CN113939309A - 使用sEphB4-HSA融合蛋白治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

提供了用于治疗受试者的癌症的组合物和方法，包括向受试者施用治疗有效量的抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂。在各种实施方案中，该方法还提供治疗有效量的免疫检查点抑制剂的施用。本发明人展示了，EphB4‑肝配蛋白B2抑制剂和检查点抑制剂的组合的协同作用通过激活T细胞和促进T细胞和NK细胞向肿瘤中的转运以及通过免疫细胞(例如，CD3和CD8)向肿瘤中的运输，为患有各种癌症的患者提供了更高的无进展生存期(PFS)和客观响应率(ORR)。

Description

使用sEphB4-HSA融合蛋白治疗癌症
相关专利申请
本申请要求于2019年3月17日提交的美国临时申请第62/819,642号和于2019年3月18日提交的美国临时申请第62/819,725号的权益，所述临时申请的每一项通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含以“纸质副本”(PDF文件)和以计算机可读形式在此提交的包含参考序列(SEQ ID NO:1-2)的文件(ST25格式文本文件)形式的序列表。序列表使用如37C.F.R.1.822中定义的氨基酸的标准三字母代码示出。
技术领域
目前，尽管已经开发了许多先进的诊断和治疗方法，癌症仍然是全世界死亡的主要原因。临床肿瘤学方面有疗效的治疗方案仍然依赖于手术切除、电离辐射和细胞毒性化学疗法的组合。成功治疗和预防癌症的主要障碍在于许多癌症仍然不能对当前的化学疗法和免疫疗法干预有响应的事实，并且许多个体即使在积极治疗后仍遭受复发或死亡。为了解决这些缺点，药物研发的趋势是开发能够调节癌症中失调的信号传导轴的靶向疗法。现在有许多FDA批准的允许对各种各样临床相关的靶进行治疗性操作的抗体和小分子。
癌症免疫疗法是给予利用免疫系统攻击癌症的癌症疗法的名称。全身免疫疗法是指用于治疗全身的免疫疗法，并且比用于治疗身体的一个“局部”部位的局部免疫疗法更常用，尤其是当癌症已经扩散时。尽管癌细胞比病原体免疫原性更低，但免疫系统明显能够识别和消除肿瘤细胞，并且癌症免疫疗法试图利用免疫系统的精致能力和特异性来治疗恶性肿瘤。不幸的是，肿瘤经常干扰免疫应答的发展和功能，例如，已建立的肿瘤内存在的抑制性环境抑制有效的免疫应答。免疫疗法的目标最终是重建免疫系统的抗肿瘤警惕性(vigilance)，并且抑制肿瘤和肿瘤微环境的免疫抑制。因此，免疫疗法的挑战是利用细胞和分子免疫学的进展来开发操纵局部肿瘤环境以促进促炎环境、促进树突细胞活化并有效和安全地增强抗肿瘤应答的策略。
使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的免疫疗法已经成为被广泛研究和临床评价的领域。免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3和TIM-3以及其他若干种蛋白(Sharpe等人,Nat Immunol,8:239-45,2007)。在正常生理条件下，免疫检查点对于维持自身耐受(即，防止自身免疫)和在免疫系统对病原感染进行应答时保护组织免受损伤至关重要。现在也很清楚的是，肿瘤选择某些免疫检查点途径作为免疫抵抗的主要机制，特别是抵抗针对肿瘤抗原特异性的T细胞(Pardoll DM.,Nat Rev Cancer,12:252-64,2012)。因此，利用针对免疫检查点分子的抗体的治疗包括，例如，CTLA-4(伊匹单抗)、PD-1(纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab))和PD-L1(BMS-936559、MPLD3280A、MEDI4736、MSB0010718C)(参见，例如，Philips和Atkins,International Immunology,27(1)；39-46,Oct 2014)和OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA(参见，例如，Sharon等人,Chin J Cancer.,33(9):434-444,Sep 2014；Hodi等人,N Engl J Med,2010；Topalian等人,N Engl J Med,366:2443-54)正被评估为治疗具有增生性疾病诸如癌症的患者，并且特别是具有难治性和/或复发性癌症的患者的新的可选的免疫疗法。
CTLA-4抗体是此类“检查点抑制剂”免疫治疗剂中第一个获得美国食品和药品管理局(FDA)批准的。抗CTLA-4抗体(包括伊匹单抗(ipilimumab)和tremelimumab)作为增强癌症中抗肿瘤免疫的新治疗策略正处于临床开发中。伊匹单抗和tremelimumab两者均已在黑素瘤中被广泛评估；值得注意的是，伊匹单抗最近被批准为治疗晚期黑素瘤的单一疗法。tremelimumab目前正在接受作为黑素瘤和恶性间皮瘤的单一疗法的II期试验评估，而伊匹单抗正在接受在各种肿瘤类型(包括黑素瘤、前列腺癌和肺癌)的II期和III期试验中作为单一疗法以及与其他治疗方式(诸如化学疗法和放射)一起的临床研究(Grosso等人,Cancer Immunity,Vol.13,第5页,22Jan 2013)。
PD-1/PD-L1相互作用的抑制在临床前模型中介导有效的抗肿瘤活性(美国专利第8,008,449号和第7,943,743号)，并且PD-1/PD-L1相互作用的Ab抑制剂用于治疗癌症的用途已经进入临床试验(参见例如，Topalian等人,Curr Opin Immunol.,24:207-212,2012；Brahmer等人,N Engl J Med.,366(26):2455-65,2012；Garon等人,N Engl J Med,372:2018-2028,2015；Philips等人,Int.Immunol.,27(1):39-46,2015)。已经在若干种鼠和人类癌症(包括人类肺癌、卵巢癌和结肠癌以及各种骨髓瘤)中发现了PD-L1表达，并且由例如Brsitol-Myers Squibb(BMS-936559)、Medimmune(MEDI4736)、Genentech(MPDL3280A)、Merck/Pfizer(MSB0010718C)开发的抗PD-L1抗体已经或目前正在进行临床评估。
目前，检查点抑制剂疗法已经成为许多癌症的首选二线或三线疗法，并且PD1/PDL1抗体已经改变了若干种癌症的治疗范式。尽管取得了这些重要进展，但对目前技术的改进仍存在重大需求。例如，检查点抑制剂疗法仍然受到潜在严重副作用的顾虑以及许多肿瘤缺乏靶向抗原并且将因此逃避治疗的事实的限制。通常，约20％的各种癌症患者对PD-1/PD-L1抗体或CTLA-4抗体有响应，并且在大多数情况下，总生存期仍不到一年，并且客观响应率不高，突出了对这些患者的近70％-80％的大量未满足的需求。
一线背景的化学免疫疗法组合正处于创新试验中。来自首个这样的试验(组合阿特珠单抗+基于铂的化学疗法)的结果于2019年9月30日在ESMO发布，该结果未达到OS的共同主要终点(co-primary endpoint)，并且达到PFS终点。值得注意的是，ORR为49％(单独化学疗法为44％)，PFS为8.2个月(单独化学疗法为6.3个月)，并且OS为16个月(单独化学疗法为13.4个月)。这些数据表明，护理标准(standard of care)没有变化，并且在这种情况下，化学疗法和免疫疗法之间表现为没有协同作用，并且对于生物标志物(即，PD-L1)表达没有预测价值。
为了解肿瘤微环境(TME)内免疫疗法的耐药性所涉及的因素所做的协同努力，已导致将调节性T细胞(Treg)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)鉴定为肿瘤生长和治疗响应的关键调节因素(Messenheimer DJ等人,Clin Cancer Res,23:6165-77,2017)。研究显示了高Treg/TAM浸润与较差生存结果(Pitt JM等人,Ann Oncol,27:1482-92,2016)和/或对化疗剂较差的响应之间的相关性。Treg或TAM的靶向耗竭已被报道改善不同肿瘤模型对化学疗法和检查点抑制剂的响应(Arce Vargas F等人,Immunity,46:577-86,2017)。然而，来自临床试验的数据表明，用Treg靶向免疫疗法(诸如抗CTLA-4)治疗后缺乏疗效(Robert C,Schachter等人,N Engl J Med,372:2521-32,2015)。因此，对于既能靶向TME内的免疫抑制细胞群体又能增强治疗益处的替代方法的需求尚未得到满足。
通过引用并入
为了所有目的，专利文件US 7,381,410、US 7,862,816、US 7,977,463、US 8,063,183、US 8,273,858、US 8,975,377、US 8,981,062、US 9,533,026；和本文公开的所有参考文献在此通过引用以其整体并入。
本发明的公开内容
如本文描述的，本发明人通过评估将免疫细胞募集至肿瘤的剂，通过解决具有少量免疫细胞或没有免疫细胞(冷肿瘤)且不太可能对免疫疗法有响应的肿瘤，在PD1/PD-L1靶向疗法成功的基础上进行了构建。特别地，肝配蛋白B2及其高亲和力同源受体EphB4是在肿瘤血管中诱导并调节免疫细胞运输的跨膜蛋白。融合到白蛋白的可溶性EphB4胞外片段(sEphB4-HSA)阻断了肝配蛋白B2和EphB4之间的相互作用，并阻断了双向信号传导，从而促进了免疫细胞运输。本发明人确定了EphB4-肝配蛋白B2相互作用的抑制可以在各种癌症中诱导抗肿瘤免疫应答。本发明人评估了单独的sEphB4-HSA以及与PD-1/PD-L1靶向抗体和CTLA-4靶向抗体组合的sEphB4-HSA作为各种癌症的一线治疗，或者可选地用于治疗在接受至少一种基于铂的化学疗法、放射疗法或检查点抑制剂疗法后疾病已经进展的患者的功效。本发明人展示了，该组合的协同作用通过激活T细胞和促进T细胞和NK细胞向肿瘤中的转运以及通过免疫细胞(例如，CD3和CD8)向肿瘤中的运输，为患有各种癌症的患者提供了更高的无进展生存期(PFS)和客观响应率(ORR)。
在一方面，本发明涉及抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂在制备用于单独或与免疫检查点抑制剂组合治疗癌症的药物中的用途。在各种实施方案中，癌症选自由以下组成但不限于以下的组：非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、转移性尿路上皮癌、乳腺癌、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤和白血病。在各种实施方案中，癌症肿瘤表达肝配蛋白B2。在各种实施方案中，癌症肿瘤表达PD-L1。在各种实施方案中，癌症肿瘤表达肝配蛋白B2和PD-L1。
在各种实施方案中，抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分或肝配蛋白B2蛋白，或结合并影响EphB4或肝配蛋白B2的抗体。在各种实施方案中，多肽剂是特异性结合肝配蛋白B2多肽并包含EphB4蛋白胞外结构域氨基酸序列的可溶性EphB4(sEphB4)多肽。在各种实施方案中，sEphB4多肽包含EphB4蛋白的球状结构域。
在各种实施方案中，sEphB4多肽包含选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-522至少90％相同的序列、与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-412至少90％相同的序列、以及与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-312至少90％相同的序列。在各种实施方案中，sEphB4多肽可以包含包括以下的序列：球状(G)结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸29-197)和任选的另外的结构域，诸如富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸239-321)、第一纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸324-429)和第二纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸434-526)。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-427。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-326。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-197、29-197、1-312、29-132、1-321、29-321、1-326、29-326、1-412、29-412、1-427、29-427、1-429、29-429、1-526、29-526、1-537和29-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸16-197、16-312、16-321、16-326、16-412、16-427、16-429、16-526和16-537。
在各种实施方案中，可溶性多肽可以以多聚体形式制备，例如通过表达为Fc融合蛋白或与另一种多聚化结构域融合。
在各种实施方案中，sEphB4多肽将还包含赋予增加的血清半衰期同时仍然保持肝配蛋白B2结合活性的另外的成分。在各种实施方案中，sEphB4多肽是单体的并且共价连接到一种或更多种聚氧化烯(polyoxyalkylene)基团(例如，聚乙烯、聚丙烯)。在各种实施方案中，sEphB4多肽共价连接到聚乙二醇(PEG)基团(以下简称“sEphB4-PEG”)。
在各种实施方案中，sEphB4多肽与赋予增加的半衰期而不实质减弱肝配蛋白B2结合的第二稳定多肽稳定缔合。在各种实施方案中，稳定多肽与人类患者(或动物患者，在设想兽医用途的情况下)免疫相容，并且将具有很小的生物活性或没有显著的生物活性。在各种实施方案中，sEphB4多肽与选自由人类血清白蛋白(HSA)(以下简称“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(以下简称“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-197。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQID NO:1的残基16-312。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-321。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-412。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-427。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-429。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-526。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。
在各种实施方案中，受试者先前对用抗癌疗法的治疗有响应，但是在疗法停止后遭受复发(下文称为“复发性癌症”)。在各种实施方案中，受试者患有抵抗性或难治性癌症。在各种实施方案中，所述癌症是基于铂的化学疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是免疫疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用化疗剂治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用小分子激酶抑制剂靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用手术治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用干细胞移植治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用放射治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是包括以下(例如两种或更多种)的组合疗法难治的：免疫疗法治疗、用基于铂的化疗剂治疗、用肿瘤抗原特异性的耗竭性抗体治疗、用包含肿瘤抗原特异性的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子治疗、用小分子激酶抑制剂靶向治疗、使用手术治疗、使用干细胞移植治疗和使用放射治疗。
在另一方面，本发明涉及抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂在制备用于治疗受试者的癌症的组合疗法的药物中的用途。在各种实施方案中，组合疗法对癌症的治疗具有协同作用。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的转移性尿路上皮癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述癌症是复发/难治的顺铂失败或不耐受的尿路上皮癌。在各种实施方案中，所述尿路上皮癌是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述尿路上皮癌是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了尿路上皮癌。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述NSCLC是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述NSCLC是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了NSCLC。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述HCC是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述HCC是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了HCC。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的结肠癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述结肠癌是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述结肠癌是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了结肠癌。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述RCC是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述RCC是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了RCC。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述HNSCC是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述HNSCC是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了HNSCC。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的卡波西肉瘤(KS)的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述KS是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述KS是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了KS。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的乳腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述乳腺癌是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述乳腺癌是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了乳腺癌。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的间皮瘤的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述间皮瘤是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述间皮瘤是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了间皮瘤。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述前列腺癌是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述前列腺癌是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了前列腺癌。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的胰腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述胰腺癌是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述胰腺癌是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了胰腺癌。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的膀胱癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述膀胱癌是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述膀胱癌是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了膀胱癌。
在各种实施方案中，该用途涉及治疗受试者的白血病的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽，和b)治疗有效量的检查点抑制剂。在各种实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，所述白血病是使用基于铂的化学疗法和/或放射疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述白血病是使用检查点抑制剂治疗难治的。在各种实施方案中，受试者复发了白血病。
在各种实施方案中，所述方法包括一种或更多种选自由以下组成的组的另外的抗癌疗法：免疫疗法、化学疗法、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的靶向治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的靶向治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子的靶向治疗、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法以及干细胞移植。组合疗法可以是协同的。组合疗法可以提高抗癌疗法的治疗指数。
在各种实施方案中，另外的疗法包括施用特异性结合免疫检查点蛋白抗原(来自包括但不限于以下的列表：CD276、CD272、CD152、CD223、CD279、CD274、TIM-3和B7-H4)的抗体或者本领域中教导的任何免疫检查点蛋白抗原抗体。
在各种实施方案中，PD-1抑制剂选自由以下组成但不限于以下的组：纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)(Drugbank 09035；Drugbank 06132)、派姆单抗(Merck)(Drugbank 09037)和匹地利珠单抗(Medivation)(Drugbank 15383)。
在各种实施方案中，CTLA-4抑制剂选自由以下组成但不限于以下的组：伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)(Drugbank 06186)和tremelimumab(MedImmune)(Drugbank11771)。
附图简述
图1描绘了用免疫染色法对上皮癌中EphB4表达进行的评估。
图2A描绘了携带B16黑素瘤(左图)或神经胶质瘤KR158(右图)的肝配蛋白B2-LacZ小鼠的肿瘤血管中或作为对照的正常肌肉(中图)中的肝配蛋白B2表达。图2B描绘了携带B16黑素瘤的肝配蛋白B2条件敲除小鼠与野生型小鼠相比显示出减少的肿瘤生长。图2C描绘了携带B16黑素瘤的肝配蛋白B2条件敲除小鼠与野生型小鼠相比具有CD3+T细胞数目的增加。图2D描绘了CD4/CD8 T细胞的耗竭消除了肝配蛋白B2条件敲除小鼠中肿瘤生长的降低。图2E描绘了植入KR158的肝配蛋白B2条件敲除小鼠显示出减少的肿瘤生长。图2F描绘了从前一实验中收获的肿瘤，显示出与野生型小鼠相比，肝配蛋白B2条件敲除小鼠中CD3+T细胞数目的增加。图2G描绘了在肝配蛋白B2条件敲除小鼠和野生型小鼠中，用CD4/CD8耗竭性抗体处理的小鼠显示出相似的肿瘤生长。
图3描绘了，用CD8细胞耗竭消除了msEphB4-MSA对B16黑素瘤的肿瘤生长抑制作用，而CD4细胞耗竭没有此效果。
图4描绘了msEphB4-MSA处理诱导的PD-L1表达。通过免疫荧光分析来自对照和sEphB4-MSA处理的小鼠的肿瘤的肿瘤样品的PD-L1表达。观察到膜中的PD-L1定位。
图5描绘了EphB4-Alb治疗后B16黑素瘤肿瘤裂解物中细胞因子和趋化因子的分析。
图6描绘了CD4 T细胞和CD8 T细胞的定量。
图7描绘了用sEphB4 10mg/kg每周三次、和PD-1中和抗体100μg每周两次、CTLA 4抗体以100μg每周两次腹膜内处理持续10天的B16黑素瘤肿瘤的肿瘤体积。随时间推移测量肿瘤体积。
图8描绘了测量具有基线和至少一次基线后肿瘤尺寸评估的靶病灶的最长直径总和从基线的最佳百分比变化的瀑布图。活检和仅切除剩余病变部位的肿瘤未显示肿瘤迹象，因此这些受试者的总响应是放射学PR和病理学CR。
图9描绘了提供随时间推移的患者响应的蜘蛛图。描绘了具有疾病进展(红色)、病情稳定(黄色)、部分响应(浅绿色)和完全响应(深绿色)的患者。
图10描绘了响应的持续时间。底部箭头描绘了已经切除病变残余部位的具有SD的患者。肾上腺中只有一个结节具有活的肿瘤。在治疗后12+个月，患者仍然没有疾病。
图11描绘了总生存期(A)和无进展生存期(B)的Kaplan-Meier图。中位值无进展生存期为5.7个月(95％CI：2.5-14.6)。
图12描绘了在治疗期间具有残余肿瘤的7名患者的基线和治疗期间的活检样品中测量的CD3和CD8的肿瘤细胞浸润。另外5名患者在重复活检时没有肿瘤(基线数据未示出)。
图13描绘了接受sEphB4-HSA+派姆单抗的一名患有广泛转移性膀胱癌的63岁女性。以上第12周的扫描显示90％以上的肺转移消退。
图14描绘了一名具有新膀胱(neo-bladder)的79岁男性。治疗第15周时，大的肿块(large mass)完全消退；病人仍在接受治疗。
用于进行本发明的方式
定义
除非本文中另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交关联使用的命名和技术是本领域常用且熟知的那些。除非另有指示，否则本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法和如各种一般和更具体的参考文献中描述地进行，所述参考文献在整个本说明书中引用和讨论。参见，例如，Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)，通过引用并入本文)。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书进行，如本领域通常完成或如本文描述的。本文描述的与分析化学、合成有机化学和药学和药物化学关联使用的命名以及实验程序和技术是本领域通常使用且熟知的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者治疗使用标准技术。
如本文使用的，“增生性疾病”包括肿瘤疾病(包括良性或癌性)和/或任何转移。增生性疾病可以包括过度增生性状况，诸如增生(hyperplasia)、纤维化(尤其是肺纤维化，但也包括其他类型的纤维化，诸如肾纤维化)、血管生成、银屑病、动脉粥样硬化和血管平滑肌增生，诸如血管成形术后狭窄或再狭窄。在各种实施方案中，增生性疾病是癌症。在各种实施方案中，增生性疾病是非癌性疾病。在各种实施方案中，增生性疾病是良性或恶性肿瘤。
术语“肿瘤”，如本文使用的，是指所有赘生性细胞生长和增殖(不论是恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。
术语“原发性肿瘤”是指位于细胞的自发、失调性生长开始的解剖部位(例如原始癌性肿瘤的器官)处的所有赘生性细胞生长和增殖(不论是恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。原发性肿瘤不包括转移。
如本文使用的，术语“转移”是指癌性肿瘤在与原始癌性肿瘤的器官不直接相连的器官或身体部分中的生长。转移将被理解为包括微转移，微转移是在与原始癌性肿瘤的器官(例如，包含原发性肿瘤的器官)不直接相连的器官或身体部分中检测不到的量的癌性细胞的存在。转移也可以被定义为一个过程的若干步骤，诸如癌细胞从原始肿瘤部位(例如，原发性肿瘤部位)离开，以及癌细胞迁移和/或侵袭到身体的其他部分。
用本发明的方法治疗的感兴趣的肿瘤包括实体肿瘤，例如癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肉瘤等。特别感兴趣的是乳腺癌。癌包括各种腺癌，例如前列腺、肺中的癌等；肾上腺皮质癌；肝细胞癌；肾细胞癌、卵巢癌、原位癌、导管癌、乳腺癌、基底细胞癌；鳞状细胞癌；移行细胞癌；结肠癌；鼻咽癌；多房囊性肾细胞癌；燕麦细胞癌、大细胞肺癌；小细胞肺癌；等等。癌可以存在于前列腺、胰腺、结肠、脑(通常作为继发性转移)、肺、乳腺、皮肤等中。软组织肿瘤的名称中包括源自成纤维细胞、肌成纤维细胞、组织细胞、血管细胞/内皮细胞和神经鞘细胞的赘生物。结缔组织的肿瘤包括肉瘤、组织细胞瘤、纤维瘤、骨骼软骨肉瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、透明细胞肉瘤、纤维肉瘤等。血液癌症包括白血病和淋巴瘤，例如皮肤T细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)等。
“抵抗性或难治性癌症”是指对以前的抗癌疗法(包括例如化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植和免疫疗法)无响应的肿瘤细胞或癌症。肿瘤细胞在治疗开始时可以具有抵抗性或难治性，或者在治疗期间可以变得具有抵抗性或难治性。难治性肿瘤细胞包括在治疗开始时对治疗没有响应或最初短时间段对治疗有响应但失去响应的肿瘤。难治性肿瘤细胞也包括对抗癌疗法治疗有响应但对后续轮治疗失去响应的肿瘤。为了本发明的目的，难治性肿瘤细胞还包括表现为被抗癌疗法治疗抑制但在停止治疗后长达5年(有时长达10年或更长时间)复发的肿瘤。抗癌疗法可以使用单独的化疗剂、单独的放射、单独的靶向疗法、单独的手术或其组合。为了便于描述而非限制，应当理解，难治性肿瘤细胞可与抵抗性肿瘤细胞互换。
如本文使用的，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下任何一种或更多种：减轻一种或更多种症状；减少疾病程度；预防或延缓疾病的扩散(例如转移，例如转移到肺或淋巴结)；预防或延缓疾病复发；稳定、延缓或减缓疾病进展；改善疾病状态；缓解(部分或全部)和提高生活质量。“治疗”还涵盖减少增生性疾病的病理后果。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任何一个或更多个方面。
如本文使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗特定紊乱、状况或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或更多种症状的化合物或组合物的量。对于NHL和其他癌症或其他有害的细胞增殖，有效量包括足以实现以下量：(i)降低癌细胞的数目；(ii)降低肿瘤尺寸；(iii)在一定程度抑制、延迟、减缓并且优选地，停止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度减缓并且优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度减轻一种或更多种与癌症关联的症状。有效量可以以一次或更多次施用来施用。
“辅助背景”是指其中受试者有增生性疾病史，特别是癌症史，并且通常(但不一定)对治疗(包括但不限于手术(诸如手术切除)、放射疗法和化学疗法)有响应的临床背景。然而，由于其增生性疾病(诸如癌症)史，这些受试者被认为有发展为该疾病的风险。“辅助背景”中的治疗或施用是指随后的治疗模式。风险程度(即，处于辅助背景中的受试者被认为是“高风险”还是“低风险”)取决于若干因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。
措辞“协同效应”是指当一起使用的活性成分大于单独使用活性成分产生的效应的总和时所达到的效应。
措辞“施用”或“引起施用(cause to be administered)”是指由医学专业人员(例如医师)或控制受试者的医疗护理的人员采取的控制和/或允许向受试者施用所讨论的剂/化合物的行动。引起施用可以包括诊断和/或确定合适的治疗方案，和/或为受试者开特定的剂/化合物的处方。这样的开处方可以包括例如起草处方形式、注释医疗记录等。当本文中描述施用时也设想了“引起施用”。
术语“患者”、“个体”和“受试者”可以互换地使用，并且指哺乳动物，优选人类或非人类灵长类动物，但也指家养哺乳动物(例如犬科动物或猫科动物)、实验室哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)和农业哺乳动物(例如马科动物、牛科动物、猪、绵羊(ovine))。在各种实施方案中，患者可以是在医院、精神病护理机构如门诊或其他临床环境中的医师或其他医务人员的护理下的人类(例如，成年男性、成年女性、青少年男性、青少年女性、男性儿童、女性儿童)。
如本文使用的，述及本发明的融合分子与一种或更多种其他治疗剂的术语“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“与...组合(in combinationwith)”旨在意指并且的确指以下且包括以下：当此类组分被一起配制成在基本上同时将所述组分释放至所述受试者的单一剂型时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合同时施用至需要治疗的受试者；当此类组分彼此分开配制成在基本上同时被所述受试者服用的单独的剂型，届时所述组分基本上同时释放至所述受试者时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合基本上同时施用至需要治疗的受试者；当此类组分彼此分开配制成以每次施用之间的显著的时间间隔被所述受试者在连续时间服用的单独的剂型，届时所述组分在基本上不同的时间释放至所述受试者时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合依次施用至需要治疗的受试者；以及，当此类组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型，届时它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠释放至所述受试者，其中每个部分可通过相同或不同的途径施用时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合依次施用至需要治疗的受试者。
如本文使用的，术语“免疫疗法”是指包括但不限于以下的癌症治疗：使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体
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诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物响应调节因子诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继性转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因的)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；以及使用免疫刺激剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。在某些实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此链的一个末尾(氨基末端)处的末端氨基酸具有游离氨基基团，而链的另一个末尾(羧基末端)处的末端氨基酸具有游离羧基基团。如本文使用的，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基基团，或肽中任何其他位置处的氨基酸的α-氨基基团(当参与肽键时为亚氨基基团)。类似地，术语“羧基末端”是指肽的羧基末端上的游离羧基基团，或肽中任何其他位置处的氨基酸的羧基基团。肽还包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模拟物(peptide mimetic)，诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。
术语“重组多肽”，如本文使用的，旨在包括所有多肽，包括通过重组方式制备、表达、产生、衍生或分离的融合分子，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽。
本公开内容的多肽包括已经以任何方式和为了任何目的被修饰的多肽，所述目的例如：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改变其它物理化学或功能性质。例如，单氨基酸取代或多氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。“保守氨基酸取代”是指多肽中的氨基酸被功能上相似的氨基酸取代。以下六组各自包含互相为保守取代的氨基酸：
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
精氨酸(R)和赖氨酸(K)
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
如本文使用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指与对应的全长蛋白相比具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失的多肽。在某些实施方案中，片段的长度可以是例如至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度也可以是例如最多1000个、最多900个、最多800个、最多700个、最多600个、最多500个、最多450个、最多400个、最多350个、最多300个、最多250个、最多200个、最多150个、最多100个、最多50个、最多25个、最多10个或最多5个氨基酸。片段还可以在其任一个或两个末端处包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在的蛋白的氨基酸的序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
本文使用的术语“多肽变体”和“多肽突变体”是指包含这样的氨基酸序列的多肽，其中相对于另一多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入至该氨基酸序列、从该氨基酸序列中缺失和/或被取代到该氨基酸序列中。在某些实施方案中，待被插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。本公开内容的变体包括融合蛋白。
如本文使用的术语“可溶性多肽”仅表示多肽不包含足以损害多肽在生理盐溶液中溶解性的跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。
“药物组合物”是指适于动物中的药物使用的组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药理学有效量”是指有效产生预期药理学结果的剂的量。“药学上可接受的载体或赋形剂”意指可用于制备药物组合物的通常为安全、无毒性且期望的赋形剂，并且包括对于兽医使用以及人类药物使用是可接受的赋形剂。这样的赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者，在气雾剂组合物的情况下，可以是气体，并且指任何标准的药物载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖的水性溶液，和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和各种类型的润湿剂和/或辅助剂。在Remington's Pharmaceutical Sciences,21st Ed.2005,Mack Publishing Co,Easton中描述了合适的药物载体和制剂。“药学上可接受的盐”是可以被配制成用于药学用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨的盐或有机胺的盐。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“主要由这些方面和实施方案组成”。
本文中述及“约”某一值或参数包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。例如，述及“约X”的描述包括对“X”的描述。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附的权利要求中使用的单数形式“一”、“或”和“所述/该”包括复数指代物。
用于进行本公开内容的方式
本公开内容的方法包括通过施用抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂作为单一疗法或与PD-1抑制剂其他针对免疫检查点分子的拮抗性或阻断抗体组合来治疗、降低或预防原发性肿瘤生长或原发性癌形成或癌转移。
EphB4–肝配蛋白B2抑制剂
I型受体酪氨酸激酶EphB4和膜定位配体肝配蛋白B2诱导双向信号传导(在受体表达细胞中正向信号传导，在配体表达细胞中反向信号传导)。EphB4属于最大的受体酪氨酸激酶家族，并且据报道，在与肝配蛋白B2配体相互作用时，可调节神经元迁移、骨重塑、血管生成、癌症进展和转移(Pasquale EB,Cell,133:38-52,2008)。EphB4和肝配蛋白B2的表达在绝大多数成年正常组织中下调，甚至在出生后发育早期也是如此，但EphB4在多种上皮癌(包括肺癌、膀胱癌、头颈癌和胰腺癌)中过表达(Ferguson BD等人,Growth Factors,32:202-6,2014)。包括突变Kras和PTEN缺失在内的癌基因诱导EphB4表达。因为EphB4的敲低通过细胞凋亡导致细胞死亡，所以EphB4的表达与分期、分级和存活相关。在若干种癌症类型中报道了配体肝配蛋白B2的过表达和与不良结果的相关性。ICT使肿瘤血管(和肿瘤)中的肝配蛋白B2增加，并且高肝配蛋白B2阻止免疫细胞募集，并从而导致对疗法的抵抗。
抑制EphB4-肝配蛋白B2相互作用对体外和离体肿瘤细胞增殖有直接抑制作用。本发明人先前已经描述了抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂(参见，例如，US 7,381,410、US 7,862,816、US 7,977,463、US 8,063,183、US 8,273,858、US 8,975,377、US8,981,062、US 9,533,026；为了所有目的，每一项在此通过引用以其整体并入)。sEphB4-HSA是一种由在C末端与白蛋白融合的可溶性EphB4胞外结构域组成的表达为123.3kDa的单个无缝蛋白的完全人类融合蛋白。sEphB4-HSA特异性地结合肝配蛋白B2。在肿瘤模型中对sEphB4-HSA的初步研究显示，T细胞和NK细胞向肿瘤中的迁移增加。这伴随着肿瘤血管中ICAM-1的诱导。ICAM-1是一种促进T细胞和NK细胞附着于内皮的整联蛋白，随后细胞转移到肿瘤中。sEphB4-HSA还显示出通过阻断肿瘤细胞和肿瘤血管中的EphB-肝配蛋白B2相互作用而下调PI3K信号传导。sEphB4-HSA通过下调PI3K途径阻断信号传导并促进免疫细胞向肿瘤中运输并抑制肿瘤细胞中的存活信号。
靶向EphB4-肝配蛋白B2代表了一种经受住临床试验检验的治疗策略。它在多项临床试验中被显示是安全的，毒性极低至无毒性(A.El-Khoueiry BG等人,Eur J Cancer,69,2016)，这可能是由于正常组织中的低表达水平。虽然缺乏表明癌症相关免疫应答中EphB4-肝配蛋白B2相互作用的直接证据，但多份报告记录了Eph/肝配蛋白基因家族成员在炎症模型(诸如动脉硬化和伤口愈合)中调节免疫细胞过程(Braun J等人,Arterioscler ThrombVasc Biol,31:297-305,2011；Poitz DM等人,Mol Immunol,68:648-56,2015；Yu G等人,JImmunol,171:106-14,2003；Funk SD等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol,32:686-95,2012)。Eph-肝配蛋白相互作用还被报道调节单核细胞粘附至血管壁跨内皮迁移、T细胞趋化性、活化、增殖和细胞凋亡以及造血细胞从骨髓窦的动员。
在本发明的各种实施方案中，抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分或肝配蛋白B2蛋白，或结合并影响EphB4或肝配蛋白B2的抗体。在各种实施方案中，多肽剂是特异性结合肝配蛋白B2多肽并包含EphB4蛋白胞外结构域氨基酸序列的可溶性EphB4(sEphB4)多肽。在各种实施方案中，sEphB4多肽包含EphB4蛋白的球状结构域。
在各种实施方案中，sEphB4多肽包含选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-522至少90％相同的序列、与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-412至少90％相同的序列、以及与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-312至少90％相同的序列。在各种实施方案中，sEphB4多肽可以包含包括以下的序列：球状(G)结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸29-197)和任选的另外的结构域，诸如富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸239-321)、第一纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸324-429)和第二纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸434-526)。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-427。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-326。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-197、29-197、1-312、29-132、1-321、29-321、1-326、29-326、1-412、29-412、1-427、29-427、1-429、29-429、1-526、29-526、1-537和29-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸16-197、16-312、16-321、16-326、16-412、16-427、16-429、16-526。在各种实施方案中，sEphB4多肽可以是包含与任何前述氨基酸序列至少90％并且任选95％或99％相同的氨基酸序列同时保留肝配蛋白B2结合活性的多肽。在各种实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的任何变异是不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的保守改变或缺失，特别是在表面环区域。
在各种实施方案中，可溶性多肽可以以多聚体形式制备，例如通过表达为Fc融合蛋白或与另一种多聚化结构域融合。
在各种实施方案中，sEphB4多肽将还包含赋予增加的血清半衰期同时仍然保持肝配蛋白B2结合活性的另外的成分。在各种实施方案中，sEphB4多肽是单体的并且共价连接到一种或更多种聚氧化烯基团(例如，聚乙烯、聚丙烯)。在各种实施方案中，sEphB4多肽共价连接到单个聚乙二醇(PEG)基团(以下简称“sEphB4-PEG”)。在各种实施方案中，sEphB4多肽共价连接到两种、三种或更多种PEG基团。
在各种实施方案中，一种或更多种PEG可以具有范围为约1kDa至约100kDa、约10kDa至约60kDa和约10kDa至约40kDa的分子量。PEG基团可以是直链PEG或支链PEG。在各种实施方案中，可溶性单体sEphB4缀合物包含与一种约10kDa至约40kDa或约15kDa至30kDa的PEG基团共价连接的sEphB4多肽(单PEG化EphB4)，优选经由sEphB4赖氨酸的s-氨基基团或N-末端氨基基团。在各种实施方案中，sEphB4在由sEphB4赖氨酸的s-氨基基团和N-末端氨基基团组成的组中的一个氨基基团处随机PEG化。
在各种实施方案中，sEphB4多肽与赋予增加的半衰期而不实质减弱肝配蛋白B2结合的第二稳定多肽稳定缔合。在各种实施方案中，稳定多肽与人类患者(或动物患者，在设想兽医用途的情况下)免疫相容，并且将具有很小的生物活性或没有显著的生物活性。在各种实施方案中，sEphB4多肽与选自由人类血清白蛋白(HSA)(以下简称“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(以下简称“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合。
在各种实施方案中，共价附接可以通过将sEphB4多肽表达为与人类血清白蛋白的共翻译融合体来实现。白蛋白序列可以融合在sEphB4多肽的N-末端、C-末端或非破坏性的内部位置。sEphB4的暴露环将是白蛋白序列插入的合适位置。白蛋白也可以在翻译后通过例如化学交联附接到sEphB4多肽。在各种实施方案中，sEphB4多肽也可以与多于一种白蛋白多肽稳定缔合。
在各种实施方案中，sEphB4-HSA融合体抑制肝配蛋白B2和EphB4之间的相互作用、肝配蛋白B2或EphB4的聚集、肝配蛋白B2或EphB4的磷酸化或其组合。在各种实施方案中，相对于未修饰的野生型多肽，sEphB4-HSA融合体具有增强的体内稳定性。
在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQID NO:1的残基16-197。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-312。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-321。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-412。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-427。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-429。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-526。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。
免疫检查点抑制剂
据报道，许多免疫检查点蛋白抗原在各种免疫细胞上表达，包括例如SIRP(在巨噬细胞、单核细胞、树突细胞上表达)、CD47(在肿瘤细胞和其他细胞类型上高度表达)、VISTA(在单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞上表达)、CD152(由活化的CD8+T细胞、CD4+T细胞和调节性T细胞表达)、CD279(在肿瘤浸润性淋巴细胞上表达，由活化的T细胞(CD4和CD8两者)、调节性T细胞、活化的B细胞、活化的NK细胞、无反应性T细胞、单核细胞、树突细胞表达)、CD274(在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞上表达)和CD223(由活化的T细胞、调节性T细胞、无反应性T细胞、NK细胞、NKT细胞和浆细胞样树突细胞表达)(参见例如，Pardoll,D.,Nature Reviews Cancer,12:252-264,2012)。结合被确定为免疫检查点蛋白的抗原的抗体是本领域技术人员已知的。例如，本领域已经描述了各种抗CD276抗体(参见例如，美国专利公布第20120294796号(Johnson等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了各种抗CD272抗体(参见例如，美国专利公布第20140017255号(Mataraza等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了各种抗CD152/CTLA-4抗体(参见例如，美国专利公布第20130136749号(Korman等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了各种抗LAG-3/CD223抗体(参见例如，美国专利公布第20110150892号(Thudium等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了各种抗CD279(PD-1)抗体(参见例如，美国专利第7,488,802号(Collins等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了各种抗PD-L1抗体(参见例如，美国专利公布第20130122014号(Korman等人)及其中引用的参考文献)；本领域已经描述了各种抗TIM-3抗体(参见例如，美国专利公布第20140044728号(Takayanagi等人)及其中引用的参考文献)；并且本领域已经描述了各种抗B7-H4抗体(参见例如，美国专利公布第20110085970号(Terrett等人)及其中引用的参考文献)。为了其中教导的特定抗体和序列，这些参考文献中的每一篇通过引用以其整体特此并入。
在各种实施方案中，免疫检查点蛋白抗原选自由以下组成但不限于以下的组：PD1和PDL-1、CD276、CD272、CD152、CD223、CD279、CD274、CD40、SIRPα、CD47、OX-40、GITR、ICOS、CD27、4-1BB、TIM-3、B7-H3、B7-H4和VISTA。
免疫检查点PD-1和CTLA抑制剂对若干种表达干扰素γ信号、富含肿瘤浸润免疫细胞和表达PD-L1的癌症有效。肿瘤血管调节免疫细胞进入肿瘤，因此肿瘤血管调节可以提供改变肿瘤环境的途径。
PD-1受体-配体相互作用是被肿瘤劫持以抑制免疫控制的主要途径。在健康条件下，在活化的T细胞的细胞表面表达的PD-1的正常功能是下调不需要的或过度的免疫应答，包括自身免疫反应。PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)在多种细胞类型(包括非造血组织以及多种肿瘤)中是组成型表达或可被诱导的。任一种PD-1配体与PD-1的结合抑制通过T细胞受体触发的T细胞活化。PD-1被认为调节具有黑素瘤(MEL)的受试者的肿瘤特异性T细胞扩增。这表明，PD-1/PD-L1途径在肿瘤免疫逃避中发挥关键作用，并且应被认为是有吸引力的用于治疗干预的靶。
派姆单抗
Figure BDA0003359999030000241
是一种强效且高选择性的IgG4/κ同种型的人源化单克隆抗体(mAb)，被设计为直接阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。美国食品和药品管理局(FDA)于2016年8月5日批准了
Figure BDA0003359999030000251
用于治疗一些具有晚期形式头颈癌的患者。该批准是用于具有复发或转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者(尽管采用了标准的化学疗法护理治疗，但仍持续进展)。
Figure BDA0003359999030000252
最近在美国获得批准，用于治疗具有无法切除或转移性黑素瘤的患者、以及在伊匹单抗和BRAF抑制剂(如果BRAFV600突变阳性)之后疾病进展的患者。
纳武单抗
Figure BDA0003359999030000253
是一种人类IgG4抗PD-1单克隆抗体，其作为检查点抑制剂发挥作用，阻断本来会阻止活化的T细胞攻击癌症的信号，从而允许免疫系统清除癌症。
Figure BDA0003359999030000254
与伊匹单抗组合用作无法手术或转移性黑素瘤的一线治疗(如果癌症不伴有BRAF突变)；
Figure BDA0003359999030000256
用作伊匹单抗治疗后的二线治疗；并且如果癌症伴有BRAF突变，则
Figure BDA0003359999030000255
与BRAF抑制剂一起用作鳞状非小细胞肺癌的二线治疗；以及
Figure BDA0003359999030000257
用作肾细胞癌的二线治疗。
在各种实施方案中，组合治疗方法中使用的PD-1抑制剂选自由以下组成但不限于以下的组：纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)(Drugbank 09035；Drugbank 06132)、派姆单抗(Merck)(Drugbank 09037)和匹地利珠单抗(Medivation)(Drugbank 15383)。
在各种实施方案中，CTLA-4抑制剂选自由以下组成但不限于以下的组：伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)(Drugbank 06186)和tremelimumab(MedImmune)(Drugbank11771)。
癌症
在美国，尿路上皮癌发病率为每年80,470例，每年导致17,670人死亡，并且仍然是重大的健康挑战(Siegel RL等人,Cancer J Clin.2019；69(1):7-34,2019)。如果不治疗，则患者的中位值生存期为～4.5个月。如果用细胞毒性化学疗法治疗，则生存期增加至～7.5个月，其中ORR为～15％，并且PFS为3-3.5个月。然而，细胞毒性化学疗法会导致严重的毒性。组合细胞毒性化学疗法导致响应率略微提高，而生存期没有提高，但毒性恶化。因此，在免疫疗法出现之前，对于以前治疗过的转移性尿路上皮癌患者，单一疗法优于组合疗法。在美国最常用的单一剂(single agent)包括吉西他滨、紫杉醇和多西他赛。
在转移情形中，自2000年以来，一线背景的标准治疗没有改变，并且仍然是基于顺铂的化学疗法。研究了许多一线治疗失败后的单一剂(诸如长春氟宁(ORR 18％，OS 6.6个月)、吉西他滨(ORR 11％，OS 8.7个月)、培美曲塞(ORR 28％，OS 9.6个月)、紫杉醇(ORR10％，OS 7.2个月))和组合方案(诸如紫杉醇与氨甲蝶呤(ORR 32％，OS 5个月)或吉西他滨(ORR 47％，OS 7.5个月)或多西他赛与异环磷酰胺(ORR 25％，OS 4个月))。基于安全性和功效，最常用的剂是紫杉醇、多西他赛和卡铂。响应率为～10％-15％，并且总生存期为6-9个月。组合化学疗法导致更高的响应率，更大的毒性，但生存期没有提高(Raggi D等人,AnnOncol.27(1):49-61,2016)。直到抗PD1/PDL1抗体获得批准，以前接受过治疗的转移性尿路上皮癌患者才获得了具有生存期益处的更持久的二线选择。预期中位值生存期达10.3个月，并且响应率为21.1％，5种不同的药物正处于临床实践中，包括派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。派姆单抗被批准用于这一患者群体，它仅在少数患者中有效，中位值总生存期(OS)为10.3个月(95％CI，8-11.8)，中位值总无进展生存期(PFS)为2.1个月(95％CI，2.0-2.2)，在这一患者群体中总响应率(ORR)为21.1％(95％CI，16.4至26.5)以及完全响应率为7％。
肝细胞癌(HCC)是世界某些地区最常见的癌症，并且也是全球第五常见的癌症。在全球范围内，它是男性癌症死亡的第二大原因，也是女性癌症死亡的第六大原因(参见例如，Parkin D.M.,Lancet Oncology,2:533-43,2001)。由于HCC通常在临床表现过程中诊断较晚，因此只有10％-15％的患者适合进行治疗性手术。对于大多数HCC患者，全身化学疗法或支持疗法是主要的治疗选择。HCC通常是治疗高度难治的，并且大多数化疗剂显示出有限的有效性，并且不能提高患者的生存率(参见例如，Gish R.G.等人,J.of ClinicalOncology 25:3069-75,2007；Ramanathan R.K.等人,J.of Clinical Oncology 24:4010,2006)。最近评估程序性死亡1(PD-1)抗体纳武单抗
Figure BDA0003359999030000261
的研究显示出约10％-20％的响应率。CR的响应持续时间为14–17+个月，PR为<1–8+个月，并且病情稳定(SD)为1.5–17+个月。6个月的总生存(OS)率为72％。纳武单抗展示出可管理的AE概况，并在所有剂量水平和HCC队列中产生了持久的响应，具有良好的6个月OS率。
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)占涉及上呼吸消化道(UADT)的癌症的几乎90％。在美国2005年，口腔癌、咽癌和喉癌预计占癌症发病率的近3％和癌症死亡的2％。全世界每年有约50万新确诊病例。男性受到的影响是女性的两倍多。这些癌症中超过一半涉及口腔。其余的在喉和咽之间平均分配。许多临床试验正在测试免疫疗法在人类癌症包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中的益处。客观响应率为6％-20％(Szturz P等人,BMC Med,15:110,2017；Ferris RL等人,Oral Oncol,81:45-51,2018；Postow MA等人,J Clin Oncol,33:1974-82,2015；Chow LQM等人,J Clin Oncol,34:3838-45,2016；Siu LL等人,JAMA Oncol 2018)并且绝大多数患者表现出对免疫疗法的先天或适应性抵抗。由于对患者的毒性增加且缺乏额外的益处，简单组合更多免疫检查点抑制剂的尝试也被证明是令人失望的(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02205333)。在HNSCC的原位小鼠模型中，我们最近已经展示，即使在用抗PDL1抗体和放射疗法(RT)组合治疗后，肿瘤再生也会发生(7,8)。(OweidaA等人,Clin Cancer Res,2018；Messenheimer DJ等人,Clin Cancer Res,23:6165-77,2017)。
放射治疗仍然是局部晚期HNSCC患者的最佳治疗(definitive management)的标准护理治疗，并且可以作为免疫治疗的辅助，但响应于RT有一些不良效应，继而损害了免疫治疗剂的功效。RT在后期(修复)阶段无法克服免疫抑制性群体诸如Treg的积累(7)。因此，找到与RT协同并抵消其负面作用的其他治疗对于克服不利副作用、治疗耐药性和肿瘤再生至关重要。
HNSCC的五年生存率很低，并且几十年来尚未改善。此外，患有这种疾病的患者经历严重的病状，包括外形毁损、言语问题、吞咽和呼吸问题。晚期诊断和复发倾向是阻碍改善这些患者预后的挑战。派姆单抗是一种强效且高选择性的IgG4/κ同种型的人源化单克隆抗体(mAb)，被设计为直接阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。美国食品和药品管理局(FDA)于2016年8月5日批准了派姆单抗
Figure BDA0003359999030000281
用于治疗一些具有晚期形式头颈癌的患者。该批准是用于具有复发或转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者(尽管采用了标准的化学疗法护理治疗，但仍持续进展)。根据FDA的批准摘要，28名患者(16％)在用派姆单抗治疗后经历肿瘤响应。这些患者中23例(82％)的肿瘤响应持续了6个月或更长时间，并且有几例持续了2年以上。与肿瘤为人类乳头瘤病毒(HPV)阴性的患者相比，肿瘤为HPV阳性的HNSCC患者通常在用化学疗法治疗后具有更佳的结果。根据FDA的批准摘要，在具有HPV阳性肿瘤的患者以及具有HPV阴性肿瘤的患者中均观察到响应(分别为24％和16％)。
非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型。鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌都是NSCLC的亚型。NSCLC占所有肺癌的约85％。作为一个类别，与小细胞癌相比，NSCLC对化学疗法相对不敏感。在可能的情况下，它们主要通过治疗目的性手术切除进行治疗，尽管越来越多地在术前(新辅助化学疗法)和术后(辅助化学疗法)均使用化学疗法。在2015年10月2日，FDA批准了派姆单抗用于治疗肿瘤表达PD-L1且其他化疗剂治疗失败的转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者。在2016年10月，派姆单抗成为第一个用于NSCLC一线治疗的免疫疗法，前提是癌症过表达PDL1且癌症没有EGFR或ALK突变；如果已经施用了化学疗法，那么派姆单抗可以用作二线治疗，但如果癌症具有EGFR或ALK突变，则应首先使用靶向这些突变的剂。必须用经验证和批准的伴随诊断进行PDL1的评估。在Keynote-001试验(NTC01295827)中，评估了派姆单抗对程序性细胞死亡1(PD-1)的抑制在晚期非小细胞肺癌患者中的功效和安全性。在所有患者中，客观响应率为19.4％，并且中位值响应持续时间为12.5个月。无进展生存的中位值持续时间为3.7个月，并且总生存的中位值持续时间为12.0个月。至少50％的肿瘤细胞中PD-L1表达被选为区分于训练组的截止值。在验证组的比例评分为至少50％的患者中，响应率为45.2％。在比例评分为至少50％的所有患者中，中位值无进展生存期为6.3个月；未达到中位值总生存期。至少50％的肿瘤细胞中PD-L1表达与提高的派姆单抗疗效相关(Garon等人,N Engl J Med,372:2018-2028,2015)。
前列腺癌是男性中最常见的非皮肤恶性肿瘤并且是西方世界男性癌症死亡的第二大原因。前列腺癌是由前列腺中异常细胞不受控制的生长引起的。当前列腺癌肿瘤发展时，雄激素，诸如睾酮，促进前列腺癌肿瘤生长。在其早期阶段，局限性前列腺癌通常用局部疗法治疗，包括例如前列腺的手术切除和放射疗法。然而，当局部治疗不能治愈前列腺癌(多达三分之一的男性均是如此)时，该疾病会进展为无法治愈的转移性疾病(即癌症从身体的一个部位扩散到其他部位的疾病)。如本文使用的，术语“前列腺癌”以最广泛的意义使用，并且指产生于前列腺组织的所有阶段和所有形式的癌症。术语“前列腺癌”包括位于前列腺组织中的任何类型的恶性(即，非良性)肿瘤，诸如例如前列腺腺癌、前列腺肉瘤、未分化的前列腺癌、前列腺鳞状细胞癌、前列腺导管移行癌和前列腺上皮内瘤。
卡波西肉瘤(KS)是一种血管内皮的多灶性血管增生性紊乱，与卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)(也称为人类疱疹病毒-8(HHV-8))感染相关性最高。KS与许多流行病学和病理生理学因素相关。KS分为四种不同的临床类型：典型的地中海型KS、非洲特有型KS、免疫抑制药物相关型KS和HIV相关型KS。HIV相关型KS(在HIV和AIDS时代之前是罕见疾病)在HIV感染患者中是最常见的恶性肿瘤。KS可以影响很多器官。KS最常表现为皮肤疾病。在许多晚期病例中，KS涉及诸如肺、肝或胃肠道等器官。此时，KS是无法治愈的。可用的治疗是为了缓解。全身化学疗法一般用于具有更晚期疾病或有疾病快速进展迹象的患者。治疗的主要目标是缓解症状、防止疾病进展和减少肿瘤负担，以减轻淋巴水肿、器官损害和心理压力。内脏或晚期皮肤KS的标准疗法包括细胞毒性化学疗法，诸如脂质体蒽环类和紫杉醇。与非脂质体多柔比星、长春新碱和博莱霉素的组合相比，脂质体多柔比星具有更好的功效以及有利的耐受性和毒性，在HIV患者中的总响应率为59％。在经典KS中，对脂质体多柔比星的响应率可以更高。然而，完全响应率并不常见，并且不存在治愈。在这个时间点，尚未完全开发出针对KS的靶向疗法。
在2014年，预计美国将诊断出46,420例胰腺癌新病例，估计有39,590人死于该疾病。虽然手术切除是唯一的潜在治疗性治疗，但只有15％-20％的患者在诊断时具有可切除性疾病，并且对不可切除性、局部晚期和转移性胰腺癌的治疗在很大程度上仍然是缓解性的。在一项随机试验显示与单一剂氟尿嘧啶相比，吉西他滨单一疗法具有临床益处以及约一个月的生存期益处后，吉西他滨单一疗法已被用作晚期胰腺癌治疗的参考方案。荟萃分析(meta-analysis)中显示，与基于吉西他滨的方案的组合疗法用于局部晚期和转移性胰腺癌提供了总生存期(OS)的微小益处，尽管伴随更常见的毒性，并且也有证据表明组合方案对患者有提高的益处和良好的表现状态。
一种这样的组合方案是吉西他滨加白蛋白结合的紫杉醇(nab-紫杉醇)。在3期开放标签MPACT试验中，861名患者随机分为1:1的比例，接受单独的吉西他滨(每平方米体表面积1000mg或mg/m2)或吉西他滨(1000mg/m2)加nab-紫杉醇(125mg/m2)的静脉内输注。与单一剂组的6.7个月相比，组合组具有增加的8.5个月的中位值总生存期，但组合组中观察到更多的高级别的中性粒细胞减少、疲劳和神经病变。在组合组中，41％的患者的nab-紫杉醇的剂量减少，并且47％的患者的吉西他滨的剂量减少。由于OS增加了1.8个月，这项研究导致2013年美国食品和药品管理局(FDA)批准了nab-紫杉醇用于晚期胰腺癌的治疗。在2015年公布的MPACT研究的最新OS分析证实，与吉西他滨单一疗法组的6.6个月相比，nab-紫杉醇和吉西他滨组合组具有更长的8.7个月的中位值OS。
在各种实施方案中，癌症选自由以下组成但不限于以下的组：非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、转移性尿路上皮癌、乳腺癌、肝细胞癌(HCC)、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤和白血病。
在各种实施方案中，患者先前对用抗癌疗法治疗有响应，但是在停止治疗后遭受复发(下文称为“复发性增生性疾病”)。
在各种实施方案中，患者具有抵抗性或难治性癌症。在各种实施方案中，所述癌症是免疫疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用化疗剂治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用小分子激酶抑制剂靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是包括以下的组合疗法难治的：例如，以下两种或更多种：免疫疗法治疗，使用化疗剂的治疗，使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗，使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗，用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子的治疗，用小分子激酶抑制剂的靶向治疗，使用手术的治疗，使用干细胞移植的治疗和使用放射的治疗。
药物组合物
在各种实施方案中，本发明的多肽治疗剂通常以药物组合物施用，所述药物组合物包含活性治疗剂，即，以及各种其他药学上可接受的组分。(参见Remington'sPharmaceutical Science,15.sup.th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1980)。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。取决于所希望的制剂，组合物也可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合物的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其他载体、辅助剂、或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。
在各种实施方案中，用于治疗原发性或转移性癌症的药物组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、瘤内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式施用。
对于肠胃外施用，本发明的药物组合物可以以该物质在生理上可接受的稀释剂(具有可以是无菌液体诸如水、油、盐水、甘油或乙醇的药物载体)中的溶液或悬浮液的可注射剂量施用。此外，组合物中可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它组分是石油、动物、植物或合成来源的组分，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二醇诸如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。抗体和/或多肽可以以贮库注射剂(depot injection)或植入制剂的形式施用，所述贮库注射剂或植入制剂可以以允许活性成分持续释放的方式配制。通常，药物组合物以液体溶液或悬浮液制备为可注射剂；也可以制备为适于在注射之前在液体媒介物中形成溶液或悬浮液的固体形式。如以上讨论的，制剂也可以被乳化或包封在脂质体或微粒(诸如用于增强辅助作用的聚乳酸、聚乙交酯或共聚物)中。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的多肽剂可以以贮库注射剂或植入制剂的形式施用，所述贮库注射剂或植入制剂可以以允许活性成分持续释放的方式配制。
适用于其他施用模式的另外的制剂包括口服、鼻内和肺部制剂、栓剂和透皮应用。
在各种实施方案中，本发明的方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量或有效剂量的本发明的sEphB4-HSA多肽。在各种实施方案中，本发明的多肽的有效剂量(例如用于治疗本文所述的原发性或转移性癌症)取决于许多不同的因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人类还是动物、施用的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但也可以治疗包括转基因哺乳动物在内的非人类哺乳动物。治疗剂量需要进行滴定以优化安全性和有效性。
在各种实施方案中，剂量的范围可以是0.0001至100mg/kg宿主体重，并且更通常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg-10mg/kg的范围内。在各种实施方案中，向患者施用的多肽剂量选自由以下组成的组：约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约3.5mg/kg、约4.0mg/kg、约4.5mg/kg、约5.0mg/kg、约6.0mg/kg、约7.0mg/kg、约8.0mg/kg、约9.0mg/kg和约10.0mg/kg。在各种实施方案中，治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。本发明的治疗实体通常以多于一次施用。单个剂量之间的间隔可以是每周、每两周、每月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量患者体内治疗实体的血液水平来指示。可选地，本发明的治疗实体可以以缓释制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率取决于多肽在患者体内的半衰期而变化。
本文描述的多肽的毒性可在细胞培养物或实验动物中通过标准制药学程序确定，例如，通过确定LD50(使群体的50％死亡的剂量)或LD100(使群体的100％死亡的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于规划对在人类中使用无毒性的剂量范围。本文描述的多肽的剂量优选地在包含有效的剂量而毒性很小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可以取决于所使用的剂型和利用的施用途径而在该范围内变动。确切的制剂、施用途径和剂量可以由专科医师根据患者的状况进行选择。(参见例如，Fingl等人,1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics中的第一章)。
在各种实施方案中，所述方法包括一种或更多种选自由以下组成的组的另外的抗癌疗法：免疫疗法、化学疗法、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的靶向治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的靶向治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子的靶向治疗、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法以及干细胞移植。组合可以是协同的。组合可以提高抗癌疗法的治疗指数。
在各种实施方案中，免疫疗法选自由以下组成的组：使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体
Figure BDA0003359999030000331
诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物响应调节因子诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、和IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继性转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因的)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；以及使用免疫刺激剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法选自由以下组成的组：使用针对共刺激分子或共抑制分子的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；和使用双特异性T细胞接合抗体
Figure BDA0003359999030000341
的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用针对共刺激分子或共抑制分子的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用CAR-NK细胞的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用双特异性T细胞接合抗体
Figure BDA0003359999030000342
的治疗。
在各种实施方案中，另外的疗法包括特异性结合免疫检查点蛋白抗原(来自包括但不限于以下的列表：CD276、CD272、CD152、CD223、CD279、CD274、TIM-3和B7-H4)的抗体或者本领域中教导的任何免疫检查点蛋白抗原抗体。在各种实施方案中，组合治疗方法中使用的PD-1抑制剂选自由以下组成但不限于以下的组：派姆单抗(Merck)；纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)和匹地利珠单抗(Medivation)。在各种实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗。在各种实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗。在各种实施方案中，PD-1抑制剂是匹地利珠单抗。
在各种实施方案中，施用约0.1mg/kg至约10mg/kg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约1mg/kg至约15mg/kg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约3mg/kg至约12mg/kg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约1mg/kg至约10mg/kg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约3mg/kg至约10mg/kg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约1mg/kg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约2mg/kg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约3mg/kg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约5mg/kg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约10mg/kg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约10mg至约400mg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约50mg至约400mg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约10mg至约300mg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约50mg至约300mg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约10mg至约250mg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用约50mg至约250mg之间的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约50mg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约100mg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约150mg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约200mg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约250mg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，施用至少约300mg的PD-1抑制剂。在各种实施方案中，PD-1抑制剂在一个周期期间至少一次施用。在各种实施方案中，PD-1抑制剂在一个周期期间至少两次施用。在各种实施方案中，周期为21天。在各种实施方案中，周期为28天。在各种实施方案中，PD-1抑制剂至少每周一次施用。在各种实施方案中，PD-1抑制剂至少每两周一次施用。在各种实施方案中，PD-1抑制剂至少每三周一次施用。在各种实施方案中，PD-1抑制剂至少每四周一次施用。
根据组合疗法的性质，本发明的多肽治疗剂的施用可以在施用其他疗法同时和/或之后继续进行。多肽治疗剂可以在另外的抗癌疗法之前、同时或之后施用，通常在至少约1周、至少约5天、至少约3天、至少约1天内施用。多肽治疗剂可以以单剂量递送，或者可以分成多于一个剂量，例如在一定时间段内(包括每日、每两日、每半周、每周等)递送。有效剂量将随着施用途径、特定的剂、抗癌药剂的剂量等而变化，并且可以由本领域技术人员凭经验确定。
提供以下实施例来更详细地描述本公开内容。
实施例1
上皮癌中的EphB4表达
用免疫染色测定分析了人类肿瘤中EphB4的表达。使用EphB4特异性单克隆抗体MAb131分析新鲜冷冻肿瘤样品和(当可行时)邻近正常组织的EphB4表达。在分析的许多上皮癌中EphB4表达被诱导(总结在表1中)。例如，在正常膀胱和结肠中EphB4不表达，但在膀胱肿瘤和结肠肿瘤中EphB4高表达。图1中还示出了乳腺癌、头颈癌、卵巢癌和前列腺癌中EphB4表达的代表性实例。
表1
组织来源 研究的肿瘤数目 表达EphB4的数目(％)
头颈 41* 41(100％)
肺 110* 72(66％)
食道 25 19(76％)
膀胱 35 33(94％)
前列腺 62 41(66％)
乳腺 23 19(82％)
结肠直肠 102 102(100％)
卵巢 85 73(86％)
*发现了基因扩增并在下文描述
在头颈癌、肺癌和食道癌中分析了EphB4基因扩增。在食道鳞状细胞癌中，15名患者中有9名(60％)具有4和20之间的基因拷贝数。类似地，在食道腺癌中，8名中有5名(62％)具有4至20的范围的基因拷贝数。
实施例2
EphB4-肝配蛋白B2信号传导的抑制使各种癌症中的肿瘤免疫微环境重编程
肝配蛋白B2是肿瘤中免疫细胞运输的门卫(gatekeeper)。进行研究以评价抑制EphB4-肝配蛋白B2信号传导对于肿瘤微环境和免疫细胞运输的作用。
为了防止对药物的免疫应答，在所有小鼠研究中使用了与小鼠血清白蛋白融合的sEphB4小鼠类似物(msEphB4-MSA)。用msEphB4-MSA处理的小鼠没有引起对该蛋白的抗体应答。将肿瘤细胞皮下或静脉内注射到肝配蛋白B2lacZ/WT小鼠中，并使用x-gal染色分析组织。在所有同基因(syngeneic)肿瘤(B16、KR158、LLC、EL4)以及自发性淋巴瘤的肿瘤脉管系统中观察到肝配蛋白B2表达。正常的邻近器官和重要器官，诸如肝脏，缺乏肝配蛋白B2表达(图2A)。携带B16黑素瘤的肝配蛋白B2条件敲除小鼠与野生型小鼠相比显示出减少的肿瘤生长(图2B)。携带B16黑素瘤的肝配蛋白B2条件敲除小鼠与野生型小鼠相比具有CD3+T细胞数目的增加(图2C)。CD4/CD8 T细胞的耗竭消除了肝配蛋白B2条件敲除小鼠中肿瘤生长的降低(图2D)。植入KR158的肝配蛋白B2条件敲除小鼠显示出减少的肿瘤生长(图2E)。从前一实验中收获的肿瘤显示出与野生型小鼠相比，肝配蛋白B2条件敲除小鼠中CD3+T细胞数目的增加(图2F)。在肝配蛋白B2条件敲除小鼠和野生型小鼠中，用CD4/CD8耗竭性抗体处理的小鼠显示出相似的肿瘤生长(图2G)。
msEphB4-MSA融合蛋白靶向肝配蛋白B2，并阻断肝配蛋白B2与EphB受体的结合和阻断双向信号传导。msEphB4-MSA抑制肿瘤生长并促进免疫细胞向肿瘤中迁移。CD8细胞(而不是CD4细胞)的耗竭消除了sEphB4-MSA的肿瘤生长抑制作用(图3)。这些研究展示，在肿瘤中T细胞的募集受肿瘤血管中的肝配蛋白B2调节。
为了理解msEphB4-MSA募集T细胞的机制，我们对CD45选择的T细胞进行了无偏倚基因表达分析。一组770个肿瘤免疫相关基因表达分析显示出炎症途径、树突细胞成熟途径的诱导，NF-kB途径的上调。基因表达分析显示出T细胞耗竭和共刺激基因诱导，包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CD80、CD27、CTLA-4、MARCO、EOMES、TIGIT、ICOS、OX40以及其他。
小鼠sEphB4-MSA处理诱导PD-L1在来自携带B16黑素瘤的msEphB4-MSA和对照小鼠的肿瘤样品中得到证实，如下所示(图4)。
还分析了B16黑素瘤肿瘤裂解物的细胞因子和趋化因子。来自msEphB4-MSA处理小鼠的肿瘤显示TNF-α、干扰素γ、IL-1、IL-6、MIPa、MIP1b、MCP-1显著增加，与肿瘤中的炎症应答一致(图5)。
为了研究调节T细胞向肿瘤中迁移的机制，我们分析了来自24种不同细胞类型的肿瘤免疫细胞组(tumor immune cell panel)的770个基因，包括常见的检查点抑制因子、CT抗原以及涵盖先天免疫应答和适应性免疫应答两者的基因。正常情况下，免疫细胞沿着血管内皮滚动，但ICAM-1的存在通过接合LFA-1而束缚免疫细胞(Yang L等人,Blood,106(2):584-592,2005)。这种相互作用激活免疫细胞并促进向血管外空间的迁移。为了验证该过程，我们用ICAM-1抗体处理荷瘤小鼠。在小鼠暴露于ICAM-1抗体后，用msEphB4-MSA处理的小鼠具有与对照小鼠相当的肿瘤生长。特别地，在接受ICAM-1抗体处理的小鼠中，msEphB4-MSA肿瘤抑制活性对肿瘤生长的抑制显著降低，表明免疫细胞从循环向肿瘤中的运输需要ICAM-1诱导。这些数据支持ICAM-1在响应于msphB4-MSA的免疫细胞运输中的作用，并且展示msphB4-MSA处理诱导了ICAM-1从而调节免疫细胞运输。
肿瘤浸润性免疫细胞(CD45+)中的基因表达研究揭示了PD-L1、PD-L2和PD-1的诱导。PD-L1的诱导表明了msEphB4-MSA活性的反馈抑制。因此，我们在小鼠模型中测试了PD-1拮抗性抗体和msEphB4-MSA的组合。携带B16黑素瘤细胞的C57Bl6小鼠用对照PBS、sEphB4-MSA、PD-1抗体或组合疗法处理。随时间推移测量肿瘤体积。sEphB4-MSA加PD-1抗体增强了抗肿瘤活性和免疫细胞募集，并且组合疗法比各种单独化合物更有效。对肿瘤进行CD4或CD8染色，并且组合疗法显示出最多的肿瘤内T细胞定位增加。CD4 T细胞和CD8 T细胞的定量显示组合疗法的增加最高(图6)。
将B16黑素瘤细胞植入C57/B6免疫活性小鼠(immune competent mice)。当肿瘤达到约100mm3的体积时，小鼠用sEphB4 10mg/kg每周三次、和PD-1中和抗体100μg每周两次、CTLA 4抗体100μg每周两次腹膜内处理，持续10天。随时间推移测量肿瘤体积。sEphB4促进了T细胞浸润并使肿瘤体积显著降低。这种效果在与PD-1抗体和CTLA-4抗体组合时进一步增强(图7)。
表2
Figure BDA0003359999030000381
Figure BDA0003359999030000391
这些研究展示，当与PD-1拮抗性抗体和CTLA-4抗体组合时，sEphB4-HSA阻断肝配蛋白B2信号传导，从而改变肿瘤微环境、促进T细胞募集、诱导PD-L1/PD-1并引发增强的功效。该实验数据支持肝配蛋白B2在阻止T细胞向肿瘤中募集的作用。
实施例3
sEphB4-HSA I期剂量递增研究在未达到最大耐受剂量(MTD)的情况下完成。sEphB4-HSA在某些肿瘤类型(包括头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌和卡波西肉瘤)中展示出单一剂活性。sEphB4-HSA耐受性良好，作为药物相关毒性，高血压的频率明显增加。sEphB4-HSA单一剂试验显示T细胞向肿瘤中的募集增加，以及肿瘤血管中ICAM-1的诱导增加。
实施例4
本实施例描述了sEphB4-HSA与派姆单抗组合的II期临床试验。患者的合格标准为先前用于局部晚期或转移性疾病的含顺铂方案失败(复发或难治或不耐受)的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者，或在接受含顺铂的新辅助疗法后12个月内复发的患者。排除标准是之前接受过检查点抑制剂靶向疗法的患者。
治疗方案由每周一次静脉内(IV)输注sEphB4-HSA 10mg/kg加每3周一次IV输注派姆单抗
Figure BDA0003359999030000392
200mg组成。每6周测量一次肿瘤响应。收集基线组织或档案组织的生物标志物(特别是PD-L1 IHC 22C3PharmDx，派姆单抗/
Figure BDA0003359999030000393
的伴随标志物)。对响应的独立评价通过不知情放射学审查进行评估。PD-L1染色在参考实验室进行。对于毒性评估，所有患者均合格。研究的主要终点为OS，次要终点为ORR和PFS。对高风险亚组的分析包括鳞状细胞变异、上尿路疾病、肝转移、血红蛋白<10mg/dl水平和超过0的表现状态。计划应计人数为60名患者。总结了34名患者的中期分析。在计划的中期分析时，获得34名患者同意。在施用第一剂试验治疗后不久，发现其中三(3)名患者不符合试验资格。两名患者在研究进入时因CNS疾病而不合格并在一周内死亡，并且一名患者在一周后撤回同意。为了提交监管文件的目的，这些不合格的患者被纳入了对OS和PFS的治疗意向分析，但未被纳入响应率，因为对于响应无法评价他们。
患者人口统计数据可以大致概括如下：中位值年龄为67岁，并且29/34为男性。26/34之前接受过基于顺铂的化学疗法。大部分患者伴有内脏转移，其中7例涉及肝脏，12例进入研究3个月内，6例Hb<10g/dL。9例鳞状变异，7例上GU道。30例中有14例出现等于或大于1％的PD-L1组合阳性评分，1名患者的组织不可用。实验室开发了肝配蛋白B2测定，30例中有19例的肝配蛋白B2(sEphB4-HSA的靶)超过1％。
结果
使用Kaplan-Meier方法中位值随访为18.9个月(95％CI 15.5-27.2)时，中位值总生存期在21.4+个月时为无法估计的(not estimable)。PD-L1阳性患者的中位值总生存期为NE(95％CI 16.5-NE)，并且PD-L1阴性患者的中位值OS为21.0个月(95％CI 14.9-NE)。对数秩p＝0.11(OS PD-L1阳性对比阴性)。肝配蛋白B2阳性的中位值OS为24.6个月(95％CI14.9-NE)，并且肝配蛋白B2阴性的中位值OS为21.0个月(95％CI；4.1-NE)。对数秩p＝0.3(OS肝配蛋白B2阳性对比阴性)。
PFS为5.7个月(95％CI 2.5-14.6)。PD-L1阳性受试者的中位值PFS为8.2个月(95％CI 2.3-NE)，并且PD-L1阴性受试者的中位值PFS为4.8个月(95％CI 1.4-14.6)。对数秩p＝0.13(PFS PD-L1阳性对比阴性)。肝配蛋白B2阳性受试者的中位值PFS为14.9个月(95％CI 2.7-NE)，并且肝配蛋白B2阴性受试者的中位值PFS为2.8个月(95％CI 1.3-8.2)。对数秩p＝0.02(PFS肝配蛋白B2阳性对比阴性)。
ORR为45.2％(95％CI 27-61)。CR为29.0％(9/31)(6例有放射影像学响应，并且3例有病理学响应)。响应持续时间在14.7个月时为无法估计的。14名患者的PD-L1超过1％，在这些患者中，ORR为57.1％(8/14名患者)，并且CR为35.7％(5/14名患者)。在19名患者中，实验室开发的肝配蛋白B2的IHC超过1％，在这些患者中，ORR为63.2％(12/19名患者)，并且CR为42.1％(8/19名患者)。另一名病情稳定的患者切除了肾上腺的一个残留肿瘤部位，获得持续12+个月的手术完全缓解(手术CR或sCR)。该患者未被纳入响应分析。
亚组分析显示出上尿路的响应(5/7–71.4％ORR)、鳞状细胞变异的响应(4/9–44.4％ORR)、内脏疾病的响应(6/16–35.2％ORR)、肝转移响应(3/7–42.8％ORR)、低于10g/dL的血红蛋白的响应(2/6–33.3％ORR)和风险组1、2或3的响应(分别为4/9–44.4％、3/7–42.8％和1/4–25％)。所有上述数据在表3-表4中示出。
表3
按亚组对sEphB4-HSA加派姆单抗的响应率
Figure BDA0003359999030000411
Figure BDA0003359999030000421
表4
sEphB4-HSA组合研究与单独的派姆单抗的响应率和生存期
Figure BDA0003359999030000422
肿瘤响应的量级在瀑布图中示出(图8)。活检或切除了残留的放射影像学异常、未显示残留肿瘤迹象的部分响应的患者被归类为病理学CR。这些患者被纳入完全缓解类别。这些病例还值得注意的是，在停止治疗后的长时间段没有肿瘤复发(中位值在14.7+个月时无法估计)。肿瘤消退的时间和肿瘤的状态在蜘蛛图中示出(图9)。在一些病例中，在第一次扫描时已经观察到肿瘤完全消退。响应持续时间在图10中示出。中位值OS的概率为21.4个月，并且中位值PFS为5.7个月(图11)。
在基线和治疗(sEphB4-HSA加派姆单抗)期间第二次活检时收集的肿瘤样品显示，采用下文示出的组合疗法，CD3细胞和CD8细胞数值增加。特别地，使用实验室开发的测定，基线时具有低驻留T细胞或没有驻留T细胞的患者在治疗后也显示出CD3细胞和CD8细胞的增加，尤其是在具有基线肝配蛋白B2表达的肿瘤中(图12)。在治疗期间具有残余肿瘤的7名患者的基线和治疗期间的活检样品中测量了CD3和CD8的肿瘤细胞浸润。另外5名患者在重复活检时没有肿瘤(基线数据未示出)。
PD-L1免疫检查点抑制剂被确立为尿路上皮癌的一线治疗。免疫检查点抑制剂治疗的复发/难治性尿路上皮癌有数值差异，但统计学上不显著。在31例中的30例中评估了PD-L1表达和对sEphB4-HSA加派姆单抗组合的响应(表5)。
表5
PD-L1表达和总响应
Figure BDA0003359999030000431
肝配蛋白B2是sEphB4-HSA的靶。因此，肝配蛋白B2的表达及其与治疗的相关性是潜在的生物标志物。膀胱癌中的肝配蛋白B2免疫组织化学染色采用基于实验室的测定使用商业可得的单克隆抗体进行。染色在CLIA认证的实验室中使用Leica平台完成。所有染色组织由对组织获取时间(基线或治疗期间)和患者治疗结果不知情的一位病理学家审查。抗体的特异性使用缺乏肝配蛋白B2表达的同基因细胞系(中国仓鼠卵巢或CHO细胞)或进行工程化以表达人类肝配蛋白B2或密切相关蛋白(肝配蛋白B1或肝配蛋白B3)来实现。肝配蛋白B2的表达和对组合方案的响应在下表6中示出。
表6
肝配蛋白B2表达。患者响应率：响应者/总数(％)
Figure BDA0003359999030000441
sEphB4-HSA和派姆单抗的组合耐受性良好。评估了前六名患者的全剂量组合的安全性。组合耐受性良好，未从组合疗法观察到新的毒性。sEphB4-HSA单一剂安全性研究显示高血压频繁发生。在sEphB4-HSA加派姆单抗组合中注意到高血压。在该组合研究中也观察到了派姆单抗相关的毒性。未观察到新的或意外的毒性。长期使用sEphB4-HSA加派姆单抗的组合未导致新的和意外的毒性。毒性总结在下表7中示出。
表7
如下治疗的群体中的不良事件
Figure BDA0003359999030000442
如下治疗的群体中的不良事件
Figure BDA0003359999030000451
总结
sEphB4-HSA与派姆单抗组合显示出21.4+个月的中位值OS、5.7个月的PFS、和45％的ORR以及29％的CR。尿路上皮癌的高风险变异显示出响应，包括9名患者中的5名(55.6％)的鳞状细胞变异和8名患者中的5名(62.5％)的上尿路疾病。7名患者中有3名(42.8％)具有Bellmunt风险组2，并且5名患者中有1名(20％)具有风险组3/4。为了进行历史对比，在同一患者群体中进行了派姆单抗研究。派姆单抗显示出21.1％的ORR(95％CI 16.4-26.5)、2.1个月的无进展生存期(95％CI 2.0-2.2)和10.3个月的总生存期(95％CI 8.0至11.8)。另外四种PD-1(纳武单抗)或PD-L1(阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗)抗体被FDA批准用于该患者群体。这些剂的中位值总生存期如下：纳武单抗-8.7个月，阿特珠单抗-7.9个月，德瓦鲁单抗-18.2个月，以及阿维鲁单抗-6.5个月。所有五种抗体的PFS为2.1个月或更短。ORR为21.1％或更低，CR为7％或更低。
sEphB4-HSA加派姆单抗的组合对预期中位值生存期小于一年的复发/难治性尿路上皮癌患者具有显著的功效和持久性。在大多数情况下，获得CR的患者在无治疗时保持无癌症。sEphB4-HSA加派姆单抗的组合对所有亚组(包括具有组织学变异、上尿路、低血红蛋白、2级、3级和4级表现状态、肝转移、Bellmunt不良风险亚组的患者和PD-L1阴性患者)均有显著益处。
当与PD-1抗体组合时，治疗耐受性良好，不伴有明显的重叠毒性，并且治疗可以长期施用。实验室开发的针对肝配蛋白B2(sEphB4-HSA的靶)的测定显示，肝配蛋白B2阳性肿瘤的ORR更高，为68.4％(13/19名患者)。肝配蛋白B2和PD-L1两者均为阳性的患者具有87.5％的ORR率(7/8名患者)。PD-L1阴性患者具有37.5％的ORR(6/16名患者)。
sEphB4-HSA与PD-1抗体联合的组合的活性表现为通过互补功能而发生，其中sEphB4-HSA促进T细胞向肿瘤中的迁移，而PD-1抗体激活新募集和驻留的免疫细胞以实现持久的响应。
实施例5
在本实施例中，一名患有局部晚期膀胱癌的63岁女性用新辅助性吉西他滨顺铂化学疗法治疗，并且进行了根治性膀胱切除术。然而，她在手术后不久复发，伴有多个部位处快速进展的病变，包括许多大的双侧肺病变。她接受了sEphB4-HSA加派姆单抗疗法。她在治疗6周内有深度响应；并继续接受治疗。在第12周进行的扫描(图13)描绘了90％的肺转移消退。
一名具有新膀胱的79岁男性，在新辅助性吉西他滨和顺铂化学疗法后进行根治性膀胱切除术之后具有广泛的局部复发。他接受了sEphB4-HSA+派姆单抗。在治疗第15周时，大的肿块完全消退；并在第15周后继续接受治疗。在第15周进行的扫描(图14)。
实施例6
在本实施例中，我们发现，在原位头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)模型中，与对照组相比，单独的EphB4-肝配蛋白B2抑制或与放射(RT)组合使肿瘤内调节性T细胞(Treg)减少并使CD8+T细胞和CD4+Foxp3-T细胞两者的激活增加。我们还比较了EphB4-肝配蛋白B2抑制和RT组合与抗PDL1和RT组合的效果，并观察到类似的肿瘤生长抑制，特别是在早期时间点。我们在患者来源的异种移植物模型中的数据显示肿瘤相关的M2巨噬细胞减少，有利于在EphB4-肝配蛋白B2抑制和RT后朝向抗肿瘤M1表型的极化。在体外，与对照组相比，EphB4信号传导抑制降低了表达Ki67的Treg和Treg激活。总的来说，我们的研究代表了涉及EphB4-肝配蛋白B2在肿瘤免疫应答中的作用的首次报告，并且我们的发现表明，EphB4-肝配蛋白B2抑制与RT组合代表了HNSCC患者的潜在替代方案，并且能够对没有资格接受或不能耐受抗PDL1疗法的患者特别有益。我们的研究将EphB4-肝配蛋白B2抑制展示为抗PDL1疗法的新的替代方案，该替代方案可以与放射组合使用，以便在HNSCC患者中诱导有效的抗肿瘤免疫应答。
为了研究肿瘤免疫微环境对由于EphB4-肝配蛋白B2抑制引起的肿瘤生长迟缓的贡献，在施用TNYL-RAW-Fc质粒(参见下文材料和方法)或pcDNA3对照质粒后第14天至第18天对Ly2肿瘤进行了CyTOF分析。我们的数据显示出TNYL-RAW-Fc处理后的肿瘤浸润性免疫细胞的显著变化。特别地，与pcDNA3对照组相比，TNYL-RAW-Fc处理后肿瘤中的CD8+T细胞增加了1.2倍(p＝0.03)。然而，CD4+T细胞的百分比保持不变。在TME中Treg细胞(对于Foxp3标志物也为阳性的CD4+T细胞)构成了重要的免疫抑制群体，并且在EphB4-肝配蛋白B2抑制组中显著减少了～3倍(p＝0.009)。重要的是，在EphB4-肝配蛋白B2抑制后，作为治疗响应增强的指标的CD8+Teff细胞/Treg比率也显著增加(p＝0.02)。此外，基于ICOS(诱导型T细胞共刺激因子)表达评估的常规CD4+Foxp3-T细胞和CD8+T细胞两者的活化状态在EphB4-肝配蛋白B2抑制后显示出～2.8倍的增加(p＝0.0002；p＝0.009)。
除了在T细胞中观察到的变化，我们还观察到巨噬细胞群体(F4/80+细胞，针对CD11b+细胞进行门控)的变化。在TNYL-RAW-Fc处理组中F4/80+巨噬细胞下降了1.9倍(p＝0.04)。特别地，我们注意到在TNYL-RAW-Fc处理后，原致癌性(pro-tumorigenic)M2巨噬细胞(Arg1+F4/80+细胞)下降了1.4倍(p＝0.01)，并且M1巨噬细胞(F4/80+iNOS+)增加了16倍(p<0.0001)。肿瘤内CD11b+Ly6C+单核细胞或CD11b+Ly6G+中性粒细胞未检测到显著差异。我们还观察到，在EphB4-肝配蛋白B2阻断后，CD11C+树突细胞群体上调1.7倍(p＝0.01)。
为了理解EphB4-肝配蛋白B2相互作用影响HNSCC肿瘤中T细胞数量和功能的机制，我们对分离自荷瘤小鼠的脾并用重组肝配蛋白B2-Fc处理72小时的CD4+T细胞进行了体外分析。我们选择重组肝配蛋白B2-Fc蛋白用于体外研究，因为据报道重组肝配蛋白B2-Fc蛋白在高浓度(20μg/ml)抑制某些EphB4下游信号。我们观察到用20μg/ml肝配蛋白B2-Fc处理的CD4+T细胞中酪氨酸磷酸化的EphB4的水平低于用Fc对照处理的CD4+T细胞。为了证实这些结果，我们还用PEG化形式的TNYL-RAW肽EphB4拮抗剂(已知也阻断EphB4-肝配蛋白B2相互作用)处理CD4+T细胞，并观察到类似的效果。
我们使用流式细胞术检查了肝配蛋白B2-Fc处理对表达Ki67(增殖的代表性标志物)的Treg的影响，并观察到与Fc对照处理相比，20μg/ml浓度的肝配蛋白B2-Fc使表达Ki67的Treg减少了1.7倍(p＝0.02)。对照组和肝配蛋白B2-Fc处理组之间总CD4+T细胞的百分比保持不变。
Treg还组成性地表达高水平的IL-2Rα，并依赖于IL-2进行增殖、存活和正常功能。由于我们观察到高剂量肝配蛋白B2-Fc后表达Ki67的Treg减少，因此我们研究了这是否可能是通过细胞因子诸如IL-2的分泌减少介导的。我们的数据确实显示，在用20μg/ml肝配蛋白B2-Fc处理的Treg细胞的条件培养基中，IL-2(p＝0.07)以及TGF-β(Treg功能的一种关键调节因子)(p＝0.009)的分泌水平降低。此外，与对照Fc相比，用高浓度肝配蛋白B2-Fc处理24小时后，通过蛋白印迹法在T细胞裂解物中观察到促存活标志物(诸如p-AKT和Bcl-XL)的水平降低。另一方面，与对照-Fc相比，用20μg/ml肝配蛋白B2-Fc处理后，裂解的胱天蛋白酶-3的水平增加。
我们评价了EphB4-肝配蛋白B2抑制剂TNYL-RAW-Fc与RT组合在Ly2原位模型中通过调节肿瘤免疫微环境和减轻EphB4-肝配蛋白B2信号传导的原致癌性作用来抑制肿瘤生长的功效。我们还比较了EphB4-肝配蛋白B2抑制和RT组合的体内功效与免疫检查点抑制剂抗PDL1和RT组合的体内功效。我们的数据显示，与IgG+pcDNA3对照组相比，单独放射(RT+IgG+pcDNA3)可使肿瘤生长减少2.2倍(p＝0.0003)。然而，当与单独的TNYL-RAW-Fc相比时，TNYL-RAW-Fc与RT组合使用导致了4.4倍的减少(p＝0.0003)。重要的是，当EphB4-肝配蛋白B2抑制和RT组合时，在肿瘤植入后第20天产生了与抗PDL1和RT组合相似的抗肿瘤响应。抗PDL1+RT和TNYL-RAW-Fc的三重组合没有增加额外的协同作用。长期监测肿瘤生长显示，在Ly2肿瘤中，与RT+IgG+pcDNA3相比，RT+IgG+TNYL组合组的肿瘤生长抑制增强。我们还在另一侵袭性HNSCC肿瘤模型Moc2中评价了TNYL-RAW-Fc抑制剂与RT组合的功效，并且组合组与单独的单一剂RT相比显示出相似的肿瘤生长抑制。与对照pcDNA3组相比，用RT治疗Moc2肿瘤导致肿瘤生长显著减少1.59倍(p<0.0001)。当TNYL-RAW-Fc抑制剂与RT组合时，肿瘤生长降低1.36倍(p<0.005)。当辐照组与TNYL-RAW-Fc或抗PDL1组合时，与单独RT相比，在肿瘤植入后第17天和第21天导致相似的肿瘤生长抑制水平。与Ly2模型相似，TNYL-RAW-Fc抑制剂与抗PDL1+RT组合未显示出任何额外的益处。
为了理解在RT存在的情况下EphB4-肝配蛋白B2抑制对免疫调节的贡献，我们通过流式细胞术分析了在有RT和没有RT的情况下从对照组和TNYL-RAW-Fc组收获的Ly2肿瘤。我们的数据展示，在没有RT的情况下，EphB4-肝配蛋白B2抑制使CD8+T细胞群体增加，而不影响CD4+T细胞亚群。将Ly2肿瘤暴露于10Gy剂量的RT导致在RT后第3天CD8+T细胞和CD4+T细胞两者均显著增强。与单独RT相比，EphB4-肝配蛋白B2抑制与RT对这些T细胞群体没有影响。在RT后第3天，我们观察到与对照组相比，RT处理使Treg群体下降了1.6倍(p＝0.009)。与两种单一剂相比，TNYL-RAW-Fc加RT导致肿瘤浸润性Treg进一步下降(总计～2.7倍)。与对照或TNYL-RAW-Fc处理相比，组合处理中CD8+T细胞与Treg的比率也显著增加。为了检查EphB4-肝配蛋白B2抑制与RT对T细胞功能的影响，我们评价了活化的CD8 T细胞(CD8+IFNγ+)和活化的常规CD4T细胞(CD4+Foxp3-IFNγ+)的百分比。与单独TNYL-RAW-Fc相比，我们观察到组合组中两者的百分比增加(2.2-2.4倍)。此外，与单独的RT相比，抑制EphB4-肝配蛋白B2相互作用与RT也导致CD4+Foxp3-IFNγ+细胞显著增加(2.2倍)(p＝0.04)。分泌的IP-10/CXCL10(一种吸引功能性细胞毒性T细胞的强效趋化因子)的水平增加是由TNYL-RAW-Fc或RT处理诱导的，并且与RT相比，通过两种处理的组合进一步增加。最后，与对照组相比，经TNYL-RAW-Fc和RT处理，Treg免疫抑制作用的产物循环TGF-β分别降低了1.4倍和1.8倍。TNYL-RAW-Fc与RT组合进一步增强了TGF-β水平的降低(与RT相比p＝0.02)。
为了确定TAM的降低是否是已知促进单核细胞向巨噬细胞分化的Treg变化的直接结果，我们在裸小鼠(一种T细胞无关模型)中测试了EphB4-肝配蛋白B2抑制的作用。我们使用了已知维持肿瘤环境并模拟人类癌症的HNSCC PDX肿瘤模型。我们先前已经显示，在使用sEphB4-HSA抑制EphB4-肝配蛋白B2组合单独放射或放射和EGFR抑制剂西妥昔单抗后，肿瘤生长显著降低。sEphB4-HSA是一种可溶性蛋白，通过结合肝配蛋白B2来抑制EphB4与肝配蛋白B2之间的相互作用(而TNYL-RAW通过结合EphB4来抑制该相互作用)。在HNSCC PDX肿瘤模型中，我们通过使用铁氧化物(SPIO)累积的T2加权MRI测量了TAM浸润。我们观察到，虽然RT本身使SPIO摄取大幅增加，表现为信号强度降低，但用sEphB4-HSA抑制EphB4-肝配蛋白B2相互作用逆转了RT的这种作用(p<0.05)。
这些成像数据通过使用从对照组和实验组收获的CUHN013肿瘤的IF染色得到进一步证实。这表明，sEphB4-HSA对EphB4-肝配蛋白B2的抑制与RT组合显著降低了TAM的百分比，这通过与任一单独处理相比泛巨噬细胞标志物CD107b+和F4/80+的染色减少而确定。我们还观察到，在CUHN013肿瘤中，CD163+M2巨噬细胞的染色降低并且Gpr18+M1巨噬细胞的染色增加，表明EphB4-肝配蛋白B2抑制和RT使巨噬细胞的极化从促肿瘤M2表型转变为抗肿瘤M1表型。这在M1标志物与M2标志物(Gpr18:CD163)的比率增加方面也很明显，该比率在组合组中增强。最后，对循环细胞因子/趋化因子谱的分析展示，与单一剂处理相比，sEphB4-HSA与RT组合显著降低了巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，一种介导M2极化的关键分化因子)的水平。这伴随着GM-CSF和IFNγ两者水平的显著增加，特别是与单独的sEphB4-HSA或单独的RT相比在组合处理组中。已知，GM-CSF和IFNγ均促进M1极化。因此，综合来看，我们的数据表明，EphB4-肝配蛋白B2抑制和RT组合通过影响巨噬细胞极化来诱导抗肿瘤免疫应答。
鉴于我们的数据显示EphB4-肝配蛋白B2抑制促进朝向M1表型的极化，我们进行了TCGA和CIBERSORT分析，以检查这样的极化对HNSCC患者生存期的意义。我们的分析首次揭示，较低的M1/M2比率与较差的总生存期以及无病变生存期之间存在显著的相关性。该分析是基于0.5的M1/M2比率截止值。与M1/M2比率>0.5的患者相比，当M1/M2比率<0.5时，患者的总生存率较差。M1/M2比率>0.5的患者的中位值生存期为65.8个月，相比之下，M1/M2比率<0.5的患者的中位值生存期为32.8个月(p＝0.0170)。此外，M1/M2比率>0.5的患者队列的疾病进展的中位值时间为76.2个月，相比之下，M1/M2比率<0.5的患者队列的疾病进展的中位值时间为53.1个月(p＝0.0111)。
材料和方法
细胞培养和试剂
鼠Moc2细胞系从Ravindra Uppaluri博士(Dana-Farber Cancer Institute,MA)获得，并且Ly2细胞系从Nadarajah Vigneswaran博士(University of Texas HealthScience Center,TX)获得。将Ly2细胞在DMEM-F12培养基中培养，并且Moc2细胞在IMDM培养基中培养。培养基补充有10％的FBS和1％的primocin，并且细胞在5％CO2培养箱中于37℃培养。融合到人类血清白蛋白的可溶性EphB4胞外结构域(sEphB4-HSA)用于在PDX免疫妥协的小鼠模型中抑制EphB4-肝配蛋白B2相互作用。sEphB4-HSA蛋白由Parkash Gill博士(University of Southern California,CA；Vasgene Therapeutics,Inc.)提供。对于免疫活性的小鼠模型，使用编码与人类IgG1的Fc部分融合的长度为15个氨基酸的TNYL-RAW肽(TNYL-RAW-Fc，一种EphB4拮抗剂)的质粒来阻断EphB4-肝配蛋白B2信号传导。pcDNA3质粒用作对照。质粒从Elena Pasquale博士的实验室(Sanford Burnham Prebys MedicalDiscovery Institute,CA)获得。TNYL-RAW肽的PEG化形式从Anaspec(Fremont,CA)获得，用于涉及T细胞的体外研究。
体内模型
所有小鼠根据University of Colorado,Anschutz Medical Campus AnimalCare and Use Committee制定和监管的伦理准则和条件进行处理和安乐死。对于免疫妥协的小鼠模型研究，雌性无胸腺裸小鼠(5-6周龄，每组n＝5-7只)购自Envigo(Indianapolis,IN,USA)。HNSCC PDX肿瘤CUHN013和CUHN004(F8-F16代)从Antonio Jimeno博士的实验室(University of Colorado,Anschutz Medical Campus,Aurora,CO)获得。
肿瘤植入如先前描述(25)进行。当肿瘤体积达到约50-150mm3时，将小鼠随机分成四组(1)PBS，(2)sEphB4-HSA，(3)PBS+RT，和(4)sEphB4-HSA+RT。小鼠注射PBS或20mg/kg剂量的sEphB4-HSA(三次/周)和/或经受如先前描述的RT(5Gy/级分x 4级分)。
对于氧化铁成像研究，生成了超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒。遵循如Serkova等人报道的磁共振(MR)成像的详细方案。在治疗前和最后一剂RT后96小时进行MR成像。最终图像用ParaVision软件(Bruker Biospin)处理。
对于免疫活性的小鼠模型研究，使用5-6周龄雌性BALB/c小鼠(Charles RiverLaboratories,Wilmington,MA)或C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)。肿瘤细胞接种如先前描述进行。每个实验组或对照组7只至8只小鼠进行植入。在肿瘤接种后第4-5天(肿瘤体积～50mm3)将小鼠随机分组，通过流体力学注射(hydrodynamicinjection)接受pcDNA3对照质粒或TNYL-RAW-Fc质粒，如先前描述的。简而言之，将20μg质粒DNA重悬于～2ml的PBS中，并在少于6秒内注射到尾静脉中。每两周一次(biweekly)用数字卡尺测量肿瘤尺寸，并使用公式[(较小直径)2×最大直径/2]估算肿瘤体积。对于组合疗法研究，将小鼠随机分为IgG+pcDNA3对照、IgG+TNYL-RAW-Fc、抗PDL1+TNYL-RAW-Fc、RT+IgG+pcDNA3、RT+IgG+TNYL-RAW-Fc、RT+抗PDL1+pcDNA3和RT+抗PDL1+TNYL-RAW-Fc。IgG2b对照(称为IgG；BioXcell，NH)和抗PDL1(BioXcell，NH)在整个实验过程中以10mg/kg的剂量每周两次腹膜内施用。如上所述施用pcDNA3和TNYL-RAW-Fc。RT以10Gy的单剂量施用，如先前描述的。质粒DNA处理在肿瘤接种后第5天开始，并以单剂量施用。IgG2b或抗PDL1与RT组合在肿瘤接种后第7-9天开始，并在整个实验过程中持续。根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)制定的指南对小鼠实施安乐死。在处死时收获肿瘤组织，并固定在10％的中性缓冲福尔马林中或快速冷冻用于进一步分析。
免疫细胞耗竭研究
使用抗CD8抗体(克隆53-6.7，10mg/kg，腹膜内(i.p.)BioXcell，NH)进行CD8 T细胞耗竭并且相应的大鼠IgG1同种型用作对照。抗体在肿瘤植入前1周施用，并在肿瘤植入后每周一次施用，持续3周。TNYL-RAW-Fc或pcDNA3处理(20μg/2ml PBS；尾静脉流体力学注射)在肿瘤植入后第4天进行，因为本研究中使用的肿瘤模型具有侵袭性。通过使用不与用于耗竭实验的克隆53-6.7竞争的抗CD8抗体克隆进行流式细胞术，以证实CD8+T细胞的全身性耗竭。
流式细胞术
将肿瘤和脾处理成单细胞悬液，用于如先前描述的流式细胞术分析，并将1-2x106个活细胞铺在96孔板中，然后用抗CD16/32抗体封闭。对于分析免疫细胞、细胞因子和磷酸化STAT3标志物，使用了以下缀合抗体：AlexaFluor700-CD45(1:50，克隆30-F11，cat#56-0451-82，eBioscience)、BUV737-CD11b(1:100，克隆M1/70，at#564443，BD Biosciences)、FITC-F4/80(1:100，克隆BM8，cat#123108，Biolegend)、DyLight350-CD3(1:100，克隆145-2C11，Novus Biologicals)、eFluor450-CD4(1:100，克隆RM4-5，cat#48-0042-82，eBioscience)、APC-eFluor780-CD8(1:100，克隆53-6.7，cat#47-0081-82，eBioscience)、PECyanine7-IFNγ(1:20，克隆XMG1.2，cat#25-7311-82，eBioscience)、Ki67-BV605(1:50，克隆16A8，cat#652413，eBioscience)、p-STAT3-PE(1:5，克隆49；p727，cat#558557，eBioscience)。
对于细胞因子释放实验，在存在莫能菌素(以阻断细胞因子释放)和含有布雷菲德菌素的细胞活化混合物的情况下，将单细胞悬液铺在6孔板中，以在37℃刺激细胞因子产生，持续3.5-4小时。在用FA3缓冲液(PBS，10mM HEPES，2mM EDTA，1％FBS)洗涤后，细胞用稀释于FA3缓冲液/Fc封闭液中的表面标志物抗体(1:100稀释)在室温染色30min。在随后的洗涤后，将细胞重悬于100μl的Cytofix/CytoperMTM溶液(BD Biosciences)中，在4℃持续20min。孵育后，用1X Perm/WashTM溶液(BD Biosciences)洗涤细胞，并用抗细胞因子抗体在4℃染色30min。将细胞沉淀物重悬于FA3缓冲液中，并将样品在YETI细胞分析仪上运行。为了通过流式细胞术检测培养的T细胞中的STAT3磷酸化(p-STAT3)和Ki67表达，单细胞悬液用刺激剂量的肝配蛋白B2-Fc(2.5μg/ml)处理24-48h后，用预聚集(pre-cluster)的对照Fc、20μg/ml肝配蛋白B2-Fc或PEG化的TNYL-RAW(4.5μg/ml)处理，对免疫细胞表面标志物进行染色。这之后在37℃在1X裂解/固定缓冲液(BD Biosciences)中孵育30min。通过以1:3的比例将Fc蛋白和hIgG一起在4℃在定轨振荡器中孵育30min来进行预聚集。
用PBS洗涤后，将样品重悬于冷perm III缓冲液(BD Biosciences)中，在冰上孵育15min，并在室温用p-STAT3或Ki67抗体染色30min。用FA3缓冲液洗涤后，样品在YETI细胞分析仪上运行。各种对照，诸如仅有珠、用单一抗体染色的样品、同种型对照和荧光减一(FMO)对照也被包括在内。活细胞用Aqua/vi活/死染色来门控。染色的细胞在University ofColorado Denver Cancer Flow Cytometry Core的YETI细胞分析仪上运行。使用Kaluza分析软件分析数据。
RNA提取和qPCR分析
使用分离试剂盒(Stemcell Technologies)从Ly2肿瘤收获Treg和单核细胞。用IL-4(25ng/ml)处理单核细胞，以允许其分化为M2巨噬细胞。使用RNeasy微型制备试剂盒(Qiagen)从Treg和巨噬细胞收集总RNA。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(ThermoScientific)以逆转录反应从5μg的RNA样品制备cDNA。使用iQ实时PCR检测系统(BioRad)，用SYBR Select Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和下列引物，以10μL反应对1:2稀释的逆转录反应物的等分试样(2μL)进行定量实时PCR(RT-PCR)。GAPDH mRNA水平作为持家基因被分析用于归一化的目的。类似的RNA提取和qPCR方案被用于检测在存在和不存在10Gy剂量RT的情况下Ly2肿瘤中EPHB4和EFNB2的mRNA水平。
质谱流式细胞术(CyTOF)
对于质谱流式细胞术(mass cytometry)实验，如上文流式细胞术部分所述收获并消化肿瘤。单细胞悬液用PBS洗涤，并根据制造商说明用加重金属标签的抗体(Fluidigm,San Francisco,CA)染色。使用了以下抗体：CD45-Y89(cat#3089005B)、CD3e-Sm152(cat#3152004B)、FoxP3-Gd158(cat#3158003A)、CD4-Nd145(cat#3145002B)、CD8a-Er168(cat#3168003B)、CD11b-Nd148(cat#3148003B)、F4/80-Nd146(cat#3146008B)、CD11c-Nd142(cat#3142003B)、Ly6G-Pr141、Ly6C-Nd150、ICOS-Yb176(cat#3176014B)和live-dead-Pt-195。染色的细胞在University of Colorado Denver Cancer Center Flow CytometryCore的Helios质谱流式细胞仪上运行。使用Kaluza或FlowJo分析软件分析数据。
免疫印迹
对于免疫印迹，制备蛋白细胞裂解物，并在10％SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到PVDF膜上并进行蛋白印迹。印迹用一级抗体在4℃探测过夜。抗p-AKT抗体(1:1000，cat#4058)、抗AKT抗体(1:1000，cat#9272)、抗Bcl-XL抗体(1:1000，cat#2764)、抗裂解的胱天蛋白酶-3抗体(1:1000，cat#9579)和抗β-肌动蛋白抗体(1:5000，cat#12262)购自CellSignaling Technology(Danvers,MA,USA)。抗EphB4抗体(克隆m265)由VasgeneTherapeutics Inc.(Los Angeles,CA,USA)提供或从R&D Systems(cat#AF446)购买。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体从Sigma(St.Louis,MO,USA)获得。对于p-EphB4分析，使用EasySep CD4+T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)从小鼠脾细胞分离CD4+T细胞，并接种在6孔板中，然后在37℃用预聚集的对照Fc、肝配蛋白B2-Fc(20μg/ml)、或PEG-TNYL-RAW-Fc(4.5μg/ml)与肝配蛋白B2-Fc(2.5μg/ml)处理72小时。如上所述进行预聚集。如上所述，收集裂解物并在10％SDS-PAGE上运行。膜用p-EphB4抗体(1:1000，cat#PA5-64792，ThermoFisher)和抗β-肌动蛋白抗体探测。
免疫荧光染色
对4％缓冲福尔马林中固定的石蜡包埋切片进行免疫荧光(IF)染色。将以4μm切片的肿瘤组织脱蜡和水合，并通过将载玻片在抗原恢复缓冲液(Vector Laboratories)中孵育10-15分钟来进行抗原表位恢复。将切片与一级抗体一起在4℃孵育过夜。使用了以下抗体：CD107b(1:100，cat#550292，BD Pharmingen)、CD163(1:100，cat#orb13303，Biorbyt)、Gpr18(1:100，cat#NBP2-24918SS，Novus Biologicals)、F4/80(1:50，cat#NB600-404SS，Novus Biologicals)、Foxp3(1:1000，cat#ab20034，Abcam)、F4/80(1:100，cat#70076，CellSignaling)和泛角蛋白(1:100，cat#4545，Cell Signaling)。一级抗体孵育后，用加AlexaFlour标签IgG二级抗体(1:400稀释，Life Technologies)处理。细胞核用6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐水合物(DAPI)复染。图像使用Nikon荧光显微镜或Olympus共焦显微镜用20x物镜捕获。每个实验重复至少两次。对每个实验组和对照组的6-8个随机视野进行分析。
ELISA
分离从TNYL-RAW-Fc和pcDNA3对照小鼠收集的血浆样品，并进行ELISA以测量TNYL-RAW-Fc的水平，如先前描述的。简而言之，用抗人类IgG-Fc捕获抗体(10μg/ml)包被96孔板，并在4℃孵育过夜。在室温将孔用BSA(5mg/ml于PBS中)封闭1h。将以1:100稀释的血浆样品或作为标准品的重组人类Fc(R&D Systems)添加到预包被的孔中。添加山羊抗人类Fc-HRP(1:700稀释，Southern Biotech)，在室温持续1小时，并且在洗涤后，添加TMB底物，并且在450nm处测量吸光度。为了检测TGF-β1水平，根据制造商的说明，使用TGF-βELISA试剂盒(R&D systems)分析血浆样品或细胞培养上清液/条件培养基。
U-plex细胞因子阵列
在流体力学注射TNYL-RAW-Fc质粒后11-18天(免疫活性的小鼠模型)或RT后96小时(裸小鼠模型)对小鼠进行眶后采血。分离血浆，并根据制造商的说明进行U-plex阵列(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)。
CIBERSORT、TCGA和mRNA表达分析
基因表达数据从TCGA数据库中的HNSCC队列获得(n＝530)。TCGA提供了使用期望最大化RNA-Seq(RNA-Seq by Expectation Maximization，RSEM)与参考基因组比对并在基因转录物水平定量的3级RNA-seq。CIBERSORT分析如先前描述进行。只有p值<0.05的病例用于进一步的生存分析，p值<0.05表明免疫细胞浸润的可靠估计。M1:M2的截止值0.5被指定用于生存分析。EphB4和肝配蛋白B2表达通过使用R2平台来分析。
辐照
使用带有0.3mm Cu滤波器的RS-2000辐照器(Rad Source Technologies,GA)以160kVp、10mA进行辐照，或者使用带有0.3mm Cu过滤器的PXi-225Cx图像引导辐照器(PXiinc,KC)以225kVp、13mA进行辐照。将小鼠以俯卧位放置，并采集CT扫描。如描述的进行处理计划和放射剂量递送。放射以5.6Gy/min的剂量率递送。
统计学分析
使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。所有实验均以一式两份或一式三份进行并重复2-3次。使用Student t检验或单因素ANOVA对两组之间的差异进行统计学分析。Dunnett事后检验用于ANOVA后的进一步验证，其中多于一个实验组与对照组进行了比较。p值<0.05被认为是显著的。
本文公开的和要求保护的所有物品和方法均可鉴于本公开内容被制备和执行而无需过度实验。尽管已根据优选的实施方案描述本发明的物品和方法，但对于本领域技术人员将明显的是，变化形式可被应用到所述物品和方法而不偏离本发明的精神和范围。对于本领域技术人员明显的是，所有这样的变化和等效物，无论是现有的还是以后开发的，都被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围之内。本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物指示本发明所属领域的普通技术人员的水平。为了所有目的，将所有专利、专利申请和出版物通过引用以其整体并入本文，并且其程度如同每个主题出版物具体地且主题性地被指示为了任何和所有目的通过引用以其整体并入本文。本文示例性地描述的发明可在本文未具体地公开的任何一个或更多个要素不存在的情况下被合适地实践。使用的术语和表述被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所显示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但是认识到，多种改变在本发明要求保护的范围内是可能的。因此，应理解，尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征被具体地公开，但是本领域技术人员可寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在由所附的权利要求书限定的本发明的范围内。
序列表
所附序列表中列出的氨基酸序列使用氨基酸的标准三字母编码示出，如37C.F.R.1.822中规定的。
SEQ ID NO:1是人类肝配蛋白B型受体前体的氨基酸序列(NP_004435.3)。氨基酸残基1-15编码信号序列。
Figure BDA0003359999030000581
SEQ ID NO:2是人类血清白蛋白前蛋白原(NP_000468.1)的氨基酸序列。氨基酸残基25-609编码成熟肽。
Figure BDA0003359999030000591
序列表
<110> 血管基因治疗公司
<120> 使用sEphB4-HSA融合蛋白治疗癌症
<130> CACVT1.0003WO
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 987
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Glu Leu Arg Val Leu Leu Cys Trp Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Glu Glu Thr Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys Trp
20 25 30
Val Thr Phe Pro Gln Val Asp Gly Gln Trp Glu Glu Leu Ser Gly Leu
35 40 45
Asp Glu Glu Gln His Ser Val Arg Thr Tyr Glu Val Cys Asp Val Gln
50 55 60
Arg Ala Pro Gly Gln Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Trp Val Pro Arg
65 70 75 80
Arg Gly Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu Glu
85 90 95
Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe Thr
100 105 110
Val Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr Pro
115 120 125
Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr Ile Lys Val Asp Thr Val Ala Ala Glu
130 135 140
His Leu Thr Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Val Asn
145 150 155 160
Val Lys Thr Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu
165 170 175
Ala Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His Leu
180 185 190
Phe Tyr Lys Lys Cys Ala Gln Leu Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe Pro
195 200 205
Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val
210 215 220
Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys Arg
225 230 235 240
Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys Ala
245 250 255
Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys Ala
260 265 270
Gln Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro Cys
275 280 285
Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln Cys
290 295 300
Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gly Ala Pro Cys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Ser Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Asn Gly
325 330 335
Ser Ser Leu His Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly Arg
340 345 350
Glu Asp Leu Thr Tyr Ala Leu Arg Cys Arg Glu Cys Arg Pro Gly Gly
355 360 365
Ser Cys Ala Pro Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Pro Gly Pro Arg
370 375 380
Asp Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp Phe
385 390 395 400
Thr Tyr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu Ala
405 410 415
Thr Gly Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg Glu
420 425 430
Val Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro Ser
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Val
450 455 460
Leu Asp Tyr Glu Val Lys Tyr His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro Ser
465 470 475 480
Ser Val Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg Gly
485 490 495
Leu Lys Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser Glu
500 505 510
Ala Gly Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln Leu
515 520 525
Asp Glu Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ile Ala Gly Thr
530 535 540
Ala Val Val Gly Val Val Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Ala Val
545 550 555 560
Leu Cys Leu Arg Lys Gln Ser Asn Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser Asp
565 570 575
Lys His Gly Gln Tyr Leu Ile Gly His Gly Thr Lys Val Tyr Ile Asp
580 585 590
Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys
595 600 605
Glu Ile Asp Val Ser Tyr Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly Ala Gly
610 615 620
Glu Phe Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Ala Pro Gly Lys Lys
625 630 635 640
Glu Ser Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Glu Arg
645 650 655
Gln Arg Arg Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe Glu
660 665 670
His Pro Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Asn Ser Met Pro
675 680 685
Val Met Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Ser Phe
690 695 700
Leu Arg Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly Met
705 710 715 720
Leu Arg Gly Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu Ala Glu Met Ser Tyr
725 730 735
Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu
740 745 750
Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Glu Asn
755 760 765
Ser Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile Pro Ile
770 775 780
Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Phe Arg Lys Phe Thr Ser Ala
785 790 795 800
Ser Asp Ala Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser Phe
805 810 815
Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Asn Ala
820 825 830
Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr Ser
835 840 845
Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp Arg Asn Ala Arg
850 855 860
Pro Arg Phe Pro Gln Val Val Ser Ala Leu Asp Lys Met Ile Arg Asn
865 870 875 880
Pro Ala Ser Leu Lys Ile Val Ala Arg Glu Asn Gly Gly Ala Ser His
885 890 895
Pro Leu Leu Asp Gln Arg Gln Pro His Tyr Ser Ala Phe Gly Ser Val
900 905 910
Gly Glu Trp Leu Arg Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Glu Glu Ser Phe
915 920 925
Ala Ala Ala Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala
930 935 940
Glu Asp Leu Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys
945 950 955 960
Ile Leu Ala Ser Val Gln His Met Lys Ser Gln Ala Lys Pro Gly Thr
965 970 975
Pro Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Pro Gln Tyr
980 985
<210> 2
<211> 609
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
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515 520 525
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Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu

Claims (25)

1.抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂用于制备与免疫检查点抑制剂组合用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是用基于铂的化学疗法治疗难治的。
2.抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂用于制备与免疫检查点抑制剂组合用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是用放射疗法治疗难治的。
3.抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂用于制备与免疫检查点抑制剂组合用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是用免疫检查点抑制剂治疗难治的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成但不限于以下的组：非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、转移性尿路上皮癌、乳腺癌、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤和白血病。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌症肿瘤表达PD-L1。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌症肿瘤表达肝配蛋白B2。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌症肿瘤表达PD-L1和肝配蛋白B2。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述组合疗法提供协同作用。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由纳武单抗、派姆单抗和匹地利珠单抗组成的组的PD-1抗体。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由伊匹单抗和tremelimumab组成的组的CTLA-4抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，其中所述多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分并且包含增加血清半衰期的修饰。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，其中多肽剂包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1(“sEphB4多肽”)的氨基酸1-197、16-197、29-197、1-312、16-312、29-312、1-321、16-321、29-321、1-326、16-326、29-326、1-412、16-412、29-412、1-427、16-427、29-427、1-429、16-429、29-429、1-526、16-526、29-526、1-537、16-537和29-537，所述序列与选自由人类血清白蛋白(HSA)(“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。
15.一种分离的多肽剂用于制备治疗患者的癌症的药物的用途，所述分离的多肽剂抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能，其中所述多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分并且包含增加血清半衰期的修饰，其中所述癌症是选自由以下组成的组的抗癌疗法难治的：免疫疗法治疗、用化疗剂治疗、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子的激动性、拮抗性或阻断性抗体(免疫检查点抑制剂)的治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子的靶向治疗、用小分子激酶抑制剂的靶向治疗、使用手术的治疗、使用干细胞移植的治疗和使用放射的治疗。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是用免疫检查点抑制剂治疗难治的。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是用放射疗法治疗难治的。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症是用基于铂的化学疗法治疗难治的。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成但不限于以下的组：非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、转移性尿路上皮癌、乳腺癌、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤和白血病。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症肿瘤表达肝配蛋白B2。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的用途，其中多肽剂包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1(“sEphB4多肽”)的氨基酸1-197、16-197、29-197、1-312、16-312、29-312、1-321、16-321、29-321、1-326、16-326、29-326、1-412、16-412、29-412、1-427、16-427、29-427、1-429、16-429、29-429、1-526、16-526、29-526、1-537、16-537和29-537，所述序列与选自由人类血清白蛋白(HSA)(“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。
24.抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂用于制备与免疫检查点抑制剂组合用于治疗癌症的药物的用途，并且其中疗法与使用免疫检查点抑制剂的单一疗法相比提供了改进的总响应率。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述组合疗法提供协同效应。
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