CN114007633A

CN114007633A - 作为治疗前列腺癌的新型标志物的ephb4-肝配蛋白b2受体配体对

Info

Publication number: CN114007633A
Application number: CN202080028627.1A
Authority: CN
Inventors: V·卡拉斯诺佩洛夫
Original assignee: Vascular Gene Therapy Co
Current assignee: Vascular Gene Therapy Co
Priority date: 2019-02-13
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2022-02-01
Also published as: JP2022520596A; AU2020221276A1; EP3923969A4; CA3139416A1; KR20220010469A; US20220153791A1; WO2020168110A1; EP3923969A1

Abstract

提供了用于治疗受试者的前列腺癌(PC)的组合物和方法，包括向受试者施用治疗有效量的抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂。更特别地，提供了用于治疗缺乏PTEN的PC或使用雄激素受体(AR)靶向疗法治疗难治的PC的方法。重要的是，在已建立的去势前和去势后肿瘤中，可溶性EphB4治疗剂防止肿瘤形成并诱导肿瘤消退。令人惊讶的是，雄激素受体(AR)水平也随着治疗而下降。PI3K亚型分析显示，仅下调PI3K p110β直接调节AR水平，因此AR下降被PI3K β的异位表达挽救。因此，EphB4是前列腺癌的新靶。

Description

作为治疗前列腺癌的新型标志物的EPHB4-肝配蛋白B2受体配体对

相关专利申请

本申请要求于2019年2月13日提交的美国临时申请第62/805,291号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请包含以“纸质副本”(PDF文件)和以计算机可读形式在此提交的包含参考序列(SEQ ID NO:1-2)的文件(ST25格式文本文件)形式的序列表。序列表使用如37C.F.R.1.822中定义的氨基酸的标准三字母代码示出。

技术领域

目前，尽管已经开发了许多先进的诊断和治疗方法，癌症仍然是全世界死亡的主要原因。临床肿瘤学方面有疗效的治疗方案仍然依赖于手术切除、电离辐射和细胞毒性化学疗法的组合。成功治疗和预防癌症的主要障碍在于许多癌症仍然不能对当前的化学疗法和免疫疗法干预有响应的事实，并且许多个体即使在积极治疗后仍遭受复发或死亡。为了解决这些缺点，药物研发的趋势是开发能够调节癌症中失调的信号传导轴的靶向疗法。现在有许多FDA批准的允许对各种各样临床相关的靶进行治疗性操作的抗体和小分子。

前列腺癌(PC)是男性中最常见的非皮肤癌，并且是男性中癌症死亡的第二大常见原因，因此仅在美国，每年就有约30,000名患者死于转移性疾病。雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，ADT)已经是用于治疗晚期前列腺癌的常用策略，诱导前列腺肿瘤显著消退。然而，尽管ADT最初获得治疗响应，但ADT最终在几乎所有患者中失败。因此，在开始治疗后的两到三年内，患者发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，即在雄激素耗竭的背景下侵袭性、致死性前列腺癌的恒定复发。不幸的是，CRPC迄今为止是不可治愈的并且几乎每个转移性CRPC患者最终都死于该疾病。尽管从那时起已经开发了许多不同的药物并应用于患者，但雄激素剥夺背后的基本前提几乎保持不变。全世界每年有超过250,000名男性死于致命性前列腺癌。因此，迫切需要为患者提供治疗选择。本公开内容涉及这个目的以及其他重要目的。

下一代测序已经鉴定了作为PC中的早期事件的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K)途径中的突变，包括PI3KCA和磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensinhomolog，PTEN)中的突变(Bezinelli et al.,Bone Marrow Transplant,52(10),1384-1389,2017)。目前，尽管PI3K亚型特异性抑制剂的研究正处于临床试验，但迄今为止PI3K途径抑制剂活性有限。因此，需要鉴定PC的主导驱动因素(PC dominant drivers)并开发影响这些关键靶的新疗法。

Eph(促红细胞生成素生成性肝癌(Erythropoietin Producing Hepatoma))受体和配体是最大的受体酪氨酸激酶家族(RTK)的一部分。根据序列同源性和对两种不同类型的膜锚定肝配蛋白配体(ephrin ligand)的结合亲和力，该家族被细分为A类和B类。每个Eph受体和配体可以与多于一个配体和受体结合，并且某些受体被假设为假定的肿瘤抑制因子，并且其他受体被假设为肿瘤促进因子(Vaught et al,Breast Cancer Res,10(6):217-224,2008)。EphB4和肝配蛋白B2作为酪氨酸激酶受体-配体对发挥作用，其主要存在于内皮细胞上并参与血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。抑制肝配蛋白B2-EphB4相互作用对体外和离体肿瘤细胞增殖有直接抑制作用。本发明人先前已经描述了抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂(参见，例如，US 7,381,410、US 7,862,816、US 7,977,463、US 8,063,183、US 8,273,858、US 8,975,377、US 8,981,062、US 9,533,026；为了所有目的，每一项在此通过引用以其整体并入)。

本发明人已经鉴定EphB4受体是PC中潜在的新靶。用前列腺上皮Pten缺失背景下的EphB4条件性缺失进行的遗传验证研究消除了肿瘤形成，并消除了PI3K途径诱导。此外，在已建立的去势前和去势后肿瘤中，可溶性EphB4(sEphB4)治疗剂防止肿瘤形成并诱导肿瘤消退。令人惊讶的是，AR水平也随着治疗而下降。PI3K亚型分析显示仅PI3K p110β(直接调节AR水平)被下调，因此AR下降被PI3Kβ的异位表达挽救。

通过引用并入

为了所有目的，专利文件US 7,381,410、US 7,862,816、US 7,977,463、US 8,063,183、US 8,273,858、US 8,975,377、US 8,981,062、US 9,533,026；和本文公开的所有参考文献在此通过引用以其整体并入。

本发明的公开内容

本文提供了用于治疗受试者的前列腺癌的新的方法和组合物。一方面，本发明涉及抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂在制备用于治疗前列腺癌(PC)的药物中的用途。更特别地，用于治疗缺乏PTEN的PC或使用雄激素受体(AR)靶向疗法治疗难治的PC。

在各种实施方案中，抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分或肝配蛋白B2蛋白，或结合并影响EphB4或肝配蛋白B2的抗体。在各种实施方案中，多肽剂是特异性结合肝配蛋白B2多肽并包含EphB4蛋白胞外结构域氨基酸序列的可溶性EphB4(sEphB4)多肽。在各种实施方案中，sEphB4多肽包含EphB4蛋白的球状结构域。

在各种实施方案中，sEphB4多肽包含选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-522至少90％相同的序列、与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-412至少90％相同的序列、以及与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-312至少90％相同的序列。在各种实施方案中，sEphB4多肽可以包含包括以下的序列：球状(G)结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸29-197)和任选的另外的结构域，诸如富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸239-321)、第一纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸324-429)和第二纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸434-526)。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-427。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-326。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-197、29-197、1-312、29-132、1-321、29-321、1-326、29-326、1-412、29-412、1-427、29-427、1-429、29-429、1-526、29-526、1-537和29-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸16-197、16-312、16-321、16-326、16-412、16-427、16-429、16-526和16-537。

在各种实施方案中，可溶性多肽可以以多聚体形式制备，例如通过表达为Fc融合蛋白或与另一种多聚化结构域融合。

在各种实施方案中，sEphB4多肽将还包含赋予增加的血清半衰期同时仍然保持肝配蛋白B2结合活性的另外的成分。在各种实施方案中，sEphB4多肽是单体的并且共价连接到一种或更多种聚氧化烯(polyoxyaklylene)基团(例如聚乙烯、聚丙烯)。在各种实施方案中，sEphB4多肽共价连接到聚乙二醇(PEG)基团(以下简称“sEphB4-PEG”)。

在各种实施方案中，sEphB4多肽与赋予增加的半衰期而不实质减弱肝配蛋白B2结合的第二稳定多肽稳定缔合。在各种实施方案中，稳定多肽与人类患者(或动物患者，在设想兽医用途的情况下)免疫相容，并且将具有很小的生物活性或没有显著的生物活性。在各种实施方案中，sEphB4多肽与选自由人血清白蛋白(HSA)(以下简称“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(以下简称“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-197。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQID NO:1的残基16-312。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-321。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-412。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-427。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-429。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-526。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。

另一方面，本发明涉及抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂在制备用于治疗受试者的癌症的组合疗法的药物中的用途。在各种实施方案中，组合疗法涉及治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用a)治疗有效量的sEphB4-HSA多肽和b)治疗有效量的第二抗癌疗法。组合疗法可以是协同的。组合疗法可以提高抗癌疗法的治疗指数。

在各种实施方案中，第二抗癌疗法选自由以下组成的组：雄激素剥夺疗法(ADT)、AR靶向疗法、激素剥夺疗法、免疫疗法、化学疗法、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的靶向治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的靶向治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子的靶向治疗、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、使用DHT阻断剂的治疗以及干细胞移植。在各种实施方案中，第二抗癌疗法包括施用特异性结合免疫检查点蛋白抗原(来自包括但不限于以下的列表：CD276、CD272、CD152、CD223、CD279、CD274、TIM-3和B7-H4)的抗体或者本领域中教导的任何免疫检查点蛋白抗原抗体。

在各种实施方案中，受试者患有抵抗性或难治性前列腺癌。在各种实施方案中，所述癌症是化学疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是雄激素剥夺疗法(ADT)难治的。在各种实施方案中，所述癌症是AR靶向疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是激素剥夺疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是免疫疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用小分子激酶抑制剂靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用手术治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用干细胞移植治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用放射治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用DHT阻断剂治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是包括以下(例如两种或更多种)的组合疗法难治的：雄激素剥夺疗法、AR靶向疗法、激素剥夺疗法、免疫疗法治疗、用化疗剂治疗、用肿瘤抗原特异性的耗竭性抗体治疗、用包含肿瘤抗原特异性的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子治疗、用小分子激酶抑制剂靶向治疗、使用手术治疗、使用干细胞移植治疗、使用DHT阻断剂治疗和使用放射治疗。

在各种实施方案中，受试者先前对用抗癌疗法治疗有响应，但是在停止治疗后遭受复发(下文称为“复发性增生性疾病”)。

附图简述

图1.前列腺癌中肝配蛋白B2-EphB4的诱导。(A)基于癌症基因组图谱(The CancerGenome Atlas，TCGA)，对492名具有体细胞突变的前列腺癌患者进行了EphB/肝配蛋白B家族成员基因表达分析。(B)对148例人前列腺癌组织阵列(Biomax Inc.PR1921b)中肝配蛋白B2的苏木精-伊红染色(H&E)和免疫组织化学(IHC)染色。肝配蛋白B2在前列腺癌中而不是正常前列腺组织中高表达。顶栏表示前列腺癌的格里森评分。上面两个面板指示较低的放大倍数(200x)；下面两个面板表示更高的放大倍数(400x)。该表显示格里森评分为6和高于7时肝配蛋白B2表达没有显著变化。(C)通过生物发光成像(BLI)无创跟踪PTEN缺失小鼠(PTEN-null mice)中原发性前列腺癌的生长。从4月龄至7月龄，萤光素酶信号表达随时间增加。颜色表示萤光素酶信号的强度。蓝色表示弱信号；绿色和黄色表示中等信号；红色表示强信号。(D)野生型(WT)小鼠前列腺与Cre-PTEN^-/-萤光素酶(CPPL)小鼠前列腺中EphB4、PTEN、磷酸化AKT(pAKT)、磷酸化S6(pS6)蛋白水平的H&E和IHC。(E)一只野生型(WT)和三只CPPL小鼠中EphB4、EphB2、EphB3和Pten蛋白水平的蛋白印迹。探测甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)以确保相等上样量。(F)在野生型(蓝色)和CPPL小鼠(红色)中测量EphB4、EphB1、EphB2和EphB3 RNA水平的定量RT-PCR。基因表达针对β-肌动蛋白进行归一化。误差线表示标准差(s.d.)。这些实验至少重复了两次，并且得到了相似的结果。使用双尾非配对的Student t检验计算P值。**P<0.002。

图2.EphB4遗传型小鼠模型。(A)具有floxed等位基因的诱导型EphB4条件敲除(EphB4 CKO)小鼠的示意图。数字表示外显子1-4。黑色粗箭头表示围绕外显子2和3两侧的两个loxp位点。P1和P2表示用于基因分型的PCR引物位点。(B)基因分型PCR证实了野生型、杂合型和纯合型floxed Pten和EphB4。左图：野生型EphB4(WT，EphB4^{野生型/野生型})具有一条189bp的条带，杂合型EphB4(F/+，EphB4^{floxed/野生型})具有两条尺寸为189bp和282bp的条带，并且纯合型EphB4(F/F，EphB4^{floxed/floxed})具有一条282bp的条带。右图:野生型Pten(WT，Pten^{野生型/野生型})具有一条321bp的条带；杂合型Pten(F/+，Pten^{floxed/野生型})具有两条尺寸为321bp和493bp的条带，并且纯合型Pten(F/F，Pten^{floxed/floxed})具有一条493bp的条带。bp表示碱基对。(C)在野生型小鼠(EphB4和Pten两者均为野生型，蓝色)、CPPL小鼠(具有野生型EphB4的CPPL小鼠，红色)、EphB4杂合CPPL小鼠(EphB4杂合缺失的CPPL小鼠，绿色)和EphB4纯和CPPL小鼠(EphB4纯合缺失的CPPL小鼠，紫色)前列腺组织中测量了EphB4、EphB1、EphB2和EphB3RNA水平的定量RT-PCR。基因表达针对β-肌动蛋白进行归一化。误差线表示标准差(s.d.)。这些实验至少重复了三次，并且得到了相似的结果。使用双尾非配对的Student t检验计算P值。*P<0.05；**P<0.002。

图3.EphB4的敲除抑制PTEN缺失诱导的前列腺癌进展。(A)在包括3月龄、5月龄和7月龄的时间的活体小鼠萤光素酶表达成像。EphB4^+/+；CPPL表示具有野生型EphB4的CPPL小鼠。EpHB4^F/F；CPPL表示具有纯合型EphB4的CPPL小鼠。左图代表14只EphB4^+/+；CPPL中的3只。右图代表29只EpHB4^F/F；CPPL中的3只。彩色条表示萤光素酶信号的强度。蓝色表示弱信号；绿色和黄色表示中等信号；红色表示强信号。(B)定量测量总共14只EphB4^+/+；CPPL小鼠和29只EpHB4^F/F；CPPL小鼠的生物发光成像(BLI)信号强度。蓝色：3月龄。红色：5月龄。绿色：7月龄。BLI的强度在每个条的顶部标出。误差线表示标准差(s.d.)。(C)解剖来自EphB4野生型PTEN缺失小鼠(EphB4^+/+；CPPL)、EphB4杂合型PTEN缺失小鼠(EphB4^F/+；CPPL)和EphB4纯合型PTEN缺失小鼠(EphB4^F/F；CPPL)的前列腺。红色虚线表示肿瘤区域。(D)对从小鼠前列腺收获的肿瘤进行EphB4的蛋白印迹。β探测β-肌动蛋白以确保相等的上样量。这些实验至少重复了三次，并且得到了相似的结果。(E)不同放大倍数(分别为100x、200x和400x)的来自WT、EphB4^+/+；CPPL和EpHB4^F/F；CPPL小鼠的前列腺的H&E染色。(F)前列腺组织中Ki67的IHC染色。右图上示出的信号强度使用ImageJ(NIH)软件基于阳性染色像素点进行定量。所有误差线表示s.d.。(G)前列腺组织中EphB4、PTEN、pAKT和pS6的IHC染色。WT：EphB4和Pten均为野生型；EphB4^+/+；CPPL：EphB4野生型PTEN缺失小鼠；EpHB4^F/F；CPPL：EphB4纯合型PTEN缺失小鼠。所有这些实验至少重复了三次，并且得到了相似的结果。

图4.通过sEphB4抑制EphB4信号传导阻止了PTEN缺失诱导的前列腺癌进展。(A)4月龄、5月龄、6月龄和7月龄活体小鼠萤光素酶表达成像分别对应于处理0个月、1个月、2个月和3个月的时间长度。左图：用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的CPPL，作为对照。右图：用可溶性EphB4-白蛋白(sEphB4-Alb)处理的CPPL。展示了来自每组的三只小鼠。彩色条表示萤光素酶信号的强度。(B)定量测量总共8只CPPL；PBS处理的小鼠和15只CPPL；sEphB4处理的小鼠的生物发光成像(BLI)信号强度。BLI的强度在每个条的顶部标出。(C)7月龄、8月龄、9月龄和10月龄活体小鼠萤光素酶表达成像分别对应于sEphB4-白蛋白处理0个月、1个月、2个月和3个月的时间长度。展示了三只小鼠。彩色条表示萤光素酶信号的强度。(D)定量测量总共8只CPPL；sEphB4处理的小鼠的生物发光成像(BLI)信号强度。蓝色：处理0个月。红色：处理1个月。绿色：处理2个月。紫色：处理3个月。BLI的强度在每个条的顶部标出。误差线表示标准差(s.d.)。(E)来自PBS处理和sEphB4-白蛋白处理的CPPL小鼠的前列腺组织的TUNEL免疫测定(上图)，并且下图是来自同一组织的系列切片的H&E染色。(F)野生型(WT)、PBS处理的CPPL(CPPL；PBS)和sEphB4-白蛋白处理的CPPL(CPPL；sEphB4-Alb)的前列腺组织中的EphB4、pAKT和pS6的IHC染色。所有这些实验至少重复了三次，并且得到了相似的结果。

图5.通过sEphB4抑制EphB4信号传导抑制了雄激素抵抗性前列腺癌进展。(A)4月龄、5.5月龄、8.5月龄、10月龄和14.5月龄活体小鼠萤光素酶表达成像分别对应于去势后0个月、1.5个月、4.5个月、6个月和10.5个月。两组中的小鼠从8.5月龄开始用PBS或sEphb4-白蛋白处理。左图：用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的CPPL。右图：用可溶性EphB4-白蛋白(sEphB4-Alb)处理的CPPL。展示了来自每组的三只小鼠。(B)彩色条表示萤光素酶信号的强度。定量测量总共8只CPPL；sEphB4处理的小鼠的生物发光成像(BLI)信号强度。BLI的强度在每个条的顶部标出。误差线表示标准差(s.d.)。

图6.EphB4在体外在PI3K途径中发挥作用。(A)在两种人前列腺癌细胞系(C4-2B和PC3)中EphB4、P110α、P110β、P110γ、磷酸化AKT(pAKT)、AKT、磷酸化S6(PS6)、S6、磷酸化P38(pP38)、P38的蛋白印迹。在PC3和C4-2B细胞系中，EphB4 siRNA特异性地下调PI3K下游标志物(pAKT，pS6)和P110亚基β，但不下调p110α和p110γ。探测β-肌动蛋白以确保相等的上样量。实验以一式三份进行。(B)磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸(PIP3)的免疫荧光(IF)染色。DAPI表示核染色。合并PIP3和DAPI。PIP3随着EphB4siRNA敲低而减少。(C)EphB4的蛋白印迹并且它证实了在所有测试样品中EphB4被EphB4 siRNA敲低。(D)AKT和pAKT的蛋白印迹。野生型AKT(wt-AKT)的过表达和AKT的组成型活性形式(ΔAKT)都从EphB4siRNA中挽救了AKT和pAKT水平。载体：空载体作为对照。探测β-肌动蛋白以确保相等的上样量。(E)细胞存活力(MTT)测定证实，wt-AKT或ΔAKT的过表达挽救了与对照siRNA相比由siEphB4引起的细胞死亡，而空载体则没有。细胞存活力百分比标记在每个条的顶部。实验以一式三份进行。

图7.PI3K途径经由P110β亚型调节AR。(A)显示不同癌细胞系22RV1、C4-2B、PC3、K562和RAJI中P85、P110α、P110β、P110γ和P110δ的表达水平的蛋白印迹。(B)以不同浓度的P110α抑制剂(BYL719)、P110β抑制剂(GSK2636771)、P110γ抑制剂(IPI-549)和P110δ抑制剂(GSK2269557)的抑制剂处理后，22RV1前列腺细胞系中S6、pS6、EphB4和AR的蛋白印迹。α和β亚型的抑制显著降低了pS6水平。只有P110β的抑制降低了EphB4和AR，而P110α/γ/δ的抑制对这两种蛋白均无影响。下图展示了使用ImageJ(NIH)对相对pS6/S6比率、EphB4和AR蛋白水平进行的定量分析。探测β-肌动蛋白以确保相等的上样量。实验以一式三份进行。

图8.EphB4经由P110β亚型调节AR。(A)22RV1和C4-2B细胞中EphB4和AR的蛋白印迹。与对照siRNA(ctrlsi)和无siRNA(模拟)相比，当使用EphB4siRNA(B4si)敲低EphB4时，AR显著下调。探测β-肌动蛋白以确保相等的上样量。(B)来自野生型(WT)、PBS处理的CPPL(CPPL；PBS)、EphB4敲除的CPPL(CPPL；EphB4F/F)和可溶性EphB4-Alb处理的CPPL(CPPL；sEphB4-Alb)的小鼠前列腺组织中用抗AR抗体(棕色)进行的IHC染色，以100x、400x、1000x放大倍数。虚线矩形表示较高放大倍数示出的相应图片。(C)通过定量RT-PCR分析与对照siRNA和无siRNA(模拟)相比使用EphB4siRNA进行的EphB4-敲低22RV1和C4-2B细胞中AR的mRNA水平。左图示出了相对EphB4和AR水平的定量分析，其在siEphB4处理的C4-2B和22RV1细胞系中显著降低。实验以一式三份进行。使用双尾非配对的Student t检验计算P值。NS，不显著；*P<0.05；(D)AR挽救实验。分别用EphB4 siRNA和EphB4、p110α、p110β和p110γ质粒共转染的22RV1细胞中AR、EphB4、AKT、p110α、p110β和p110γ的蛋白印迹。相对AR水平的定量分析使用ImageJ(NIH)来进行。在本实验中，由EphB4 siRNA引起的AR水平降低可以通过Akt和p110β而非p110α和p110γ的过表达来挽救。令人感兴趣的是，p110α和p110γ的过表达还可以抑制AR水平，这与其他研究一致。

图9.sEphB4降低了CRPC患者中的PSA水平。前列腺肿瘤活检样品中肝配蛋白B2和CD31的H&E和IHC染色。右下图示出了sEphB4-Alb处理后PSA水平在数周内的变化。

图10.EphB4 CKO1(-/-)；CMV-Cre(+)小鼠表型。第E9.5天的小鼠胚胎解剖。一个EphB4 CKO1(wt/wt)胚胎和三个具有胚胎致死性的EphB4 CWKO1(-/-)胚胎。

图11.CPPL小鼠与Eph4-敲除CPPL小鼠的BLI强度。该图总结了基于鼠龄的BLI强度。每个点代表每只小鼠。红线示出了所有小鼠在一定鼠龄时的平均BLI强度。左图：EphB4野生型CPPL小鼠(仅CPPL)。右图：Eph4-敲除CPPL小鼠(EphB4(F/F)；CPPL)。每个图的底部示出对应于鼠龄组的活的小鼠数目。

图12.PBS处理的CPPL小鼠与sEph4-Alb处理的CPPL小鼠的BLI强度。该图总结了基于鼠龄的BLI强度。每个点代表每只小鼠。红线示出了所有小鼠在一定鼠龄时的平均BLI强度。左图：PBS处理的CPPL小鼠。右图：sEph4-Alb处理的CPPL小鼠。每个图的底部示出对应于鼠龄组的活的小鼠数目。

图13.在消退实验中，sEph4-Alb处理的CPPL小鼠的BLI强度。该图总结了基于鼠龄的BLI强度。每个点代表每只小鼠。红线示出了所有小鼠在一定鼠龄时的平均BLI强度。图的底部示出对应于鼠龄组的活的小鼠数目。

图14.EphB4敲低的前列腺癌细胞系中的AR水平。RT-PCT曲线示出在C4-2B(左图)和22RV1(右图)细胞系中，使用EphB4 siRNA与对照siRNA时AR、EphB4、GADPH的基因水平变化。

用于进行本发明的方式

定义

除非本文中另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交关联使用的命名和技术是本领域常用且熟知的那些。除非另有指示，否则本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法和如各种一般和更具体的参考文献中描述地进行，所述参考文献在整个本说明书中引用和讨论。参见，例如，Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)，通过引用并入本文)。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书进行，如本领域通常完成或如本文描述的。本文描述的与分析化学、合成有机化学和药学和药物化学关联使用的命名以及实验程序和技术是本领域通常使用且熟知的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者治疗使用标准技术。

如本文使用的，“增生性疾病”包括肿瘤疾病(包括良性或癌性)和/或任何转移。增生性疾病可以包括过度增生性状况，诸如增生(hyperplasia)、纤维化(尤其是肺纤维化，但也包括其他类型的纤维化，诸如肾纤维化)、血管生成、银屑病、动脉粥样硬化和血管平滑肌增生，诸如血管成形术后狭窄或再狭窄。在各种实施方案中，增生性疾病是癌症。在各种实施方案中，增生性疾病是非癌性疾病。在各种实施方案中，增生性疾病是良性或恶性肿瘤。

术语“肿瘤”，如本文使用的，是指所有赘生性细胞生长和增殖(不论是恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。

术语“原发性肿瘤”是指位于细胞的自发、失调性生长开始的解剖部位(例如原始癌性肿瘤的器官)处的所有赘生性细胞生长和增殖(不论是恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。原发性肿瘤不包括转移。

如本文使用的，术语“转移”是指癌性肿瘤在与原始癌性肿瘤的器官不直接相连的器官或身体部分中的生长。转移将被理解为包括微转移，微转移是在与原始癌性肿瘤的器官(例如，包含原发性肿瘤的器官)不直接相连的器官或身体部分中检测不到的量的癌性细胞的存在。转移也可以被定义为一个过程的若干步骤，诸如癌细胞从原始肿瘤部位(例如原发性肿瘤部位)离开，以及癌细胞迁移和/或侵袭到身体的其他部分。

“抵抗性或难治性癌症”是指对以前的抗癌疗法(包括例如雄激素剥夺疗法(ADT)、激素剥夺治疗、化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植和免疫疗法)无响应的肿瘤细胞或癌症。肿瘤细胞在治疗开始时可以具有抵抗性或难治性，或者在治疗期间可以变得具有抵抗性或难治性。难治性肿瘤细胞包括在治疗开始时对治疗没有响应或最初短时间段对治疗有响应但失去响应的肿瘤。难治性肿瘤细胞也包括对抗癌疗法治疗有响应但对后续轮治疗失去响应的肿瘤。为了本发明的目的，难治性肿瘤细胞还包括表现为被抗癌疗法治疗抑制但在停止治疗后长达5年(有时长达10年或更长时间)复发的肿瘤。抗癌疗法可以使用单独的化疗剂、单独的放射、单独的靶向疗法、单独的手术或其组合。为了便于描述而非限制，应当理解，难治性肿瘤细胞可与抵抗性肿瘤细胞互换。

如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗的个体的疾病的自然过程的临床干预，并且可以进行临床干预用于预防或者在临床病理过程期间进行临床干预。期望的治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。如本文使用的，“减轻”疾病、紊乱或状况意指降低疾病、紊乱或状况的症状的严重性和/或发生频率。此外，本文中述及“治疗”包括述及治愈性、缓解性和预防性治疗。

如本文使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗特定紊乱、状况或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或更多种症状的化合物或组合物的量。对于NHL和其他癌症或其他有害的细胞增殖，有效量包括足以实现以下量：(i)降低癌细胞的数目；(ii)降低肿瘤尺寸；(iii)在一定程度抑制、延迟、减缓并且优选地，停止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度减缓并且优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度减轻一种或更多种与癌症关联的症状。有效量可以以一次或更多次施用来施用。

“辅助背景”是指其中受试者有增生性疾病史，特别是癌症史，并且通常(但不一定)对治疗(包括但不限于手术(诸如手术切除)、放射疗法和化学疗法)有响应的临床背景。然而，由于其增生性疾病(诸如癌症)史，这些受试者被认为有发展为该疾病的风险。“辅助背景”中的治疗或施用是指随后的治疗模式。风险程度(即，处于辅助背景中的受试者被认为是“高风险”还是“低风险”)取决于若干因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。

措辞“协同效应”是指当一起使用的活性成分大于单独使用活性成分产生的效应的总和时所达到的效应。术语“协同效应(synergy)”、“协同效应(synergism)”、“协同效应(synergistic)”、“组合协同量(combined synergistic amount)”和“协同治疗作用”在本文中可互换使用。

措辞“施用”或“引起施用(cause to be administered)”是指由医学专业人员(例如医师)或控制受试者的医疗护理的人员采取的控制和/或允许向受试者施用所讨论的剂/化合物的行动。引起施用可以包括诊断和/或确定合适的治疗方案，和/或为受试者开特定的剂/化合物的处方。这样的开处方可以包括例如起草处方形式、注释医疗记录等。当本文中描述施用时也设想了“引起施用”。

术语“患者”、“个体”和“受试者”可以互换地使用，并且指哺乳动物，优选人类或非人类灵长类动物，但也指家养哺乳动物(例如犬科动物或猫科动物)、实验室哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)和农业哺乳动物(例如马科动物、牛科动物、猪、绵羊(ovine))。在各种实施方案中，患者可以是在医院、精神病护理机构如门诊或其他临床环境中的医师或其他医务人员的护理下的人类(例如，成年男性、成年女性、青少年男性、青少年女性、男性儿童、女性儿童)。在各种实施方案中，患者可以是免疫功能低下的患者或免疫系统减弱的患者，包括但不限于患有原发性免疫缺陷、AIDS的患者；癌症患者和正在服用某些免疫抑制药物的移植患者；以及患有影响免疫系统的遗传性疾病(例如，先天性无丙种球蛋白血症、先天性IgA缺乏症)的患者。在各种实施方案中，患者患有免疫原性癌症，包括但不限于膀胱癌、肺癌、黑素瘤和报道具有高突变率的其他癌症(Lawrence et al.,Nature,499(7457):214-218,2013)。

如本文使用的，述及本发明的融合分子与一种或更多种其他治疗剂的术语“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administered)”和“与...组合(in combinationwith)”旨在意指并且的确指以下且包括以下：当此类组分被一起配制成在基本上同时将所述组分释放至所述受试者的单一剂型时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合同时施用至需要治疗的受试者；当此类组分彼此分开配制成在基本上同时被所述受试者服用的单独的剂型，届时所述组分基本上同时释放至所述受试者时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合基本上同时施用至需要治疗的受试者；当此类组分彼此分开配制成以每次施用之间的显著的时间间隔被所述受试者在连续时间服用的单独的剂型，届时所述组分在基本上不同的时间释放至所述受试者时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合依次施用至需要治疗的受试者；以及，当此类组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型，届时它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠释放至所述受试者，其中每个部分可通过相同或不同的途径施用时，将本发明的融合分子与一种或更多种治疗剂的此类组合依次施用至需要治疗的受试者。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。在某些实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此链的一个末尾(氨基末端)处的末端氨基酸具有游离氨基基团，而链的另一个末尾(羧基末端)处的末端氨基酸具有游离羧基基团。如本文使用的，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基基团，或肽中任何其他位置处的氨基酸的α-氨基基团(当参与肽键时为亚氨基基团)。类似地，术语“羧基末端”是指肽的羧基末端上的游离羧基基团，或肽中任何其他位置处的氨基酸的羧基基团。肽还包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模拟物(peptide mimetic)，诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。

术语“重组多肽”，如本文使用的，旨在包括所有多肽，包括通过重组方式制备、表达、产生、衍生或分离的融合分子，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽。

本公开内容的多肽包括已经以任何方式和为了任何目的被修饰的多肽，所述目的例如：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改变其它物理化学或功能性质。例如，单氨基酸取代或多氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。“保守氨基酸取代”是指多肽中的氨基酸被功能上相似的氨基酸取代。以下六组各自包含互相为保守取代的氨基酸：

丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)

天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)

天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)

精氨酸(R)和赖氨酸(K)

异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)

苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)

如本文使用的术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指与对应的全长蛋白相比具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失的多肽。在某些实施方案中，片段的长度可以是例如至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度也可以是例如最多1000个、最多900个、最多800个、最多700个、最多600个、最多500个、最多450个、最多400个、最多350个、最多300个、最多250个、最多200个、最多150个、最多100个、最多50个、最多25个、最多10个或最多5个氨基酸。片段还可以在其任一个或两个末端处包含一个或更多个另外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在的蛋白的氨基酸的序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。

本文使用的术语“多肽变体”和“多肽突变体”是指包含这样的氨基酸序列的多肽，其中相对于另一多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入至该氨基酸序列、从该氨基酸序列中缺失和/或被取代到该氨基酸序列中。在某些实施方案中，待被插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。本公开内容的变体包括融合蛋白。

如本文使用的术语“可溶性多肽”仅表示多肽不包含足以损害多肽在生理盐溶液中溶解性的跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。

“药物组合物”是指适于动物中的药物使用的组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药理学有效量”是指有效产生预期药理学结果的剂的量。“药学上可接受的载体”是指任何标准的药物载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖的水性溶液，和乳液，诸如油/水乳液或水/油乳液，和各种类型的润湿剂和/或辅助剂。在Remington's Pharmaceutical Sciences,21st Ed.2005,MackPublishing Co,Easton中描述了合适的药物载体和制剂。“药学上可接受的盐”是可以被配制成用于药学用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨的盐或有机胺的盐。

应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“主要由这些方面和实施方案组成”。

本文中述及“约”某一值或参数包括(并且描述)针对该值或参数本身的变化。例如，述及“约X”的描述包括对“X”的描述。

如本文和所附的权利要求书中使用的单数形式“一”、“或”和“所述/该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。

用于进行本公开内容的方式

本公开内容的方法包括通过施用抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂作为单一疗法或与第二抗癌疗法组合来治疗、降低或预防前列腺癌的原发性肿瘤生长或形成或前列腺癌的转移。

EphB4-肝配蛋白B2抑制剂

EphB4是最大的受体酪氨酸激酶家族的成员，并且脊椎动物中的16个中的第一个(EphA1)是从产生促红细胞生成素的肝癌细胞系克隆的。Eph受体相互作用肝配蛋白配体也是膜结合的。EphA(EphA1-8,10)亚组配体(肝配蛋白A1-5)经由糖基-磷脂酰肌醇GPI锚而定位于细胞表面，而B家族配体(肝配蛋白B1-3)是跨膜蛋白(Gale et al.,Neuron,17(1):9-19,1996)。由于与细胞结合，Eph-肝配蛋白相互作用在细胞-细胞接触时发生。Eph和肝配蛋白的二聚体形成高亲和力异四聚体复合物，该高亲和力异四聚体复合物在表达受体和配体的细胞中触发双向信号(Dravis et al.,Dev Biol,271(2):272-290,2004)。Eph和肝配蛋白调节细胞定位、组织边界形成和轴突导向中的重要生物功能。它们也是肠隐窝前体细胞和成熟细胞及绒毛细胞正确定位(Jubb et al.,Clin Cancer Res,11(14):5181-5187,2005)，以及泌尿生殖系统中尿道发育(Peuckert et al.,Kidney Int,90(2):373-388,2016)所必需的。

本发明人和其他人先前已经在基因和蛋白表达水平两方面示出EphB4在PC中的诱导(Xia et al.,Cancer Res,65(11):4623-4632,2005)。与EphB4在PC中的潜在作用一致，EphB4先前已被示出促进PC(Alazzouzi et al.,Cancer Res,65(22):10170-10173,2005)。本发明人和其他人先前已经示出，在前列腺癌中EphB4通过PI3K以及β-连环蛋白途径被诱导(Batlle et al.,Cell,111(2):251-263,2002；Kumar et al.,Cancer Res,69(9):3736-3745,2009)。EphB4通过进一步激活PI3K途径在肿瘤细胞中提供了生存优势。相反，EphB2(EphB受体家族的另一个成员)作为肿瘤抑制因子发挥作用，因为功能丧失突变增加了前列腺癌的风险，尤其是在非裔美国男性中(Robbins et al.PLoS One,6(5),e1949,2011)。本发明人和其他人先前也在结肠癌和膀胱癌中观察到，在肿瘤发生期间，EphB2表达下降，伴随EphB4的诱导(Ozgur et al.,Urol Oncol,29(1):78-84,2011；Stephenson et al.,BMCMol Biol,2,15,2001)。

EphB4本身不是癌基因，但可以在PTEN丧失和/或PI3K激活的情况下促进肿瘤的发生。先前已经示出PI3K激活导致EphB4诱导(R.Liu et al.,BMC Cancer,13:269,2013)。接下来，EphB4的激活导致PI3K-AKT途径活性的诱导。由于PI3K途径在约40％的PC早期和近100％的转移性PC中被诱导，因此除了生长因子介导的转录增加外，在PIKCA和PTEN中经常观察到突变(Sarker et al.,Clin Cancer Res,15(15):4799-4805,2009)。据本发明人所知，EphB4在PC发生中的作用是未知的。

EphB4在PI3K-AKT途径中何处相交也是未知的。由于PI3K激活AKT，并且AKT的组成型激活挽救了缺乏EphB4的细胞，因此这表明EphB4在AKT处或AKT上游相交。因此，EphB4可以在PI3K本身处参与。I类PI3K有四种催化亚型p110α、β、γ和δ，并且每一种都与调节亚基形成二聚体以调节复合物的活性和亚细胞定位。由于EphB4敲低仅降低PI3K p110β并且PI3K p110β是缺乏PTEN的细胞中最主要的形式，因此PI3K p110β可能是节点(nodalpoint)。上皮细胞依赖于PI3K p110α亚型，但当使PTEN缺失时，它通过p110β发出肿瘤进展的信号。

本发明人先前已经描述了抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂(参见，例如，US 7,381,410、US 7,862,816、US 7,977,463、US 8,063,183、US 8,273,858、US 8,975,377、US 8,981,062、US 9,533,026；为了所有目的，每一项在此通过引用以其整体并入)。在本发明的各种实施方案中，抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分或肝配蛋白B2蛋白，或结合并影响EphB4或肝配蛋白B2的抗体。在各种实施方案中，多肽剂是特异性结合肝配蛋白B2多肽并包含EphB4蛋白胞外结构域氨基酸序列的可溶性EphB4(sEphB4)多肽。在各种实施方案中，sEphB4多肽包含EphB4蛋白的球状结构域。

在各种实施方案中，sEphB4多肽包含选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-522至少90％相同的序列、与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-412至少90％相同的序列、以及与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基1-312至少90％相同的序列。在各种实施方案中，sEphB4多肽可以包含包括以下的序列：球状(G)结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸29-197)和任选的另外的结构域，诸如富含半胱氨酸的结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸239-321)、第一纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸324-429)和第二纤连蛋白3型结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸434-526)。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-427。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-326。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-197、29-197、1-312、29-132、1-321、29-321、1-326、29-326、1-412、29-412、1-427、29-427、1-429、29-429、1-526、29-526、1-537和29-537。在各种实施方案中，sEphB4多肽将包含SEQ ID NO:1的氨基酸16-197、16-312、16-321、16-326、16-412、16-427、16-429、16-526。在各种实施方案中，sEphB4多肽可以是包含与任何前述氨基酸序列至少90％并且任选95％或99％相同的氨基酸序列同时保留肝配蛋白B2结合活性的多肽。在各种实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的任何变异是不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的保守改变或缺失，特别是在表面环区域。

在各种实施方案中，sEphB4多肽将还包含赋予增加的血清半衰期同时仍然保持肝配蛋白B2结合活性的另外的成分。在各种实施方案中，sEphB4多肽是单体的并且共价连接到一种或更多种聚氧化烯基团(例如聚乙烯、聚丙烯)。在各种实施方案中，sEphB4多肽共价连接到单个聚乙二醇(PEG)基团(以下简称“sEphB4-PEG”)。在各种实施方案中，sEphB4多肽共价连接到两种、三种或更多种PEG基团。

在各种实施方案中，一种或更多种PEG可以具有范围为约1kDa至约100kDa、约10kDa至约60kDa和约10kDa至约40kDa的分子量。PEG基团可以是直链PEG或支链PEG。在各种实施方案中，可溶性单体sEphB4缀合物包含与一种约10kDa至约40kDa或约15kDa至30kDa的PEG基团共价连接的sEphB4多肽(单PEG化EphB4)，优选经由sEphB4赖氨酸的s-氨基基团或N-末端氨基基团。在各种实施方案中，sEphB4在由sEphB4赖氨酸的s-氨基基团和N-末端氨基基团组成的组中的一个氨基基团处随机PEG化。

在各种实施方案中，sEphB4多肽与赋予增加的半衰期而不实质减弱肝配蛋白B2结合的第二稳定多肽稳定缔合。在各种实施方案中，稳定多肽与人类患者(或动物患者，在设想兽医用途的情况下)免疫相容，并且将具有很小的生物活性或没有显著的生物活性。在各种实施方案中，sEphB4多肽与选自由人血清白蛋白(HSA)(以下简称“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(以下简称“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合。sEphB4-HSA是一种由在C末端与白蛋白融合的可溶性EphB4胞外结构域组成的表达为123.3kDa的单个无缝蛋白的完全人融合蛋白。sEphB4-HSA特异性结合肝配蛋白B2。在肿瘤模型中对sEphB4-HSA的初步研究显示，T细胞和NK细胞向肿瘤中的迁移增加。这伴随着肿瘤血管中ICAM-1的诱导。ICAM-1是一种促进T细胞和NK细胞附着于内皮的整联蛋白，随后细胞转移到肿瘤中。sEphB4-HSA还显示出通过阻断肿瘤细胞和肿瘤血管中的EphB-肝配蛋白B2相互作用而下调PI3K信号传导。跨膜蛋白肝配蛋白B2在肿瘤血管中被诱导。肝配蛋白B2结合肿瘤细胞中诱导的EphB受体酪氨酸激酶家族的几个成员。肝配蛋白B2-EphB4诱导双向信号传导。sEphB4-HSA通过下调PI3K途径阻断信号传导并促进免疫细胞向肿瘤内转运并抑制肿瘤细胞中的存活信号。

在各种实施方案中，共价附接可以通过将sEphB4多肽表达为与人血清白蛋白的共翻译融合体来实现。白蛋白序列可以融合在sEphB4多肽的N-末端、C-末端或非破坏性的内部位置。sEphB4的暴露环将是白蛋白序列插入的合适位置。白蛋白也可以在翻译后通过例如化学交联附接到sEphB4多肽。在各种实施方案中，sEphB4多肽也可以与多于一种白蛋白多肽稳定缔合。

在各种实施方案中，sEphB4-HSA融合体抑制肝配蛋白B2和EphB4之间的相互作用、肝配蛋白B2或EphB4的聚集、肝配蛋白B2或EphB4的磷酸化或其组合。在各种实施方案中，相对于未修饰的野生型多肽，sEphB4-HSA融合体具有增强的体内稳定性。

在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQID NO:1的残基16-197。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-312。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-321。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-412。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-427。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-429。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-526。在各种实施方案中，sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。

前列腺癌

前列腺癌是男性中最常见的非皮肤恶性肿瘤并且是西方世界男性癌症死亡的第二大原因。前列腺癌是由前列腺中异常细胞不受控制的生长引起的。当前列腺癌肿瘤发展时，雄激素，诸如睾酮，促进前列腺癌肿瘤生长。在其早期阶段，局限性前列腺癌通常用局部疗法治疗，包括例如前列腺的手术切除和放射疗法。然而，当局部治疗不能治愈前列腺癌(多达三分之一的男性均是如此)时，该疾病会进展为无法治愈的转移性疾病(即癌症从身体的一个部位扩散到其他部位的疾病)。如本文使用的，术语“前列腺癌”以最广泛的意义使用，并且指产生于前列腺组织的所有阶段和所有形式的癌症。术语“前列腺癌”包括位于前列腺组织中的任何类型的恶性(即非良性)肿瘤，诸如例如前列腺腺癌、前列腺肉瘤、未分化的前列腺癌、前列腺鳞状细胞癌、前列腺导管移行癌和前列腺上皮内瘤。

根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的肿瘤、淋巴结、转移(tumor,node,metastasis；TNM)分期系统，AJCC癌症分期手册(第7版，2010)，前列腺癌的各个阶段定义如下：肿瘤：T1：触诊不到或通过影像学不可见的临床上不明显的肿瘤，T1a：在5％或更少的切除组织中偶然组织学发现的肿瘤，T1b：在多于5％的切除组织中偶然组织学发现的肿瘤，T1c：通过穿刺活检确定的肿瘤；T2：局限于前列腺内的肿瘤，T2a：涉及一个叶的一半或更少的肿瘤，T2b：涉及一个叶的一半以上但不是两个叶的肿瘤，T2c：涉及两个叶的肿瘤；T3：延伸穿过前列腺包膜的肿瘤，T3a：包膜外延伸(单侧或双侧)，T3b：肿瘤侵入精囊；T4：肿瘤是固定的或侵入精囊之外的邻近结构(膀胱颈、外括约肌、直肠、提肌或骨盆壁)。通常，临床T(cT)阶段为T1或T2并且病理T(pT)阶段为T2或更高。淋巴结：N0：无局部淋巴结转移；N1：局部淋巴结转移。转移：M0：无远端转移；M1：存在远端转移。

PC由AR信号传导驱动，并且一线雄激素剥夺疗法仍然是晚期疾病治疗的基础，然而，肿瘤在保留AR功能的同时确实变得对剥夺有抵抗性。例如，AR基因扩增可以导致更高的敏感度，而配体结合结构域中的突变可以结合雌激素、孕酮和糖皮质激素并激活AR信号传导。AR突变也可以导致独立于配体结合的组成型激活。具有讽刺意味的是，PI3K途径的激活通常降低AR水平，并且因此用泛PI3K抑制剂抑制PI3K途径会上调AR途径活性。类似地，AR抑制部分地通过由PHLPP磷酸酶减少引起的持续性pAKT激活PI3K途径(Carver et al.,Cancer Cell,19(5):575-586,2011)。因此，这两种途径相互反向调节，并为彼此的抑制剂提供逃逸机制。如本文所述，本发明人决定评估sEphB4-HSA是否对AR本身有影响，假设与用PI3K抑制剂观察到的一样的AR潜在增加。因此，测量了来自sEphB4-HSA处理小鼠肿瘤中的AR。令人惊讶的是，观察到AR水平显著降低。本发明人还评估了sEphB4-HSA是否可能具有PTEN缺乏相关的PI3Kβ抑制，以及PI3Kβ是否是AR下降的原因。已提出PI3Kβ诱导AR表达(Zhuet al.,Oncogene,27(33),4569-4579,2008)，而PI3Kα则不。PI3K亚型特异性抑制剂显示PI3Kβ负责调节AR水平。对于PI3K p110β抑制，EphB4的减少也最为显著。类似地，EphB4抑制降低了AR，该AR降低通过表达p110β被挽救。因此，EphB4不仅调节PI3K，而且还控制AR水平。

治疗方法

在各种实施方案中，本发明涉及治疗需要这样的治疗的受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括向人施用治疗有效量的抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂。

在各种实施方案中，本发明涉及治疗需要这样的治疗的受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括a)向人施用治疗有效量的抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的多肽剂，和b)施用治疗有效量的第二抗癌疗法。组合疗法可以是协同的。组合疗法可以提高抗癌疗法的治疗指数。

进行雄激素剥夺疗法(“ADT”)或雄激素抑制疗法以减少睾丸产生睾酮。ADT包括手术去势(睾丸切除术)。本文所用的“雄激素”或“雄激素化合物”是指睾酮、二氢睾酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮、雄烯二醇、雄酮等。在各种实施方案中，“雄激素”是指睾酮或二氢睾酮。如本文使用的，“抗雄激素化合物”是指能够降低体内雄激素水平的任何化合物。抗雄激素化合物可以是小分子、肽或蛋白。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是指用于化学睾丸切除术的化合物。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是促性腺激素释放激素(GnRH)拮抗剂。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是促黄体激素释放激素(LHRH)拮抗剂。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是阿巴瑞克、阿比特龙、阿帕鲁胺(apalutamide)、比卡鲁胺、地加瑞克、恩杂鲁胺、氟他胺、戈舍瑞林、亮丙瑞林(也称为亮丙立德(leuprolide))、尼鲁米特、ozarelix或其两种或更多种的组合。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是阿巴瑞克。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是阿比特龙。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是阿帕鲁胺。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是比卡鲁胺。在实施方案中，抗雄激素化合物是地加瑞克。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是恩杂鲁胺。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是氟他胺。在实施方案中，抗雄激素化合物是戈舍瑞林。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是亮丙瑞林。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是尼鲁米特。在各种实施方案中，抗雄激素化合物是ozarelix。在各种实施方案中，抗雄激素化合物呈药学上可接受的盐的形式。在各种实施方案中，该剂是靶向AR信号传导途径的剂，包括更有效的抗雄激素、CYP17抑制剂、雄激素合成所需的酶、5α-还原酶抑制剂、保护AR免受降解的HSP90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(最佳的AR介导的转录所需)抑制剂以及酪氨酸激酶抑制剂的抑制剂。

如本文使用的，抗激素疗法是一类抑制选定激素或其作用的激素剥夺疗法。抗激素活性可以通过拮抗激素功能(例如用激素类似物或拮抗剂，或阻断激素与其受体之间结合/缔合的组合物，(例如激素阻断组合物或阻断剂))和/或通过阻止或减少激素的产生来实现。这可以通过药物、放射和/或手术方法来实现。抑制某些激素对癌症患者可以是有益的，在这些癌症中某些激素促进或帮助肿瘤生长。例如，雄激素剥夺疗法(使用试剂(诸如促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂)来减少内源雄激素产生从而导致体内雄激素水平低)可用于治疗前列腺癌。

如本文使用的，术语“免疫疗法”是指癌症治疗，其包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗；使用抗体-药物缀合物的治疗；使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)诸如CTLA-4、PD-1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗；使用双特异性T细胞接合抗体

诸如博纳吐单抗的治疗；涉及施用生物响应调节因子诸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的治疗；使用治疗性疫苗诸如sipuleucel-T的治疗；使用树突细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗的治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的治疗；使用CAR-NK细胞的治疗；使用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的治疗；使用过继性转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因的)的治疗；使用TALL-104细胞的治疗；以及使用免疫刺激剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特的治疗。

使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的免疫疗法已经成为被广泛研究和临床评价的领域。免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD-1、LAG-3和TIM-3以及其他几种蛋白(Pardoll DM.,Nat Rev Cancer,12:252-64,2012；Sharpeet al.,Nat Immunol,8:239-45,2007)。在正常生理条件下，免疫检查点对于维持自身耐受(即防止自身免疫)和在免疫系统对病原感染进行应答时保护组织免受损伤至关重要。现在也很清楚，肿瘤选择某些免疫检查点途径作为免疫抵抗的主要机制，特别是抵抗针对肿瘤抗原特异性的T细胞(Pardoll DM.,Nat Rev Cancer,12:252-64,2012)。因此，利用针对免疫检查点分子的抗体的治疗包括，例如，CTLA-4(伊匹单抗)、PD-1(纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗)和PD-L1(BMS-936559、MPLD3280A、MEDI4736、MSB0010718C)(参见，例如，Philips和Atkins,International Immunology,27(1)；39-46,Oct 2014)和OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA(参见，例如，Sharon et al.,Chin J Cancer.,33(9):434-444,Sep 2014；Hodi et al.,N Engl J Med,2010；Topalian et al.,N Engl J Med,366:2443-54)正被评估为治疗具有增生性疾病诸如癌症的患者，并且特别是具有难治性和/或复发性癌症的患者的新的可选的免疫疗法。尽管这些免疫疗法中的若干种显示出巨大的益处和重大的前景，但它们仍然受限于潜在的严重副作用的顾虑以及许多肿瘤缺乏靶向抗原并且因此将逃避治疗的事实。通常，具有各种癌症的患者中约20％对PD-1/PD-L1抗体或CTLA-4抗体有响应。因此，对于治疗对免疫检查点疗法(ICT)无响应的复发性癌症和/或难治性癌症患者的新的和改进的免疫疗法仍然存在重大的未满足的需求。

在各种实施方案中，另外的疗法包括施用特异性结合免疫检查点蛋白抗原(来自包括但不限于以下的列表：CD276、CD272、CD152、CD223、CD279、CD274、TIM-3和B7-H4)的抗体或者本领域中教导的任何免疫检查点蛋白抗原抗体。

根据组合疗法的性质，本发明的多肽治疗剂的施用可以在施用其他疗法同时和/或之后继续进行。多肽治疗剂可以在另外的抗癌疗法之前、同时或之后施用，通常在至少约1周、至少约5天、至少约3天、至少约1天内施用。多肽治疗剂可以以单剂量递送，或者可以分成多于一个剂量，例如在一定时间段内(包括每日、每两日、每半周、每周等)递送。有效剂量将随着施用途径、特定的剂、抗癌药剂的剂量等而变化，并且可以由本领域技术人员凭经验确定。

在各种实施方案中，患者先前对用抗癌疗法治疗有响应，但是在停止治疗后遭受复发(下文称为“复发性增生性疾病”)。

在各种实施方案中，患者具有抵抗性或难治性癌症。在各种实施方案中，所述癌症是雄激素剥夺疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是AR靶向疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是激素剥夺疗法难治的。在各种实施方案中，所述癌症是免疫疗法治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症用化疗剂治疗是难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是用小分子激酶抑制剂靶向治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用DHT阻断剂治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是使用放射治疗难治的。在各种实施方案中，所述癌症是包括以下的组合疗法难治的：例如，以下两种或更多种：免疫疗法治疗，使用化疗剂的治疗，使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗，使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗，用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、ADC或融合分子的治疗，用小分子激酶抑制剂的靶向治疗，使用手术的治疗，使用干细胞移植的治疗，使用DHT阻断剂的治疗和使用放射的治疗。

药物组合物

在各种实施方案中，本发明的多肽治疗剂通常以药物组合物施用，所述药物组合物包含活性治疗剂，即，以及各种其他药学上可接受的组分。(参见Remington'sPharmaceutical Science,15.sup.th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1980)。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。取决于所希望的制剂，组合物也可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合物的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其他载体、辅助剂、或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。

在各种实施方案中，用于治疗原发性或转移性癌症的药物组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、瘤内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式施用。

对于肠胃外施用，本发明的药物组合物可以以该物质在生理上可接受的稀释剂(具有可以是无菌液体诸如水、油、盐水、甘油或乙醇的药物载体)中的溶液或悬浮液的可注射剂量施用。此外，组合物中可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它组分是石油、动物、植物或合成来源的组分，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二醇诸如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。抗体和/或多肽可以以贮库注射剂(depot injection)或植入制剂的形式施用，所述贮库注射剂或植入制剂可以以允许活性成分持续释放的方式配制。通常，药物组合物以液体溶液或悬浮液制备为可注射剂；也可以制备为适于在注射之前在液体媒介物中形成溶液或悬浮液的固体形式。如以上讨论的，制剂也可以被乳化或包封在脂质体或微粒(诸如用于增强佐剂作用的聚乳酸、聚乙交酯或共聚物)中。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的多肽剂可以以贮库注射剂或植入制剂的形式施用，所述贮库注射剂或植入制剂可以以允许活性成分持续释放的方式配制。

适用于其他施用模式的另外的制剂包括口服、鼻内和肺部制剂、栓剂和透皮应用。

在各种实施方案中，本发明的方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量或有效剂量的本发明的sEphB4-HSA多肽。在各种实施方案中，本发明的多肽的有效剂量(例如用于治疗本文所述的原发性或转移性癌症)取决于许多不同的因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人类还是动物、施用的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但也可以治疗包括转基因哺乳动物在内的非人类哺乳动物。治疗剂量需要进行滴定以优化安全性和有效性。

在各种实施方案中，剂量的范围可以是0.0001至100mg/kg宿主体重，并且更通常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg-10mg/kg的范围内。在各种实施方案中，向患者施用的多肽剂量选自由以下组成的组：约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约3.5mg/kg、约4.0mg/kg、约4.5mg/kg、约5.0mg/kg、约6.0mg/kg、约7.0mg/kg、约8.0mg/kg、约9.0mg/kg和约10.0mg/kg。在各种实施方案中，治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。本发明的治疗实体通常以多于一次施用。单个剂量之间的间隔可以是每周、每两周、每月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量患者体内治疗实体的血液水平来指示。可选地，本发明的治疗实体可以以缓释制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率取决于多肽在患者体内的半衰期而变化。

本文描述的多肽的毒性可在细胞培养物或实验动物中通过标准制药学程序确定，例如，通过确定LD₅₀(使群体的50％死亡的剂量)或LD₁₀₀(使群体的100％死亡的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于规划对在人类中使用无毒性的剂量范围。本文描述的多肽的剂量优选地在包含有效的剂量而毒性很小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可以取决于所使用的剂型和利用的施用路径而在该范围内变动。确切的制剂、施用途径和剂量可以由专科医师根据患者的状况进行选择。(参见例如，Fingl et al.,1975,In:The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第一章)。

提供以下实施例来更详细地描述本公开内容。

实施例1

在本实施例中，为了阐明EphB在PC中的作用，对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中492名PC患者进行了EphB-肝配蛋白B基因表达分析。经确定，在EphB受体中，EphB4在前列腺癌中具有最高的表达，其次是EphB3和EphB6。EphB2和EphB1水平明显较低(图1A)。在配体中，只有肝配蛋白B2(EphB4的同源受体)以高水平表达，而肝配蛋白B1和肝配蛋白B3具有非常低的水平。

然后在74个PC样品和40个正常前列腺组织中确定了肝配蛋白B2蛋白表达。肝配蛋白B2在58％的前列腺癌组织中高表达。肿瘤细胞、肿瘤血管和间质均为肝配蛋白B2染色阳性，而所有40个正常前列腺和正常血管均为阴性(图1B)。格里森分级与肝配蛋白B2表达之间没有相关性。然后分析了格里森分级和肝配蛋白B2表达的相关性。令人惊讶的是，肝配蛋白B2没有随着格里森分级和阶段的增加而增加，表明肝配蛋白B2在前列腺癌的所有肿瘤分级和阶段中都上调(见表1)。

表1

不同等级PC组中肝配蛋白B2的免疫组织化学表达

	总例数	阳性例(#)	阳性例(％)	p值
					等级组1(格里森评分3+3＝6)	12	05	41.7％	0.562
等级组2(格里森评分3+4＝7)	28	11	39.3％	0.562
					等级组3(格里森评分4+3＝7)	10	06	60.0％	0.562
等级组4(格里森评分8)	46	18	39.1％	0.562
					等级组5(格里森评分9-10)	52	27	51.9％	0.562
总计	148	67	45.3％	0.562

实施例2

在本实施例中，进行实验以确定EphB4和肝配蛋白B2表达是否受Pten功能丧失的调节，并因此激活PI3K途径。特别地，完成了处于前列腺特异性probasin启动子下的条件性Pten^-/-萤光素酶(cPten^-/-L)报告基因(参见下文的方法和材料部分)。萤光素酶表达允许实时活体小鼠肿瘤成像，而probasin驱动的Cre导致Pten等位基因缺失。PC发展始于9周龄，此时睾酮开始上升。通过生物发光成像(BLI)无创跟踪原发性前列腺癌的生长(R.S.Liao etal.,Transl Androl Urol,2(3):187-196,2013)。从6-8周龄开始，使用BLI以2周的间隔监测45只小鼠的群组长达52周。代表前列腺癌负荷的萤光素酶表达随时间增加(图1C)。生物发光信号从蓝色到绿色到红色的变化表明肿瘤负荷增加。通过免疫组织化学(IHC)和蛋白印迹法测定小鼠前列腺中的EphB4表达。在肿瘤中观察到EphB4表达增加，而正常前列腺没有表达(图1D和图1E)。也检查了其他EphB受体家族成员(EphB1、EphB2、EphB3)的表达。通过蛋白印迹，EphB2没有显示出明显的变化(图1E)，相反，定量PCR显示在Cre-Pten^-/--萤光素酶(CPPL)小鼠中在mRNA水平，EphB2下调，同时EphB4增加。经由定量PCR检测不到EphB1水平(图1F)。此外，在肿瘤组织和正常组织之间EphB3水平没有显著变化(图1E和图1F)。因此，Pten缺失和PI3K的诱导表现为与人PC相似地表达EphB-肝配蛋白B2受体配体。

实施例3

在本实施例中，进行研究以确定在Pten缺失小鼠前列腺癌中前列腺癌的起始和进展是否需要EphB4。在前列腺上皮中产生了类似于Pten缺失的用于条件性EphB4敲除(EphB4CKO)小鼠的floxed EphB4等位基因(图2A)。基因分型证实了野生型EphB4(EphB4^{野生型/野生型}：189bp)、杂合型(EphB4^{flox/野生型}：189bp和282bp)和纯合型(EphB4^flox/flox：282bp)floxedEphB4(图2B)。为了检查条件性EphB4缺失的表型，将EphB4^flox/flox(EphB4^f/f)小鼠与CMV-Cre小鼠杂交以进行全局基因缺失。EphB4的胚胎全鼠纯合缺失显示出在E8.5的形态学缺陷以及在E9.5-E10.5的胚胎致死性(图10)，与之前报道的典型的EphB4敲除引起的在E9.5-10.5的胚胎致死性一致(Gerety et al.,Mol Cell,4(3):403-414,1999)，而杂合胚胎没有明显缺陷。为了研究EphB4在成体生命中的作用，通过将EphB4^f/f与他莫昔芬诱导型CMV-Cre小鼠杂交，在12周龄的小鼠中进行全鼠条件性缺失。对15只小鼠进行了20个月的监测。没有明显的表型。在尸检时收集的包括心脏、肺、肝、肾、结肠、脑在内的多器官分析显示组织学检查无异常(数据未示出)。总之，这些数据表明EphB4在胚胎发育中是重要必需的，但在成体生命中则不。

接下来，确定了Ephb4^f/f；CPPL前列腺组织中EphB的表达。在EphB4杂合子中EphB4RNA水平显著降低，在纯合子敲除CPPL小鼠中下降甚至更大(图2F)。

为了研究EphB4在Pten缺失的情况下在前列腺癌发展中的作用，将Ephb4 floxed小鼠与CPPL小鼠杂交。监测小鼠超过7个月。在29只小鼠中的16只中，Ephb4缺失防止了PC发展，并且在其他13只小鼠中观察到极小的肿瘤发展(图3A、图11)。Ephb4敲除小鼠没有肿瘤进展或肿瘤进展非常缓慢，如这29只小鼠中的萤光素酶水平明显较低(Pten^-/-；Ephb4^-/-对比Pten^-/-；Ephb4^+/+)(图3B)显示的，相比之下，14只对照小鼠中信号强度显著增加，如通过萤光素酶信号定量测量评估的。这些观察结果与前列腺组织分析的结果一致。在EphB4野生型Pten缺失小鼠(Ephb4^+/+；CPPL)和Ephb4杂合Pten缺失动物(Ephb4^f/+；CPPL)中，前列腺发展大的双侧肿瘤。相比之下，Ephb4和Pten敲除基因型(Ephb4^f/f；CPPL)具有正常表观的前列腺(图3C)。从Pten缺失小鼠(Ephb4^+/+；CPPL)的前列腺收获的肿瘤显示出EphB4水平升高，但在野生型(Pten^+/+；Ephb4^+/+)和Ephb4敲除CPPL小鼠(Ephb4^f/f；CPPL)的前列腺中仅获得极小信号(图3D)。前列腺的病理分析显示，与Pten敲除小鼠中失去正常结构的致密肿瘤相比，Ephb4缺陷小鼠中的腺结构接近正常表观，但腺结构中的细胞密度(cellularity)有所增加(图3E)。与Ephb4野生型组相比，在EphB4缺失组(CPPL；Ephb4^f/f)中，腺结构中细胞凋亡增加和增殖降低是明显的(图3F)。Ephb4敲除Pten缺失小鼠的组织分析显示PTEN、EphB4、磷酸化AKT(pAKT)和磷酸化S6(pS6)显著降低(图3G)。PTEN在正常前列腺组织中表达，但在CPPL小鼠中不存在。此外，通过Ki67免疫组织化学分析，与Ephb4野生型组相比，Ephb4缺失组显示出腺结构中的低增殖(图3F)。

实施例4

在本实施例中，进行了使用诱饵可溶性EphB4受体来阻断EphB4-肝配蛋白B2双向信号传导的研究。可溶性EphB4(sEphB4)是EphB4的全长胞外结构域。sEphB4是一种以高亲和力结合同源配体肝配蛋白B2并且甚至使肝配蛋白B2-EphB4复合物解离的单体蛋白。由于这种结合，sEphB4阻断内源性肝配蛋白B2与内源性EphB4和其他EphB受体的相互作用，从而抑制双向信号传导。sEphB4在许多PC异种移植物模型中具有活性；然而，尚未测试sEphB4在遗传型小鼠模型中的活性。由EphB4的全长胞外结构域和全长鼠白蛋白组成的鼠形式的蛋白被设计成在C-末端处同框(in frame)，从而产生129kD的融合蛋白(sEphB4-Alb)，该融合蛋白在小鼠中的半衰期超过24hr。研究了sEphB4-Alb在防止CPPL小鼠肿瘤发展方面的作用。sEphB4-Alb治疗在8周龄，在肿瘤起始(在青春期(第12周以后)开始)之前开始，并持续到7月龄。每周三次腹膜内(IP)施用进行处理。当通过定量BLI测量时，在所有15只经处理的小鼠中肿瘤发展显著减少。平均而言，在治疗3个月时，处理组的BLI是对照组的近1/70,000(P<0.05)(图4A和图4B、图12)。

在Pten缺失模型中展示了sEphB4-Alb的有效性之后，进行了确定sEphB4-Alb是否能诱导已建立的肿瘤消退或延缓进一步进展的有效性研究。通过萤光素酶成像记录16只具有已建立的前列腺肿瘤的用sEphB4-Alb(n＝8只)或PBS对照(n＝8只)处理的小鼠。小鼠处理3个月，并且每4周进行一次BLI。在药物处理组中观察到所有8只小鼠的肿瘤消退，其中5只完全消退并且其余3只接近完全消退(图4C和图4D、图13)。作为处理的结果，平均BLI信号从1.68E+08下降到5.13E+02(>处理组群的300,000倍)。在研究结束时收获前列腺并且分析PI3K下游的信号传导途径组分。与EphB4野生型组相比，在EphB4缺失组的腺结构中观察到细胞凋亡增加(图4E)。与对照组相比，处理组的pAKT和pS6均显著降低(图4F)。

实施例5

PC中最大的未满足需求是雄激素剥夺难治的晚期肿瘤的疗法。为了评估sEphB4-Alb在可比群体中的疗效，在12周龄建立肿瘤后，通过去势在Pten缺失小鼠中产生不依赖雄激素的肿瘤。每四周一次监测去势小鼠的肿瘤消退以及随后的复发。最初，生物发光信号在去势后的前4-6周下降，最终在10-12周的时间段内复发不依赖雄激素的肿瘤。然后用PBS或sEphB4-Alb处理小鼠(每组3只)。所有sEphB4处理的小鼠的BLI信号下降而对照组的信号持续增加，与药物治疗组相比，对照的平均变化倍数超过1万倍(或10⁴)(6个月处理后，sEphB4-Alb组平均8.96E+02，而对照组平均9.11E+07)(图5A和图5B)。总之，数据表明sEphB4-Alb对不依赖雄激素的肿瘤有效。本发明人有所惊讶地观察到在去势前组中对已建立的肿瘤的疗效，并且更惊讶于在去势组中对已建立的肿瘤的疗效。虽然sEphB4-Alb抑制PI3K途径，但本发明人预期肿瘤会通过AR途径逃避。基于这些数据，决定通过研究体外PC细胞系(包括不依赖激素的变体)中的EphB4敲低来探索作用机制。

实施例6

通过包括表皮生长因子(EGF)-EGFR在内的生长因子受体激活PI3K-AKT途径上调EphB4表达(Kumar et al.,Cancer Res,69(9):3736-3745,2006)。此外，用成簇的肝配蛋白B2-Fc激活EphB4受体增加了磷酸-AKT水平，表明存在正反馈回路。这在Pten敲除前列腺癌的遗传小鼠模型中得到了验证。该模型中的前列腺肿瘤显示，诱导EphB4和敲除EphB4显著降低了PC的风险，伴随PI3K途径激活标志物的减弱。本发明人希望确定敲低EphB4是否会降低前列腺癌细胞系诸如PC3和去势抵抗性前列腺癌细胞系(C4-2B和22Rv1)中PI3K的水平。经由EphB4 siRNA沉默EphB4表达(Xia et al.,Oncogene,25(5):769-780,2006)降低了EphB4和PI3K下游标志物磷酸化AKT(pAKT，Thr308)和磷酸化核糖体蛋白S6(pS6，Ser 235/Ser236；图6A)。值得注意的是，在PC3和C4-2B细胞系两者中，EphB4 siRNA特异性地下调PI3K p110亚基β，但不下调p110α、γ和δ。PI3K p110β和δ亚型在几种体外模型中促进PC发展和转移并且它们在临床前列腺癌样品中的表达与手术后复发相关。PI3K将磷脂酰肌醇(3,4)-二磷酸(PIP2)转化为磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸(PIP3)的生物功能也随着EphB4敲低而减弱(图6B)，表明EphB4在PI3K活性中发挥重要作用。然而，EphB4敲低对MAPK和p38的总量或激活形式没有影响(图6A)。因此，EphB4功能是对PI3K途径特异性的。EphB4敲低被显示在体外抑制PC细胞生长(Kertesz et al.,2006；Xia et al.,2006)。为了测试EphB4siRNA抑制PI3K活性的特异性，用野生型AKT和AKT的组成型活性形式(Δ-AKT)的异位表达进行细胞存活力挽救测定(Kohn et al.,J Biol Chem,271(36):21920-21926,1996)(图6C、图6D)。野生型AKT和Δ-AKT均挽救了EphB4 siRNA的PI3K抑制(图6E)。这些数据还证实了EphB4在AKT水平或AKT上游上调节PI3K途径。

为了确定EphB4是否在PI3K水平调节该途径，检查了PI3K催化p110亚型的表达水平。EphB4 siRNA在PC3和C4-2B细胞系中特异性地下调PI3K p110亚基β，但不下调p110α、γ和δ。当PI3K p110β和δ亚型在前列腺肿瘤中表达时，促进PC的发展和转移，并与手术后生化复发相关(Hill et al.,Prostate,70(7),755-764,2010)。总之，数据表明EphB4在所检测的细胞系中在PI3K p110β水平调节PI3K途径。

实施例7

EphB4敲低降低了体外PC细胞系中PI3K亚型p110β的水平。接下来确定了EphB4是否调节其他PI3K催化亚型。由于22RV1和C4-2B表达PI3K p110α和β但其他亚型水平较低，因此表达高水平p110γ和p110δ的造血白血病和淋巴瘤细胞系K562(红白血病细胞系)和Raji(Burkitt淋巴瘤细胞系)被包括作为阳性对照(图7A)。然后测试了每种PI3K亚型的特异性抑制剂对下游信号(磷酸化S6)的抑制。PI3K p110α亚型抑制剂(BYL719)和PI3K p110β亚型抑制剂(GSK2636771)显著降低了pS6水平，但没有降低S6的总量。对于p110γ抑制剂(IPI-549)或p110δ抑制剂(GSK2269557)未观察到pS6水平的变化(图7B)。

以前已经提出，p110β诱导雄激素受体(AR)和AR下游信号传导，并且特异性地抑制p110β降低了AR水平(Hill et al.,Prostate,70(7),755-764,2010)。本发明人观察到对p110β的抑制降低了EphB4和AR水平，而p110α/γ/δ抑制剂对这两种蛋白都没有影响(图7B)。因此，PC中通过PI3K信号(通过p110β)的EphB4诱导可能导致肿瘤起始和进展。靶向EphB4抑制了p110β，从而诱导通过AR诱导具有潜在逃避的细胞存活力的丧失。

实施例8

为了确定EphB4-丧失是否降低AR水平，进行了实验以检查EphB4敲低情况下的AR蛋白水平。用siRNA敲低EphB4显著降低了去势抵抗性PC细胞系中的AR水平(图8A)，支持了EphB4在AR表达中的作用。此外，在CPPL小鼠中使用EphB4-肝配蛋白B2竞争性抑制剂sEphB4-Alb进行了体内研究。与对照小鼠相比，药物处理小鼠的雄激素受体mRNA水平下降了80％(图8B)，并且经由定量PCR，EphB4敲低细胞系的雄激素受体mRNA水平降低了84％(图8C、图14)。基于上述发现，即PI3K亚型对AR蛋白和mRNA水平具有不同的功能，本发明人试图确定EphB4是否通过PI3K途径调节AR。在EphB4敲低的情况下，用AKT和每种PI3K亚型进行了挽救实验。感兴趣的是，AKT和PI3K p110β亚基而不是p110α和γ的异位表达挽救了AR表达γ(图8D)，表明EphB4通过PI3K途径(特别是p110β)调节AR。

实施例9

sEphB4-HSA已在人体I期试验中进行了测试，即使在长期治疗中也具有可接受的安全性(El-Khoueiry et al.,European Journal of Cancer,69,S11,2016；Hasina etal.,Cancer Res,73(1):184-194,2013；Thomas et al.,Journal of Clinical Oncology,36(4):285-285,2018)。当准备在前列腺癌中进行临床试验时，本发明人有机会为患有去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的受试者提供关怀性治疗。一名患有CRPC伴随广泛的骨、骨髓和内脏转移的年龄68岁的男性，之前的9个方案(包括ADT、AR途径抑制(恩杂鲁胺和阿比特龙)、放射疗法、化学疗法(多西他赛、卡巴他赛和卡铂)、sipuleucel-T和镭-223)均已失败。分析肿瘤并且发现其具有高的EphB4和肝配蛋白B2表达(图9)。单个患者的IND同意是在关怀性基础上获得的。经IRB和FA批准后，他接受了每周静脉内输注10mg/kg剂量的sEphB4-Alb持续3周的治疗。活跃性指标PSA在治疗开始时为1416，在最初3周增加并持续增加至2439，随后稳定下降至1200并在随后6周保持低，表明存在sEphB4-HSA的生物活性。

基于本文描述的数据和观察，EphB4和肝配蛋白B2在PC中表现为高表达，并且本文描述的实验表明EphB4-肝配蛋白B2对通过调节PI3K和AR信号传导发挥重要作用。鉴于AR和PI3K在PC中的核心作用，sEphB4提供了一种靶向PC，(最特别地是，缺乏PTEN的PC和/或AP靶向治疗难治的PC)的新方法。

人类形式的sEphB4-HSA现已发展到临床，并且可作为单一剂和与其他毒性可接受的剂组合长期施用。本发明人认为sEphB4-HSA可以在这种高度未满足的医疗需求中提供潜在益处，将很快启动晚期疾病PC的临床试验。

方法和材料

PTEN缺失前列腺癌小鼠模型

前列腺特异性PTEN敲除(Cre-PTEN^-/--Luc,CPPL)小鼠模型由Pradip Roy-Burman博士惠赠并且在前面描述过(C.P.Liao et al.,Cancer Res,67(15):7525-7533,2007)。Mouse models of prostate adenocarcinoma with the capacity to monitorspontaneous carcinogenesis by bioluminescence or fluorescence.Cancer Res,67:7525-33,2007)。将Cre-PTEN-/-Luc小鼠随机分为两组(n＝4只)并且每周两次腹膜内施用20mg/kg可溶性EphB4-白蛋白或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且处理前和处理后每4周通过生物发光成像(Xenogen)监测前列腺肿瘤。

生物发光成像(BLI)

小鼠被给予单次腹膜内(i.p.)注射的氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)，然后给予静脉内(i.v.)注射的萤光素(50mg/kg)。等待4.5min以允许萤光素适当分布后，将小鼠置于IVIS 200光学成像系统(Xenogen Corp.)的室中。收集光子持续1min的时间段，并使用LIVE IMAGE软件v.2.50(Xenogen)分析图像。感兴趣的限定区域的信号强度被定量为光子计数率/单位身体面积/单位探测器对向立体角(单位为光子/s/cm2/球面度)。

条件性EphB4敲除小鼠的产生和基因分型

基于已知的EphB4基因结构，构建了基因靶向载体以便在ES细胞中通过pEZ FRTLox盒(Robert Maxson博士实验室惠赠)取代外显子2至3和内含子1-4的部分。第一Loxp插入到内含子1-2内，第二Loxp插入到内含子3-4内，缺失为33167bp，从HindIII到AccI包括内含子1-2的部分(2188bp)、外显子2(71bp)、内含子2-3(120bp)、外显子3(288bp)、内含子3-4的部分(598bp)。lacZ基因在外显子2的起始处与EphB4编码序列同框融合。通过PCR和DNA印迹分析鉴定出两种正确靶向的ES细胞系并用于产生嵌合小鼠。种系传递后，将杂合子小鼠与FLP转基因小鼠杂交以除去Neo。然后，将无Neo杂合子小鼠与野生型C57BL/6背景小鼠杂交以除去FLP。

将floxed EphB4外显子2-3纯合的小鼠(EphB4^floxP/floxP)与从Jackson实验室(BarHarbor，ME)获得的CMV-Cre品系和PB-Cre-Pten-Luc小鼠杂交，其中Cre转基因由经修饰的probasin启动子(ARR2PB)控制。[Generation of a prostate epithelial cell-specificCre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.Mech Dev 101:61-69]。所有实验中都使用了缺乏Cre转基因的同窝对照。所有程序均由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准，并按照动物福利法(Animal Welfare Act)的规定执行。

如前所述，通过PCR对小鼠进行基因分型。分离小鼠尾尖并在55℃在含0.5μg/mL蛋白酶K(Cat#03-H5-801-001,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的裂解缓冲液(Cat#102-T,VIAGEN Biotech,LA,CA)中孵育过夜。然后在使用前将尾尖样品在85℃孵育45min。使用正向引物1(5′-TTCTCGCCTGCGCTACCTGAATG-3′)和反向引物2(5′-ACCAGGGCTCCATTTCTAGGTCG-3′)通过扩增侧翼loxP位点来区分野生型和靶等位基因。使用正向引物(5′-GATCCTGGCAATTTCGGCTAT-3′)和反向引物(5′-TTGCCTGCATTACCGGTCGAT-3′)检测Cre转基因。将基因组DNA片段扩增，在95℃持续5min，然后在95℃持续45sec，在58℃持续40sec，和在72℃持续60sec的36个循环，然后在72℃持续5min。为了检测外显子5缺失，使用与小鼠尾尖相似的方法从不同的小鼠器官中分离基因组DNA样品。使用正向引物(5′-TAGGCTGGGCAGTGCTGTTCTGG-3′)和反向引物(5′-CTCCTGTAGTCCAAGCTGGTCTC-3′)检测外显子2-3缺失。

抗体和其他试剂

针对P110α、P110β、P110γ、P110δ、p85(PI3K亚基，兔单克隆)、Akt、磷酸化AKT(Thr308；Ser473)、S6、磷酸化S6(Ser240/244)、ERK1/2(Thr202/Tyr204)、磷酸化p38、p38、雄激素受体、PTEN的抗体来自Cell Signaling(Danvers,MA)。β-肌动蛋白来自Sigma(StLouis,MO)，并且GAPDH(小鼠单克隆)抗体来自Millipore(Temecula,CA)。Ki67抗体来自Abcam(Cambridge,MA)，并且抗PtdIns(3,4,5)P3来自Echelon Biosciences(Salt LakeCity,UT)。针对Eph受体和配体的抗体从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得。EphB4抗体来自VasGene Therapeutics(Los Angeles,CA)。辣根过氧化物酶(HRP)和IRDye缀合的二抗来自Rockland(Gilbertsville,PA)。

将编码代表小鼠EphB4的整个胞外结构域的互补DNA(cDNA)克隆到成熟小鼠血清白蛋白pCRscript的上游，并置于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中稳定表达的哺乳动物表达载体中，处于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下。如前所述，将表达的sEphB4-Alb融合蛋白纯化至均一性(Scehnet,Blood 2009 113:254-263)。

从Biomax#PR1921b(Derwood,MD)获得前列腺腺癌组织微阵列，包含80例腺癌、8例邻近的正常前列腺组织和8例正常前列腺组织，每例两芯(duplicate cores per case)。

蛋白印迹法

对于蛋白印迹，通常将20μg全细胞裂解物在4％-20％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上运行并转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。将膜用TBS和0.05％Tween-20(TBST)中的5％的脱脂奶粉封闭40min，并且然后与1μg/ml一抗在4℃孵育过夜。将膜洗涤三次，每次10分钟，并与二级辣根过氧化物酶标记或IRDye标记的二抗一起孵育40min。用TBST洗涤三次后，使用来自Thermo Scientific的Femto MaximumSensitivity化学发光底物检测HRP信号，并用Odyssey(LICOR,Lincoln,NE)检测IRDye信号。

免疫荧光和免疫组织化学

对于免疫荧光，将包埋在OCT中的新鲜冷冻组织以5μm进行切片，并在磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛中固定，并在PBS中洗涤。然后用山羊血清封闭切片，并与一抗在4℃一起孵育过夜。在PBS中洗涤后，抗体结合用AlexaFluor缀合的合适的二抗(Invitrogen,Carlsbad,CA)定位。用DAPI对细胞核进行复染。用Nikon Eclipse 80i荧光显微镜和MetaMorph成像系列系统获取图像。还按照制造商的说明，用TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定试剂盒(Promega，Madison，WI)处理组织以进行细胞凋亡分析。

对于免疫组织化学，将冷冻切片在室温用3％甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤两次。将切片用3％H₂O₂处理10min，用山羊血清封闭1小时，并与一抗在4℃一起孵育过夜。然后将切片用PBS洗涤，并用ABC试剂盒(Vector labs，Burlingame，CA)处理。用Olympus BX51显微镜和Image-pro plus 6.0系统获取图像。

为每个样品拍摄四张具有代表性的照片，并用Image J(NIH)进行定量。P值通过非配对的双尾student T-检验确定。

细胞系和培养

PC3细胞系从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。C4-2B细胞由Michael Stallcup(南加州大学)惠赠，并且22Rv1和K562细胞系由AkilMerchant博士(南加州大学)惠赠。所有这些细胞均在补充有10％的FBS、100单位/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的来自Cellgro的RPMI-1640中传代。这些细胞系已经通过与各自原发肿瘤相关的HLA分型和分子表型分析得到验证。

原位杂交

原位杂交如前所述(带有修改)进行(Drummond,I.A.et al.Early developmentof the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephricfunction.Development 125,4655-4667(1998))。特别地，使用ISH试剂盒(Biochain，Hayward，CA)根据制造商的方案进行原位切片。DIG标记的反义和正义探针使用T7和T3 RNA聚合酶(Promega,San Luis Obispo,CA)通过体外转录合成。从包含小鼠EphB4全长cDNA的质粒(BC076426)扩增0.7kb的PCR片段并亚克隆到pCR4.0 TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用配有QImaging Retiga 2000R相机的Olympus BX51显微镜获取图像。

定量RT-PCR

使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从小鼠前列腺组织提取总RNA。根据制造商的说明，用来自Fermentas的试剂盒从2μg的总RNA合成第一链cDNA，并且然后使用Brilliant II SYBR Green QPCR Mastermix(Stratagene，La Jolla，CA)在MX3000P实时PCR系统(Stratagene，La Jolla，CA)上进行定量PCR。所有反应以一式三份进行。扩增信号针对β-肌动蛋白进行归一化。为了评估EphB4 siRNA敲低作用，从用EphB4 siRNA或3碱基错配对照siRNA(对照siRNA)转染的培养细胞中提取总mRNA。在表2中示出所研究基因的引物序列。

表2

实时RT-PCR引物序列

基因	正向引物(5’-3’)	反向引物(5’-3’)
			mEphB4	GCATTCAGCCAAAGTGAGG	GCCGTTTCCAGTTTTGTGTT
mEphB2	GGATGTGCCCATCAAACTCT	CCTTGAAGGTTCCTGATGGA
			mEphB3	AGCTCTACTGCAATGGCGAC	TGCTTTGCTTTGTAACTCCCA
m肝配蛋白B2	CTGTTGGGGACTTTTGATGG	TTGTCCGGGTAGAAATTTGG
			mActb	GGCTGTATTCCCCTCCATCG	CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
hEphB4	CAGTTCGAGCACCCCAATAT	ACGAGCTGGATGACTGTGAA
			hAR	GCTAGAAGGCGAGAGCCTA	TTGTAGTAGTCGCGACTCTG
hGAPDH	AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA	AATGAAGGGGTCATTGATGG

siRNA和转染

EphB4 siRNA(序列为5′-CCGGGAAGGUGAAUGUCAA-3′)由Qiagen(Valencia，CA)合成。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据制造商的说明进行siRNA转染。

AKT构建体

包含src肉豆蔻酰化信号序列的构建体野生型Akt和myrAktΔ4-129(组成型激活的Akt)如前所述(Kohn A.,Takeuchi F.,Roth R.A.(1996)J.Biol.Chem.271,21920-21926)。将这些构建体克隆到pCMV-SPORT6载体中。

体外AKT和磷酸化AKT挽救实验

将C4-2B细胞以2x10⁴个细胞/孔的密度、500μL的总体积接种在24孔板中，并且24hrs后，用EphB4 siRNA或对照siRNA转染细胞。另一个12hrs后，用全长AKT/pCMV-SPORT6(BC020530.1,Open Biosystems)、组成型激活的AKT/pCMV-SPORT6或pCMV-SPORT6质粒进一步转染这些细胞。处理2天后，如前所述，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)评估细胞存活力(Kumar SR,Singh J,Xia G,Krasnoperov V,Hassanieh L,Ley EJ,et al.Receptor tyrosine kinase EphB4 is a survival factor in breastcancer.Am J Pathol 2006；169(1):279-93)。蛋白表达通过免疫印迹证实。

统计学分析

使用非配对的双尾Student t检验来确定不同样品或组中差异的统计学显著性。如果P值小于0.05，则认为结果有显著差异。

本文公开的和要求保护的所有物品和方法均可鉴于本公开内容被制备和执行而无需过度实验。尽管已根据优选的实施方案描述本发明的物品和方法，但对于本领域技术人员将明显的是，变化形式可被应用到所述物品和方法而不偏离本发明的精神和范围。对于本领域技术人员明显的是，所有这样的变化和等效物，无论是现有的还是以后开发的，都被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围之内。本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物指示本发明所属领域的普通技术人员的水平。为了所有目的，将所有专利、专利申请和出版物通过引用以其整体并入本文，并且其程度如同每个主题出版物具体地且主题性地被指示为了任何和所有目的通过引用以其整体并入本文。本文示例性地描述的发明可在本文未具体地公开的任何一个或更多个要素不存在的情况下被合适地实践。使用的术语和表述被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表述时不意图排除所显示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但是认识到，多种改变在本发明要求保护的范围内是可能的。因此，应理解，尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征被具体地公开，但是本领域技术人员可寻求本文公开的概念的改变和变化形式，并且认为此类改变和变化形式在由所附的权利要求书限定的本发明的范围内。

序列表

所附序列表中列出的氨基酸序列使用氨基酸的标准三字母编码示出，如37C.F.R.1.822中规定的。

SEQ ID NO:1是人肝配蛋白B型受体前体的氨基酸序列(NP_004435.3)。氨基酸残基1-15编码信号序列。

SEQ ID NO:2是人血清白蛋白前蛋白原(NP_000468.1)的氨基酸序列。氨基酸残基25-609编码成熟肽。

序列表

<110> 厄弗思生物科学公司

<120> 作为治疗前列腺癌的新型标志物的EPHB4-肝配蛋白B2受体配体对

<130> CACEB1.0002WO

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 987

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Glu Leu Arg Val Leu Leu Cys Trp Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Glu Glu Thr Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys Trp

20 25 30

Val Thr Phe Pro Gln Val Asp Gly Gln Trp Glu Glu Leu Ser Gly Leu

35 40 45

Asp Glu Glu Gln His Ser Val Arg Thr Tyr Glu Val Cys Asp Val Gln

50 55 60

Arg Ala Pro Gly Gln Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Trp Val Pro Arg

65 70 75 80

Arg Gly Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu Glu

85 90 95

Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe Thr

100 105 110

Val Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr Pro

115 120 125

Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr Ile Lys Val Asp Thr Val Ala Ala Glu

130 135 140

His Leu Thr Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Val Asn

145 150 155 160

Val Lys Thr Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu

165 170 175

Ala Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His Leu

180 185 190

Phe Tyr Lys Lys Cys Ala Gln Leu Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe Pro

195 200 205

Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val

210 215 220

Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys Arg

225 230 235 240

Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys Ala

245 250 255

Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys Ala

260 265 270

Gln Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro Cys

275 280 285

Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln Cys

290 295 300

Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gly Ala Pro Cys

305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Ser Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Asn Gly

325 330 335

Ser Ser Leu His Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly Arg

340 345 350

Glu Asp Leu Thr Tyr Ala Leu Arg Cys Arg Glu Cys Arg Pro Gly Gly

355 360 365

Ser Cys Ala Pro Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Pro Gly Pro Arg

370 375 380

Asp Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp Phe

385 390 395 400

Thr Tyr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu Ala

405 410 415

Thr Gly Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg Glu

420 425 430

Val Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro Ser

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Val

450 455 460

Leu Asp Tyr Glu Val Lys Tyr His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro Ser

465 470 475 480

Ser Val Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg Gly

485 490 495

Leu Lys Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser Glu

500 505 510

Ala Gly Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln Leu

515 520 525

Asp Glu Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ile Ala Gly Thr

530 535 540

Ala Val Val Gly Val Val Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Ala Val

545 550 555 560

Leu Cys Leu Arg Lys Gln Ser Asn Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser Asp

565 570 575

Lys His Gly Gln Tyr Leu Ile Gly His Gly Thr Lys Val Tyr Ile Asp

580 585 590

Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys

595 600 605

Glu Ile Asp Val Ser Tyr Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly Ala Gly

610 615 620

Glu Phe Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Ala Pro Gly Lys Lys

625 630 635 640

Glu Ser Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Glu Arg

645 650 655

Gln Arg Arg Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe Glu

660 665 670

His Pro Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Asn Ser Met Pro

675 680 685

Val Met Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Ser Phe

690 695 700

Leu Arg Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly Met

705 710 715 720

Leu Arg Gly Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu Ala Glu Met Ser Tyr

725 730 735

Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu

740 745 750

Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Glu Asn

755 760 765

Ser Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile Pro Ile

770 775 780

Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Phe Arg Lys Phe Thr Ser Ala

785 790 795 800

Ser Asp Ala Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser Phe

805 810 815

Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Asn Ala

820 825 830

Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr Ser

835 840 845

Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp Arg Asn Ala Arg

850 855 860

Pro Arg Phe Pro Gln Val Val Ser Ala Leu Asp Lys Met Ile Arg Asn

865 870 875 880

Pro Ala Ser Leu Lys Ile Val Ala Arg Glu Asn Gly Gly Ala Ser His

885 890 895

Pro Leu Leu Asp Gln Arg Gln Pro His Tyr Ser Ala Phe Gly Ser Val

900 905 910

Gly Glu Trp Leu Arg Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Glu Glu Ser Phe

915 920 925

Ala Ala Ala Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala

930 935 940

Glu Asp Leu Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys

945 950 955 960

Ile Leu Ala Ser Val Gln His Met Lys Ser Gln Ala Lys Pro Gly Thr

965 970 975

Pro Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Pro Gln Tyr

980 985

<210> 2

<211> 609

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu

Claims

1.分离的多肽剂用于制备用于治疗患者的前列腺癌的药物的用途，所述分离的多肽剂抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能，其中所述多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分，并且包含增加血清半衰期的修饰。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述多肽剂包含与选自由人血清白蛋白(HSA)(“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合的选自由以下组成的组的序列(“sEphB4多肽”)：SEQ ID NO:1的氨基酸1-197、16-197、29-197、1-312、16-312、29-312、1-321、16-321、29-321、1-326、16-326、29-326、1-412、16-412、29-412、1-427、16-427、29-427、1-429、16-429、29-429、1-526、16-526、29-526、1-537、16-537和29-537。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的用途，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的用途，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中受试者具有复发性癌症。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述受试者具有抵抗性或难治性癌症。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述癌症是选自由以下组成的组的抗癌疗法难治的：雄激素耗竭疗法、AR靶向疗法、激素耗竭疗法、免疫疗法治疗、用化疗剂治疗、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子的靶向治疗、用小分子激酶抑制剂的靶向治疗、使用手术的治疗、使用干细胞移植的治疗和使用辐射的治疗。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用化学疗法治疗难治的。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用雄激素耗竭疗法治疗难治的。

10.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用激素耗竭疗法治疗难治的。

11.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用AR靶向疗法治疗难治的。

12.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用辐射治疗难治的。

13.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用sipuleucel-T治疗难治的。

14.根据权利要求7所述的用途，其中所述癌症是使用镭-223治疗难治的。

15.一种分离的多肽剂用于制备治疗患者的前列腺癌的药物的用途，所述分离的多肽剂抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能，其中所述多肽剂是EphB4蛋白的单体配体结合部分，并且包含增加血清半衰期的修饰，其中所述治疗包括共施用第二抗癌疗法，其中所述第二抗癌疗法与抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的所述多肽剂以协同方式起作用。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述抗癌疗法选自由以下组成的组：雄激素耗竭疗法、AR靶向疗法、激素耗竭疗法、免疫疗法治疗、用化疗剂治疗、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子的靶向治疗、用小分子激酶抑制剂的靶向治疗、使用手术的治疗、使用干细胞移植的治疗和使用辐射的治疗。

17.一种用于治疗患者的前列腺癌的方法，所述方法包括：

(a)确定来自患者的一种或更多种癌细胞是否表达或过表达EphB4；和

(b)如果一种或更多种细胞表达或过表达EphB4，则施用有效量的抑制EphB4或肝配蛋白B2介导的功能的分离的多肽剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多肽剂包含与选自由人血清白蛋白(HSA)(“sEphB4-HSA”)和牛血清白蛋白(BSA)(“sEphB4-BSA”)组成的组的白蛋白共价或非共价缔合的选自由以下组成的组的序列(“sEphB4多肽”)：SEQ ID NO:1的氨基酸1-197、16-197、29-197、1-312、16-312、29-312、1-321、16-321、29-321、1-326、16-326、29-326、1-412、16-412、29-412、1-427、16-427、29-427、1-429、16-429、29-429、1-526、16-526、29-526、1-537、16-537和29-537。

19.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-326。

20.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中所述sEphB4-HSA包含直接融合到SEQ ID NO:2的残基25-609的SEQ ID NO:1的残基16-537。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述受试者具有复发性癌症。

22.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述受试者具有抵抗性或难治性癌症。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组的抗癌疗法难治的：雄激素耗竭疗法、AR靶向疗法、激素耗竭疗法、免疫疗法治疗、用化疗剂治疗、使用针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体的治疗、使用针对共刺激分子或共抑制分子(免疫检查点)的激动性、拮抗性或阻断性抗体的治疗、用包含针对特定肿瘤抗原的耗竭性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)或融合分子的靶向治疗、用小分子激酶抑制剂的靶向治疗、使用手术的治疗、使用干细胞移植的治疗和使用辐射的治疗。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是使用化学疗法治疗难治的。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是使用雄激素耗竭疗法治疗难治的。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是使用激素耗竭疗法治疗难治的。

27.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是使用AR靶向疗法治疗难治的。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是使用辐射治疗难治的。

29.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是使用sipuleucel-T治疗难治的。

30.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症是使用镭-223治疗难治的。