸릴 위험이 증가되어 있으며, 내피 기능 장애 및 관상 동맥 질환을 앓을 가능성이 더 높을 수 있다.
염증성 장 질환 진단 기준은 질환의 병인에 대한 정보가 부족하기 때문에 잘 확립되어 있지 않다. 추가로, 이용가능한 요법에 대한 환자의 반응은 질환의 중증도에 따라 달라지며, 활동성 염증 및 관해의 주기에 따라 달라질 수 있다. 추가로, 염증성 장 질환에 대한 현행 요법들 다수는 바람직하지 못한 부작용과도 연관이 있으며, 다수의 환자를 완화시키는 데 실패하고 있다. 예를 들어, 크론병 환자 중 대략 ¾은 수술이 요구되는데, 그 이유는 이용가능한 약물요법으로는 궁극적으로 질환 증상을 완화시킬 수 없기 때문이다. 그러나, 심지어 수술 이후에도 크론병 증상은 재발할 수도 있다. 유사하게, 궤양성 결장염 환자 중 대략 1/3은 결장절제술을 받는데, 그 이유는 이용가능한 약물로는 완화시키지 못하기 때문이다.
따라서, 신뢰할 수 있는 염증성 장 질환 진단 방법을 확인하는 것이 절실히 요구되고 있다. 부정적인 부작용 또는 염증 및 관해의 주기와 연관이 없는, 광범위한 환자의 증상을 효과적으로 및 영구적으로 완화시키는 치료 방법을 확인하는 것도 추가로 요구되고 있다. 염증성 장 질환 환자 다수가 직면하는 극단의, 및 종종 비효과적인 수술 요법에 대한 대안을 제공하기 위해서는 새로운 치료학적 옵션을 확인하고자 하는 요구 또한 필요하다.
본원에 기술된 본 발명은 염증성 장 질환을 치료 및/또는 진단하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은, 염증성 장 질환에서 IL-34 발현이 상승되어 있고, 염증성 장 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 다른 염증성 시토카인의 발현 증가를 IL-34 발현이 촉진시킨다는 발견을 이용한다. 염증성 장 질환을 평가하는 다른 진단 방법이 제안되어 왔지만, 본 발명은 염증성 장 질환 환자를 진단하고, IL-34 억제제를 이용하는 염증성 장 질환 치료에 대한 환자의 적합성을 결정하는 신규한 방법을 제공한다. 유사하게, 염증성 장 질환에서 치료학적 개입에 대한 다른 잠재적인 표적들이 제안되어 왔지만, 본 발명은 신규한 표적, 즉, IL-34를 억제시킴으로써 염증성 장 질환을 치료하는 신규한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 IL-34를 억제시킴으로써 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 또는 궤양성 결장염을 치료하는 방법을 제공한다. IL-34 억제는 IL-34 유전자 생성물, 예컨대, IL-34 단백질 또는 IL-34 RNA의 발현을 방해하거나, 감소시킴으로써 달성될 수 있다. IL-34 억제는 또한 IL-34 신호전달 활성을 억제시킴으로써 (예컨대, IL-34 단백질 또는 RNA를 격리시킴으로써), IL-34 결합 파트너 또는 수용체 (예컨대, 콜로니 자극 인자 1 수용체 (CSF1R), 이는 또한 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 1 (M-CSFR-1)로도 공지됨)를 격리시킴으로써, IL-34 신호전달에 의해 활성화되는 단백질의 활성을 억제시킴으로써, 또는 다른 세포 성분과 그의 기능적 상호작용에 필요한 IL-34의 특이 모이어티 또는 모이어티들에 결합으로써도 달성될 수 있다. 본 발명은 환자에서 IL-34를 억제시킴으로써 이익을 얻게 되는 방법을 구체적으로 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 염증성 장 질환 치료를 필요로 환자에게 유효량의 IL-34의 억제제를 투여함으로써 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. IL-34의 억제제는 표적화된 방식으로 IL-34 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있는 임의의 시약일 수 있다. 예를 들어, IL-34의 억제제로는 안티센스 IL-34 요법제 (즉, IL-34에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드), 항체 (예컨대, IL-34, IL-34 결합 파트너 또는 IL-34 수용체에 결합하는 항체), 펩티드 억제제 (예컨대, CSF1R 세포외 도메인 전체 또는 그 일부를 포함하는 펩티드), 및 소분자 (예컨대, IL-34, IL-34 유전자 생성물, IL-34 결합 파트너, 또는 IL-34 수용체에 결합하거나, 또는 그를 억제시키는 소분자)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
IL-34에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 예를 들어, 8 내지 40개의 뉴클레오티드 범위의 길이일 수 있고, 분해, 전사체 프로세싱 손상, 또는 단백질 번역 손상을 위해 IL-34 RNA 전사체를 표적화한다. IL-34에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 IL-34 뉴클레오티드 서열 (NCBI 참조 서열 NM_152456.2; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)을 표적화할 수 있다. IL-34의 억제제는 항체, 예컨대, 예를 들어, 전장의 항체, 키메라 항체, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 그의 혼합물일 수 있다. IL-34의 항체 억제제는 예를 들어, IL-34 단백질 서열 (NCBI 참조 서열 NP_689669.2; 서열식별번호: 2) 또는 CSF1R 단백질 서열 (NCBI 참조 서열: NP_005202.2; 서열식별번호: 3)에 대한 항체일 수 있다. IL-34의 억제제는 콜로니 자극 인자 1 수용체의 세포외 도메인 전체 또는 그의 일부, 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_005202.2 (서열식별번호: 4)의 잔기 20-517을 포함하는 펩티드 억제제일 수 있다. IL-34의 억제제는 IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너, 예를 들어, IL-34 상호작용 단백질, 예를 들어 CSF1R에 결합할 수 있는 소분자일 수 있다.
IL-34의 억제제는 IL-34 유전자 또는 유전자 생성물, 즉, IL-34 RNA 또는 IL-34 단백질, 또는 IL-34 유전자 또는 유전자 생성물이 직접적으로 상호작용하는 세포 구성 성분들 중 임의의 것의 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-34의 억제제는 IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너를 격리시키는 항체, 펩티드, 또는 소분자, 또는 IL-34와, IL-34 신호전달에 중요한 다른 상호작용 파트너 사이의 직접적인 상호작용을 막는 방식으로 IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너에 결합하는 항체, 펩티드, 또는 소분자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. IL-34 상호작용 파트너는 IL-34 신호전달을 촉진시키기 위해 IL-34가 직접적으로 상호작용하는 상호작용의 대상이 되는 단백질, 뉴클레오티드, 또는 임의의 다른 세포 또는 세포외 성분일 수 있다. 추가로, IL-34 억제제는 IL-34 신호전달을 촉진시키기 위해 IL-34가 상호작용하는 상호작용의 대상이 되는 임의의 상호작용 파트너의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, IL-34 상호작용 파트너는 IL-34가 직접적으로 상호작용하는 상호작용의 대상이 되는 단백질 복합체의 일부일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, IL-34의 억제제는 IL-34의 수용체, 예컨대, CSF1R의 억제제일 수 있다.
본 발명은 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34를 억제시킴으로써 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 유효량의 IL-34의 억제제를 투여함으로써 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법을 제공한다. 염증성 시토카인으로는 과립구 및 림프구의 동원을 특징으로 하는 세포에서 염증성 반응성의 개시에 도움을 주는 시토카인을 포함한다. 염증성 시토카인의 예로는 IL-1, IL-6, IL-8, 및 TNF-알파를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 염증성 시토카인 (예컨대, IL-6, IL-8, 및 TNF-알파)의 생산은 IL-34 발현 증가 또는 IL-34 신호전달 증가의 결과로서 증가한다. 본 발명은 이러한 예상 밖의 발견에 영향을 미침으로써 염증성 장 질환 환자의 세포에서 IL-34 발현 및/또는 활성을 억제시킴으로써 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 염증성 시토카인 생산 억제가 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시키는 것인, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 유효량의 IL-34의 억제제를 투여함으로써, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시키는 방법을 제공한다. 염증성 반응은 염증성 시토카인의 발현, 혈액으로부터 면역계에 의해 염증성 신호가 검출되는 조직으로의 혈장 및 백혈구의 이동, 및 환부 조직의 팽윤 또는 염증을 특징으로 할 수 있다.
IL-34 억제는 IL-34가 발현될 수 있거나, 또는 활성화될 수 있는 임의의 세포에서, 또는 IL-34 신호전달이 활성화될 수 있거나, 증가될 수 있거나, 또는 변경될 수 있는 임의의 세포에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, IL-34는, 위장관 세포, 예컨대, 결장 점막 세포 또는 회장 점막 세포, 예를 들어, 결장 또는 회장 고유층 단핵 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, IL-34를 발현하는 세포에서 억제될 수 있다. 추가로, IL-34 억제는 IL-34과, IL-34 수용체 (예컨대, CSF1R)를 발현하는 세포, 예컨대, 골수 세포, 단핵구, 또는 대식세포의 상호작용을 억제시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 IL-34의 억제제를 투여함으로써, 염증성 장 질환 치료를 필요로 하는 환자에서 IL-34 발현이 변경된 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 변경된 IL-34 발현과 연관된 염증성 장 질환은 증가된 IL-34 발현 증가와 상관관계가 있다. 따라서, IL-34의 억제제는 염증성 장 질환을 앓는 환자에서 IL-34 발현 또는 활성의 수준을 감소시키는 데 유용하다. 일반적으로, 유효량의 IL-34 억제제 투여가 IL-34 활성 또는 발현을 활동성 염증성 장 질환 상태와 연관된 수준보다 더 낮은 수준으로 감소시킨다.
본 발명은 또한 IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제의 투여를 통해 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 염증성 장 질환 치료를 필요로 하는 환자에게 투여되는 IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제의 투여를 통해 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제는 투여하는 데 안전하고, 동물, 특히, 인간에 의해 용인되는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있는 제제를 포함한다. 상기 제제는 또한 제제 중에 포함되어 있는 임의의 활성 작용제 또는 작용제들을 의도하는 질환 치료 부위로 전달하는 데 있어서도 유효하여야 한다. IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제의 투여를 필요로 하는 환자로는 염증성 장 질환을 앓는 환자 (예컨대, 염증성 장 질환 진단을 받은 환자), 염증성 장 질환 발병 위험이 있는 환자 (예컨대, 염증성 장 질환 발병 위험이 높은 것으로 진단받은 환자), 염증성 장 질환에 대한 예방적 처치를 받는 환자, 현재 염증성 장 질환 치료를 받고 있는 환자, 또는 염증성 장 질환이 호전된 환자, 또는 염증성 장 질환이 호전되었지만, 재발한 환자를 비롯한, 염증성 장 질환이 효과적으로 치료, 호전되거나, 또는 그의 중증도가 감소된 환자를 포함한다.
본 발명은 또한 IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있는 염증성 장 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 예를 들어, 염증성 장 질환을 치료하는 방법, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시키는 방법, 또는 염증성 장 질환 치료를 필요로 하는 환자에서 IL-34 발현 변경과 연관된 염증성 장 질환을 치료하는 방법은 IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명은 염증성 장 질환 치료용 의약 제조에서의 IL-34의 억제제의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제를 제공한다.
본 발명은 또한 염증성 장 질환을 앓는 환자에서 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 데 사용하기 위한 IL-34의 억제제를 제공한다.
염증성 시토카인 생산을 억제시키는 데 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34 매개 염증성 반응을 감소시키거나, 또는 억제시킨다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34 매개 염증성 반응을 감소시키거나, 또는 억제시킨다.
적합하게는, 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 IL-34 억제제의 제약상 허용되는 제제로서 제제화된다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제는 그를 필요로 하는 환자에게 투여하기 위한 것이다.
본 발명은 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34 매개 염증성 반응을 감소시키거나, 또는 억제시키는 데 사용하기 위한 IL-34 억제제를 제공한다.
본 발명은 또한 IL-34 발현과 연관된 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제를 제공한다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34 억제제는 IL-34 수용체의 억제제일 수 있다. IL-34의 수용체는 콜로니 자극 인자 1 수용체일 수 있다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 IL-34에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 길이는 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 항체일 수 있다. 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 항체는 전장의 항체, 키메라 항체, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 항체는 IL-34 단백질 서열 (서열식별번호: 2) 또는 콜로니 자극 인자 1 수용체 단백질 서열 (서열식별번호: 3)에 대한 항체일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 펩티드 억제제일 수 있다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 펩티드 억제제는 콜로니 자극 인자 1 수용체의 세포외 도메인의 일부분 (서열식별번호: 4)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로 투여하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물은 IL-34에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 길이는 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물은 IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 상기 IL-34의 억제제는 항체일 수 있다. 항체는 전장의 항체, 키메라 항체, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물은 IL-34 단백질 서열 (서열식별번호: 2) 또는 콜로니 자극 인자 1 수용체 단백질 서열 (서열식별번호: 3)에 대한 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물은 IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 억제제는 펩티드 억제제이다. 펩티드 억제제는 콜로니 자극 인자 1 수용체의 세포외 도메인의 일부분 (서열식별번호: 4)을 포함할 수 있다
본 발명에 따른 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물은 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로 투여하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 IL-34의 억제제는 예를 들어, 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물은 예를 들어, 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 IL-34의 억제제, 또는 IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 방법을 포함한다. 본 발명에 따라, IL-34의 억제제는 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로 투여될 수 있다. 유사하게, IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물은 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로 투여될 수 있다. 투여 경로는 사용 방법, 질환 상태, 및 치료를 수행하는 개인 (예컨대, 의사)의 전문 기술 뿐만 아니라, 다른 인자에 의존할 수 있다.
본 발명은 또한 IL-34 발현 신호 평가를 통해 염증성 장 질환 환자를 진단하는 데 유용한 진단 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 환자의 하나 이상의 생물학적 샘플 중에서 IL-34 발현 신호 수준을 검출함으로써 염증성 장 질환 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 환자의 하나 이상의 생물학적 샘플 중 IL-34 발현 신호 수준을 검출함으로써 염증성 장 질환을 앓는 환자가 IL-34의 억제제를 이용하는 치료에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시양태에서, IL-34 발현 신호는 펩티드, 단백질, 또는 RNA 신호일 수 있다. IL-34 발현 신호는 IL-34 유전자 발현, 또는 유전자 생성물 활성의 임의의 지표를 포함할 수 있다. 평가될 수 있는 IL-34 유전자 발현의 지표로는 IL-34 유전자 또는 염색질 상태, 유전자 발현을 조절하는 세포 성분과 IL-34 유전자의 상호작용, IL-34 유전자 생성물 발현 수준 (예컨대, IL-34 RNA 발현 수준, IL-34 단백질 발현 수준), 또는 전사, 번역 또는 번역 후 프로세싱 기구와 IL-34 RNA 또는 단백질의 상호작용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. IL-34 유전자 생성물 활성의 지표로는 IL-34 신호전달 활성 평가 (예컨대, CSF1R 활성화 또는 MAPK1/MAPK3 인산화 평가), 및 IL-34 수용체 결합 (예컨대, CSF1R 결합) 평가를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. IL-34 발현 신호 검출은 생체내, 시험관내, 또는 생체외 방법을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 조직 샘플, 세포 샘플, 혈청 샘플, 또는 대변 샘플일 수 있다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 환자에서 IL-34 발현 또는 활성의 절대 수준 또는 상대 수준을 검정하는 데 유용한 환자 또는 적합한 대조군 환자 (즉, 염증성 장 질환을 앓지 않는 개체)로부터 채취된 임의의 샘플일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 환자의 위장관으로부터 채취된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, IL-34 발현 신호를, 1명 이상의 염증성 장 질환을 앓지 않는 환자의 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플, 1명 이상의 염증성 장 질환을 앓는 환자의 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플, 및/또는 1명 이상의 염증성 장 질환에 대하여 치료받은 환자의 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플로부터의 IL-34 발현 신호와 비교한다. 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플은 같은 환자, 같은 기관, 다른 환자의 동일한 기관으로부터, 또는 일반적으로는 같은 또는 다른 환자의 신체 같은 위치로부터 채취된 세포, 조직, 혈청, 또는 혈액 샘플이다. 예를 들어, 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플은 상이한 두 환자 (즉, 염증성 장 질환 진단을 받고자 하는 환자 또는 염증성 장 질환을 앓는 환자 및 염증성 장 질환을 앓지 않는 환자, 염증성 장 질환을 앓는 또 다른 환자, 또는 염증성 장 질환 치료를 받은 환자)의 위장관 (예컨대, 회장, 결장, 또는 직장)의 특정 부위로부터 채취될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 치료가 IL-34 발현 신호에 미치는 효과를 평가함으로써 염증성 장 질환을 앓는 환자의 치료 효능을 모니터링하는 데에도 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플은 IL-34의 억제제를 이용한 치료 이전 및 이후의 같은 환자로부터 유래된 것이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 적어도 1종의 생물학적 샘플을 수득할 때, 환자는 적어도 1종의 IL-34의 억제제를 받게 된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 염증성 장 질환을 앓는 환자가 치료된다. 환자는 염증성 장 질환을 앓는 임의의 동물, 바람직하게, 포유동물, 바람직하게, 인간일 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 하기: 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염 중 임의의 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 크론병이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염이다.
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도 1A는 대조군 환자 (결장 CTR), 궤양성 결장염 환자 (UC), 및 크론병 환자 (결장 CD)로부터의 결장 생검에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프를 보여주는 것이고; 도 1B는 대조군 환자 (회장 CTR) 및 크론병 환자 (회장 CD)로부터의 회장 생검에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프를 보여주는 것이고; 도 1C는 대조군 환자 (CTR), 요법을 받지 않은 염증성 장 질환 환자 (w/o 요법), 또는 메살라민 (5-ASA), 스테로이드제 (CS), 또는 면역조절제 (ISS)를 받은 염증성 장 질환 환자로부터의 결장 생검에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프를 보여주는 것이고; 도 1D는 9명의 개별 염증성 장 질환 환자의 점막의 침범 (Involv) 또는 비침범 부위 (Uninv)로부터 채취된 점막에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프를 보여주는 것이다.
도 2A는 3명의 대조군 환자 (CTR), 및 각 3명씩의 궤양성 결장염 (UC) 또는 크론병 (CD) 환자의 결장 점막 세포로부터의 전체 단백질 추출물 중에서의 IL-34 (상단 패널) 및 β-액틴 (하단 패널) 발현 신호를 보여주는 웨스턴 블롯이고; 도 2B는 3명의 대조군 환자 (회장 CTR) 및 3명의 크론병 환자 (회장 CD)의 회장 점막 세포로부터의 전체 단백질 추출물 중에서의 IL-34 (상단 패널) 및 β-액틴 (하단 패널) 발현 신호를 보여주는 웨스턴 블롯이고; 도 2C는 대조군 IgG (IgG), 또는 대조군 (CTR), 궤양성 결장염 (UC), 또는 크론병 (CD) 환자로부터 채취된 IL-34 항체로 염색된 결장 조직 절편을 100X 배율로 촬영한 현미경 사진 (좌측), 및 IL-34 염색된 CTR, UC, 또는 CD 결장 조직 절편에서 고배율 시야당 IL-34 양성 세포의 개수 (IL-34+ 세포/hpf)를 나타내는 막대 그래프 (우측 패널)를 보여주는 것이고; 도 2D는 대조군 (회장 CTR), 또는 크론병 (회장 CD) 환자로부터 채취된 IL-34 항체로 염색된 회장 조직 절편을 100X 배율로 촬영한 현미경 사진 (좌측), 및 IL-34 염색된 회장 CTR 및 회장 CD 조직 절편에서 고배율 시야당 IL-34 양성 세포의 개수 (IL-34+ 세포/hpf)를 나타내는 막대 그래프 (우측 패널)를 보여주는 것이다.
도 3A는 실시간 PCR에 의해 분석된, 9명의 대조군 (결장 CTR), 14명의 UC 환자, 및 8명의 CD 환자로부터 채취된 결장 생검에서의 CSF1R mRNA 발현을 보여주는 막대 그래프이다. CSF1R 수준은 β-액틴 수준으로 정규화하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되어 있다. 도 3B는 1명의 대조군 (CTR) 환자, 1명의 CD 환자, 및 1명의 UC 환자로부터의, 이소형 대조군 (IgG) 또는 CSF1R 항체 염색된 파라핀-포매된 결장 조직 절편의 대표적인 현미경 사진 (100x 원래 배율)을 보여주는 것이다.
도 4A는 실시간 PCR에 의해 평가된, DLD-1, HCT-116, HT-29, 및 NCM-460에서의 CSF1R mRNA 발현을 보여주는 막대 그래프이고, 여기서, 발현 수준은 β-액틴 발현 수준으로 정규화되었다. 도 4B는 DLD-1, HCT-116, NCM-460 및 HT-29 세포로부터 채취된 전체 단백질 추출물에서의 CSF1R 및 β-액틴 신호를 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다.
도 5A는 자극 없이 (UNST), 또는 20 ng/ml의 TNF-알파 (TNF-α), 50 ng/ml의 IL-6 (IL-6), 또는 100 ng/ml의 인터페론-감마 (IFN-γ)의 존재하에서 6시간 경과 후의, 실시간 PCR에 의해 측정된, 결장 점막 외식편에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프를 보여주는 것이고; 도 5B는 실시간 PCR에 의해 측정된, 인플릭시맙 (레미케이드(Remicade)®) 처리 이전 (PRE) 및 그 이후 (POST)의 개별 IBD 환자로부터 채취된 결장 조직 생검에서의 IL-34 RNA 발현 수준을 나타내는 그래프를 보여주는 것이고; 도 5C는 24시간 동안 대조군 IgG (IgG) 또는 TNF-알파 억제제 인플릭시맙 (레미케이드®, (IFX))에 노출된 염증성 장 질환 환자로부터의 결장 점막 외식편 (IBD 외식편)에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 그래프를 보여주는 것이고; 도 5D는 18시간 동안 대조군 IgG (IgG) 또는 인플릭시맙 (레미케이드®, (IFX))에 노출된 염증성 장 질환 환자로부터 수거된 결장 고유층 핵 세포 (IBD LPMC)에서의 IL-34 mRNA 발현을 나타내는 그래프를 보여주는 것이다.
도 6은 무자극 (Unst) 또는 25 ng/ml, 50 ng/ml, 또는 100 ng/ml의 재조합 인간 IL-34에의 노출 6시간 경과 후, 정상 결장 고유층 단핵 세포에서 관찰된 TNF-알파 (도 4A, TNF-a), IL-8 (도 4B, IL-8), 또는 IL-6 (도 4C, IL-6) mRNA 발현 수준을 보야주는 막대 그래프 시리즈를 나타낸 것이다.
도 7, 패널 A-I는 무자극 상태로 방치하였거나 (Unst), 또는 1.5시간, 3시간, 또는 6시간 동안 50 ng/ml의 인간 재조합 IL-34로 자극시킨, 혈청이 고갈된 DLD-1 세포에서의 개별 케모카인의 mRNA 발현을 보여주는 것이다. CCL2 (도 7A), CCL3 (도 7B), CCL5 (도 7C), CCL17 (도 7D), CCL20 (도 7E), CCL24 (도 7F), CCL25 (도 7G), CXCL9 (도 7H), 및 CXCL10 (도 7I) RNA 전사체를 실시간 PCR에 의해 분석하고, 발현 수준은 β-액틴 mRNA 수준으로 정규화하였다. 6회의 독립 실험에 대한 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되어 있다. 도 7J는 무자극 상태로 방치된, 또는 3시간 동안 25 ng/ml, 50 ng/ml, 또는 100 ng/ml IL-34의 존재하에서 배양된 DLD-1 세포에서의 CCL20 mRNA 발현을 보여주는 막대 그래프이다. CCL20 mRNA 전사체 발현을 실시간 PCR에 의해 분석하고, 발현 수준은 β-액틴 mRNA 수준으로 정규화하였다. 6회의 독립 실험에 대한 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되어 있다.
도 8A는 비처리된 (Unst) 또는 5분 (5'), 10분 (10'), 15분 (15'), 30분 (30'), 또는 60분 (60') 동안 50 ng/ml의 IL-34로 처리된, 혈청이 고갈된 DLD-1 세포의 추출물에서의 전체 개별 MAP 키나제 (ERK1/2, p38, JNK) 및 인산화된 MAP 키나제 단백질 분획 (p-ERK1/2, p-p38, p-JNK)의 웨스턴 블롯을 보여주는 것이고; 도 8B는 ERK1/2 (PD98059) 또는 p38 (SB202190)의 특이적인 억제제 또는 디메틸 술폭시드 (Dmso)와 함께 1시간 동안 미리 인큐베이션된 후, 이어서, 48시간 동안 50 ng/mL의 IL-34로 자극을 받은, 혈청이 고갈된 DLD-1 세포로부터의 무세포 상청액 중에서의 CCL20 단백질 발현 (ELISA에 의해 평가)을 보여주는 막대 그래프이다. 6회의 독립 실험에 대한 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되어 있다.
염증성 장 질환
본 발명은 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "염증성 장 질환"이란, 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염을 비롯한, 다수의 만성 염증성 질환을 지칭한다. 크론병 및 궤양성 결장염이 염증성 장 질환 중 가장 일반적인 두 형태이다. 염증성 장 질환은 소화기 계통의 자가면역 질환이다. 크론병은 회장 말단부를 비롯한, 위장관의 임의 부위로 국재화될 수 있고, 위장관의 모든 세포 유형에 영향을 줄 수 있다. 궤양성 결장염은 결장 및 직장으로 국재화되며, 이는 오직 점막 세포에만 영향을 미친다.
환경적 요인 및 유전적 요인, 이 둘 모두, 비록 상기 요인의 아이덴티티가 잘 정의되어 있지는 않지만, 염증성 장 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 환경적 구성 요소로는 섭취한 식품과 약물에의 노출에 영향을 받는 소화관의 세균총의 변경을 포함할 수 있다.
염증성 장 질환은 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 심한 경련, 근육 연축, 체중 감소, 영양실조, 발열, 빈혈, 피부 병변, 관절 통증, 안구 염증, 간 장애, 관절염, 괴저성 농피증, 원발성 경화성 담관염, 및 비-갑상선 질병 증후군을 비롯한 증상과 연관이 있다. 궤양성 결장염을 앓는 소아의 경우, 성장 결함으로 고생할 수 있다.
치료 및 평가
본원에 기술된 바, "환자"란, 염증성 장 질환의 위험이 있거나, 그를 앓거나, 또는 그에 대한 진단을 받은, 포유동물, 영장류, 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 동물을 의미한다. 특정 실시양태에서, 환자는 비-인간 포유동물, 예컨대, 예를 들어, 고양이, 개, 또는 말일 수 있다. 환자는 염증성 장 질환의 발병 위험이 높은 것으로 진단을 받은 개체, 염증성 장 질환을 진단받은 사람, 이미 염증성 장 질환을 앓은 사람, 또는 염증성 장 질환의 증상 또는 적응증, 예를 들어, IL-34 발현 신호에 대해 평가받은 개체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "필요로 하는 환자"란, 염증성 장 질환의 증상 또는 징후 중 임의의 것을 앓는 환자, 염증성 장 질환의 증상 또는 징후 중 임의의 것을 앓을 수 있는 환자, 또는 염증성 장 질환 치료를 위해 본 발명의 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 환자를 지칭한다. 필요로 하는 환자는 염증성 장 질환 발생 위험이 있는 것으로 진단받은 환자, 과거에 염증성 장 질환을 앓았던 환자, 또는 이미 염증성 장 질환 치료를 받은 적이 있는 환자를 포함할 수 있다. IL-34 발현 또는 활성 수준 증가와 연관된 염증성 장 질환을 앓는 개체가 특히 연관이 있다.
본원에서 사용되는 바, "치료하다," 치료," "치료하는"이라는 용어 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는다는 것을 의미한다. 상기 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적인 것일 수 있고/거나, 질환, 및/또는 질환에 기인하는 유해한 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 점에서 치료적인 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "치료"라는 용어는 포유동물, 특히, 인간에서의 질환에 대한 임의의 치료를 포괄하고, (a) 상기 질환에 잘 걸릴 수 있지만, 아직 그를 앓는다는 진단을 받지는 않는 대상체에서 질환 발생을 예방하는 것; (b) 질환을 억제시키는 것, 즉, 질환의 중증도 또는 범주 증가를 막는 것; (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환을 부분적으로 또는 완전히 호전시키는 것, 또는 (d) 질환의 재발을 예방하는 것, 즉, 질환이 이전의 질환 증상에 대한 성공적인 치료 또는 질환의 치료 이후 활동성인 상태로 복귀하지 못하도록 예방하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "유효량"이란, 환자에게 투여되었을 때, 병태를 적어도 부분적으로 치료하는 데 충분한 작용제의 양을 의미한다. 치료학상 유효량은 병태의 중증도, 성분의 투여 경로, 치료받는 환자의 연령, 체중 등에 의존하여 달라질 것이다. 따라서, IL-34의 억제제의 유효량은 작용제의 투여가 대상체에서 염증성 장 질환의 발생을 예방하거나, 염증성 장 질환 진행을 막거나 (예컨대, 염증성 장 질환의 증상, 예컨대, 직장 출혈, 빈혈, 또는 위장 염증의 발병 또는 중증도 증가를 막거나), 또는 염증성 장 질환의 모든 관련 증상들을 완화시키거나, 또는 완전히 호전시키도록, 즉, 질환을 퇴행시키도록 환자에서 염증성 장 질환을 치료하는 데 필요한 억제제의 양이다.
치료 효능은 염증성 장 질환과 연관된 전반적인 증상을 평가함으로써, 조직학적 방법, 생화학적 검정법, 영상화 방법, 예컨대, 예를 들어, 자기 공명 영상 또는 다른 공지된 방법에 의한 조직 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료 효능은 IL-34 억제제를 염증성 장 질환을 앓는 환자에게 투여한 이후에, 질환의 전반적인 증상, 예컨대, 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 경련, 근육 연축, 체중 감소, 영양실조, 발열, 빈혈 또는 염증성 장 질환과 연관된 전반적인 병적 이상의 다른 측면의 변화를 분석함으로써 평가될 수 있다.
치료 효능은 또한 예를 들어, 조직 생검 (예컨대, 위장 조직 생검)을 수득하고, 전반적인 조직 또는 세포 형태 또는 염색 특성을 평가함으로써 조직 또는 세포 수준에서 평가될 수 있다. 단백질 또는 RNA 발현을 조사하는 생화학적 검정법 또한 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역세포화학, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 또는 노던 블롯팅 방법, 또는 RNA 수준을 평가하는 데 유용한 방법, 예컨대, 정량적 또는 반정량적 중합효소 연쇄 반응을 통해 해리된 세포 또는 비해리된 조직에서 IL-34, IL-6, IL-8, TNF-알파, 또는 염증성 장 질환, 염증성 시토카인 생산, 또는 IL-34 매개 염증성 반응을 나타내는 또 다른 단백질 또는 유전자 생성물의 수준을 평가할 수 있다. 질환 상태 및 치료 효능을 평가하기 위해 대변, 혈장 또는 혈청 중에서 발견되는 유용한 바이어마커의 발현의 존재 여부 또는 수준도 또한 평가할 수 있다.
치료 효능을 평가하는 데 있어서, 유효한 평가를 보장하기 위해 적합한 대조군을 선택할 수 있다. 예를 들어, IL-34의 억제제 투여 이후 염증성 장 질환 환자에서 평가된 증상을 같은 환자에서 치료 이전에, 또는 치료 과정에서 조기 시점에 또는 염증성 장 질환 진단을 받지 않은 또 다른 환자에서의 상기 증상과 비교할 수 있다. 대안적으로, IL-34 억제제 투여 후 위장 조직의 생화학적 또는 조직학적 분석의 결과를 같은 환자로부터의 또는 염증성 장 질환 진단을 받지 않은 개체로부터의 또는 IL-34 억제제 투여 이전의 같은 환자로부터의 위장 조직의 것과 비교할 수 있다. 추가로, IL-34 억제제 투여 이후 혈액, 혈청, 세포 또는 대변 샘플을 염증성 장 질환 진단을 받지 않은 개체로부터의 또는 IL-34 억제제 투여 이전의 같은 환자로부터의 유사 샘플과 비교할 수 있다.
IL-34 억제 확인은 IL-34 발현 수준 또는 활성을 직접 또는 간접적으로 평가함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, IL-34 단백질 또는 RNA 발현을 측정하는 생화학적 검정법은 전반적인 IL-34 억제를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯에 의해 위장 조직에서의 IL-34 단백질 수준을 측정함으로써 전반적인 IL-34 수준을 평가할 수 있다. 또한 노던 블롯 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 IL-34 mRNA 수준을 측정함으로써 전반적인 IL-34 억제를 측정할 수 있다. 또한 면역세포화학적 또는 면역조직화학적 방법을 통해 해리된 세포, 비해리된 조직, 혈액, 혈청, 또는 대변에서 IL-34 단백질 수준 또는 IL-34 신호전달 활성을 나타내는 또 다른 단백질의 수준을 평가할 수 있다.
IL-34 억제는 또한 파라미터, 예컨대, 대식세포 또는 단핵구 생성 또는 증식을 측정함으로써, 또는 MAP 키나제 인산화, 및 CSF1R 신호전달 활성화의 다른 인디케이터를 비롯한, IL-34 활성 변화와 상관관계가 있는 다른 파라미터의 변경을 측정함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, IL-34 억제제로 치료받은 환자의 세포에서의 IL-34 활성의 지표로서 상기 세포에서 활성 MAPK1 또는 MAPK3 인산화 수준을 측정할 수 있다. 또한, 혈장 혈액, 대변 또는 조직에서 발견되는 유용한 바이오마커의 발현의 존재 또는 수준을 평가하여 IL-34 억제의 효능을 평가할 수 있다.
본원에 개시된 치료 방법은 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법을 포함한다. "염증성 시토카인 생산"이란, 염증성 시토카인 반응을 개시 및/또는 촉진시키는 시토카인의 발현을 의미한다. "염증성 시토카인 반응"이란, 과립구 동원, 림프구 동원, 전신 염증 (특히, 위장관 또는 그의 일부 또는 일부분들의 염증), 발열, 조직 파괴, 쇼크, 및/또는 사망을 특징으로 할 수 있는 면역 반응을 의미한다. 염증성 시토카인 반응은 개별 시토카인의 그의 동족 세포 표면 수용체에의 결합 (예컨대, CSF1R에의 IL-34 결합), 및 이어서, 세포 기능 및 유전자 발현을 변경시키는 세포내 신호전달의 캐스케이드를 특징으로 할 수 있다. 염증성 시토카인으로는 IL-1, IL-6, IL-8, IL-34, 및 TNF-알파를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 염증성 시토카인의 발현은 대식세포, 단핵구, 단핵 세포 고유층, 또는 위장관의 다른 세포, 또는 면역계의 세포에서 발생할 수 있다. 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법은 염증성 장 질환을 앓는 환자에서 염증성 시토카인 중 일부 또는 그 모두의 발현 수준을 감소시키는 방법을 포함한다. 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법은 또한 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 염증성 시토카인 중 일부 또는 그 모두의 발현 수준을 감소시키는 방법을 포함한다.
염증성 시토카인 생산을 억제시키는 본 발명의 방법은 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시키는 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "IL-34 매개 염증성 반응"은 IL-34 발현 또는 IL-34 신호전달 활성에 의해 개시, 가속화, 또는 촉진되는 염증성 반응을 의미한다. IL-34 매개 염증성 반응은 IL-34, IL-6, IL-8, 또는 TNF-알파를 포함하나, 이에 제한되지 않는 염증성 시토카인의 발현, 및 염증성 시토카인 신호전달의 활성화를 초래할 수 있다. 추가로, IL-34 매개 염증성 반응은 과립구 동원, 림프구 동원, 전신 염증 (특히, 위장관 또는 그의 일부 또는 일부분들의 염증), 발열, 조직 파괴, 쇼크, 및/또는 사망을 특징으로 할 수 있다. IL-34 매개 염증성 반응은 또한 IL-34 신호전달의 활성화, 예를 들어, IL-34의 CSF1R에의 결합, 및 하류 MAP 키나제의 인산화를 특징으로 할 수 있다. IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시킨다는 것은 IL-34 매개 염증성 반응과 연관된 세포 및 전신 변화 중 임의의 것 또는 그들 모두를 경감시킨다는 것을 의미한다. 예를 들어, 염증성 시토카인 생산, 면역 세포 동원, 또는 조직 염증 감소가 IL-34 매개 염증성 반응의 감소 또는 억제를 나타낼 것이다.
본 발명은 또한 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34를 억제시키는 방법을 제공한다. IL-34는 위장관 세포, 면역계 세포, 및 혈액 세포를 비롯한, IL-34 발현 또는 활성이 일어나는 임의의 세포에서 억제될 수 있다. 위장관 세포 (위, 십이지장, 공장, 회장, 결장, 직장 및 항문관 세포 포함)는 원주 상피 세포, 점막 상피 세포, 효소원 세포, 목 점액 세포, 벽 세포, 가스트린 세포, 배상 세포, 파네트 세포, 올리고 점액 세포, 및 융모 흡수 세포를 포함한다. 면역계 세포로는 백혈구, 포식세포 (예컨대, 대식세포, 호중구, 및 수지상 세포), 단핵구, 비만 세포, 호산구, 호염구, 자연살 세포, 선천 세포, 림프구, B 세포, 및 T 세포를 포함한다. 혈액 세포로는 적혈 세포 (적혈구) 및 백혈 세포 (백혈구, 단핵구, 및 혈소판)를 포함한다.
IL-34 억제
본 발명은 IL-34를 억제시키는 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "IL-34를 억제시킨다"는 것은 IL-34 발현 또는 활성을 완전히 또는 부분적으로 감소시키는 것을 의미한다. 따라서, IL-34를 억제시킨다는 것은 IL-34 유전자 또는 염색질 상태를 변경시키거나, 또는 유전자 전사 조절인자와의 상호작용 변경 또는 IL-34 유전자 생성물, 예컨대, IL-34 RNA, IL-34 단백질, 또는 IL-34의 펩티드 서열의 발현을 완전히 또는 부분적으로 감소시키는 유전자 접근성의 변경을 의미할 수 있다. IL-34를 억제시킨다는 것은 또한 IL-34 전사, IL-34 RNA 프로세싱, IL-34 단백질 번역, 또는 IL-34 번역 후 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는, IL-34 유전자 생성물 발현에 중요한 프로세스를 억제시키는 것을 의미할 수 있다. 추가로, IL-34를 억제시킨다는 것은 IL-34의 펩티드, IL-34의 뉴클레오티드 생성물 (예컨대, IL-34 mRNA), 및 IL-34 단백질을 비롯한 IL-34 유전자 생성물의 활성을 억제시키는 것을 의미할 수 있다. IL-34 유전자 생성물의 활성을 억제시키는 것은 IL-34 신호전달, 또는 핵, 세포소기관, 세포질, 막, 및 세포외 성분을 비롯한 다른 세포 성분 (예컨대, 단백질, 펩티드, DNA, RNA, 지질, 또는 신호전달 분자)과 IL-34의 직접 또는 간접적인 상호작용의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-34 활성을 억제시키는 것은 IL-34 결합 또는 CSF1R의 활성화를 억제시키는 것 또는 CSF1R 하류 신호전달 효과 (예컨대, MAP 키나제 인산화 또는 대식세포 증식)를 억제시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 유효량의 IL-34의 억제제를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하여 염증성 장 질환을 치료할 수 있거나, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 염증성 시토카인 생산을 억제시킬 수 있거나, 또는 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "IL-34의 억제제"는 IL-34 유전자 발현 또는 유전자 생성물 활성을 억제시킬 수 있는 시약 (즉, IL-34를 억제시킬 수 있는 시약)을 의미할 수 있다. 상기 억제제로는 예를 들어, 펩티드 억제제, 항체, 소형 결합 분자, 예컨대, 천연 및 합성 화합물, 압타머, 인트라머, RNAi (이중 가닥 RNA, siRNA), 및 항-IL-34 안티센스 분자 및 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. IL-34 억제제는 또한 IL-34 활성, 결합 파트너, 또는 기질을 방해하고, 이로써, IL-34 기능을 억제시키는 말단절단된 및/또는 돌연변이화된 IL-34도 포함할 수 있다.
IL-34의 억제제는 IL-34 유전자 또는 유전자 생성물, 또는 IL-34가 직접 상호작용하는 성분, 즉, IL-34 유전자 또는 유전자 생성물이 물리적 상호작용을 하는 성분 (예컨대, CSF1R)에 직접적으로 결합하는 시약을 포함한다. IL-34의 억제제는 유전자 발현 또는 유전자 생성물 활성에 미치는 광범위한 영향의 결과로서, 또는 IL-34 발현 또는 활성의 간접적 또는 비-표적화된 억제의 결과로서 IL-34를 억제시키는 시약은 포함하지 않을 것이다. 예를 들어, TNF-알파 신호전달의 억제제 (예컨대, 인플릭시맙 (레미케이드®))는 IL-34 발현을 간접적으로 억제시키지만, 인플릭시맙은 IL-34 (유전자 또는 그의 발현 생성물 중 임의의 것)에 결합하지도 않고, IL-34와 간접적 및 물리적으로 상호작용하는 성분에도 결합하지 않기 때문에, IL-34의 억제제로 간주되지 않을 것이다.
IL-34의 억제제는 그가 분자 표적, 예를 들어, IL-34 또는 IL-34 결합 단백질에 대하여 배타적으로 또는 고도의 선택성으로 가지고 작용할 수 있도록 허용하는 구조적 및/또는 기능적 특성을 가져야 한다. 따라서, IL-34의 억제제는 IL-34 유전자, 그의 RNA 또는 단백질 생성물, 또는 그의 활성 또는 발현이 IL-34, 또는 그의 생성물의 활성 또는 발현에 영향을 미치는 또 다른 분자 엔티티를 배타적으로 또는 고도의 특이성을 가지고 표적화하는 고유한 기능적 특성을 가져야 한다. IL-34의 항체 억제제의 경우, 특이성은 IL-34 단백질 에피토프 또는 IL-34 신호전달 파트너의 에피토프와 고도의 특이성을 가지고 결합하는 것으로 공지된 단백질 서열을 포함시키는 것을 통해 항체로 조작될 수 있다. IL-34의 소분자 억제제의 경우, IL-34 단백질 또는 그의 신호전달 파트너의 특이적인 특징에 결합할 수 있도록 허용하는 화학 기를 소분자 제제에 포함시킬 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입된 뉴클레오티드 서열의 표적화 부위가 IL-34 mRNA 서열 또는 IL-34 상호작용 파트너의 mRNA 서열과 완전한 또는 거의 완전한 상보성을 가지도록 디자인될 수 있다. 상기와 같이 상보적인 또는 거의 상보적인 뉴클레오티드 서열의 도입을 통해 주어진 표적에 대하여 고도의 특이성을 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 조작할 수 있다. IL-34의 펩티드 억제제는 IL-34 또는 그의 신호전달 파트너의 에피토프에 결합하는 펩티드 서열, 또는 IL-34 결합 파트너의 펩티드 서열을 복제 또는 모방하는 펩티드 서열, 예를 들어, CSF1R의 세포외 도메인을 복제 또는 모방하는 펩티드를 포함할 수 있다. IL-34의 소분자 억제제는 IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너에 결합하거나, 또는 결합할 가능성이 있는 소분자 또는 화학 구조체를 확인하는 스크리닝 검정법을 통해 확인할 수 있다. 특이성은 파라미터, 예컨대, 해리 상수, 또는 다른 기준, 예컨대, 단백질 또는 RNA 발현 수준 변화 측정 또는 IL-34 활성 또는 발현을 측정하는 다른 검정법을 통해 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란, 표적 단백질 (예컨대, IL-34)을 코딩하는 메신저 RNA (mRNA)에 상보적인 짧은 합성 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 mRNA에 하이브리드화하여 이중 가닥 하이브리드를 생성하고, 이는 DNA/RNA 하이브리드 가닥을 분해하는, 예컨대, RNase H와 같은 도처에 존재하는 촉매 효소를 활성화시켜 단백질 번역을 막을 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 소형 헤어핀 RNA's (shRNA's), 소형 간섭 RNA's (siRNA's), 2'-O-알킬을 포함하는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금형 핵산 (LNA), 또는 모르폴리노 올리고머 화학물질을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 여기서, 올리고뉴클레오티드 중 단 한 가닥만이 표적 서열에 상보적이다.
IL-34의 억제제는 특이적인 IL-34의 억제제, 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 고도의 특이성으로 IL-34를 표적화하는 임의의 다른 수단일 수 있다. IL-34의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제는 길이가 5 내지 100개의 올리고뉴클레오티드 길이, 바람직하게, 길이가 5 내지 90개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 길이가 5 내지 80개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 길이가 5 내지 70개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 길이가 5 내지 60개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 길이가 5 내지 50개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 길이가 5 내지 40개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 길이가 10 내지 30개의 올리고뉴클레오티드, 또는 더욱 바람직하게, 길이가 8 내지 40개의 올리고뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드 서열일 수 있다. IL-34의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제는 IL-34 mRNA 서열 (서열식별번호: 1)의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본원에서는 IL-34를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가, CpG 쌍의 시토신 잔기가 5'-메틸시토신 (Me-dC로 약칭됨)에 의해 대체된 것인 혼합형 백본을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 메틸포스포네이트 연결부 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 단부에 배치될 수 있다 (MeP로 약칭됨). 고려되는 IL-34 안티센스 올리고뉴클레오티드의 포스포네이트 백본은 임의적으로 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다 (예컨대, 포스포로티오에이트 결합은 포스포디에스테르 결합을 대체할 것이다). 한 실시양태에서, 모든 포스포네이트 결합은 포스포로티오에이트 결합일 수 있다.
IL-34의 억제제가 항체일 수 있다는 것이 고려된다. IL-34의 항체 억제제는 전장의 항체, 키메라 항체, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-34의 항체 억제제는 IL-34, IL-34의 수용체, 또는 또 다른 IL-34 상호작용 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-34의 항체 억제제는 리간드에 결합할 수 있고, 리간드의 그의 결합 파트너에의 결합을 막을 수 있고, 다르게는 그의 결합 파트너에의 리간드 결합으로부터 초래될 수 있는 생물학적 반응을 방해할 수 있다. 항원 결합 단백질, 예컨대, 항체 또는 그의 면역학적으로 기능성인 단편의 결합 및 특이성을 평가할 때, 과량의 항체가 리간드에 결합하는 결합 파트너의 양을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 초과만큼 감소시키는 경우에 (시험관내 경쟁적 결합 검정법으로 측정), 항체 또는 단편은 실질적으로 리간드의 그의 결합 파트너에의 결합을 억제시킬 것이다. 고려되는 항체는 IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너, 예를 들어, CSF1R의 에피토프, 에피토프들, 또는 영역들을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체인 IL-34 억제제는 IL-34에 결합할 수 있는 CSF1R의 능력을 감소시킬 것이다. 그러므로, CSF1R에의 항체 결합은 IL-34 결합 또는 신호전달을 억제시킬 수 있다. 예시적인 IL-34의 항체 억제제로는 미국 특허 번호 8,182,813, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/123381, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/140249, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/070024에 기술되어 있는 것을 포함한다.
본원에서는 또한 IL-34의 억제제가 펩티드 억제제일 수 있다는 것도 고려된다. 펩티드 억제제는 IL-34, IL-34의 수용체, 또는 또 다른 IL-34 상호작용 단백질에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-34의 펩티드 억제제는 는 단백질에 결합할 수 있고, 단백질의 그의 결합 파트너에의 결합을 막을 수 있고, 다르게는 그의 결합 파트너에의 단백질 결합으로부터 초래될 수 있는 생물학적 반응을 방해할 수 있다. 펩티드 억제제의 결합 및 특이성을 평가할 때, 과량의 펩티드 억제제가 단백질에 결합하는 결합 파트너의 양을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 초과만큼 감소시키는 경우에 (시험관내 경쟁적 결합 검정법으로 측정), 펩티드 억제제는 실질적으로 단백질의 그의 결합 파트너에의 결합을 억제시킬 것이다. 고려되는 펩티드 억제제는 IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너, 예를 들어, CSF1R의 에피토프, 에피토프들, 또는 영역들을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 억제제인 IL-34 억제제는 IL-34에 결합할 수 있는 CSF1R 또는 다른 IL-34 결합 파트너의 능력을 감소시킬 것이다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 펩티드 억제제인 IL-34 억제제는 CSF1R 또는 그의 다른 결합 파트너에 결합할 수 있는 IL-34의 능력을 감소시킬 것이다. 특정 실시양태에서, IL-34의 펩티드 억제제는 CSF1R의 세포외 도메인 모두 또는 그의 일부, 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_005202.2의 잔기 20-517 (서열식별번호: 4)을 포함한다. 예시적인 IL-34의 펩티드 억제제는 미국 특허 번호 8,183,207에 기술된 것을 포함한다.
제약 조성물 및 투여 경로
본 발명은 또한 IL-34의 억제제를 포함하는 제약 조성물의 투여를 통해 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 IL-34의 억제제, 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드 억제제, 소분자, 또는 IL-34 또는 IL-34 결합 파트너를 표적화하는 항체, 및 제약상 허용되는 담체로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "제약 조성물"이라는 용어는 염증성 장 질환을 치료하기 위해 포유동물, 예컨대, 인간에 투여하고자 하는, 제약상 허용되는 담체 중에 명시된 양의 치료학적 화합물, 예컨대, 치료학상 유효량의 치료학적 화합물을 함유하는 혼합물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 IL-34 또는 IL-34 결합 파트너의 고려되는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드 억제제, 소분자, 또는 항체 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 고려된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 치료용 의약 제조에서 IL-34의 억제제의 용도를 개시한다. 본원에서 사용되는 바, "의약"은 본질적으로 "제약 조성물"이라는 용어와 같은 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 부합하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 상기 담체(들)는 제제 중 다른 성분들과 화합성이며, 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용성"이어야 한다. 제약상 허용되는 담체로는 제약적 투여에 부합하는 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 활성인 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용에 대해서는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 경구적으로 투여되며, 소화기 계통 또는 소화관 내에서 캡슐화된 물질의 흡수 부위를 조절하는 데 적합한 장용 코팅제를 포함한다. 예를 들어, 장용 코팅제는 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 고려되는 IL-34의 억제제 및 그의 임의의 제약 조성물은 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로인 경로를 비롯한, 하나 또는 수개의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비경구적이라는 용어는 피하 주사, 췌장내 투여, 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 예를 들어, IL-34의 억제제는 피하로 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, IL-34 억제제는 경구적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, IL-34의 억제제는 비경구적 투여를 통하여 위장계, 또는 위장계의 특정 부위 (예컨대, 회장, 결장, 또는 직장)에 직접 투여될 수 있다.
IL-34의 억제제를 함유하는 제약 조성물, 예컨대, 본원에 개시된 것은 투여 단위 형태로 제공될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 부합하도록 제제화되어야 한다. 유용한 제제는 제약 업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]을 참조할 수 있다.
제약 제제는 바람직하게는 멸균된 것이다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 필터 멸균이 수행될 수 있다.
비경구적 투여
본 발명의 제약 조성물은 비경구 투여용으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 병변내 또는 복강내 경로를 통한 주사용으로 제제화될 수 있다. IL-34 억제제를 함유하는 수성 제약 조성물과 같은 수성 조성물의 제조에 대해서는 본 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알 수 있을 것이다. 전형적으로, 상기 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액 중 어느 하나로서 제조될 수 있으며; 주사 이전에 액체의 첨가에 의해 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수도 있고; 제제는 또한 유화될 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 형태로는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일, 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 상기 형태들은 멸균된 것이어야 하며, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동성을 가져야 한다. 이는 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대, 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 혼합물, 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 추가로, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세리드를 비롯한, 임의의 무자극 고정유가 사용될 수 있다. 추가로, 지방산, 예컨대, 올레산이 주사제 제조에 사용될 수 있다. 멸균 주사제 제제 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 액제, 현탁제 또는 에멀젼, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 액제일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매로는 물, 링거액, U.S.P., 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 한 실시양태에서, IL-34의 억제제는 1% (w/v) 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및 0.1% (v/v) 트윈(TWEEN)™ 80을 포함하는 담체 유체 중에 현탁될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건하에서, 상기 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
주사가능한 제제, 예를 들어, 멸균 주사가능한 수성 또는 유질 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 관련 기술분야에 따라 제제화될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균화된 활성 성분을 도입함으로써 제조된다. 본 발명의 멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 각종의 다른 성분과 함께 IL-34의 억제제를 필요한 양의 적절한 용매에 도입한 후, 이어서, 여과 멸균에 의해 제조될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과된 해당 용액으로부터 활성 성분과 함께 임의의 추가적인 원하는 성분으로 이루어진 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동 건조 기술이다. 주사가능한 제제는 예를 들어, 박테리아 유지 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
근육내 주사용의 더 많이 농축되거나, 또는 고도로 농축된 용액의 제조 또한 고려된다. 이와 관련하여, 용매로서 DMSO를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 DMSO가 극도로 빠르게 침투될 수 있도록 함으로써 고농도의 IL-34의 억제제를 작은 부위로 전달될 수 있게 하기 때문이다.
상기 용액에 사용하기에 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살 등을 포함한다. 적합한 완충제로는 pH를 약 pH 6 내지 pH 8, 및 바람직하게, 약 pH 7 내지 pH 7.5로 유지시키는 데 충분한 양으로 붕산, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨, 붕산나트륨 및 붕산칼륨, 탄산나트륨 및 탄산칼륨 10, 아세트산나트륨, 이인산나트륨 등을 포함한다. 적합한 장성 작용제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로스, 글리세린, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜, 염화나트륨 등이며, 이로써, 용액의 염화나트륨 당량은 0.9 ± 0.2% 범위가 된다. 적합한 항산화제 및 안정제로는 소듐 비술파이트, 소듐 메타비술파이트, 소듐 티오술파이트, 티오우레아 등을 포함한다. 적합한 습윤제 및 정화제로는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴을 포함한다. 적합한 점도 증가제로는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시메틸프로필셀룰로스, 라놀린, 메틸세룰로스, 바셀린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 등을 포함한다.
경구 투여
일부 실시양태에서, 본원에서는 IL-34 억제제의 경구 전달에 적합한 조성물, 예컨대, 장용 코팅제, 예컨대, 위 내성 코팅제를 포함하며, 이로써, 조성물은 IL-34 억제제를 예컨대, 환자의 위장관으로 전달할 수 있는 것인 정제가 고려된다. 예를 들어, 상기 투여를 통해 국소 효과를 얻을 수 있고, 실질적으로는 환자의 위장관 중 이환된 부위에 직접 IL-34 억제제를 적용시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 실질적으로 IL-34 억제제의 원치않는 전신 흡수를 피할 수 있다.
예를 들어, 개시된 IL-34 억제제, 예컨대, IL-34 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 과립제를 포함하는 (예컨대, 적어도 부분적으로 과립제로부터 형성된) 경구 투여용 정제를 제공한다. 상기 정제는 장용 코팅제로 코팅될 수 있다. 고려되는 정제는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 충전제, 결합제, 붕해제, 및/또는 윤활제 뿐만 아니라, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 예컨대, 윈터그린, 오렌지, 크실리톨, 소르비톨, 프럭토스 및 말토덱스트린, 및 방향제, 보존제 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제약 제제는 고려되는 IL-34 억제제, 예컨대, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드 억제제, 소분자, 또는 항체, 또는 제약상 허용되는 염, 예컨대, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드 억제제, 소분자, 또는 항체, 및 제약상 허용되는 충전제를 포함하는 과립내 상을 포함한다. 예를 들어, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드 억제제, 소분자, 또는 항체 및 충전제를 함께, 임의적으로 다른 부형제와 함께 블렌딩하여 과립제를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 습식 과립화를 이용하여 과립내 상을 형성할 수 있고, 예컨대, 액체 (예컨대, 물)을 블렌딩된 IL-34 억제제 화합물 및 충전제에 첨가한 후, 조합물을 건조, 밀링 및/또는 시빙하여 과립제를 제조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 프로세스를 이용하여 과립내 상을 달성할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제는 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있고, 과립내 상과 블렌딩하여 개시된 제제를 형성할 수 있는 것인 과립외 상을 포함한다.
개시된 제제는 충전제를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다. 예시적인 충전제로는 셀룰로스, 젤라틴, 인산칼슘, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만닛톨, 소르비톨, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 폴리아크릴레이트, 덱스트로스, 셀룰로스 아세테이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 부분적으로 예비젤라틴화된 전분, 탄산칼슘, 및 그의 조합을 비롯한 다른 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 개시된 제제는 일반적으로 제약 제제의 성분들을 함께 결합시키는 기능을 할 수 있는 결합제를 포함하는 과립내 상 및/또는 과립외 상을 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 결합제로는 하기: 전분, 당, 셀룰로스 또는 개질 셀룰로스, 예컨대, 히드록시프로필 셀룰로스, 락토스, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 저치환된 히드록시프로필 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 당 알콜, 및 그의 조합을 비롯한 다른 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
고려되는 제제, 예컨대, 과립내 상 및/또는 과립외 상을 포함하는 제제는 붕해제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 전분, 셀룰로스, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 소듐 전분 글리콜레이트, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 알기네이트, 옥수수 전분, 크로스멜로스 소듐, 가교결합된 카르복시메틸 셀룰로스, 저치환된 히드록시프로필 셀룰로스, 아카시아, 및 그의 조합을 비롯한 다른 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 과립내 상 및/또는 과립외 상은 붕해제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제는 IL-34의 억제제, 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 억제제, 펩티드 억제제, 또는 항체 및 만닛톨, 미정질 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 및 소듐 전분 글리콜레이트 또는 그의 조합으로부터 선택되는 부형제를 포함하는 과립내 상, 및 미정질 셀룰로스, 소듐 전분 글리콜레이트, 및 마그네슘 스테아레이트 또는 그의 혼합물 중 하나 이상의 것을 포함하는 과립외 상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 예컨대, 과립외 상은 윤활제를 함유할 수 있다. 윤활제로는 활석, 실리카, 지방, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 인산칼슘, 이산화규소, 칼슘 실리케이트, 인산칼슘, 콜로이드성 이산화규소, 금속 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 소듐 벤조에이트, 폴리에틸렌 글리콜, 아세트산나트륨, 칼슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 술페이트, 염화나트륨, 마그네슘 라우릴 술페이트, 활석 및 스테아르산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 제약 제제는 장용 코팅제를 포함한다. 일반적으로 장용 코팅제는 경구용 약물에 대해 장벽을 형성함으로써 약물이 소화관을 따라 흡수되는 위치를 조절한다. 장용 코팅제는 pH에 따라 상이한 속도로 붕해되는 중합체를 포함할 수 있다. 장용 코팅제로는 예를 들어, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체 유형 C, 폴리비닐 아세테이트-프탈레이트, 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함할 수 있다.
예시적인 장용 코팅제로는 오파드리(Opadry)® AMB, 아크릴(Acryl)-EZE®, 유드라지트(Eudragit)® 등급을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장용 코팅제는 고려되는 정제의 약 5중량% 내지 약 10중량%, 약 5중량% 내지 약 20중량%, 8 내지 약 15중량%, 약 8중량% 내지 약 20중량%, 약 10중량% 내지 약 20중량%, 또는 약 12 내지 약 20중량%, 또는 약 18중량%를 구성할 수 있다. 예를 들어, 장용 코팅제는 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 고려되는 실시양태에서, 약 0.5중량% 내지 약 70중량%, 예컨대, 약 0.5중량% 내지 약 10중량%, 또는 약 1중량% 내지 약 20중량%의 IL-34 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예컨대, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 소분자, 또는 펩티드 억제제)를 포함하거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진 정제를 제공한다. 상기 정제는 예를 들어, 약 0.5중량% 내지 약 60중량%의 만닛톨, 예컨대, 약 30중량% 내지 약 50중량% 만닛톨, 예컨대, 약 40중량% 만닛톨; 및/또는 약 20중량% 내지 약 40중량%의 미정질 셀룰로스, 또는 약 10중량% 내지 약 30중량%의 미정질 셀룰로스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 정제는 약 30중량% 내지 약 60중량%, 예컨대, 약 45중량% 내지 약 65중량%, 또는 대안적으로, 약 5 내지 약 10중량%의 IL-34 억제제, 약 30중량% 내지 약 50중량%, 또는 대안적으로, 약 5중량% 내지 약 15중량% 만닛톨, 약 5중량% 내지 약 15중량% 미정질 셀룰로스, 약 0중량% 내지 약 4중량%, 또는 약 1중량% 내지 약 7중량% 히드록시프로필메틸셀룰로스, 및 약 0중량% 내지 약 4중량%, 예컨대, 약 2중량% 내지 약 4중량% 소듐 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다.
또 다른 고려되는 실시양태에서, IL-34 억제제의 경구 투여용의 제약 정제 제제는 IL-34 억제제, 예컨대, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 소분자, 또는 펩티드 억제제, 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예컨대, 나트륨 염), 및 제약상 허용되는 충전제를 포함하는 과립내 상을 포함하고, 상기 제약 정제 제제는 또한 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 부형제를 포함할 수 있는 과립외 상을 포함할 수 있다. 과립외 상은 미정질 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 정제의 약 12중량% 내지 20중량%로 장용 코팅제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구용의 제약상 허용되는 정제는 약 0.5중량% 내지 10중량%의 IL-34 억제제, 예컨대, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 소분자, 또는 펩티드 억제제, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 약 30중량% 내지 50중량% 만닛톨, 약 10중량% 내지 30중량% 미정질 셀룰로스, 및 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅제를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 경구용의 제약상 허용되는 정제는 약 5 내지 약 10중량%의 IL-34 억제제, 예컨대, IL-34 또는 IL-34 상호작용 파트너 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 소분자, 또는 펩티드 억제제, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 약 40중량% 만닛톨, 약 8중량% 미정질 셀룰로스, 약 5중량% 히드로프로필메틸메틸 셀룰로스, 및 약 2중량% 소듐 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립내 상; 약 17중량% 미정질 셀룰로스, 약 2중량% 소듐 전분 글리콜레이트, 약 0.4중량% 마그네슘 스테아레이트를 포함하는 과립외 상; 및 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 정제상의 장용 코팅제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 13중량% 또는 약 15중량%, 16중량%, 17중량% 또는 18중량%, 예컨대, 아크릴EZE®을 포함하는 장용 코팅제를 함유할 수 있다 (예컨대, PCT 공개 번호 WO2010/054826 (상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다) 참조).
코팅제가 용해되고, 활성 성분이 방출되는 시점의 속도가 그의 용해 속도이다. 한 실시양태에서, 고려되는 정제는 예컨대, USP/EP 타입 2 장치 (패들)에서 포스페이트 완충제 (pH 7.2) 중 37℃에서 100 rpm로 시험되었을 때, 약 120분 내지 약 240분, 예를 들어, 180분 후, IL-34의 억제제 중 약 50% 내지 약 100%가 방출되는 용해 프로파일을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 고려되는 정제는 예컨대, USP/EP 타입 2 장치 (패들)에서 묽은 HCl (pH 1.0) 중 37℃에서 100 rpm로 시험되었을 때, 120분 후 실질적으로는 IL-34의 억제제가 전혀 방출되지 않는 용해 프로파일을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 고려되는 정제는 예컨대, USP/EP 타입 2 장치 (패들)에서 포스페이트 완충제 (pH 6.6) 중 37℃에서 100 rpm로 시험되었을 때, 30분 후, IL-34의 억제제 중 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 50% 이하가 방출되는 용해 프로파일을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 고려되는 제제, 예컨대, 정제는 환자에게 경구적으로 투여되었을 때, 환자에서 최소의 혈장 농도의 IL-34 억제제를 초래할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 제제는 환자에게 경구적으로 투여되었을 때, 환자의 결장 또는 직장으로, 예컨대, 환자의 이환된 부위 또는 환부로 국소적으로 전달된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법은 본원에 개시된 질환 및 장애 치료를 위한 것인 적어도 1종의 다른 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 고려되는 다른 작용제는 (예컨대, 순차적으로 또는 동시에) 공동 투여될 수 있다.
고려되는 작용제로는 글루코코르티코이드, 세포증식억제제, 항체, 이뮤노필린에 작용하는 작용제, 인터페론, 아편유사제, TNF 결합 단백질, 미코페놀레이트 및 소형 생물학 작용제를 비롯한, 면역억제제를 포함한다. 예를 들어, 고려되는 면역억제제로는 타크롤리무스, 시클로스포린, 피메크롤리무스, 시롤리무스, 에베롤리무스, 미코페놀산, 핑골리모드, 덱사메타손, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 레플루노미드, 테리플루노미드, 아나킨라, 항-흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 무로모납-CD3, 아푸투주맙, 리툭시맙, 테플리주맙, 에팔리주맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 아달리무맙, 인플릭시맙, 세르톨리주맙 페골, 나탈리주맙 및 에타너셉트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 고려되는 작용제로는 항생제, 지사제, 완하제, 진통제, 철 보충제, 및 칼슘 또는 비타민 D 또는 B-12 보충제를 포함한다.
투여량 및 투여 빈도
예시적인 제제는 약 35 mg 내지 약 500 mg의 IL-34 억제제를 포함하거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진 투여 형태를 포함한다. 예를 들어, 약 35 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 또는 250 mg의 IL-34 억제제를 포함하는 제제가 본원에서 고려된다. 한 실시양태에서, 제제는 약 40 mg, 80 mg, 또는 160 mg의 IL-34 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 적어도 100 ㎍의 IL-34 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제제는 약 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 또는 25 mg의 IL-34 억제제를 포함할 수 있다. 투여되는 양은 변수, 예컨대, 치료하고자 하는 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 환자의 전반적인 건강 상태 및 크기, IL-34 억제제의 생체내 효능, 제약 제제, 및 투여 경로에 의존할 것이다. 초기 투여량은 원하는 혈액 수준 또는 조직 수준을 빠르게 달성하기 위해 상위 수준 초과로 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 투여량은 최저량보다 작을 수 있고, 투여량은 치료 과정 동안 점진적으로 증가될 수 있다. 인간 투여량은 예컨대, 40 mg 내지 160 mg으로 진행되도록 디자인된 통상적인 I상 용량 점증 연구에서 최적화될 수 있다. 투약 빈도는 인자, 예컨대, 투여 경로, 투여량 및 치료되는 질환에 의존하여 달라질 수 있다. 예시적인 투약 빈도는 1일 1회, 주 1회, 및 매 2주마다 2회이다. 일부 실시양태에서, 투약은 7일 동안 1일 1회로 이루어진다.
본 발명의 진단 방법
본 발명은 또한 환자의 하나 이상의 생물학적 샘플에서 IL-34 발현 신호 수준을 검출하는 것에 의존하는 염증성 장 질환 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "IL-34 발현 신호"라는 용어는 IL-34 유전자 발현, 또는 유전자 또는 유전자 생성물 활성의 임의의 지표를 지칭한다. IL-34 유전자 생성물로는 RNA (예컨대, mRNA), 펩티드, 및 단백질을 포함한다. 평가될 수 있는 IL-34 유전자 발현의 지표로는 IL-34 유전자 또는 염색질 상태, 유전자 발현을 조절하는 세포 성분과 IL-34 유전자의 상호작용, IL-34 유전자 생성물 발현 수준 (예컨대, IL-34 RNA 발현 수준, IL-34 단백질 발현 수준), 또는 전사, 번역, 또는 번역 후 프로세싱 기구와 IL-34 RNA 또는 단백질의 상호작용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. IL-34 유전자 생성물 활성의 지표로는 IL-34 신호전달 활성 평가 (예컨대, CSF1R 활성화 또는 MAPK1/MAPK3 인산화 평가), 및 IL-34 수용체 결합 (예컨대, CSF1R 결합) 평가를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
IL-34 발현 신호 검출은 생체내, 시험관내, 또는 생체외 방법을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다. 검출 방법은 환자의 혈액, 혈청, 대변, 조직, 또는 세포에서 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 전체 조직, 조직 외식편, 세포 배양물, 해리된 세포, 세포 추출물, 또는 혈액 또는 혈청을 비롯한, 체액에서의 IL-34 발현 신호를 측정함으로써 달성될 수 있다. 고려되는 검출 방법으로는 IL-34 유전자 생성물 발현 수준을 측정하는 검정법, 예컨대, 웨스턴 블롯팅, FACS, ELISA, 다른 정량적 결합 검정법, 세포 또는 조식 성장 검정법, 노던 블롯, 정량적 또는 반정략적 중합효소 연쇄 반응, 의학적 영상화 방법 (예컨대, MRI), 또는 면역염색 방법 (예컨대, 면역조직화학법 또는 면역세포화학법)을 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 본 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되는 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 염증성 장 질환에서의 IL-34 발현
염증성 장 질환을 앓는 환자 및 대조군 환자로부터 채취된 결장 생검에서 IL-34 mRNA 전사체의 발현을 분석하였다. 결장 생검은 14명의 대조군 환자 (결장 CTR), 22명의 궤양성 결장염 환자 (UC), 및 15명의 크론병 환자 (결장 CD; 도 1A)로부터 수집하였다. RNA를 수집하고, 실시간 PCR을 수행하여 IL-34 mRNA 수준을 검출하였다. IL-34 발현 신호 수준을 β-액틴 수준으로 정규화하였다. IL-34 발현 신호 분석 결과, 대조군 샘플과 비교하였을 때, 크론병 및 궤양성 결장염 환자로부터 수거된 조직에서 유의적으로 상승되어 있는 것으로 나타났다 (도 1A; 결장 CTR 대 UC, p<0.0001; 결장 CTR 대 결장 CD, p=0.002; 평균 ± SEM). 유사하게, 3명의 대조군 환자 (회장 CTR) 및 크론병을 앓는 7명의 환자 (회장 CD; 도 1B)로부터 채취된 회장 생검에서 IL-34 mRNA 전사체 발현을 평가하였다. RNA를 생검으로부터 수집하고, 실시간 PCR을 수행하고, IL-34 발현 신호 수준을 β-액틴 수준으로 정규화하였다. IL-34 발현 신호 분석 결과, 대조군 샘플과 비교하였을 때, 크론병 환자로부터 수거된 회장 조직에서 유의적으로 상승되어 있는 것으로 나타났다 (도 1B; p<0.0001; 평균 ± SEM). 본 결과는 IL-34 mRNA 전사체 발현 수준이 대조군 환자와 비교하였을 때, 염증성 장 질환을 앓는 환자로부터의 조직에서 증가되어 있었다는 것을 입증한다.
상이한 치료학적 처치를 받은 염증성 장 질환을 앓는 환자로부터의 결장 생검에서의 IL-34 mRNA 전사체 발현 또한 분석하였다 (도 1C). 14명의 대조군 환자 (CTR), 어떤 요법도 받지 않은 9명의 염증성 장 질환 환자 (6명의 궤양성 결장염 환자 및 3명의 크론병 환자; w/o 요법), 메살라민으로 치료받은 17명의 염증성 장 질환 환자 (11명의 궤양성 결장염 환자 및 6명의 크론병 환자; 5-ASA), 스테로이드제로 치료받은 6명의 염증성 장 질환 환자 (5명의 궤양성 결장염 환자 및 1명의 크론병 환자; CS), 및 면역조절제로 치료받은 5명의 염증성 장 질환 환자 (1명의 궤양성 결장염 환자 및 4명의 크론병 환자; ISS)로부터 결장 생검을 수거하였다. 이어서, 실시간 PCR에 의해 IL-34 mRNA 발현에 대하여 조직 생검을 분석하였다. IL-34 mRNA 발현 신호 수준을 β-액틴 mRNA 발현 신호로 정규화하였다. 샘플 간의 IL-34 mRNA 발현 비교 결과, 대조군 샘플, 염증성 장 질환 치료를 받지 않은 환자, 메살라민으로 치료받은 환자, 및 스테로이드제로 치료받은 환자 사이에 유의적인 차이가 존재하는 것으로 나타났다 (도 1C; CTR 대 w/o 요법, p=0.0007; CTR 대 5-ASA, p<0.0001; CTR 대 CS, p=0.03; 평균 ± SEM). 상기 관찰 결과는 다수의 염증성 장 질환을 앓는 환자에서는 심지어 이용가능한 요법으로 처치를 받은 이후에도 IL-34 발현이 고수준으로 지속되었다는 것을 입증한다.
추가로, 개별 환자로부터 채취된 쌍별 생검 사이의 IL-34 RNA 발현 비교를 수행하였다. 염증성 장 질환을 앓는 9명의 환자 (7명의 궤양성 결장염 환자 및 2명의 크론병 환자)의 비침범 (Uninv) 및 침범 (Involv) 점막으로부터 생검을 수거하였다. 실시간 PCR을 사용하여 생검화된 조직에서의 IL-34 mRNA 발현을 평가하고, IL-34 신호 수준을 β-액틴 신호로 정규화하였다. IL-34 mRNA 발현은 침범 조직과 비교하였을 때, 비침범 조직에서 유의적으로 더 낮은 것으로 관찰되었다 (도 1D; p=0.002; 수평 막대는 각 군에 대한 중앙값을 나타낸다). 본 결과는 IL-34 mRNA 발현은 같은 환자의 염증성 장 질환에 이환된 위장관 부위와 비교하였을 때, 염증성 장 질환에 걸리지 않은 위장관 부위에서 유의적으로 더 낮았다는 것을 입증한다.
염증성 장 질환을 앓는 환자의 결장 점막으로부터 수거된 생물학적 샘플에서의 IL-34 단백질의 발현을 분석하였다. 3명의 대조군 환자 (CTR), 3명의 궤양성 결장염 환자 (UC), 및 3명의 크론병 환자 (CD)로부터 수거된 결장 점막 샘플로부터 전체 단백질 추출물을 수집하고, 웨스턴 블롯에 의해 샘플을 IL-34 단백질 신호에 대하여 분석하였다 (도 2A). β-액틴을 대조군으로서 사용하였다. 염증성 장 질환 환자로부터의 추출물을 대조군과 비교하였을 때, IL-34 신호를 상승된 수준으로 나타내었다. 유사하게, 4명의 대조군 (회장 CTR) 및 4명의 크론병 (회장 CD) 환자로부터 수거된 회장 점막 샘플로부터의 전체 단백질 추출물을 웨스턴 블롯에 의해 IL-34 단백질 신호에 대하여 분석하였다 (도 2B). β-액틴을 다시 대조군으로서 사용하였다. 대조군 샘플과 비교하였을 때, 회장 CD 단백질 추출물에서 검출된 IL-34 신호는 상승되어 있었다. 이러한 결과는 IL-34 단백질이 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 전반적으로 상승된 수준으로 존재한다는 것을 입증하였다.
면역조직화학법 또한 사용하여 염증성 장 질환을 앓는 환자에서의 IL-34 단백질 발현을 분석하였다. 결장 조직 샘플을 이소형 대조군 항체 (IgG, 좌측 상단 패널) 또는 IL-34 항체를 사용하여 염색하였다 (도 2C). IL-34 항체로 염색된 절편의 현미경 사진에서는 대조군 샘플 (CTR)과 비교하였을 때, 궤양성 결장염 환자 (UC) 및 크론병 (CD)으로부터 수거된 조직 절편에서의 IL-34 신호가 뚜렷이 증가되어 있는 것으로 나타났다. 추가로, 고배율 시야당 IL-34-양성 세포의 개수 (IL-34+ 세포/hpf)에 관한 분석 결과, 대조군과 비교하였을 때, UC 및 CD 샘플에서 IL-34+ 세포의 개수/hpf가 유의적으로 증가되어 있는 것으로 나타났다 (도 2C, 우측 패널; 6명의 CTR 대 3명의 UC 환자, p=0.01; 6명의 CTR 대 3명의 CD 환자, p=0.01; 평균 ± SEM). 유사하게, 대조군 환자 (회장 CTR) 및 크론병 환자 (회장 CD)로부터의 회장 조직 샘플을 IL-34 항체로 염색하였다 (도 2D). IL-34 항체로 염색된 회장 절편의 현미경 사진에서는 회장 CTR 샘플과 비교하였을 때, 회장 CD 조직 절편에서의 IL-34 신호가 뚜렷이 증가되어 있는 것으로 나타났다. 회장 조직 절편 분석 결과, 대조군과 비교하였을 때, 회장 CD 샘플에서 IL-34+ 세포의 개수/hpf가 유의적으로 증가되어 있는 것 또한 나타났다 (도 2D, 우측 패널; 4명의 CTR 대 5명의 CD 환자, p=0.007; 평균 ± SEM). 본 결과는 염증성 장 질환 환자에서 IL-34 단백질의 전반적인 조직 발현 수준이 뚜렷이 상승되어 있을 뿐만 아니라, 상기 환자에서 IL-34를 발현하는 개별 세포의 개수도 유의적으로 증가되어 있다는 것을 입증하였다.
실시예 2: CSF1R 발현은 염증성 장 질환 및 결장암 세포주에서 상승된다
IBD 및 대조군 환자로부터의 결장 조직에서 IL-34 수용체 CSF1R의 발현을 조사하였다. 8명의 결장 CD 환자, 및 임상적으로 활동성인 질환에 대해 결장경 검사를 받은 14명의 UC 환자의 염증이 생긴 점막으로부터 생검 샘플을 채취하였다. 상기 군 내에서, 초기 진단 시점에 약물을 받지 않은 3명의 UC 환자; 메살라민을 받은 12명의 환자 (4명의 결장 CD 환자 및 8명의 UC 환자); 스테로이드제를 받은 4명의 환자 (2명의 결장 CD 환자 및 2명의 UC 환자); 및 면역억제 약물을 받은 3명의 환자 (2명의 결장 CD 환자 및 1명의 UC 환자)로부터 생검을 수집하였다. 의학적 치료에 잘 반응하지 않는 만성 활동성 질환에 대한 수술을 받은 5명의 결장 CD 환자 및 10명의 UC 환자로부터도 또한 생검을 수집하였다. 대조군 결장 생검 샘플은 과민성 대장 증후군을 앓는 9명의 대상체로부터 채취된 샘플 및 결장암 수술을 받은 환자 5명의 육안상 및 현미경으로 볼 때 이환되지 않는 결장 부위로부터 채취된 점막 표본을 포함하였다.
상기 IBD 환자 및 대조군의 결장 생검으로부터 전체 RNA 추출물을 수집하고, 실시간 PCR에 의해 CSF1R mRNA 전사체 발현을 분석하였다. CSF1R 신호 수준을 β-액틴 신호로 정규화하였다. CSF1R RNA 전사체는 대조군 (결장 CTR)과 비교하였을 때, UC 및 CD (결장 CD) 환자, 둘 모두의 염증이 생긴 결장에서 증가되어 있었다 (도 3A; 결장 CTR 대 UC, p-0.0003; 결장 CTR 대 결장 CD, p=0.004). 어떤 약물 또는 메살라진도 복용하지 않은 IBD 환자와, 스테로이드제 또는 면역억제 약물을 이용한 IBD 환자 사이에는 CSF1R RNA 발현에 있어서 차이가 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 CSF1R mRNA 전사체 발현이 IBD를 앓지 않는 대조군 환자로부터의 결장 조직과 비교하였을 때, UC 및 CD 환자의 결장 조직에서 유의적으로 더 높았다는 것을 입증한다.
면역조직화학법에 의해 결장 조직에서의 CSF1R 단백질 발현 수준 또한 분석하였다. 인간 CSF1R에 대한 토끼 모노클로날 항체 (노부스 바이올로지컬((Novus Biological))를 사용하여 결장 조직 절편의 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 헤마톡실린을 이용하여 조직 절편을 대조염색시켰다. 이소형 대조군 IgG로 염색된 절편은 CSF1R 항체 대신 정제된 마우스 정상 IgG 대조군 항체 (R&D 시스템즈(R&D Systems); 도 3B, IgG))를 사용하여 제조하였다. 대조군 샘플 (CTR)로부터의 결장 조직 절편의 상피 세포는 CSF1R을 발현한 반면, 대조군 샘플의 선와 및 고유층 부위에서는 CSFR 염색이 거의 관찰되지 않았다 (도 3B). 그에 반해, IBD 환자로부터의 조직 절편 중의 상피 및 고유층 구획, 둘 모두에서 CSF1R 염색이 더욱 광범위하게 관찰되었고, IBD 조직 절편의 선와에서는 진한 CSF1R 염색이 관찰되었다 (도 3B, IgG와 CD 및 UC 패널 비교). 본 결과는 CSF1R 발현은 IBD를 앓지 않는 환자와 비교하였을 때, IBD 환자의 결장 조직에서 더욱 광범위하게, 및 진하게 관찰되었다는 것을 입증한다.
또한, 결장암 상피 세포주 시리즈에서도 CSF1R 발현을 분석하였다. 결장암 상피 세포주 (DLD-1, HT-29, 및 HCT-116) 및 대조군 결장 상피 세포주 (NCM460)를 플라스틱 플라스크에서 배양하고, 상기 세포에서 CSF1R RNA 및 단백질을 각각 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다. 암 세포주에서는 구성적 CSF1R mRNA 전사체 발현이 관찰된 반면, 대조군 세포에서는 구성적 발현이 관찰되지 않았다 (도 4A). 유사하게, 웨스턴 블롯팅 결과, 결장암 상피 세포주 모두에서 구성적 CSF1R 단백질 발현이 나타난 반면, 정상적인 결장 상피 세포주 NCM460에서는 CSF1R 단백질 발현을 거의 검출할 수 없었다 (도 4B). 본 결과는 CSF1R mRNA 및 단백질 발현이 비-암성 대조군 세포와 비교하였을 때, 결장암 상피 세포에서 더 높게 관찰되었다는 것을 입증한다.
실시예 3: TNF -알파가 IL-34 발현을 조절한다
자극 없이 (UNST), 또는 TNF-알파 (TNF-α, 20 ng/ml), IL-6 (50 ng/ml), 또는 인터페론 감마 (IFN-γ, 100 ng/ml)의 존재하에서 정상적인 결장 점막 외식편을 배양함으로써 다양한 인자가 IL-34 발현에 미치는 효과를 분석하였다. 외식편을 6시간 동안 상기 인자에 노출시켰다. 이어서, 실시간 PCR에 의해 IL-34 mRNA 발현을 분석하였다. IL-34 신호 수준을 β-액틴 신호로 정규화하였다. UNST 샘플을 TNF-α에 노출된 외식편과 비교한 결과, TNF-α 존재하의 IL-34 mRNA 발현이 유의적으로 증가되어 있는 것으로 나타났다 (도 5A; UNST 대 TNF-α, p=0.01; 2회 실험의 평균 ± SEM). 본 결과는 TNF-α가 결장 점막 외식편에서 IL-34 발현을 자극시킬 수 있다는 것을 시사한다.
TNF-알파 억제가 IL-34 발현에 미치는 효과를 조사하기 위해, 인플릭시맙 (레미케이드®)으로 알려진 TNF-알파에 대한 모노클로날 항체로 처리하기 이전 (PRE) 및 그 이후 (POST)에 개별 IBD 환자로부터 결장 점막 생검을 채취하였다. 실시간 PCR에 의해 결장 조직 중 IL-34 RNA 발현을 측정하고, 정규화하는 데 β-액틴 RNA 신호를 사용하였다. 개별 선으로 연결된, 도 3B의 PRE 및 POST 데이터 점으로 이루어진 쌍들은 개별 환자로부터 얻은 데이터를 나타낸다. 인플릭시맙 (레미케이드®) 처리 후의 IL-34 mRNA 발현 신호를 분석한 결과, 처리 이전 수준과 비교하였을 때, 유의적으로 증가한 것으로 나타났다 (도 5B; p=0.04; 실험 전체의 평균 ± SEM). 본 결과는 TNF-알파 활성을 억제시키는 것이 염증성 장 질환 환자로부터의 결장 조직에서 IL-34 발현 수준을 감소시키는 데 충분하였다는 것을 입증한다.
TNF-알파 억제가 IL-34 발현에 미치는 효과를 추가로 조사하기 위해, 4명의 염증성 장 질환 환자 (1명의 궤양성 결장염 환자 및 3명의 크론병 환자)로부터 채취된 결장 점막 생검 (IBD 외식편)을 24시간 동안 인플릭시맙 (레미케이드®, (IFX)), 또는 대조군 IgG (IgG)의 존재하에서 배양하였다. 이어서, 실시간 PCR에 의해 IL-34 RNA 발현을 측정하고, 정규화하는 데 β-액틴 신호를 사용하였다. IL-34 mRNA 발현 신호 분석 결과, IgG와 대조적으로, IFX의 존재하에서 배양된 IBD 외식편에서 유의적으로 감소되어 있는 것으로 입증되었다 (도 5C; p=0.01; 실험 전체의 평균 ± SEM). 추가로, 4명의 염증성 장 질환 환자 (1명의 궤양성 결장염 환자 및 3명의 크론병 환자)의 외과적 표본으로부터 단리된 결장 고유층 단핵 세포 (IBD LPMC)를 18시간 동안 IFX 또는 IgG의 존재하에서 배양하고, 이 시점 이후에, 실시간 PCR에 의해 IL-34 RNA 발현을 측정하였다. β-액틴 신호는 IL-34 RNA 신호를 정규화하는 데 다시 사용하였다. IL-34 mRNA 발현 신호 분석 결과, IgG와 대조적으로, IFX의 존재하에서 배양된 IBD LPMC에서 유의적으로 감소되어 있는 것으로 나타났다 (도 5D; p=0.02; 실험 전체의 평균 ± SEM). 본 결과는 TNF-알파 활성을 억제시키는 것이 염증성 장 질환 환자로부터의 세포 및 조직에서 IL-34 발현 수준을 감소시키는 데 충분하였다는 것을 명백하게 입증한다.
실시예 4: IL-34는 염증성 시토카인 생산을 자극한다
IL-34 자극이 염증성 시토카인 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 정상적인 결장 고유층 단핵 세포를 재조합 IL-34의 부재하에서 (Unst), 또는 재조합 인간 IL-34를 증가시켜가면서, 그의 존재하에서 (25, 50, 또는 100 ng/ml 재조합 IL-34) 배양하였다. 배양물을 6시간 동안 재조합 IL-34에 노출시킨 후, 염증성 시토카인 TNF-알파 (도 6A), IL-8 (도 6B), 및 IL-6 (도 6C)의 mRNA 발현 수준 상대치를 분석하였다. 실시간 PCR을 사용하여 mRNA 신호를 검출하고, 모든 신호는 β-액틴으로 정규화하였다. 모든 경우에서, Unst 샘플과 비교하였을 때, IL-34 자극의 존재하에서 염증성 시토카인 생산의 유의적인 증가가 관찰되었다. 도 4의 각 패널에 제시된 데이터는 5회의 독립 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다. 본 관찰 결과는 IL-34 자극이 염증성 시토카인 생산을 자극시키는 데 충분하였다는 것을 입증하고, IL-34가 염증성 장 질환에서 염증성 시토카인 생산 및 염증성 반응을 자극시키는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 5: IL-34는 ERK -의존성 경로를 통해 CCL20 발현을 자극시킨다
결장암 상피 세포주 DLD-1에서의 각종 케모카인의 발현을 자극시킬 수 있는 IL-34의 능력을 분석하였다. 간략하면, 2x105개의 DLD-1 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 부착되도록 24시간 동안 방치하고, 12시간 동안 고갈시켰다. 세포를 무자극 상태로 방치하였거나 (Unst), 또는 1.5시간, 3시간, 또는 6시간 동안 50 ng/ml의 인간 재조합 IL-34 (R&D 시스템즈, 인크., 미네아폴리스, MN)로 자극시켰다. IBD 관련 염증에 기여하는 것으로 여겨지는, 케모카인 리간드 (CCL)2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL24, CCL25, C-X-C 모티프 케모카인 (CXCL)9, 및 CXCL10을 비롯한, 각종의 케모카인의 mRNA 전사체의 발현을 실시간 PCR에 의해 평가하였다. DLD-1 세포에서 IL-34 노출이 CCL20 mRNA의 발현 증가는 자극시켰지만, 다른 케모카인의 발현 증가는 자극시키지 못했다 (도 7, 패널 A-I). 추가로, IL-34로 자극시킨 경우, DLD-1 세포에서 CCL20 mRNA 발현은 시험된 모든 농도에서 증가되었다 (25 ng/ml, p=0.01; 50 ng/ml, p=0.002; 및 100 ng/ml, p=0.04; 도 7, 패널 J). 모든 경우에서, 케모카인 발현 수준을 β-액틴 신호로 정규화하였다. 본 결과는 IL-34가 상피 세포에서 CCL20 케모카인 발현 증가를 선택적으로 자극시켰다는 것을 입증한다.
결장 조직에서 CCL20 발현을 조절할 수 있는 IL-34의 능력을 조사하기 위해, 3명의 IBD 환자로부터 채취된 점막 외식편을 각각 중화 IL-34 항체 (항-IL-34) 또는 대조군 항체 (IgG)와 함께 20시간 동안 배양하였다. 배양물 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 CCL20 발현을 측정하였다. 항-IL-34 항체 처리는 CCL20 분비를 감소시켰다 (하기 표 1). 본 결과는 IBD 환자의 결장 점막 세포에서 IL-34 활성을 차단시키는 것이 CCL20 발현 및 방출을 억제시켰다는 것을 입증한다.
<표 1>
IL-34 중화가 IBD 점막 외식편에서 CCL20 생산을 감소시킨다
Figure pct00001
IL-34-자극을 받은 CCL20 발현을 촉진시키는 데 있어서 MAP 키나제 단백질의 역할을 분석하기 위해, DLD-1 세포에서 IL-34에 의한 MAP 키나제 ERK, p38, 및 JNK의 활성화를 평가하였다. 혈청이 고갈된 DLD-1 세포를 비처리 상태로 방치하거나 (Unst) 또는 5분 내지 60분 동안 50 ng/ml의 IL-34로 처리하였다. 세포 추출물 중의 활성화된 단백질 분획 및 전체 MAP 키나제 (ERK1/2, p38, JNK) 단백질 발현을 나타내는 인산화된 MAP 키나제 (p-ERK1/2, p-p38, p-JNK) 단백질 발현을 3회의 독립된 실험에서 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다 (도 8A, 대표적인 예를 제시). IL-34는 ERK1/2 및 p38, 둘 모두의 인산화를 빠르게 증진시켰지만, JNK 인산화는 눈에 띄게 자극시키지는 못했다 (도 8A). 본 결과는 IL-34 노출이 결장 상피 세포에서 ERK1/2 및 p38 MAP 키나제의 인산화를 자극시켰다는 것을 입증한다.
IL-34 자극에 대한 반응으로 CCL20 생산을 촉진시킬 수 있는 개별 MAP 키나제의 능력 또한 평가하였다. 혈청이 고갈된 DLD-1 세포를 ERK1/2 (PD98059) 또는 p38 (SB202190)의 특이적인 억제제와, 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO, 비히클)와 함께 1시간 동안 미리 인큐베이션시키고, 추가의 48시간 동안 자극시키지 않고 방치하거나, 또는 50 ng/mL의 IL-34로 자극시켰다. ELISA에 의해 무세포 상청액 중의 CCL20 단백질 수준을 분석하였다. p38 억제제 SB202190이 아닌, ERK1/2 억제제 PD98059와 함께 DLD-1 세포를 미리 인큐베이션시킨 경우에는 IL-34-유도성 CCL20 생산이 파기되었다 (도 8B). 본 결과는 IL-34 자극이 결장 상피 세포에서 p38 및 ERK1/2, 둘 모두를 활성화시킨 반면, IL-34의 자극을 받은 CCL20의 발현은 특이적으로 ERK1/2 활성화에 의해 매개되었다는 것을 시사한다.
참조에 의한 포함
본원에서 언급된 특허 문헌 및 과학 논문들은 각각 그 전체 개시내용이 모든 목적을 위한 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 필수적인 특징으로부터 벗어남 없이 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 그러므로, 상기 실시양태는 본원에 기술된 본 발명을 제한한다기 보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 범주는 상기 설명에 의해서라기보다는 첨부된 특허청구범위에 의해 명시되며, 특허청구범위와 등가인 의미 및 범위 내에 포함되어 있는 모든 변형도 그 안에 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOGRA PHARMA LIMITED <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING AND TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISORDERS <130> GIU-038 <140> <141> <150> PCT/EP2015/067306 <151> 2015-07-28 <150> 62/029,875 <151> 2014-07-28 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1796 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 catcagacgg gaagcctgga ctgtgggttg ggggcagcct cagcctctcc aacctggcac 60 ccactgcccg tggcccttag gcacctgctt ggggtcctgg agccccttaa ggccaccagc 120 aaatcctagg agaccgagtc ttggcacgtg aacagagcca gatttcacac tgagcagctg 180 cagtcggaga aatcagagaa agcgtcaccc agccccagat tccgaggggc ctgccaggga 240 ctctctcctc ctgctccttg gaaaggaaga ccccgaaaga cccccaagcc accggctcag 300 acctgcttct gggctgccat gggacttgcg gccaccgccc cccggctgtc ctccacgctg 360 ccgggcagat aagggcagct gctgcccttg gggcacctgc tcactcccgc agcccagcca 420 ctcctccagg gccagccctt ccctgactga gtgaccacct ctgctgcccc gaggccatgt 480 aggccgtgct taggcctctg tggacacact gctggggacg gcgcctgagc tctcaggggg 540 acgaggaaca ccaccatgcc ccggggcttc acctggctgc gctatcttgg gatcttcctt 600 ggcgtggcct tggggaatga gcctttggag atgtggccct tgacgcagaa tgaggagtgc 660 actgtcacgg gttttctgcg ggacaagctg cagtacagga gccgacttca gtacatgaaa 720 cactacttcc ccatcaacta caagatcagt gtgccttacg agggggtgtt cagaatcgcc 780 aacgtcacca ggctgcagag ggcccaggtg agcgagcggg agctgcggta tctgtgggtc 840 ttggtgagcc tcagtgccac tgagtcggtg caggacgtgc tgctcgaggg ccacccatcc 900 tggaagtacc tgcaggaggt ggagacgctg ctgctgaatg tccagcaggg cctcacggat 960 gtggaggtca gccccaaggt ggaatccgtg ttgtccctct tgaatgcccc agggccaaac 1020 ctgaagctgg tgcggcccaa agccctgctg gacaactgct tccgggtcat ggagctgctg 1080 tactgctcct gctgtaaaca aagctccgtc ctaaactggc aggactgtga ggtgccaagt 1140 cctcagtctt gcagcccaga gccctcattg cagtatgcgg ccacccagct gtaccctccg 1200 cccccgtggt cccccagctc cccgcctcac tccacgggct cggtgaggcc ggtcagggca 1260 cagggcgagg gcctcttgcc ctgagcaccc tggatggtga ctgcggatag gggcagccag 1320 accagctccc acaggagttc aactgggtct gagacttcaa ggggtggtgg tgggagcccc 1380 ccttgggaga ggacccctgg gaagggtgtt tttcctttga gggggattct gtgccacagc 1440 agggctcagc ttcctgcctt ccatagctgt catggcctca cctggagcgg aggggacctg 1500 gggacctgaa ggtggatggg gacacagctc ctggcttctc ctggtgctgc cctcactgtc 1560 cccccgccta aagggggtac tgagcctcct gtggcccgca gcagtgaggg cacagctgtg 1620 ggttgcaggg gagacagcca gcacggcgtg gccattctat gaccccccag cctggcagac 1680 tggggagctg ggggcagagg gcggtgccaa gtgccacatc ttgccatagt ggatgctctt 1740 ccagtttctt ttttctatta aacaccccac ttcctttgga aaaaaaaaaa aaaaaa 1796 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly 1 5 10 15 Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn 20 25 30 Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg 35 40 45 Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile 50 55 60 Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu 65 70 75 80 Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu 85 90 95 Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly 100 105 110 His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn 115 120 125 Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser 130 135 140 Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg 145 150 155 160 Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr 165 170 175 Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu 180 185 190 Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala 195 200 205 Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro 210 215 220 His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu 225 230 235 240 Leu Pro <210> 3 <211> 972 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 35 40 45 Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 165 170 175 Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 180 185 190 Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 195 200 205 Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 210 215 220 Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 225 230 235 240 Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 500 505 510 Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu 515 520 525 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro 530 535 540 Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu 565 570 575 Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala 580 585 590 Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp 595 600 605 Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala 610 615 620 Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 625 630 635 640 Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 645 650 655 Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 660 665 670 Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 675 680 685 Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 690 695 700 Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 705 710 715 720 Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 725 730 735 Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 750 Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 755 760 765 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 770 775 780 Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 785 790 795 800 Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 820 825 830 Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845 Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 850 855 860 Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 865 870 875 880 Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 900 905 910 Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 915 920 925 Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 930 935 940 Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 945 950 955 960 Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys 965 970 <210> 4 <211> 498 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu 65 70 75 80 Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val 85 90 95 Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp 100 105 110 Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro 115 120 125 Leu Met Arg His 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Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg Leu 340 345 350 Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro Gly 355 360 365 Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro Glu 370 375 380 Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys 385 390 395 400 Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu Gln Cys Ser 405 410 415 Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln Val Trp Asp 420 425 430 Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His Lys Val Thr 435 440 445 Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gln Thr Tyr 450 455 460 Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe Ile 465 470 475 480 Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu Phe Leu Phe 485 490 495 Thr Pro

Claims (36)

  1. 환자에서 IL-34를 억제시키는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  2. 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34를 억제시키는 것을 포함하는, 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34를 억제시키는 것이 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시키는 것인 방법.
  4. 염증성 장 질환 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 IL-34의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  5. IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제의 투여를 포함하는, 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IL-34의 억제제의 제약상 허용되는 제제를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것인 방법.
  7. 유효량의 IL-34의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 염증성 시토카인 생산을 억제시키는 방법.
  8. 유효량의 IL-34의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 앓는 환자의 세포에서 IL-34 매개 염증성 반응을 감소 또는 억제시키는 방법.
  9. 유효량의 IL-34의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환 치료를 필요로 하는 환자에서 IL-34 발현 변경과 연관된 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 억제제가 IL-34의 수용체의 억제제인 방법.
  11. 제10항에 있어서, IL-34의 수용체가 콜로니 자극 인자 1 수용체인 방법.
  12. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 억제제가 IL-34에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 8 내지 40개의 뉴클레오티드 길이인 방법.
  14. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 억제제가 항체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 전장의 항체, 키메라 항체, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 항체가 IL-34 단백질 서열 (서열식별번호: 2) 또는 콜로니 자극 인자 1 수용체 단백질 서열 (서열식별번호: 3)에 대한 항체인 방법.
  17. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 억제제가 펩티드 억제제인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 펩티드 억제제가 콜로니 자극 인자 1 수용체의 세포외 도메인의 일부분 (서열식별번호: 4)을 포함하는 것인 방법.
  19. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 억제제가 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로 투여되는 것인 방법.
  20. 제4항 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에서 있어서, 제약 조성물이 국소적으로, 비경구적으로, 경구적으로, 폐로, 기관내로, 비내로, 경피적으로, 또는 십이지장내로 투여되는 것인 방법.
  22. IL-34의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 염증성 장 질환 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물.
  23. 염증성 장 질환 치료용 의약 제조에서 IL-34의 억제제의 용도.
  24. 환자의 하나 이상의 생물학적 샘플 중에서 IL-34 발현 신호 수준을 검출하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환 환자를 진단하는 방법.
  25. 염증성 장 질환을 앓는 환자의 하나 이상의 생물학적 샘플 중 IL-34 발현 신호 수준을 검출하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 앓는 환자가 IL-34의 억제제를 이용하는 치료에 대한 후보인지 여부를 결정하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, IL-34 발현 신호가 펩티드, 단백질, 또는 RNA 신호인 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, IL-34 발현 신호를, 1명 이상의 염증성 장 질환을 앓지 않는 환자의 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플, 1명 이상의 염증성 장 질환을 앓는 환자의 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플, 및/또는 1명 이상의 염증성 장 질환에 대하여 치료받은 환자의 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플로부터의 IL-34 발현 신호와 비교하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 해부학적으로 등가인 생물학적 샘플이 IL-34의 억제제를 이용한 치료 이전 및 이후의 같은 환자로부터 유래된 것인 방법.
  29. 제24항 또는 제25항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 것인 방법.
  30. 제24항 또는 제25항에 있어서, 적어도 1종의 생물학적 샘플을 수득할 때, 환자는 적어도 1종의 IL-34의 억제제를 받게 되는 것인 방법.
  31. 제24항 또는 제25항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 조직 샘플, 세포 샘플, 혈청 샘플, 또는 대변 샘플인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 생물학적 샘플이 환자의 위장관으로부터의 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제21항 또는 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  34. 제1항 내지 제21항 또는 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제22항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  36. 제23항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병, 위십이지장 크론병, 크론성 (육아종) 결장염, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병, 미세형 결장염, 궤양성 직장염, 직장 S상 결장염, 공회장염, 좌측 결장염, 범결장염, 회결장염, 회장염, 및 불확정 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
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