WO2023080157A1 - Ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ）の治療又は予防剤、並びに、ｈａｍの治療有効性判定方法、活動性評価方法又は診断方法 - Google Patents

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WO2023080157A1
WO2023080157A1 PCT/JP2022/040989 JP2022040989W WO2023080157A1 WO 2023080157 A1 WO2023080157 A1 WO 2023080157A1 JP 2022040989 W JP2022040989 W JP 2022040989W WO 2023080157 A1 WO2023080157 A1 WO 2023080157A1
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WO
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ham
map3k8
inhibitor
mek1
substance
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PCT/JP2022/040989
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薫 内丸
誠 山岸
香帆 永井
嘉久 山野
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国立大学法人東京大学
学校法人 聖マリアンナ医科大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic or preventive agent for HTLV-1-associated myelopathy (HAM) and a method for treating HAM.
  • the present invention also relates to a method for determining therapeutic effectiveness, a method for evaluating HAM activity, or a method for diagnosing HAM, and a kit used for these methods.
  • HTLV-1 Human T-cell Lukemia Virus Type 1
  • T-cells mainly CD4-positive T-cells
  • HTLV-1 infected T cells cause chronic inflammation in the spinal cord.
  • damage and degeneration of spinal nerve cells are caused, causing spastic spinal cord paralysis and the like.
  • Spastic spinal cord paralysis caused by cells infected with HTLV-1 is called HTLV-1-associated myelopathy (hereinafter also referred to as "HAM").
  • HAM HTLV-1-associated myelopathy
  • Symptoms of HAM include paralysis of both legs, pain, and dysuria due to nerve tissue damage. As these symptoms progress, the patient becomes wheelchair-bound and bedridden.
  • HAM is one of the diseases designated as a designated intractable disease in Japan. At present, no effective treatment method for HAM has been established, and symptomatic treatment is exclusively performed. Methods for treating HAM have been proposed, for example, a method using an anti-CCR4 antibody and a method using an RGMa inhibitor (Non-Patent Document 1, Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Documents 1 and 2 are known, a causative factor that triggers the chronic inflammatory loop caused by HTLV-1 infected cells as described above has been identified. It has not been.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel therapeutic or preventive method or the like capable of treating HAM.
  • mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (hereinafter referred to as "MAP3K8") is a causative factor of the chronic inflammatory loop caused by HTLV-1 infected cells. Also called.) was found. Furthermore, the present inventors have found that suppressing the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved is effective in treating HAM, and have completed the present invention.
  • a therapeutic or preventive agent for HTLV-1-associated myelopathy comprising a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8).
  • HAM HTLV-1-associated myelopathy
  • MAP3K8 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8
  • the agent for treating or preventing HAM according to [1] wherein the substance is a MAP3K8 inhibitor, MAP3K8 gene expression inhibitor, MEK1/2 inhibitor, and/or ERK1/2 inhibitor.
  • the agent for treating or preventing HAM according to [1] wherein the substance is a MEK1/2 inhibitor.
  • Efficacy of treating or preventing HTLV-1-associated myelopathy (HAM) in a subject comprising measuring the activation level of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8) in said subject.
  • a method of assessing HTLV-1-associated myelopathy (HAM) activity in a subject comprising measuring the activation level of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8) in said subject. .
  • determining whether a subject has HTLV-1-associated myelopathy (HAM), comprising measuring the activation level of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8) in the subject. how to diagnose.
  • HAM HTLV-1-associated myelopathy
  • HAM comprising administering a pharmacologically effective amount of a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8) to patients with HAM.
  • Method of treatment [12-1] The method for treating HAM according to [12], wherein the substance is a MAP3K8 inhibitor, a MAP3K8 gene expression inhibitor, a MEK1/2 inhibitor, and/or an ERK1/2 inhibitor.
  • MAP3K8 inhibitor mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8
  • MEK1/2 inhibitor mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8
  • MAP3K8 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 8
  • the substance is a MAP3K8 inhibitor, a MAP3K8 gene expression inhibitor, a MEK1/2 inhibitor, and/or an ERK1/2 inhibitor.
  • a composition for treating or preventing HTLV-1-associated myelopathy comprising a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8).
  • the substance is a MAP3K8 inhibitor, a MAP3K8 gene expression inhibitor, a MEK1/2 inhibitor, and/or an ERK1/2 inhibitor.
  • MAP3K8 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase kinase 8
  • HAM mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 8
  • the substance is a MAP3K8 inhibitor, a MAP3K8 gene expression inhibitor, a MEK1/2 inhibitor, and/or an ERK1/2 inhibitor.
  • MAP3K8 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8
  • HAM HTLV-1-associated myelopathy
  • HAM which is an intractable disease
  • HAM can be treated or prevented.
  • FIG. 1 shows an example of a MAPK signaling pathway involving MAP3K8 or Raf.
  • FIG. 2 is a diagram showing an overview of estimation of causative factors of HAM; MAP3K8 in T cells derived from healthy subjects (Resting.CD4.), HTLV-1 unaffected subjects (AC_P, AC_D, AC_N), HAM patients (HAM_D), and ATL patients (iATL_D, iATL_N, aATL_N) It is a figure which shows the expression level of.
  • FIG. 3 shows open chromatin data and mRNA expression levels.
  • FIG. 3 shows the correlation between the expression levels of MAP3K8, IFNG, and TBX21 in HAM-derived infected cells and the concentrations of CXCL10 and neopterin in cerebrospinal fluid.
  • FIG. 4 shows that phosphorylated ERK1/2 levels in HAM patient spinal fluid-derived HTLV-1-infected T cells are suppressed by MEK1/2 inhibitor treatment.
  • FIG. 4 shows suppression of IFNG and CXCL10 expression in HAM-derived infected cell lines by MEK1/2 inhibitor treatment.
  • FIG. 4 shows growth inhibition of HAM-derived infected cells by MEK1/2 inhibitor treatment.
  • FIG. 4 shows the results of treating HAM-derived infected cells with various MEK1/2 inhibitors.
  • FIG. 4 shows that MEK1/2 inhibitor treatment suppressed the expression of genes related to immune response and the like in HAM-derived infected cells.
  • FIG. 1 shows that the phosphorylation levels of MEK1/2 and ERK1/2 are enhanced in transformants in which MAP3K8 expression is induced, and that the phosphorylation levels of ERK1/2 are decreased by treatment with MEK1/2 inhibitors. is.
  • FIG. 1 shows that the phosphorylation levels of MEK1/2 and ERK1/2 are enhanced in transformants in which MAP3K8 expression is induced, and that the phosphorylation levels of ERK1/2 are decreased by treatment with MEK1/2 inhibitors. is.
  • FIG. 4 shows results of effects on spontaneous proliferative activity with respect to effects of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMCs.
  • FIG. 4 shows the results of effects on CXCL10 or cytokine production with respect to effects of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMCs.
  • Fig. 2 shows the percentage of proliferating cells (Ki67+ cells) in HAM-PBMCs in relation to the effect of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMCs (*p ⁇ 0.05).
  • FIG. 4 shows the proportion of proliferating cells (Ki67+ cells) in PBMC cultured with the addition of DMSO, binimetinib, trametinib, or PSL for each HAM patient.
  • FIG. 2 shows the proportion of proliferating cells (Ki67+ cells) in HAM-CD4+ T cells with respect to the effect of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMCs (*p ⁇ 0.05).
  • Fig. 3 shows the proportion of proliferating cells (Ki67+ cells) in HAM-CD4+CCR4+ T cells with respect to the effect of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMCs (*p ⁇ 0.05).
  • Fig. 2 shows the proportion of proliferating cells (Ki67+ cells) in HAM-CD8+ T cells with respect to the effect of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMCs (*p ⁇ 0.05).
  • FIG. 10 shows the percentage of Tax-specific CTL in HAM-CD8 with respect to the effect of MEK1/2 inhibitors on HAM patient PBMC (*p ⁇ 0.05).
  • this embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “this embodiment") will be described in detail, but the present invention is not limited to this, and various modifications can be made without departing from the scope of the invention. is possible.
  • a therapeutic or preventive agent for HAM includes a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 (MAP3K8).
  • the MAPK signaling pathway is a signaling pathway involved in cell proliferation, and is also referred to as mitogen-activated protein kinase (MAPK), MAPK kinase, and MAPKK kinase (MAPKKK, hereinafter referred to as "MAP3K”.
  • MAP3K mitogen-activated protein kinase
  • MAPKK MAPK kinase
  • MAPKKK MAPKK kinase
  • MAP3K MAP3K
  • Protein kinases are enzymes that phosphorylate serine and/or threonine and/or tyrosine in peptides and/or proteins.
  • MAPKs are divided into four families in mammals, specifically extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2 (hereinafter referred to as "ERK1/2");ERK5; c-Jun N-terminal kinase; (JNK); and p38 MAPK, and each family is known to form an independent cascade.
  • ERK1/2 extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2
  • JNK c-Jun N-terminal kinase
  • p38 MAPK a family in mammals, specifically extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2
  • each family is known to form an independent cascade.
  • the cascade involving ERK1/2 is mainly activated by growth factors, etc.
  • ERK1/2 downstream When ERK1/2 downstream is activated, it translocates into the nucleus and interacts with transcription factors etc. to activate cell proliferation signals. .
  • ERK1/2 is activated (phosphorylated) by MAPK kinases MAPK/ERK kinases 1 and 2 (hereinafter referred to as "MEK1/2"), and MEK1/2 is activated by multiple MAP3Ks typified by Raf. It can be activated (phosphorylated).
  • MEK1/2 also known as Tpl-2, COT, or MEKK8, is a type of MAP3K that phosphorylates MEK1/2.
  • MAPK signaling pathways in which MAP3K8 is involved include, for example, phosphorylation of MEK1/2 by MAP3K8, phosphorylation of ERK1/2 by phosphorylated MEK1/2, and activation of transcription factors and the like by phosphorylated ERK1/2. transmission route.
  • FIG. 1 shows an example of a MAPK signaling pathway involving MAP3K8 or Raf.
  • the MAPK signaling pathways in which MAP3K8 is involved are indicated by lines.
  • phosphorylated MEK1/2 is sometimes referred to as p-MEK1/2
  • phosphorylated ERK1/2 is sometimes referred to as p-ERK1/2.
  • MAP3K8 is one of the causative factors of the chronic inflammatory loop caused by HTLV-1-infected cells, as shown in Examples below. That is, the present inventors found that MAP3K8 is specifically overexpressed in HAM patients. In addition, based on the findings, it is presumed that inflammatory cytokines are excessively produced as a result of excessive activation of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 in the body of HAM patients. We have found that suppressing the activity of the signal transduction pathway is effective in treating or preventing HAM.
  • the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved may be a pathway that contributes to the production of inflammatory cytokines.
  • the inflammatory cytokine may be interferon (IFN), interleukin (IL), tumor necrosis factor (TNF), and/or chemokine.
  • the inflammatory cytokine may be CXCL10, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6 and/or IL-10.
  • a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved (hereinafter also simply referred to as an “inhibitor”), which is contained in a therapeutic or prophylactic agent for HAM, suppresses the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved. It is a substance that causes As used herein, “suppressing the activity of a signal transduction pathway” means inhibiting at least a portion of signal transduction in the signal transduction pathway, for example, reducing or eliminating the activity of at least one protein kinase , inhibiting phosphorylation of at least one protein, inhibiting signaling other than phosphorylation, and the like. As used herein, the term “inhibition of activity” also includes reducing or eliminating the function or activity in the absence of inhibitors.
  • the inhibitor is a protein kinase cascade comprising phosphorylation of MEK1/2 by MAP3K8, phosphorylation of ERK1/2 by phosphorylated MEK1/2, and activation of transcription factors and the like by phosphorylated ERK1/2, It can inhibit at least one protein kinase or interact with at least one substrate of at least one protein kinase to suppress the activity of the signal transduction pathway of that protein kinase cascade.
  • the inhibitor in one aspect, inhibits at least one protein kinase or interacts with at least one substrate of at least one protein kinase in the MAPK signaling pathway that involves MAP3K8 and contributes to the production of inflammatory cytokines. and can suppress the activity of the protein kinase cascade signaling pathway.
  • the suppressive substance is not particularly limited as long as it suppresses (reduces or eliminates) the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved.
  • it may be a low-molecular-weight compound or the like.
  • the term "low molecular weight compound” means compounds other than proteins, peptides, peptidomimetics, nucleic acids, carbohydrates, and lipids. means a compound.
  • the therapeutic or prophylactic agent for HAM may contain one inhibitory substance alone, or may contain two or more inhibitory substances in combination.
  • An inhibitory substance may be, for example, a MAP3K8 inhibitor or a MAP3K8 gene expression inhibitor.
  • the MAP3K8 inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that suppresses the phosphorylation activity of MAP3K8 protein.
  • the MAP3K8 inhibitor may be, for example, a substance that binds to MAP3K8, or a substance that binds to a substrate of MAP3K8 and suppresses the phosphorylation activity of MAP3K8.
  • a MAP3K8 inhibitor may be a substance (eg, a small molecule compound or an antibody) that recognizes MAP3K8 or a substrate of MAP3K8.
  • the MAP3K8 inhibitor may be a substance that suppresses phosphorylation of MEK1/2 by MAP3K8, a substance that suppresses phosphorylation of MEK1 by MAP3K8, or a substance that suppresses phosphorylation of MEK2 by activated MAP3K8. It's okay.
  • Non-limiting examples of MAP3K8 inhibitors include those shown in the table below and derivatives thereof that have MAP3K8 inhibitory activity. Other commercially available agents may be used as MAP3K8 inhibitors.
  • the MAP3K8 gene expression inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that is involved in the expression of the MAP3K8 gene and suppresses the expression of MAP3K8.
  • the MAP3K8 gene expression inhibitor may be siRNA (short interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), and antisense oligonucleotides of the MAP3K8 gene, and siRNA, shRNA, and antisense of genes involved in the expression of the MAP3K8 gene. It may be an oligonucleotide.
  • Examples of the gene whose expression is suppressed by the MAP3K8 gene expression inhibitor include, for example, the human MAP3K8 gene, and more specifically, the human MAP3K8 gene stored in the NCBI database, but is not limited thereto. .
  • Information on the nucleotide sequences of MAP3K8 genes derived from various organisms can be obtained from databases such as GenBank.
  • An example of the amino acid sequence of human MAP3K8 and the base sequence of the human MAP3K8 gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • a MAP3K8 gene expression inhibitor may suppress gene expression by inhibiting transcription, translation, or both of the MAP3K8 gene.
  • siRNA is a double-stranded RNA that can suppress the expression of the target MAP3K8 gene.
  • the length (base length) of the base sequence in the siRNA is not particularly limited, but is preferably less than about 30 bases, more preferably about 19-27 bases, still more preferably about 21-25 bases.
  • shRNA is a single-stranded RNA containing a partially palindromic nucleotide sequence, and has a double-stranded structure and a 3′ end overhang in the molecule, and consists of a short hairpin structure of about 20 bases. It is a pair or more molecules.
  • the shRNA After being introduced into the cell, the shRNA is degraded to a length of about 20 bases in the cell and can suppress the expression of the target MAP3K8 gene, similar to siRNA.
  • siRNA and shRNA may be chemically synthesized artificially.
  • siRNA and shRNA may be synthesized in vitro from template DNA to antisense and sense RNA using, for example, T7 RNA polymerase and T7 promoter.
  • Antisense oligonucleotides may be nucleotides that are complementary to or hybridize to a continuous base sequence of less than about 30 bases in the DNA sequence of the MAP3K8 gene, and may be either DNA or RNA. Moreover, it may be modified as long as it does not interfere with the function. Antisense oligonucleotides can be synthesized by conventional methods, and can be easily synthesized by, for example, a commercially available DNA synthesizer.
  • the inhibitor may be a MEK1/2 inhibitor.
  • the MEK1/2 inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that suppresses the phosphorylation activity of MEK1/2 protein.
  • the MEK1/2 inhibitor may be an inhibitor of MEK1 and MEK2, an inhibitor of MEK1, or an inhibitor of MEK2.
  • the MEK1/2 inhibitor may be, for example, a substance that binds to MEK1 and/or 2, or a substance that binds to a substrate of MEK1 and/or 2 and suppresses phosphorylation by MEK1 and/or 2. , p-MEK1 and/or 2 to dephosphorylate and inactivate them.
  • a MEK1/2 inhibitor may be a substance (eg, a small molecule compound or an antibody) that recognizes either MEK1/2 or a substrate of MEK1/2.
  • the MEK1/2 inhibitor may be a substance that binds to MEK1 and/or 2 or p-MEK1 and/or 2 and suppresses phosphorylation of ERK1 and/or 2 by p-MEK1 and/or 2.
  • Non-limiting examples of MEK1/2 inhibitors include those shown in the table below and derivatives thereof that have MEK1/2 inhibitory activity. Other commercially available agents may be used as MEK1/2 inhibitors.
  • the inhibitor may be an ERK1/2 inhibitor.
  • the ERK1/2 inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that suppresses the phosphorylation activity of ERK1/2 protein.
  • the ERK1/2 inhibitor may be an inhibitor of ERK1 and ERK2, an inhibitor of ERK1, or an inhibitor of ERK2.
  • the ERK1/2 inhibitor may be, for example, a substance that binds to ERK1 and/or 2, or a substance that binds to a substrate of ERK1 and/or 2 and suppresses phosphorylation by ERK1 and/or 2. , p-ERK1 and/or 2 to dephosphorylate and inactivate them.
  • the ERK1/2 inhibitor may be a substance (low molecular weight compound or antibody) that recognizes either ERK1/2 or a substrate of ERK1/2.
  • the ERK1/2 inhibitor may be a substance that binds to ERK1 and/or 2 or p-ERK1 and/or 2 and suppresses phosphorylation of a transcription factor or the like by p-ERK1 and/or 2, and p- It may be a substance that suppresses nuclear translocation of ERK1 and/or 2.
  • Non-limiting examples of ERK1/2 inhibitors include Rineterkib, Ravoxertinib, Ulixertinib, Astragaloside IV, Piperlongumine, Mogrol, Magnolin, Corinoxein, Methylthiouracil, Methylnissoline (Astrapterocarpane), 2 , 5-dihydroxyacetophenone, deltonin, hypothemycin, and those shown in the table below, and derivatives thereof with ERK1/2 inhibitory activity.
  • Other commercially available agents may be used as ERK1/2 inhibitors.
  • the inhibitory substance preferably has cell permeability. Therefore, the suppressing substance is preferably a low-molecular-weight compound among the above examples. Alternatively, the antibody or the like exemplified above with cell permeability is also preferable.
  • the inhibitory substance may be a low-molecular compound having a molecular weight of 700 or less, and may be a compound having a molecular weight of 700 or less, two or more aromatic rings, and at least one fluorine atom.
  • the inhibitory substance is a substance that inhibits the activity of upstream protein kinases in the MAPK signaling pathway involving MAP3K8.
  • Preferred embodiments of inhibitors include, for example, MAP3K8 inhibitors, MAP3K8 gene expression inhibitors, and MEK1/2 inhibitors.
  • a more preferred embodiment of the inhibitory substance is a MEK1/2 inhibitor, more preferably a MEK1/2 inhibitor that is a low-molecular-weight compound (for example, the molecular weight is 700 or less).
  • the inhibitor may be at least one selected from the group consisting of trametinib, binimetinib, selumetinib, cobimetinib, and derivatives thereof having MEK1/2 inhibitory activity.
  • the antibody may be an antibody that binds to a protein kinase or the like in the MAPK signal transduction pathway in which MAP3K8 is involved and inhibits its activity. It may be an antibody that renders it unable to bind to the substrate.
  • the above antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies. Antibodies may also be of any of the IgG, IgM, IgA, IgD and IgE isotypes.
  • the above antibody may be, for example, a mouse antibody, a human CDR-grafted antibody, a human chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody, or may be a low-molecular-weight antibody.
  • a human CDR-grafted antibody is an antibody in which the CDRs of a non-human animal antibody are replaced with the CDRs of a human antibody.
  • a human chimeric antibody is an antibody consisting of a variable region derived from a non-human animal antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody refers to a non-human animal antibody in which a portion derived from a human antibody is incorporated while leaving a portion of the highly safe region. The concept encompasses CDR-grafted antibodies.
  • a low-molecular-weight antibody is an antibody fragment or an antibody fragment bound to an arbitrary molecule, and is an antibody that recognizes the same epitope as the original antibody.
  • Fab consisting of VL, VH, CL and CH1 regions; F(ab′)2 in which two Fabs are linked by a disulfide bond at the hinge region; Fv consisting of VL and VH; scFv, which is a single-chain antibody linked by a polypeptide linker, as well as sdFv, Diabody, and sc(Fv)2, but are not limited to these.
  • the inhibitory substance when the inhibitory substance is a low-molecular-weight compound, the low-molecular-weight compound may be produced by a known method, or may be obtained by purchasing a commercially available product.
  • the inhibitory substance when the inhibitory substance is an antibody, it can be produced by a known method using the protein kinase of interest or a fragment thereof as an immunogen.
  • Inhibitory substances may also be pharmacologically acceptable salts of the substances mentioned above.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, salts with pharmaceutically acceptable bases and acids.
  • Specific non-limiting examples of pharmacologically acceptable salts include addition salts of inorganic acids (hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.), organic acids (p-toluenesulfone acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p-bromophenylsulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, acetic acid, etc.) addition salts, inorganic bases (ammonium hydroxide or alkali or alkaline earth metal hydroxides , carbonates, bicarbonates, etc.), addition salts of amino acids, and the like.
  • the therapeutic or preventive agent for HAM is not particularly limited as long as it contains the inhibitory substance, but may further contain a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive, and may be formulated.
  • Formulations include oral agents such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, and emulsions; injections, infusions, suppositories, ointments, and parenteral agents such as patches.
  • the content of the carrier or additive may be appropriately set based on the range normally employed in the pharmaceutical field. Examples of the carrier include, but are not limited to, water, physiological saline, other aqueous solvents, and aqueous or oily bases.
  • additives examples include, but are not limited to, excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption enhancers, lubricants, coloring agents, corrigents, perfumes, and the like.
  • excipients examples include, but are not limited to, excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption enhancers, lubricants, coloring agents, corrigents, perfumes, and the like.
  • binders examples include, but are not limited to, excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption enhancers, lubricants, coloring agents, corrigents, perfumes, and the like.
  • disintegrants examples include, but are not limited to, excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption enhancers, lubricants, coloring agents, corrigents, perfumes, and the like.
  • the inhibitory substance is a low-molecular-weight compound
  • the low-molecular-weight compound is an oral formulation (e.g., tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules) formulated with a pharmaceutically acceptable carrier. , solutions, suspensions, or emulsions) by the oral route of administration.
  • the inhibitory substance is an antibody that recognizes a protein kinase such as MAP3K8, MEK1/2, and/or ERK1/2
  • the antibody is an injection or infusion formulated with a pharmaceutically acceptable carrier
  • a parenteral route of administration eg, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous or topical.
  • injections or infusions containing the antibody may be used as solutions, suspensions or emulsions.
  • Solvents to be used include, for example, distilled water for injection, physiological saline, glucose solution, and isotonic solution (e.g., solutions of sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, propylene glycol, etc.). etc. These solvents may be used singly or in combination of two or more.
  • the above injections or infusions may contain additives such as stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, preservatives, and pH adjusters.
  • Stabilizers include, for example, albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol, propylene glycol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium EDTA, sodium citrate, and dibutylhydroxytoluene. be done.
  • solubilizing agents include alcohols (e.g., ethanol, etc.), polyalcohols (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), and nonionic surfactants (e.g., polysorbate 80 (registered trademark), HCO-50, etc.). ) and the like.
  • Suspending agents include, for example, glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, sodium lauryl sulfate and the like.
  • Emulsifiers include, for example, gum arabic, sodium alginate, tragacanth, and the like.
  • Analgesics include, for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol, and the like.
  • buffers include phosphate buffers, acetate buffers, borate buffers, carbonate buffers, citrate buffers, Tris buffers and the like.
  • preservatives include methyl parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate, butyl parahydroxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, and borax and the like.
  • antiseptics include benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol, and the like.
  • pH adjusters include hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, and acetic acid.
  • the inhibitory substance when the inhibitory substance is a MAP3K8 gene expression inhibitor, the inhibitory substance can also be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • administration methods include methods of introducing nucleic acid molecules using liposomes (liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method). etc.), a microinjection method, and a method of transferring nucleic acid molecules into cells together with carriers (metal particles) using a gene gun.
  • viral vectors such as recombinant adenoviruses and retroviruses can be used.
  • DNA expressing siRNA or shRNA in DNA or RNA viruses such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, polio virus, Sindbis virus, Sendai virus, and SV40 and infecting cells or tissues with this recombinant virus, a gene can be introduced into cells or tissues.
  • the therapeutic or preventive agent for HAM of this embodiment can inhibit the spontaneous proliferative activity of HTLV-1-infected T cells.
  • the therapeutic or preventive agent for HAM of this embodiment can suppress the expression of genes associated with immune response.
  • the therapeutic or preventive agent for HAM of this embodiment can suppress the production of inflammatory cytokines.
  • the agent for treating or preventing HAM of the present embodiment may be useful for treating or preventing HAM patients who are resistant to steroid therapeutics such as prednisolone.
  • One aspect of this embodiment is a pharmaceutical formulation used for treating or preventing HAM.
  • the pharmaceutical formulation of this embodiment contains the therapeutic or prophylactic agent for HAM of this embodiment.
  • the pharmaceutical formulation contains any of the above substances (suppressive substances) that suppress the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved.
  • HAM can be prevented or treated.
  • the dosage of therapeutic or prophylactic agents for HAM or pharmaceutical preparations containing them should be determined appropriately in consideration of the purpose, severity of the disease, age, body weight, sex, medical history, type of active ingredient, etc. of the patient. may
  • the therapeutic or preventive agent for HAM of this embodiment can suppress overproduction of inflammatory cytokines caused by MAP3K8, which is abnormally expressed specifically in HAM patients. Therefore, HAM therapeutic or prophylactic agents may provide prevention, amelioration, and/or prevention of progression of chronic inflammatory loops by HTLV-1 infected cells.
  • the therapeutic or prophylactic agent for HAM of this embodiment can be effective in ameliorating the pathology or symptoms of HAM, preventing or reducing the progress of HAM, and/or preventing the onset of HAM in HTLV-1 infected cell carriers.
  • HAM can be treated or prevented by suppressing the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved.
  • One aspect of the present embodiment is a method for treating or preventing HAM, which comprises administering to a HAM patient a pharmacologically effective amount of a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved (an inhibitory substance). be.
  • Subjects to which a method for treating or preventing HAM is applied may be humans or non-human mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved (inhibitor) is determined by considering the purpose, severity of the disease, age, weight, sex, medical history of the patient, type of active ingredient, etc. can be set as appropriate.
  • a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 for use in the treatment or prevention of HAM is: A pharmaceutical composition containing a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved, for use in treating or preventing HAM; use of a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 for treating or preventing HAM; Use of a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of HAM; or MAPK signal involving MAP3K8 for use in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of HAM. It may be a substance that suppresses the activity of the transduction pathway.
  • the substance may be any of the inhibitory substances described above.
  • Yet another aspect of this embodiment is: A method of determining efficacy of treating or preventing HAM in a subject, comprising measuring the activation level of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 in the subject; A method of evaluating HAM activity in a subject comprising measuring the activation level of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 in the subject; or Measuring the activation level of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 in the subject.
  • a method of diagnosing whether the subject is suffering from HAM comprising:
  • the method for measuring the activation level of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved is not particularly limited, but for example, measuring the MAP3K8 concentration in the subject's peripheral blood; and/or 2 or ERK1 and/or 2 concentration; measuring the phosphorylation level of MEK1 and/or 2 in the peripheral blood of the subject; phosphorylation of ERK1 and/or 2 in the peripheral blood of the subject measuring the oxidation level; measuring the expression level of mRNA encoding MEK1 and/or 2 or ERK1 and/or 2 in the peripheral blood of the subject; These markers may be obtained not only from peripheral blood but also by other methods (for example, obtaining from cerebrospinal fluid).
  • MAP3K8 concentration may be measured using an anti-MAP3K8 antibody.
  • p-MEK1 and/or 2 may be measured using an anti-p-MEK1 antibody and/or an anti-p-MEK2 antibody.
  • p-ERK1 and/or 2 may be measured using an anti-p-ERK1 antibody and/or an anti-p-ERK2 antibody.
  • the concentrations of MEK1 and/or 2 and ERK1 and/or 2 may be measured using anti-MEK1 and/or anti-MEK2 antibodies and anti-ERK1 and/or anti-ERK2 antibodies, respectively.
  • Expression levels of mRNA may be measured using known methods such as quantitative RT-PCR.
  • CXCL10 and neopterin in cerebrospinal fluid are used as markers in methods for evaluating HAM activity and diagnosing whether a person is suffering from HAM.
  • the activation level of the MAPK signaling pathway in which MAP3K8 is involved can be measured using a peripheral blood marker. It can be evaluated and more easily diagnosed whether or not one has HAM.
  • kits used for any of the above methods may contain an antibody for measuring the level of activation of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8.
  • the kit may contain an anti-MAP3K8 antibody, an anti-p-MEK1 antibody, an anti-p-MEK2 antibody, an anti-p-ERK1 antibody, and/or an anti-p-ERK2 antibody.
  • a substance that suppresses the activity of the MAPK signaling pathway involving MAP3K8 is preferred in the aspects described herein, as well as herein, It can be any of the aspects described as more preferred and more preferred (all of these aspects are hereinafter collectively referred to as "preferred aspects"). It may also be any combination of preferred aspects.
  • RNA-seq analysis Consolidated analysis of RNA-seq analysis and ATAC-seq analysis was performed for 4 groups of healthy subjects, HTLV-1 unaffected subjects, HAM patients, and ATL patients. As an overview, as shown in FIG. 2, identification of HAM-specific chromatin structural abnormalities by ATAC-seq analysis, identification of genes overexpressed in HAM patients by RNA-seq analysis, and RNA-seq analysis by Through the identification of HAM-specifically overexpressed genes, the causative factors of HAM were deduced.
  • RNA-seq analysis was performed as follows. First, HTLV-1 uninfected T cells (CD4 positive/CADM1 negative/ CD7-positive cells) and HTLV-1-infected T cells (CD4-positive/CADM1-positive/CD7-positive cells or CD4-positive/CADM1-positive/CD7-negative cells) were sorted. Whole gene expression data was obtained for these T cells by RNA-seq analysis. For the read count data obtained from the RNA-seq data, the total read number and the TPM value corrected for each transcript length were obtained and comparative analysis was performed.
  • ATAC-seq analysis was performed as follows. ATAC-seq analysis was performed on the cell population obtained in the same manner as the RNA-seq analysis, and genome-wide open chromatin structural analysis was performed. ATAC-seq analysis was commissioned to Active Motif, and chromatin preparation, ATAC reaction, and sequencing were performed. Open chromatin region data of each sample was analyzed from the obtained data.
  • the specimens used for the above analysis are as follows. ⁇ Normal T cells 3 cases (Resting.CD4.) ⁇ 10 cases of CD4-positive/CADM1-negative/CD7-positive T cells derived from HTLV-1 infected unaffected individuals (AC_P) ⁇ 8 cases of CD4-positive/CADM1-positive/CD7-positive HTLV-1 infected T cells derived from HTLV-1 infected unaffected individuals (AC_D) ⁇ 13 CD4-positive/CADM1-positive/CD7-positive HTLV-1 infected T cells derived from HAM patients (HAM_D) ⁇ 5 cases of CD4-positive/CADM1-positive/CD7-positive HTLV-1 infected T cells derived from patients with smoldering ATL or chronic ATL (iATL_D) ⁇ 9 cases of CD4-positive/CADM1-positive/CD7-negative HTLV-1 infected T cells derived from HTLV-1 infected unaffected individuals (AC_N)
  • MAP3K8 was presumed to be the causative factor of HAM.
  • a portion of the RNA-seq analysis is shown in FIG. FIG. 3 revealed that MAP3K8 was overexpressed in the HAM patient-derived cell group (HAM_D).
  • HAM_D HAM patient-derived cell group
  • TPM values are plotted.
  • the HAM_D group had a significantly higher expression level of MAP3K8 than all other groups (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 4 shows the results of examining the open chromatin data and mRNA expression levels of each sample at the MAP3K8, IFNG, and TBX21 loci.
  • FIG. 4 shows that the MAP3K8 locus has an enhancer region that opens the chromatin structure in a HAM-specific manner and is specifically overexpressed in HAM.
  • HAM patient cerebrospinal fluid-derived HTLV-1-infected T cell line HCT-4 was suspended in a medium (RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% FBS (GIBCO) and 100 U/ml Recombinant Human IL-2 (PeproTech)), 1 ⁇ 10 6 cells were seeded in a 6 cm dish.
  • Trametinib was then added at final concentrations of 0, 10, 100, and 1,000 nM, and cultured for 24 hours at 37°C, 5% CO2 . After that, total proteins were extracted and intracellular phosphorylated MEK1/2 levels (p-MEK1/2) and phosphorylated ERK1/2 levels (p-ERK1/2) were evaluated by Western blotting.
  • HAM-derived infected cell line HCT-4 was seeded on a 12-well plate at a rate of 1 ⁇ 10 5 cells, trametinib was added at a final concentration of 1,000 nM, and treated at 37° C., 5% CO 2 conditions for 0, 24, 48, Cultured for 72 and 96 hours.
  • Total RNA was extracted from cells at each culture time, and mRNA levels of IFNG and CXCL10 genes were measured by quantitative RT-PCR. ⁇ -actin gene mRNA was similarly measured and used as an internal standard.
  • the results (mean values) of three independent quantitative RT-PCR experiments and their standard deviations are shown in FIG. Trametinib treatment significantly suppressed the expression of IFNG and CXCL10 in HAM-derived infected cell lines. An inhibitory effect was detected from 24 hours.
  • HAM-derived infected cell line HCT-4 was seeded on a 12-well plate at a rate of 7.5 ⁇ 10 4 cells, and trametinib was added at final concentrations of 0, 10, 100, and 1,000 nM. Cultured for 96 hours under CO2 conditions. Subsequent cell counts were measured using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) to measure changes in relative cell counts due to trametinib treatment. The results (mean values) of three independent cell proliferation assays and their standard deviations are shown in FIG. Trametinib treatment significantly inhibited the growth of HAM-derived infected cell lines. An inhibitory effect was detected from 10 nM.
  • HAM patient cerebrospinal fluid-derived HTLV-1-infected T cell line HCT-4 was suspended in a medium (RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% FBS (GIBCO) and 100 U/ml Recombinant Human IL-2 (PeproTech)), 1 ⁇ 10 6 cells were seeded in a 6 cm dish.
  • a medium RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% FBS (GIBCO) and 100 U/ml Recombinant Human IL-2 (PeproTech)
  • a MEK1/2 inhibitor trametinib, binimetinib, selumetinib, or cobimetinib
  • a B-Raf inhibitor vemurafenib
  • total proteins were extracted and intracellular phosphorylated MEK1/2 levels (p-MEK1/2) and phosphorylated ERK1/2 levels (p-ERK1/2) were evaluated by Western blotting. As intracellular controls, expression levels of total MEK1/2 and total ERK1/2 were also assessed. The results of Western blotting are shown in the upper left of FIG.
  • HAM-derived infected cell line HCT-4 was pretreated and cultured for 24 hours at 37°C under 5% CO 2 conditions with PBS. washed.
  • This HCT-4 was suspended in a new RPMI1640 medium containing 10% FBS and 100 U/ml Recombinant Human IL-2, and 3 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 12 well plate, followed by addition of a MEK1/2 inhibitor (trametinib, or binimetinib) was added at a final concentration of 1,000 nM and cultured for 24 hours at 37°C and 5% CO2 .
  • RNA-seq analysis For the read count data obtained from the RNA-seq analysis data, the total read number and the TPM value corrected for each transcript length were obtained and comparative analysis was performed.
  • a lentiviral vector into which a cDNA encoding MAP3K8 was inserted was introduced into the human CD4-positive T-cell leukemia cell line Jurkat to establish a T cell line stably expressing MAP3K8.
  • Trametinib was added to control cells (LV-Empty) and MAP3K8-expressing cells (LV-MAP3K8) at a final concentration of 1,000 nM, and cultured for 24 hours at 37° C. and 5% CO 2 .
  • the results of evaluating the IFNG expression level in the same cells by quantitative RT-PCR are shown on the right side of FIG.
  • the MAP3K8 gene vector was obtained by subcloning the commercially available MAP3K8 expression vector (pCLXSN-Tpl2/Cot (addgene)) with an HA tag at the N-terminus into the CSII-EF-MCS-IRES2-Venus vector (RIKEN BRC). It was produced by
  • binimetinib Ono Pharmaceutical, Bini
  • cobimetinib Roche, Cobi
  • selumetinib AstraZeneca, Selum
  • trametinib Novartis Pharma, Tram
  • Binimetinib was added to final concentrations of 1, 10, 100 or 1000 nM
  • cobimetinib, selumetinib, and trametinib were added to final concentrations of 100 nM.
  • a group to which prednisolone (LKT Laboratories, Inc., St. Paul, Minn., PSL) known as a steroid therapeutic drug at a final concentration of 1 ⁇ g/mL was added instead of the MEK1/2 inhibitor was used as a positive control.
  • the culture solution was centrifuged to collect only the culture supernatant.
  • the CXCL10 concentration in the culture supernatant was measured with a flow cytometer FACSCantoII (BD Biosciences) using a Cytokine Beads Array kit (BD Biosciences). Taking the CXCL10 concentration in the culture medium of the DMSO group as 100%, the relative value of each group was calculated, and the mean value of the CXCL10 concentration of 8 HAM patients was obtained. As a result, the MEK1/2 inhibitor showed no effect on CXCL10 production by HAM-PBMC. The results are shown in FIG.
  • the culture solution was centrifuged to collect only the culture supernatant.
  • IFN ⁇ , TNF ⁇ , IL-2, IL-6, and IL-10 concentrations in the culture supernatant were measured with a flow cytometer FACSCantoII (BD Biosciences) using Cytokine Beads Array kit (BD Biosciences).
  • FACSCantoII BD Biosciences
  • Cytokine Beads Array kit BD Biosciences
  • nM and 1000 nM binimetinib, 100 nM cobimetinib, and 100 nM trametinib were found to have an inhibitory effect on IFN ⁇ production by HAM-PBMC. All MEK1/2 inhibitors were found to have a suppressive effect on TNF ⁇ production. MEK1/2 inhibitors had no effect on IL-2 production. 1000 nM binimetinib and 100 nM cobimetinib had an inhibitory effect on IL-6 production. Suppressive effects of 1000 nM binimetinib, 100 nM cobimetinib, and 100 nM trametinib were observed on IL-10 production. In addition, 1000 nM of binimetinib corresponds to 100 nM of trametinib in blood concentration at a normal dose. The results are shown in FIG.
  • MEK1/2 inhibitors 1 ⁇ M binimetinib and 100 nM trametinib were used (drug concentrations were determined with reference to blood concentrations at normal doses). A group to which the same amount of DMSO was added instead of the MEK1/2 inhibitor (DMSO) was used as a negative control. A group to which PSL at a final concentration of 1 ⁇ g/mL was added instead of the MEK1/2 inhibitor was used as a positive control.
  • PBMCs were treated with CD3 antibody-BV510 (Biolegend), CD4 antibody-APC (eBioscience), CD8 antibody-PECy7 (eBioscience), CCR4 antibody-BV421 (Biolegend), or HLA-A*24:02 HTLV- Stained with 1 Tax 301-309 Tetramer antibody-PE (MBL) at 4° C. for 30 minutes. After staining, the cells were washed with FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA and 0.1% sodium azide), suspended in 70% ethanol, and permeabilized at -20°C for 90 minutes. Permeabilized PBMCs were washed twice and proliferating cells were stained with Ki67 antibody-FITC (BD) (room temperature, 30 minutes). Thereafter, the PBMCs were washed, suspended in FACS buffer, and analyzed using a flow cytometer Celesta (BD).
  • BD Ki67 antibody-FITC
  • binimetinib and trametinib showed the effect of reducing proliferating cells in both PSL-responsive (+) and PSL-responsive ( ⁇ ) PBMCs (FIG. 15).
  • 3 cases had PSL response (+) and 4 cases had PSL response (-), but binimetinib and trametinib reduced proliferating cells in all 7 cases of PBMC. (Fig. 16).
  • CD8+ T cells are a group of cells that respond to viral expression in HTLV-1 infected cells, proliferate and produce inflammatory cytokines, causing hyperimmune responses in HAM.
  • the effect of MEK1/2 inhibitors on proliferation of this CD8+ T cell was analyzed.

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Abstract

本発明は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を含む、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防剤に関する。

Description

ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防剤、並びに、ＨＡＭの治療有効性判定方法、活動性評価方法又は診断方法
　本発明は、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防剤、及びＨＡＭの治療方法に関する。また、本発明は、ＨＡＭの治療有効性判定方法、活動性評価方法又は診断方法、及びこれらの方法に用いられるキットに関する。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（Human T-cell Lukemia Virus Type 1；ＨＴＬＶ－１）は、血液中の白血球の１つであるＴ細胞等（主にＣＤ４陽性Ｔ細胞）に感染するウイルスである。
　ＨＴＬＶ－１に感染したＴ細胞は、脊髄に慢性の炎症を引き起こす。その結果、脊髄神経細胞の障害及び変性が引き起こされ、痙性脊髄麻痺等を惹起する。ＨＴＬＶ－１に感染した細胞を原因とする痙性脊髄麻痺は、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（以下、「ＨＡＭ」ともいう。）と呼ばれる。ＨＡＭの病態メカニズムは、ＨＴＬＶ－１感染細胞が慢性的な炎症ループを引き起こすことであると考えられている。
　ＨＡＭの症状としては、神経の組織障害による、両足の麻痺、痛み、及び排尿排便障害等が挙げられる。これらの症状が進行すると、車いす生活、寝たきり生活になる。ＨＡＭは日本国の指定難病に指定される疾患の一つである。現在、有効なＨＡＭの治療方法は確立されておらず、専ら対症療法がおこなわれている。
　ＨＡＭの治療方法として、例えば抗ＣＣＲ４抗体を用いる方法、及びＲＧＭａ阻害物質を用いる方法等が提案されている（非特許文献１、特許文献１及び２）。
特開２０１０－１００５７８号公報 国際公開第２０２０／０１７６２９号
N Engl J Med, 2018, 378, 529-538.
　非特許文献１、特許文献１及び２に開示されるようなＨＡＭの治療方法が知られているものの、上記のようなＨＴＬＶ－１感染細胞による慢性的な炎症ループのトリガーとなる原因因子は同定されていない。
　そこで、本発明者らは、原因因子を同定することができれば、当該因子を治療ターゲットとすることで、ＨＡＭを治療することができる新規の治療又は予防方法等を提供することができると考えた。
　本発明が解決しようとする課題は、ＨＡＭを治療することができる新規の治療又は予防方法等を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＨＴＬＶ－１感染細胞による慢性的な炎症ループの原因因子として、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（以下、「ＭＡＰ３Ｋ８」ともいう。）を見出した。そして、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させることがＨＡＭの治療に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
　マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を含む、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防剤。
［１－１］
　前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、及び／又はＥＲＫ１／２阻害剤である、［１］に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
［２］
　前記物質が、ＭＥＫ１／２阻害剤である、［１］に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
［３］
　前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤又はＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤である、［１］に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
［４］
　前記物質が、ＥＲＫ１／２阻害剤である、［１］に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
［５］
　対象におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、前記対象におけるＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防の有効性を判定する方法。
［６］
　対象におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、前記対象におけるＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の活動性を評価する方法。
［７］
　対象におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、前記対象がＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）に罹患しているかどうかを診断する方法。
［８］
　前記対象の末梢血中のＭＡＰ３Ｋ８濃度を測定することを含む、［５］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
　前記対象の末梢血中のＭＥＫ１／２又はＥＲＫ１／２のリン酸化レベルを測定することを含む、［５］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
　抗ＭＡＰ３Ｋ８抗体を含む、［８］に記載の方法のためのキット。
［１１］
　抗リン酸化ＭＥＫ１／２抗体又は抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を含む、［９］に記載の方法のためのキット。
［１１－１］
　抗ＭＡＰ３Ｋ８抗体、抗リン酸化ＭＥＫ１／２抗体、及び／又は抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を含む、［５］～［９］のいずれか１つに記載の方法のためのキット。
［１２］
　ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）患者に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を薬理学的有効量投与することを含む、ＨＡＭの治療方法。
［１２－１］
　前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、及び／又はＥＲＫ１／２阻害剤である、［１２］に記載のＨＡＭの治療方法。
［１３］
　前記物質が、ＭＥＫ１／２阻害剤である、［１２］に記載のＨＡＭの治療方法。
［１４］
　前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤又はＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤である、［１２］に記載のＨＡＭの治療方法。
［１５］
　前記物質が、ＥＲＫ１／２阻害剤である、［１２］に記載のＨＡＭの治療方法。
［１６］
　ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防用の、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質。
［１７］
　［１６］において、前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、及び／又はＥＲＫ１／２阻害剤である。
［１８］
　マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を含む、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防用組成物。
［１９］
　［１８］において、前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、及び／又はＥＲＫ１／２阻害剤である。
［２０］
　ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防用組成物の製造のための、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質の使用。
［２１］
　［２０］において、前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、及び／又はＥＲＫ１／２阻害剤である。
［２２］
　ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防のための、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質の使用。
［２３］
　［２２］において、前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、及び／又はＥＲＫ１／２阻害剤である。
　本発明によれば、難治性疾患であるＨＡＭを治療又は予防することができる。
ＭＡＰ３Ｋ８又はＲａｆが関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の一例を示す図である。 ＨＡＭの原因因子の推定の概要を示す図である。 健常者（Resting.CD4.）、ＨＴＬＶ－１感染未発症者（AC_P、AC_D、AC_N）、ＨＡＭ患者（HAM_D）、及びＡＴＬ患者（iATL_D、iATL_N、aATL_N）のそれぞれに由来するＴ細胞における、ＭＡＰ３Ｋ８の発現量を示す図である。 健常者（Normal CD4+）、ＨＴＬＶ－１感染未発症者（Carrier）、ＨＡＭ患者（HAM/TSP）、及びＡＴＬ患者（ATL）のそれぞれに由来するＴ細胞における、ＭＡＰ３Ｋ８、ＩＦＮＧ、ＴＢＸ２１遺伝子座のオープンクロマチンデータとｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。 ＨＡＭ由来感染細胞における、ＭＡＰ３Ｋ８、ＩＦＮＧ、及びＴＢＸ２１の発現レベルと、髄液中のＣＸＣＬ１０及びネオプテリンの濃度との相関を示す図である。 ＨＡＭ患者髄液由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞におけるリン酸化ＥＲＫ１／２レベルがＭＥＫ１／２阻害剤処理により抑制されることを示す図である。 ＭＥＫ１／２阻害剤処理による、ＨＡＭ由来感染細胞株におけるＩＦＮＧ及びＣＸＣＬ１０の発現抑制を示す図である。 ＭＥＫ１／２阻害剤処理によるＨＡＭ由来感染細胞の増殖抑制を示す図である。 ＨＡＭ由来感染細胞を種々のＭＥＫ１／２阻害剤で処理したときの結果を示す図である。 ＭＥＫ１／２阻害剤処理により、ＨＡＭ由来感染細胞における免疫応答などに関連する遺伝子の発現が抑制されたことを示す図である。 ＭＡＰ３Ｋ８の発現誘導がされた形質転換体においてＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２のリン酸化レベルが増強すること、及び当該ＥＲＫ１／２のリン酸化レベルがＭＥＫ１／２阻害剤処理により低下することを示す図である。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関して、自発的増殖活性に対する作用の結果を示す図である。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関して、ＣＸＣＬ１０又はサイトカイン産生に対する作用の結果を示す図である。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関してＨＡＭ－ＰＢＭＣにおける増殖細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の割合を示す図である（*p<0.05）。 ＰＳＬによりＰＢＭＣ増殖が阻害されるＨＡＭ患者（ＰＳＬ応答（＋））及び増殖阻害されないＨＡＭ患者（ＰＳＬ応答（－））にＤＭＳＯ、ビニメチニブ、トラメチニブ又はＰＳＬを添加して培養した際のＰＢＭＣにおける増殖細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の変化を示す図である。 ＨＡＭ患者ごとに、ＤＭＳＯ、ビニメチニブ、トラメチニブ又はＰＳＬを添加して培養した際のＰＢＭＣにおける増殖細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の割合を示す図である。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関してＨＡＭ－ＣＤ４＋Ｔ細胞における増殖細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の割合を示す図である（*p<0.05）。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関してＨＡＭ－ＣＤ４＋ＣＣＲ４＋Ｔ細胞における増殖細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の割合を示す図である（*p<0.05）。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関してＨＡＭ－ＣＤ８＋Ｔ細胞における増殖細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の割合を示す図である（*p<0.05）。 ＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用に関してＨＡＭ－ＣＤ８中のＴａｘ特異的ＣＴＬの割合を示す図である（*p<0.05）。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
［ＨＡＭの治療又は予防剤］
　本実施形態の一態様は、ＨＡＭの治療又は予防剤である。
　本実施形態の一態様のＨＡＭの治療又は予防剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を含む。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、細胞増殖に関わるシグナル伝達経路であり、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（mitogen-activated protein kinase；ＭＡＰＫ）、ＭＡＰＫキナーゼ、及びＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫとも称され、以下、「ＭＡＰ３Ｋ」という。）の３種のキナーゼ群を含むプロテインキナーゼカスケードである。プロテインキナーゼは、ペプチド及び／又はタンパク質中のセリン及び／又はトレオニン及び／又はチロシンをリン酸化する酵素である。
　ＭＡＰＫは、哺乳類では４種のファミリー、具体的には細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼ（extracellular signal-regulated protein kinase）１及び２（以下、「ＥＲＫ１／２」という。）；ＥＲＫ５；ｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）；及びｐ３８　ＭＡＰＫを代表とするファミリーに分類され、それぞれのファミリーが独立したカスケードを形成していることが知られている。
　中でもＥＲＫ１／２が関与するカスケードは主に増殖因子等により活性化され、下流のＥＲＫ１／２は活性化されると核内へ移行して転写因子等と相互作用し細胞増殖シグナルを活性化する。ＥＲＫ１／２は、ＭＡＰＫキナーゼであるＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ１及び２（以下、「ＭＥＫ１／２」という。）により活性化（リン酸化）され、ＭＥＫ１／２は、Ｒａｆを代表とする複数のＭＡＰ３Ｋにより活性化（リン酸化）され得る。
　ＭＡＰ３Ｋ８は、Ｔｐｌ－２、ＣＯＴ、又はＭＥＫＫ８等としても知られ、ＭＥＫ１／２をリン酸化するＭＡＰ３Ｋの１種である。
　したがって、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路は、例えばＭＡＰ３Ｋ８によるＭＥＫ１／２のリン酸化、リン酸化ＭＥＫ１／２によるＥＲＫ１／２のリン酸化、及びリン酸化ＥＲＫ１／２による転写因子等の活性化を含む伝達経路である。
　図１に、ＭＡＰ３Ｋ８又はＲａｆが関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の一例を示す。図１において、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路が線で囲まれて示されている。
　本明細書において、リン酸化ＭＥＫ１／２をｐ－ＭＥＫ１／２と、リン酸化ＥＲＫ１／２をｐ－ＥＲＫ１／２とそれぞれいう場合がある。
　本発明者らは、鋭意研究した結果、後述する実施例で示すように、ＨＴＬＶ－１感染細胞による慢性的な炎症ループの原因因子の１つがＭＡＰ３Ｋ８であることを見出した。すなわち、本発明者らはＨＡＭ患者の体内ではＭＡＰ３Ｋ８が特異的に過剰発現していることを見出した。また、当該知見に基づいて、ＨＡＭ患者の体内ではＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路が過剰に活性化される結果、炎症性サイトカインが過剰に産生されていると推定し、当該ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制することがＨＡＭの治療又は予防に有効であることを見出した。
　したがって、上記ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路は、炎症性サイトカインの産生に寄与する伝達経路であってよい。上記炎症性サイトカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び／又はケモカインであってよい。上記炎症性サイトカインは、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及び／又はＩＬ－１０であってよい。
　ＨＡＭの治療又は予防剤に含まれる、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質（以下、単に「抑制物質」ともいう。）は、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質である。
　本明細書において、「シグナル伝達経路の活性を抑制させる」とは、当該シグナル伝達経路におけるシグナル伝達の少なくとも一部分を阻害することを意味し、例えば少なくとも１つのプロテインキナーゼの活性を低下又は消失させること、少なくとも１つのタンパク質のリン酸化を阻害すること、及びリン酸化以外のシグナル伝達を阻害すること等を包含する。本明細書中、「活性の抑制」とは、抑制物質なしの状態において有する機能又は活性を低下させ、又は消失させることをも包含する。
　抑制物質は、一態様において、ＭＡＰ３Ｋ８によるＭＥＫ１／２のリン酸化、リン酸化ＭＥＫ１／２によるＥＲＫ１／２のリン酸化、及びリン酸化ＥＲＫ１／２による転写因子等の活性化を含むプロテインキナーゼカスケードにおいて、少なくとも１つのプロテインキナーゼを阻害するか、少なくとも１つのプロテインキナーゼの少なくとも１つの基質と相互作用し、そのプロテインキナーゼカスケードのシグナル伝達経路の活性を抑制させ得る。抑制物質は、一態様において、ＭＡＰ３Ｋ８が関与し、炎症性サイトカインの産生に寄与するＭＡＰＫシグナル伝達経路において、少なくとも１つのプロテインキナーゼを阻害するか、少なくとも１つのプロテインキナーゼの少なくとも１つの基質と相互作用し、そのプロテインキナーゼカスケードのシグナル伝達経路の活性を抑制させ得る。
　抑制物質は、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制（低下又は消失）させる物質であれば特に限定されず、例えば、抗体等のタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、又は低分子化合物等であってよい。
　本明細書中、「低分子化合物」とは、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、及び脂質以外の化合物を意味し、例えば分子量が１０００以下、９００以下、８００以下、又は７００以下の化合物を意味する。
　ＨＡＭの治療又は予防剤は、抑制物質を１種単独で含んでいてもよく、２種以上を組み合わせて含んでいてもよい。
　抑制物質は、例えばＭＡＰ３Ｋ８阻害剤又はＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤であってよい。
　ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤は、ＭＡＰ３Ｋ８タンパク質のリン酸化活性を抑制させる物質であれば特に限定されない。ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤は、例えばＭＡＰ３Ｋ８に結合する物質であってよく、ＭＡＰ３Ｋ８の基質に結合してＭＡＰ３Ｋ８によるリン酸化活性を抑制する物質であってもよい。ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤は、ＭＡＰ３Ｋ８又はＭＡＰ３Ｋ８の基質を認識する物質（例えば低分子化合物又は抗体）であってよい。
　ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤は、ＭＡＰ３Ｋ８によるＭＥＫ１／２のリン酸化を抑制する物質であってよく、ＭＡＰ３Ｋ８によるＭＥＫ１のリン酸化を抑制する物質であってよく、活性化ＭＡＰ３Ｋ８によるＭＥＫ２のリン酸化を抑制する物質であってよい。
　ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤の非限定的な例示としては、以下の表に示すもの、及びＭＡＰ３Ｋ８阻害活性を有するそれらの誘導体が挙げられる。ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤として、その他商業的に入手可能な薬剤を用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤は、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の発現に関与し、ＭＡＰ３Ｋ８の発現を抑制する物質であれば特に限定されない。ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤は、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよく、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の発現に関与する遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
　ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤が発現を抑制する遺伝子としては、例えばヒトＭＡＰ３Ｋ８遺伝子等が挙げられ、より具体的にはＮＣＢＩデータベースに保存されるヒトＭＡＰ３Ｋ８遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の塩基配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから取得することができる。ヒトＭＡＰ３Ｋ８のアミノ酸配列及びヒトＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１及び２にそれぞれ示す。
　ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤は、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の転写、翻訳、又はその両方を阻害することで遺伝子発現を抑制してよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｓｉＲＮＡとは、標的であるＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡにおける塩基配列の長さ（塩基長）は特に限定されないが、好ましくは約３０塩基未満、より好ましくは約１９～２７塩基、さらに好ましくは約２１～２５塩基である。
　ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡ中に部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内に二本鎖構造及び３’末端の突出部を有する、短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的であるＭＡＰ３Ｋ８遺伝子の発現を抑制し得る。
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよい。また、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンス及びセンスのＲＮＡをインビトロで合成してもよい。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する約３０塩基未満の塩基配列に対して相補的な、又はハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
　抑制物質は、ＭＥＫ１／２阻害剤であってもよい。
　ＭＥＫ１／２阻害剤は、ＭＥＫ１／２タンパク質のリン酸化活性を抑制させる物質であれば特に限定されない。ここで、ＭＥＫ１／２阻害剤は、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の阻害剤であってよく、ＭＥＫ１の阻害剤であってもよく、ＭＥＫ２の阻害剤であってもよい。ＭＥＫ１／２阻害剤は、例えばＭＥＫ１及び／又は２に結合する物質であってよく、ＭＥＫ１及び／又は２の基質に結合してＭＥＫ１及び／又は２によるリン酸化を抑制する物質であってもよく、ｐ－ＭＥＫ１及び／又は２を脱リン酸化して不活性化させる物質であってもよい。ＭＥＫ１／２阻害剤は、ＭＥＫ１／２及びＭＥＫ１／２の基質のいずれかを認識する物質（例えば低分子化合物又は抗体）であってよい。
　ＭＥＫ１／２阻害剤は、ＭＥＫ１及び／又は２あるいはｐ－ＭＥＫ１及び／又は２に結合して、ｐ－ＭＥＫ１及び／又は２によるＥＲＫ１及び／又は２のリン酸化を抑制する物質であってよい。
　ＭＥＫ１／２阻害剤の非限定的な例示としては、以下の表に示すもの、及びＭＥＫ１／２阻害活性を有するそれらの誘導体が挙げられる。ＭＥＫ１／２阻害剤として、その他商業的に入手可能な薬剤を用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　抑制物質は、ＥＲＫ１／２阻害剤であってもよい。
　ＥＲＫ１／２阻害剤は、ＥＲＫ１／２タンパク質のリン酸化活性を抑制させる物質であれば特に限定されない。ここで、ＥＲＫ１／２阻害剤は、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の阻害剤であってよく、ＥＲＫ１の阻害剤であってもよく、ＥＲＫ２の阻害剤であってもよい。ＥＲＫ１／２阻害剤は、例えばＥＲＫ１及び／又は２に結合する物質であってよく、ＥＲＫ１及び／又は２の基質に結合してＥＲＫ１及び／又は２によるリン酸化を抑制する物質であってもよく、ｐ－ＥＲＫ１及び／又は２を脱リン酸化して不活性化させる物質であってもよい。ＥＲＫ１／２阻害剤は、ＥＲＫ１／２及びＥＲＫ１／２の基質のいずれかを認識する物質（低分子化合物又は抗体）であってよい。
　ＥＲＫ１／２阻害剤は、ＥＲＫ１及び／又は２あるいはｐ－ＥＲＫ１及び／又は２に結合して、ｐ－ＥＲＫ１及び／又は２による転写因子等のリン酸化を抑制する物質であってよく、ｐ－ＥＲＫ１及び／又は２の核内移行を抑制する物質であってもよい。
　ＥＲＫ１／２阻害剤の非限定的な例示としては、Ｒｉｎｅｔｅｒｋｉｂ、ラボキセルチニブ、ウリクセルチニブ、アストラガロシドＩＶ、ピペルロングミン、モグロール、マグノリン（magnolin）、コリノキセイン、メチルチオウラシル、メチルニッソリン（アストラプテロカルパン）、２，５－ジヒドロキシアセトフェノン、デルトニン、ヒポテマイシン、及び以下の表に示すもの、並びにＥＲＫ１／２阻害活性を有するそれらの誘導体が挙げられる。ＥＲＫ１／２阻害剤として、その他商業的に入手可能な薬剤を用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　抑制物質は、細胞透過性を有することが好ましい。したがって、抑制物質は、上記の例示の中でも、低分子化合物のものが好ましい。あるいは、上記で例示した抗体等に細胞透過性を付与したものも好ましい。抑制物質は、分子量が７００以下の低分子化合物であってよく、分子量が７００以下であり、芳香環を２つ以上有し、フッ素原子を少なくとも１つ有する化合物であってよい。
　抑制物質が、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路中、上流のプロテインキナーゼの活性を抑制する物質であることも好ましい。抑制物質の好ましい態様としては、例えばＭＡＰ３Ｋ８阻害剤、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤、及びＭＥＫ１／２阻害剤が挙げられる。抑制物質のより好ましい態様としては、ＭＥＫ１／２阻害剤が挙げられ、更に好ましくは低分子化合物（例えば分子量が７００以下）であるＭＥＫ１／２阻害剤が挙げられる。
　抑制物質は、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、及びコビメチニブ、並びにＭＥＫ１／２阻害活性を有するそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。
　抑制物質が抗体である場合、抗体は、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路中のプロテインキナーゼ等に結合してその活性を阻害する抗体であってよく、プロテインキナーゼに結合することによりプロテインキナーゼがその基質に結合できないようにする抗体であってよい。
　上記の抗体は、モノクローナル抗体であってよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。
　上記の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってよく、低分子抗体であってもよい。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のＣＤＲで置換した抗体である。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体に由来する可変領域と、ヒト抗体に由来する定常領域からなる抗体である。また、ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体において、安全性の高い一部の領域を残して、ヒトの抗体に由来する部分を組み込んだものをいい、ヒト型キメラ抗体、及びヒト型ＣＤＲ移植抗体を包含する概念である。
　低分子抗体とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同一のエピトープを認識する抗体である。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｓｄＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられるが、これらに限定されない。
　抑制物質が低分子化合物である場合、低分子化合物は公知の方法で製造してもよく、市販のものを購入することにより入手してもよい。
　抑制物質が抗体である場合、対象とするプロテインキナーゼ又はそのフラグメントを免疫原として用い、公知の方法で製造することができる。
　抑制物質は、上記した物質の薬理学的に許容可能な塩であってもよい。薬理学的に許容可能な塩は、例えば、医薬として許容される塩基や酸との塩を含む。
　薬理学的に許容可能な塩の非限定的な具体例としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）の付加塩、及びアミノ酸の付加塩等が挙げられる。
　ＨＡＭの治療又は予防剤は、上記の抑制物質を含んでいる限り特に限定されないが、さらに薬学的に許容される担体及び／又は添加剤を含んでいてもよく、製剤化されていてもよい。
　製剤化の形態としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、及び乳剤等の経口剤；並びに、注射剤、輸液、坐剤、軟膏、及びパッチ剤等の非経口剤が挙げられる。
　担体又は添加剤の含有量については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。
　上記担体としては、特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、及び水性又は油性基剤等が挙げられる。上記添加剤としては、特に制限されないが、賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、及び香料等が挙げられる。
　上記の担体及び／又は添加剤は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　上記の抑制物質が低分子化合物であるとき、当該低分子化合物は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された経口剤（例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、又は乳剤）として、経口投与経路で投与されることが好ましい。
　上記の抑制物質がＭＡＰ３Ｋ８、ＭＥＫ１／２、及び／又はＥＲＫ１／２のようなプロテインキナーゼを認識する抗体であるとき、当該抗体は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された注射剤又は輸液として、非経口投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下又は局所）で投与されることが好ましい。
　抗体を含む注射剤又は輸液は、溶液、懸濁液又は乳濁液として用いてもよい。用いる溶剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、及び等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等が挙げられる。これらの溶剤は１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　さらに、上記注射剤又は輸液は、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、及びｐＨ調整剤等の添加剤を含んでいてもよい。
　安定剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸ナトリウム、及びジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。
　溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及び非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ－５０等）等が挙げられる。
　懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
　乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、及びトラガント等が挙げられる。
　無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びソルビトール等が挙げられる。
　緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、及びトリス緩衝液等が挙げられる。
　保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、及びホウ砂等が挙げられる。
　防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、及びクロロブタノール等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、及び酢酸等が挙げられる。
　上記の抑制物質がＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤であるとき、抑制物質は非ウイルスベクター又はウイルスベクターの形態で投与することもできる。
　ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤が非ウイルスベクター形態のとき、投与の方法としては、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ－リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法等）、マイクロインジェクション法、及び遺伝子銃（Ｇｅｎｅ　Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法等が挙げられる。
　ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤がウイルスベクター形態のとき、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、及びＳＶ４０等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞又は組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞又は組織内に遺伝子を導入することができる。
　本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤は、一態様において、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞の自発的増殖活性を阻害し得る。
　本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤は、一態様において、免疫応答に関連する遺伝子の発現を抑制させ得る。
　本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤は、一態様において、炎症性サイトカインの産生を抑制させ得る。
　本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤は、一態様において、プレドニゾロン等のステロイド治療薬に対して抵抗性を有するＨＡＭ患者の治療又は予防に有用であり得る。
　本実施形態の一態様は、ＨＡＭの治療又は予防剤に用いる医薬製剤である。
　本実施形態の医薬製剤は、本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤を含む。言い換えると、医薬製剤は、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる上記いずれかの物質（抑制物質）を含む。
　本実施形態の医薬製剤を、例えばヒト、並びにラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、及びサル等の他の哺乳動物に対して、その有効量を投与することにより、ＨＡＭを予防又は治療することができる。
　ＨＡＭの治療又は予防剤、あるいはそれらを含む医薬製剤の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類等を考慮して、適宜設定してもよい。
　本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤は、ＨＡＭ患者に特異的に異常発現しているＭＡＰ３Ｋ８が引き起こす炎症性サイトカインの過剰産生を抑制し得る。したがって、ＨＡＭの治療又は予防剤は、ＨＴＬＶ－１感染細胞による慢性的な炎症ループの予防、改善、及び／又は進行の防止を提供し得る。本実施形態のＨＡＭの治療又は予防剤は、ＨＡＭの病態若しくは症状の改善、ＨＡＭの進行の防止若しくは低減、及び／又はＨＴＬＶ－１感染細胞キャリアのＨＡＭ発症の予防に有効であり得る。
［ＨＡＭの治療方法］
　上述のとおり、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させることによりＨＡＭを治療又は予防することができる。
　本実施形態の一態様は、ＨＡＭ患者に、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質（抑制物質）を薬理学的有効量で投与することを含む、ＨＡＭの治療又は予防方法である。
　ＨＡＭの治療又は予防方法を適用する対象としては、ヒトであってよく、非ヒト哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、及びサル等）であってよい。
　ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質（抑制物質）の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類等を考慮して、適宜設定してもよい。
　本実施形態の別の一態様は：
　ＨＡＭの治療又は予防に使用するための、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質；
　ＨＡＭの治療又は予防に使用するための、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を含む医薬組成物；
　ＨＡＭを治療又は予防するための、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質の使用；
　ＨＡＭの治療又は予防用医薬の製造における、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質の使用；又は
　ＨＡＭの治療又は予防用医薬の製造に使用するための、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質であってよい。
　ここで、当該物質としては、上記した抑制物質のいずれであってもよい。
［ＨＡＭの治療有効性判定方法、活動性評価方法又は診断方法］
　本実施形態の更なる別の一態様は：
　対象におけるＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、当該対象におけるＨＡＭの治療又は予防の有効性を判定する方法；
　対象におけるＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、当該対象におけるＨＡＭの活動性を評価する方法；又は
　対象におけるＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、当該対象がＨＡＭに罹患しているかどうかを診断する方法である。
　上記いずれの方法においても、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルの測定方法は、特に限定されないが、例えば対象の末梢血中のＭＡＰ３Ｋ８濃度を測定すること；対象の末梢血中のＭＥＫ１及び／又は２あるいはＥＲＫ１及び／又は２の濃度を測定すること；対象の末梢血中のＭＥＫ１及び／又は２のリン酸化レベルを測定すること；対象の末梢血中のＥＲＫ１及び／又は２のリン酸化レベルを測定すること；対象の末梢血中のＭＥＫ１及び／又は２あるいはＥＲＫ１及び／又は２をコードするｍＲＮＡの発現レベルを測定すること等が挙げられる。これらのマーカーは末梢血からだけでなく、その他の方法（例えば髄液からの取得）により取得してもよい。
　ＭＡＰ３Ｋ８濃度は抗ＭＡＰ３Ｋ８抗体を用いて測定してもよい。ｐ－ＭＥＫ１及び／又は２は、抗ｐ－ＭＥＫ１抗体及び／又は抗ｐ－ＭＥＫ２抗体を用いて測定してもよい。ｐ－ＥＲＫ１及び／又は２は、抗ｐ－ＥＲＫ１抗体及び／又は抗ｐ－ＥＲＫ２抗体を用いて測定してもよい。ＭＥＫ１及び／又は２並びにＥＲＫ１及び／又は２の濃度は、それぞれ抗ＭＥＫ１抗体及び／又は抗ＭＥＫ２抗体並びに抗ＥＲＫ１抗体及び／又は抗ＥＲＫ２抗体を用いて測定してもよい。ｍＲＮＡの発現レベルは、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等の公知の方法を用いて測定してもよい。
　ＨＡＭの活動性評価方法やＨＡＭに罹患しているかどうかを診断する方法において、従来は髄液中のＣＸＣＬ１０やネオプテリンをマーカーとして用いている。本実施形態の一態様に係る上記の方法のいずれにおいても、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルは末梢血のマーカーを用いて測定することができるため、より簡便にＨＡＭの活動性評価をすることができ、またより簡便にＨＡＭに罹患しているかどうかを診断することができる。
　本実施形態の更なる別の一態様は、上記いずれかの方法に用いるキットである。当該キットは、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルの測定のための抗体を含んでいてよい。当該キットは、抗ＭＡＰ３Ｋ８抗体、抗ｐ－ＭＥＫ１抗体、抗ｐ－ＭＥＫ２抗体、抗ｐ－ＥＲＫ１抗体、及び／又は抗ｐ－ＥＲＫ２抗体を含んでいてもよい。
　本明細書で述べた上記の実施形態のいずれにおいても、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質（抑制物質）は、本明細書において記載する態様、並びに本明細書において好ましい、より好ましい、及び更に好ましいとして記載する態様（これらの全ての態様を総称して、以下、「好ましい態様」という）のうちの任意の態様であり得る。また、好ましい態様の任意の組み合わせであってもよい。
　以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
［ＨＡＭの原因因子の同定］
　健常者、ＨＴＬＶ－１感染未発症者、ＨＡＭ患者、及びＡＴＬ患者の４群について、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析及びＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析の統合解析を行った。
　概要としては、図２に示すように、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析によるＨＡＭ特異的なクロマチン構造異常の特定、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析によるＨＡＭ患者において過剰に発現している遺伝子の特定、及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析によるＨＡＭ特異的に過剰発現している遺伝子の特定を介して、ＨＡＭの原因因子を推定した。
　ＲＮＡ－ｓｅｑ解析は、以下のようにして行った。まず、健常者、ＨＴＬＶ－１感染未発症者、ＨＡＭ患者、及びＡＴＬ患者のＰＢＭＣ（末梢血単核球）から、フローサイトメトリーを用いてＨＴＬＶ－１非感染Ｔ細胞（ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陰性／ＣＤ７陽性細胞）及びＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陽性細胞、もしくはＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陰性細胞）を分取した。これらのＴ細胞について、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析によって、全遺伝子発現データを取得した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータから得られるリードカウントデータについて、総リード数と各転写産物長で補正したＴＰＭ値とを求め、比較解析を行った。
　ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析は、以下のようにして行った。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析と同様に取得した細胞集団を対象に、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析を行い、ゲノムワイドのオープンクロマチン構造解析を行なった。ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析はＡｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社に依頼し、クロマチン調製、ＡＴＡＣ反応、及びシークエンスまで実施した。得られたデータから各サンプルのオープンクロマチン領域データを解析した。
　上記の解析に用いた検体は以下のとおりである。
・正常Ｔ細胞　３例（Resting.CD4.）
・ＨＴＬＶ－１感染未発症者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陰性／ＣＤ７陽性Ｔ細胞　１０例（AC_P）
・ＨＴＬＶ－１感染未発症者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陽性ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞　８例（AC_D）
・ＨＡＭ患者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陽性ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞　１３例（HAM_D）
・くすぶりＡＴＬもしくは慢性型ＡＴＬ患者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陽性ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞　５例（iATL_D）
・ＨＴＬＶ－１感染未発症者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陰性ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞　９例（AC_N）
・くすぶりＡＴＬもしくは慢性型ＡＴＬ患者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陰性ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞　９例（iATL_N）
・急性型ＡＴＬ患者由来ＣＤ４陽性／ＣＡＤＭ１陽性／ＣＤ７陰性ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞　１４例（aATL_N）
　以上の解析により、ＨＡＭの原因因子として、ＭＡＰ３Ｋ８が推定された。
　ＲＮＡ－ｓｅｑ解析の一部を図３に示す。図３から、ＨＡＭ患者由来細胞群（ＨＡＭ＿Ｄ）でＭＡＰ３Ｋ８が過剰に発現していることが明らかになった。図３中、ＴＰＭ値がプロットされる。ＨＡＭ＿Ｄ群は、その他の全ての群と有意差をもってＭＡＰ３Ｋ８の発現量が上昇していた（Ｐ＜０．０５）。
　また、ＭＡＰ３Ｋ８、ＩＦＮＧ、ＴＢＸ２１遺伝子座における各検体のオープンクロマチンデータとｍＲＮＡ発現レベルを検討した結果を図４に示す。図４からは、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子座において、ＨＡＭ特異的にクロマチン構造が開くエンハンサー領域が存在し、ＨＡＭで特異的に過剰発現していることがわかる。
　次に、複数のＨＡＭ患者において、ＨＡＭ由来感染細胞における各遺伝子の発現レベルと、髄液中のＣＸＣＬ１０及びネオプテリンの濃度との相関を調べた。なお、ＣＸＣＬ１０及びネオプテリンは、ＨＡＭの疾患活動性を評価するためのバイオマーカーとして用いられている。
　図５に示すように、ＭＡＰ３Ｋ８の発現レベルがＨＡＭの疾患活動性と非常に強い相関を有することが示唆された。細胞の炎症状態と相関するＩＦＮＧ及びＴＢＸ２１の発現レベルもＣＸＣＬ１０及びネオプテリンの濃度と高い相関を示すことを考慮すると、ＭＡＰ３Ｋ８の発現レベルと細胞の炎症状態とが相関することも示唆された。
［ＭＥＫ１／２阻害剤の作用検討］
　ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質のＨＡＭ治療に対する有効性を確認するため、以下の実験を行った。
　なお、ＭＡＰ３Ｋ８が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質として、いずれもＭＥＫ１／２阻害剤として知られるトラメチニブ（ノバルティスファーマ）、ビニメチニブ（小野薬品工業）、セルメチニブ（アストラゼネカ）、及びコビメチニブ（ロシュ）を用いた。ネガティブコントロールとして、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤として知られるベムラフェニブ（Cayman Chemical）を用いた。
　まず、ＨＡＭ患者髄液由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株ＨＣＴ－４を培地（１０％　ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ／ｍｌ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２　（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ））に懸濁し、１×１０６細胞ずつ６ｃｍディッシュに播種した。次いで、トラメチニブを終濃度０、１０、１００、及び１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、全タンパク質を抽出し、細胞内のリン酸化ＭＥＫ１／２レベル（ｐ－ＭＥＫ１／２）、及びリン酸化ＥＲＫ１／２レベル（ｐ－ＥＲＫ１／２）をウエスタンブロッティングで評価した。細胞内コントロールとして、全ＭＥＫ１／２及び全ＥＲＫ１／２の発現レベルも評価した。
　ウエスタンブロッティングの結果を図６に示す。トラメチニブによる細胞内のＥＲＫ１／２のリン酸化レベルの抑制が認められた。抑制効果は１０ｎＭから検出された。
　また、ＨＡＭ由来感染細胞株ＨＣＴ－４を１×１０５細胞ずつ12 well plateに播種し、トラメチニブを終濃度１，０００ｎＭで加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で０、２４、４８、７２、及び９６時間培養した。各培養時間の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＩＦＮＧ、及びＣＸＣＬ１０遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定した。β－ａｃｔｉｎ遺伝子ｍＲＮＡも同様に測定し、内部標準として使用した。
　独立した３回の定量的ＲＴ－ＰＣＲ実験の結果（平均値）及びその標準偏差を図７に示す。トラメチニブ処理により、ＨＡＭ由来感染細胞株におけるＩＦＮＧ及びＣＸＣＬ１０の発現が有意に抑制された。抑制効果は２４時間から検出された。
　また、ＨＡＭ由来感染細胞株ＨＣＴ－４を７．５×１０４細胞ずつ12 well plateに播種し、トラメチニブを終濃度０、１０、１００、及び１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で９６時間培養した。その後の細胞数をＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８　（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて測定し、トラメチニブ処理による相対的な細胞数の変化を測定した。
　独立した３回の細胞増殖アッセイの結果（平均値）及びその標準偏差を図８に示す。トラメチニブ処理により、ＨＡＭ由来感染細胞株の増殖が有意に抑制された。抑制効果は１０ｎＭから検出された。
　次いで、種々のＭＥＫ１／２阻害剤（トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、及びコビメチニブ）を用いて以下の実験を行った。また、ネガティブコントロールとしてＢ－Ｒａｆ阻害剤（ベムラフェニブ）を用いた実験を行い、ビヒクルとしてＤＭＳＯを添加した実験を行った。
　まず、ＨＡＭ患者髄液由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株ＨＣＴ－４を培地（１０％　ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ／ｍｌ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２　（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ））に懸濁し、１×１０６細胞ずつ６ｃｍディッシュに播種した。次いで、ＭＥＫ１／２阻害剤（トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、若しくはコビメチニブ）又はＢ－Ｒａｆ阻害剤（ベムラフェニブ）を終濃度１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、全タンパク質を抽出し、細胞内のリン酸化ＭＥＫ１／２レベル（ｐ－ＭＥＫ１／２）、及びリン酸化ＥＲＫ１／２レベル（ｐ－ＥＲＫ１／２）をウエスタンブロッティングで評価した。細胞内コントロールとして、全ＭＥＫ１／２及び全ＥＲＫ１／２の発現レベルも評価した。
　ウエスタンブロッティングの結果を図９上段左に示す。いずれのＭＥＫ１／２阻害剤処理によっても、ビヒクルと比較して細胞内のＥＲＫ１／２のリン酸化レベルの抑制が認められた。一方、ＭＡＰ３Ｋ８が関与しないＭＡＰＫシグナル伝達経路の上流のリン酸化を阻害するＢ－Ｒａｆ阻害剤を用いた場合には細胞内のＥＲＫ１／２のリン酸化レベルの抑制は認められなかった。
　また、終濃度１，０００ｎＭのＭＥＫ１／２阻害剤（トラメチニブ、又はビニメチニブ）の存在下、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間前処理培養したＨＡＭ由来感染細胞株ＨＣＴ－４をＰＢＳで洗浄した。このＨＣＴ－４を、１０％　ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２を含む新たなＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、３×１０５細胞ずつ12 well plateに播種したのち、ＭＥＫ１／２阻害剤（トラメチニブ、又はビニメチニブ）を終濃度１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、培養上清中に産生されたＩＦＮ－γ量をＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｂｅａｄ　Ａｒｒａｙを用いて測定した。
　独立した３回のＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｂｅａｄ　Ａｒｒａｙの結果（平均値）及びその標準偏差を図９上段右に示す。ＭＥＫ１／２阻害剤処理により、ＨＡＭ由来感染細胞株におけるＩＦＮ－γ産生が有意に抑制された。
　また、２種のＨＡＭ患者髄液由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株（ＨＣＴ－４、及びＨＣＴ－５）、及び２種のＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株（ＭＴ－２、及びＨＵＴ１０２）のそれぞれを、１×１０６細胞ずつ６ｃｍディッシュに播種したのち、ＭＥＫ１／２阻害剤（トラメチニブ、又はビニメチニブ）を終濃度１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、全タンパク質を抽出し、細胞内のリン酸化ＭＥＫ１／２レベル（ｐ－ＭＥＫ１／２）、及びリン酸化ＥＲＫ１／２レベル（ｐ－ＥＲＫ１／２）をウエスタンブロッティングで評価した。細胞内コントロールとして、全ＥＲＫ１／２の発現レベルも評価した。
　ウエスタンブロッティングの結果を図９下段に示す。いずれのＭＥＫ１／２阻害剤処理によっても、細胞内のＥＲＫ１／２のリン酸化レベルの抑制が認められた。
　次に、ＭＥＫ１／２阻害剤処理による遺伝子発現抑制の効果を調べた。
　ＨＡＭ由来感染細胞株ＨＣＴ－４を１×１０５細胞ずつ12 well plateに播種し、トラメチニブを終濃度１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。各培養時間の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析によって、全遺伝子発現データを取得した。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析データから得られるリードカウントデータについて、総リード数と各転写産物長で補正したＴＰＭ値とを求め、比較解析を行った。
　独立した３回のＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果から、ＭＥＫ１／２阻害剤処理による減少レベルが統計的に有意（Ｐ＜０．０５）と認められた４５２遺伝子について、Ｇｅｎｅ　ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析を行った結果を図１０上に示す。ＭＥＫ１／２阻害剤処理により、免疫応答などに関連する遺伝子の発現抑制が認められた。
　またＭＥＫ１／２阻害剤処理による減少レベルを図１０下に示す。ＨＡＭで過剰に発現することが知られているＩＦＮＧ及びＣＣＲ４等の遺伝子発現の減少が検出された。
　次に、ＭＡＰ３Ｋ８を発現するように形質転換された細胞株に対するＭＥＫ１／２阻害剤処理の効果を調べた。
　ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔに対し、ＭＡＰ３Ｋ８をコードするｃＤＮＡを挿入するレンチウイルスベクターを導入し、ＭＡＰ３Ｋ８を安定的に発現するＴ細胞株を樹立した。コントロール細胞（ＬＶ－Ｅｍｐｔｙ）及びＭＡＰ３Ｋ８発現細胞（ＬＶ－ＭＡＰ３Ｋ８）に対し、トラメチニブを終濃度１，０００ｎＭの条件で加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。その後、全タンパク質を抽出し、細胞内のリン酸化ＭＥＫ１／２レベル（ｐ－ＭＥＫ１／２）、及びリン酸化ＥＲＫ１／２レベル（ｐ－ＥＲＫ１／２）をウエスタンブロッティングで評価した。発現させたＭＡＰ３Ｋ８は抗ＨＡ抗体、及びＭＡＰ３Ｋ８特異的抗体を用いて検出した。細胞内コントロールとして、全ＭＥＫ１／２及び全ＥＲＫ１／２の発現レベルも評価した。
　ウエスタンブロッティングの結果を図１１左に示す。ＭＡＰ３Ｋ８の発現誘導により、ＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２のリン酸化レベルの増強が認められた。またＭＥＫ１／２阻害剤処理によって、誘導されたＥＲＫ１／２のリン酸化レベルが抑制されることもわかった。
　同細胞のＩＦＮＧ発現レベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲで評価した結果を図１１右に示す。
　なお、ＭＡＰ３Ｋ８遺伝子のベクターは、市販のＭＡＰ３Ｋ８発現ベクター（ｐＣＬＸＳＮ－Ｔｐｌ２／Ｃｏｔ（ａｄｄｇｅｎｅ））のＮ末端にＨＡタグをつけた配列をＣＳＩＩ－ＥＦ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｕｓベクター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）にサブクローニングすることにより作製した。
［複数のＨＡＭ患者ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用検討］
（自発的増殖活性へのＭＥＫ１／２阻害剤の作用）
　８例のＨＡＭ患者ＰＢＭＣを培地（１０％　ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し、１×１０５細胞ずつ96 well round bottom plateに播種し、ＭＥＫ１／２阻害剤を加え合計０．２ｍＬの培養液において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　ＭＥＫ１／２阻害剤としては、ビニメチニブ（小野薬品工業、Ｂｉｎｉ）、コビメチニブ（ロシュ、Ｃｏｂｉ）、セルメチニブ（アストラゼネカ、Ｓｅｌｕｍ）、及びトラメチニブ（ノバルティスファーマ、Ｔｒａｍ）を用いた。ビニメチニブは終濃度が１、１０、１００又は１０００ｎＭとなるように添加し、コビメチニブ、セルメチニブ、及びトラメチニブは終濃度が１００ｎＭとなるように添加した。
　ＭＥＫ１／２阻害剤に代えて、同量のＤＭＳＯを添加した群（ＤＭＳＯ）、及び終濃度１００ｎＭのＢ－Ｒａｆ阻害剤として知られるベムラフェニブ（Cayman Chemical、Ｖｅｍｕｒ）を添加した群をネガティブコントロールとした。また、ＭＥＫ１／２阻害剤に代えて、終濃度１μｇ／ｍＬのステロイド治療薬として知られるプレドニゾロン（LKT Laboratories, Inc., St. Paul, MN、ＰＳＬ）を添加した群をポジティブコントロールとした。
　培養開始から６日後、各ウェルに１μＣｉ　３Ｈ－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１６時間培養を行った。その後、培養細胞をセルハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ　ＭＨ３　ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてガラスフィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ　Ａ　ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に吸着させ、乾燥させた。次いで、固体シンチレータＭｅｌｔｉｌｅｘ－Ａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を染み込ませ、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ　（ＷＡＬＬＡＣ　ＭｉｃｒｏＢｅｔａ　ＴｒｉＬｕｘ　１４５０－０２１）を用いて細胞に取り込まれた３Ｈ－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ量の測定を行った。各ＨＡＭ患者ＰＢＭＣのＤＭＳＯ群における３Ｈ－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅのカウントの平均を１００％として、各群の相対値を算出し、ＨＡＭ患者８例の３Ｈ－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ取り込み率の平均値を求めた。その結果、ＰＳＬと同様に全てのＭＥＫ１／２阻害剤がＨＡＭ－ＰＢＭＣの自発的増殖活性を抑制する効果を示した。結果を図１２に示す。
（ＣＸＣＬ１０産生へのＭＥＫ１／２阻害剤の作用）
　ＨＡＭ患者ＰＢＭＣによるＣＸＣＬ１０産生に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用について解析するため、８例のＨＡＭ患者ＰＢＭＣを培地（１０％　ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し１×１０５細胞ずつ96 well round bottom plateに播種し、ＭＥＫ１／２阻害剤を加え合計０．２ｍＬの培養液において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　用いたＭＥＫ１／２阻害剤及びその濃度、並びにネガティブコントロール及びポジティブコントロールの条件は（自発的増殖活性へのＭＥＫ１／２阻害剤の作用）に記載の条件と同様とした。
　培養開始から７日後、培養液を遠心分離して培養上清のみを回収した。培養上清中のＣＸＣＬ１０濃度はＣｙｔｏｋｉｎｅ　Ｂｅａｄｓ　Ａｒｒａｙ　ｋｉｔ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。
　ＤＭＳＯ群の培養液中におけるＣＸＣＬ１０濃度を１００％として、各群の相対値を算出し、ＨＡＭ患者８例のＣＸＣＬ１０濃度の平均値を求めた。その結果、ＭＥＫ１／２阻害剤はＨＡＭ－ＰＢＭＣによるＣＸＣＬ１０産生に対して作用を示さなかった。結果を図１３に示す。
（サイトカイン産生へのＭＥＫ１／２阻害剤の作用）
　ＨＡＭ患者ＰＢＭＣにおける各種サイトカインの産生に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用について解析するため、８例のＨＡＭ患者ＰＢＭＣを培地（１０％　ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し１×１０５細胞ずつ96 well round bottom plateに播種し、ＭＥＫ１／２阻害剤を加え合計０．２ｍＬの培養液において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　用いたＭＥＫ１／２阻害剤及びその濃度、並びにネガティブコントロール及びポジティブコントロールの条件は（自発的増殖活性へのＭＥＫ１／２阻害剤の作用）に記載の条件と同様とした。
　培養開始から７日後、培養液を遠心分離して培養上清のみを回収した。培養上清中のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０濃度はＣｙｔｏｋｉｎｅ　Ｂｅａｄｓ　Ａｒｒａｙ　ｋｉｔ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。
　各サイトカインについて、ＤＭＳＯ群の培養液中における濃度を１００％として、各群の相対値を算出し、ＨＡＭ患者８例の平均値を求めた。その結果、ＨＡＭ－ＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生に対しては、１００ｎＭ及び１０００ｎＭビニメチニブ、１００ｎＭコビメチニブ、並びに１００ｎＭトラメチニブによる抑制効果が認められた。ＴＮＦα産生に対しては、全てのＭＥＫ１／２阻害剤による抑制効果が認められた。ＩＬ－２産生に対しては、ＭＥＫ１／２阻害剤は作用を示さなかった。ＩＬ－６産生に対しては、１０００ｎＭビニメチニブ及び１００ｎＭコビメチニブによる抑制効果が認められた。ＩＬ－１０産生に対しては、１０００ｎＭビニメチニブ、１００ｎＭコビメチニブ、及び１００ｎＭトラメチニブによる抑制効果が認められた。なお、通常の投与量における血中濃度は、ビニメチニブ１０００ｎＭがトラメチニブ１００ｎＭに相当する。結果を図１３に示す。
［ＨＡＭ－ＰＢＭＣにおける各種細胞群に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用検討］
（実験手順）
　ＨＡＭ患者ＰＢＭＣにおける各種細胞群に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用について解析するため、ＨＴＬＶ－１　Ｔａｘ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を検出可能な７例のＨＡＭ患者ＰＢＭＣを用いて実験をおこなった。各ＨＡＭ患者のＰＢＭＣを培地（１０％　ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し、１×１０５細胞ずつ96 well round bottom plateに播種した。各ウェルにＭＥＫ１／２阻害剤を加え、合計０．２ｍＬの培養液において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　ＭＥＫ１／２阻害剤としては、１μＭビニメチニブ、及び１００ｎＭトラメチニブを用いた（薬剤の濃度は通常の投与量における血中濃度を参照して決定した。）。ＭＥＫ１／２阻害剤に代えて、同量のＤＭＳＯを添加した群（ＤＭＳＯ）をネガティブコントロールとした。また、ＭＥＫ１／２阻害剤に代えて、終濃度１μｇ／ｍＬ　ＰＳＬを添加した群をポジティブコントロールとした。
　培養開始から７日後、ＰＢＭＣをＣＤ３抗体－ＢＶ５１０（Biolegend）、ＣＤ４抗体－ＡＰＣ（eBioscience）、ＣＤ８抗体－ＰＥＣｙ７（eBioscience）、ＣＣＲ４抗体－ＢＶ４２１（Biolegend）、又はHLA-A*24:02 HTLV-1 Tax 301-309 Tetramer抗体－ＰＥ（ＭＢＬ）で４℃、３０分間染色した。染色後、ＦＡＣＳバッファー（０．５％　ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム添加ＰＢＳ）で洗浄し、７０％エタノールに懸濁して－２０℃で９０分間透過化処理を行った。透過化処理後のＰＢＭＣを２回洗浄し、増殖細胞をＫｉ６７抗体－ＦＩＴＣ（ＢＤ）を用いて染色した（室温、３０分間）。その後、ＰＢＭＣを洗浄後にＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメーターＣｅｌｅｓｔａ（ＢＤ）を用いて解析を行った。
（ＨＡＭ－ＰＢＭＣに対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用検討）
　ＨＡＭ患者７例のＨＡＭ－ＰＢＭＣ中のＫｉ６７＋細胞の割合の平均値を求めた。その結果、ビニメチニブ、トラメチニブ又はＰＳＬを添加した場合において、ＤＭＳＯを添加した場合と比較して増殖細胞の減少が認められた（図１４）。
　また、解析に用いたＨＡＭ－ＰＢＭＣには、ＰＳＬ添加により増殖細胞の減少が認められるＰＢＭＣ（ＰＳＬ応答（＋））と増殖細胞の減少が認められないＰＢＭＣ（ＰＳＬ応答（－））が存在した。他方、ビニメチニブ及びトラメチニブはＰＳＬ応答（＋）、及びＰＳＬ応答（－）のどちらのＰＢＭＣに対しても増殖細胞を減少する作用を示した（図１５）。解析を行った７例のＨＡＭ－ＰＢＭＣにおいてＰＳＬ応答（＋）は３例、ＰＳＬ応答（－）は４例であったが、ビニメチニブ及びトラメチニブは７例全てのＰＢＭＣに対して増殖細胞を減少する作用を示した（図１６）。
（ＨＡＭのＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用検討）
　ＨＡＭ患者７例においてＨＴＬＶ－１感染細胞を主に含む細胞群であるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＣＲ４＋Ｔ細胞における増殖細胞に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用を解析した。ＨＡＭ患者７例のＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合の平均値を求めた結果、ビニメチニブ又はトラメチニブを添加した場合において、ＤＭＳＯを添加した場合と比較して増殖細胞の減少が認められた（図１７）。また、ＨＡＭ患者７例のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＣＲ４＋細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合の平均値を求めた結果、ビニメチニブ又はトラメチニブを添加した場合において、ＤＭＳＯを添加した場合と比較して増殖細胞の減少が認められた（図１８）。
（ＨＡＭのＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用検討）
　ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＴＬＶ－１感染細胞中のウイルス発現に応答し、増殖すると共に炎症性サイトカインを産生しＨＡＭの過剰免疫応答を引き起こす細胞群である。このＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用を解析した。ＨＡＭ患者７例のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合の平均値を求めた結果、ビニメチニブ又はトラメチニブを添加した場合において、ＤＭＳＯを添加した場合に対して増殖細胞の減少が認められた（図１９）。
　また、ＨＴＬＶ－１より発現するＴａｘに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対するＭＥＫ１／２阻害剤の作用を検討するため、ＨＡＭ－ＰＢＭＣ中のＣＤ３＋ＣＤ８＋HLA-A*24:02 HTLV-1 Tax 301-309 Tetramer＋細胞の割合変化を解析した。その結果、ビニメチニブ又はトラメチニブを添加した場合において、ＤＭＳＯを添加した場合と比較してＴａｘ特異的なＣＴＬの減少が認められた（図２０）。

Claims (15)

  1. 　マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を含む、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防剤。
  2. 　前記物質が、ＭＥＫ１／２阻害剤である、請求項１に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
  3. 　前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤又はＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤である、請求項１に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
  4. 　前記物質が、ＥＲＫ１／２阻害剤である、請求項１に記載のＨＡＭの治療又は予防剤。
  5. 　対象におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、前記対象におけるＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の治療又は予防の有効性を判定する方法。
  6. 　対象におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、前記対象におけるＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）の活動性を評価する方法。
  7. 　対象におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化レベルを測定することを含む、前記対象がＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）に罹患しているかどうかを診断する方法。
  8. 　前記対象の末梢血中のＭＡＰ３Ｋ８濃度を測定することを含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記対象の末梢血中のＭＥＫ１／２又はＥＲＫ１／２のリン酸化レベルを測定することを含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　抗ＭＡＰ３Ｋ８抗体を含む、請求項８に記載の方法のためのキット。
  11. 　抗リン酸化ＭＥＫ１／２抗体又は抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を含む、請求項９に記載の方法のためのキット。
  12. 　ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）患者に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ８（ＭＡＰ３Ｋ８）が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性を抑制させる物質を薬理学的有効量投与することを含む、ＨＡＭの治療方法。
  13. 　前記物質が、ＭＥＫ１／２阻害剤である、請求項１２に記載のＨＡＭの治療方法。
  14. 　前記物質が、ＭＡＰ３Ｋ８阻害剤又はＭＡＰ３Ｋ８遺伝子発現抑制剤である、請求項１２に記載のＨＡＭの治療方法。
  15. 　前記物質が、ＥＲＫ１／２阻害剤である、請求項１２に記載のＨＡＭの治療方法。
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