JP2019510061A - 高脂肪食関連疾患を阻害する方法 - Google Patents
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Abstract
前糖尿病対象を治療する方法が開示され、この対象は、5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする。本方法は、治療上有効な量の少なくとも1つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤をこの対象に投与することを含み、該MNK阻害剤は、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる。本方法は、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させ得る。本方法はまた、空腹時グルコース障害(IFG)の段階にある前糖尿病のグルコース耐性障害(IGT)の段階への進行を予防し得る。【選択図】
Description
本開示は、高脂肪食の作用、特に前糖尿病を阻害することに関する。特定の形態において、本開示は、MAPキナーゼ相互作用キナーゼの発現または機能を阻害することに関する。
優先権書類
本出願は、2016年3月31日出願の「Method of inhibiting high fat diet−related conditions」と題される豪州仮特許出願第2016/901192号の優先権を主張するものであり、この内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、2016年3月31日出願の「Method of inhibiting high fat diet−related conditions」と題される豪州仮特許出願第2016/901192号の優先権を主張するものであり、この内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
食物、特に飽和脂肪の過剰消費の結果、主要かつ急速に増加する健康問題が世界的に生じ、肥満、ならびに脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、及び2型糖尿病などの関連疾患を引き起こす。西欧諸国の成人4人に1人近くが、糖尿病または前糖尿病のいずれかであり、肥満の有病率の増加のため、発生率が上昇している。前糖尿病は、異常に高いが、その人が糖尿病であると診断するのに十分な高さではない血中グルコース値に関連する疾患である。前糖尿病患者は、しばしば肥満であり、この疾患は、概して、高脂肪食などの不健康な食事と関連している。したがって、前糖尿病の管理には、低脂肪食を介した減量の勧告が頻繁に関与する。しかしながら、前糖尿病の多くの患者は、彼らの疾患を治療するための推奨された減量を達成及び維持するために必要な生活習慣の変化を遵守したくない、もしくはできない、または代替として、既存の療法が失敗した可能性がある。したがって、前糖尿病の代替治療及び/または管理の必要性が存在する。
マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)は、MAPKシグナル伝達の下流エフェクターであるセリン/スレオニンキナーゼ群であり、発癌の形質転換及び進行に関与している。ネズミMNK1及びMNK2は、それぞれ、Mknk1及びMknk2遺伝子によってコードされる。対応するタンパク質(MNK1及びMNK2)は、MAPキナーゼ(例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK))と、特にMNK1の場合は、p38MAPキナーゼと相互作用する。MNKタンパク質は、MAPキナーゼによりリン酸化され、MNK活性の刺激を引き起こす(Waskiewiczら、1997)。MNKタンパク質の最もよく知られた基質は、いくつかの更なる基質が記載されているが(Buxadeら、2008に掲載される)、タンパク質合成機構の重要な成分である真核生物翻訳開始因子4E(eIF4E)である(Waskiewiczら、1997;Scheperら、2001)。MNKがeIF4Eに作用する唯一のキナーゼであるため、MNKタンパク質の生物活性は、リン酸化されたeIF4E(P−eIF4E)のレベルを測定することによって測定され得る。
それらの一次配列に関して非常に類似しているが、MNK1及びMNK2は、多数の重要な点で異なる。例えば、ネズミMNK1(ヒトMNK1aに相当)は、主に細胞質であるが、ネズミMNK2(ヒトMNK2aと類似)は、核及び細胞質で見られる。MNK1は、ERKまたはp38MAPキナーゼ経路の刺激後に強く活性化されるが(Scheperら、2001;Waskiewiczら、(1999);Wangら、1999)、MNK2は、これらの経路によってわずかに更に刺激されるのみである高い定常活性を示す。MNK1及びMNK2 mRNAは、肝臓、骨格筋、及び心臓で発現することが知られているが、しかしながら、異なるマウス組織におけるMNK1及びMNK2の発現パターンは、異なり、MNK1及びMNK2が違う役割を果たすことを示唆する。ノックアウトマウスにおけるMKNK1及びMKNK2遺伝子の一方または両方の破壊は、有害作用の報告がなく、ダブルMNK1/2ノックアウトマウスは、生存可能、かつ繁殖可能であり、異常は報告されなかった(Uedaら、2004)。
本発明者らは、MNK活性が、肥満、脂肪生成及び脂質生成、ならびに関連疾患、例えば、脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、前糖尿病、及び2型糖尿病を含む高脂肪食の作用と関連し得ることを認識した。本明細書に記載されるように、MNK発現または生物活性を阻害することは、高脂肪食の作用を阻害し、前糖尿病などの高脂肪食関連疾患を治療及び/または管理することに対する新しい手段を提供し得る。
本開示の第1の態様によると、5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療する方法が提供され、治療上有効な量の少なくとも1つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤を対象に投与することを含み、該MNK阻害剤は、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる。
一実施形態において、MNK阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーである。
本開示は、MNK1またはMNK2がノックアウトされたマウス(それぞれ、MNK1−KO及びMNK2−KO)を用いて、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて、正常飼料食(CD)または高脂肪食(HFD)を消費したマウスにおけるMNK1及びMNK2の役割の調査を記載する。MNK1及び/またはMNK2の発現の阻害、またはMNK阻害剤を用いたMNK1及び/またはMNK2の生物活性の低下が、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、及び脂質生成を含む高脂肪食の作用を阻害し得ることが見出された。
本明細書で提供されるデータは、MNK1及びMNK2が、インスリンによる身体代謝の調節に関与する脂肪組織で発現されることを実証する。MNK2 mRNAが、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて急速に誘導され、脂肪生成中のこのタンパク質の関与が示される。注目すべきことに、MNK2−KOマウスは、WT/HFDマウスで観察されるHFD誘発性脂肪増加に対して保護されていた。MNK2−KO/HFDマウスの脂肪細胞のサイズは、それらの飼料食摂取対応物よりも大きくないことが観察された。しかしながら、比較において、WT/HFDマウスの脂肪細胞のサイズは、飼料食(WT/CD)のWTマウスと比べて著しく増加した。MNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスの両方は、インスリン抵抗性の指標に対して保護され、WT/HFDマウスと比較して、減少した循環グルコース及びインスリンのレベル、及び減少したHOMA−IR(インスリン抵抗性の指標)、より良好なグルコース耐性、及びPKBシグナル伝達経路(PKBリン酸化)の強い応答によって示される減少したインスリン抵抗性を有した。更に、MNK2−KO/HFDマウスは、脂肪組織における炎症の低下を示した。これらの結果は、高脂肪食の有害作用の媒介におけるMNK1、特にMNK2の関与を確認する。
MNK1及びMNK2の両方の小分子阻害剤、CGP57380(すなわち、N3−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ−[3,4−d]ピリミジン−3,4−ジアミン、または4−アミノ−3−(p−フルオロフェニルアミノ)ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン)の存在下で、脂肪細胞の細胞モデルにおける脂質の蓄積が顕著に阻害された。更に、CGP57380は、脂肪細胞の分化に必要な多くの遺伝子の発現を阻害し、脂肪生成及び脂質貯蔵におけるMNK1及びMNK2の重要な役割を示す。これらの結果は、MNK1及び/またはMNK2の生物学的機能の低下が脂肪生成及び脂質貯蔵を阻害することを実証する。更に、CGP57380の存在下で分化された細胞では、より少ないグリセロールが、CGP57380の非存在下で分化された細胞と比較して、脂肪分解アッセイにおいて放出され、CGP57380処理細胞におけるトリグリセリドの貯蔵の低下が確認された。
MNK1及びMNK2は、eIF4Eをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼである。MNK2−KOマウスは、両方の食餌条件下で、WTマウスと比較して、P−eIF4Eの実質的な低下を示したが、MNK1−KOマウスは、飼料食でP−eIF4Eの変化を示さず、WT動物と比較して、HFDでP−eIF4Eのわずかな減少を示すのみであった。これは、MNK2が脂肪組織におけるより活性なMNKアイソフォームであることを示す。
したがって、第1の態様では、本開示は、5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療する方法を提供し、治療上有効な量の少なくとも1つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤を対象に投与することを含み、該MNK阻害剤は、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる。
前糖尿病対象は、グルコース代謝障害を有する。2つの段階が認められる:(1)空腹時グルコース障害(IFG)の前糖尿病、及び(2)グルコース耐性障害(IGT)の前糖尿病。本質的に、ヒト対象における標準的な経口グルコース負荷試験(GTT)は、4つの診断のうちの1つを決定する結果を提供する。グルコース代謝を診断するために使用されるGTT及び「カットオフ」グルコース値の正確なプロトコルは、国によって異なるが、一般的に用いられる一例は、空腹時血中グルコース値を測定し、次いで、グルコース溶液の測定された用量(通常、75gのグルコース)が5分以内に経口摂取され、次いで、血中グルコース値が、通常2時間後に再度測定される。診断は、典型的に、表1に示すように行われる。しかしながら、表1に示される数値のいくつかの小さな変化が一般的に引用されている。本開示の目的のために、本方法は、5.5mmol/l〜6.9mmol/l(すなわち、100mg/dl〜125mg/dl)の空腹時血漿グルコース値を有する前糖尿病対象に対して使用され得る。
多くの前糖尿病対象は、症状のいかなる顕著な変化も伴わずに、例えば、3年から15年の間、糖尿病前の状態のままであるが、他の症例では、症状は、より迅速に悪化し、2型糖尿病に進行する。重要なことに、前糖尿病の診断は、最終的に2型糖尿病を発症する高リスク因子と考慮されるが、前糖尿病の2つの段階は、互いに、かつ2型糖尿病とは区別され、それは、空腹時グルコース障害の前糖尿病と診断された全ての対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病または2型糖尿病障害に進行するわけではないからである。同様に、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する全ての対象が、2型糖尿病に進行するわけではない。
本開示の方法は、前糖尿病から2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させ得る。本方法はまた、空腹時グルコース障害(IFG)の段階にある前糖尿病のグルコース耐性障害(IGT)の段階への進行を予防し得る。本方法はまた、肥満、体重増加、脂肪組織重量の増加、脂肪組織炎症の増加、循環グルコース及び/またはグルコース耐性の増加、循環インスリン及び/またはインスリン抵抗性の増加などの前糖尿病に関連する症状及び/または作用を回避または軽減し得る。
上記のように、前糖尿病対象は、しばしば体重過剰であり、この状態は一般に、高脂肪食などの不健康な食事と関連する。「高脂肪食」という用語は、本明細書では、通常の食事と比較して、典型的に、カロリーの高い割合(食事中の脂肪から得られる)を有する食餌を指すために使用される。食餌中の脂肪は、動物性であろうと植物性であろうと、一価不飽和性、多価不飽和性、飽和性などであろうと、全ての種類の食物脂肪を含み得る。したがって、高脂肪食は、通常の食事より高いカロリー含量を有する。一実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの30%以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。別の実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの35%、40%、45%、50%、55%、60%、または65%以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。加えて、または代替として、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、通常の食事より高い総エネルギー値を特徴とする高脂肪食を有する。例えば、中年成人に対する通常の食事に関して推奨されるエネルギー摂取量が表2に示される。
当業者は、推奨されるエネルギー摂取量値が通常の食事エネルギー摂取レベルを示すことを理解するであろう。しかしながら、これらの値は、年齢、性別、身長、活動レベルによって異なる。したがって、高脂肪食は、通常の食事とほぼ同じエネルギー摂取量を有するか、そうでなければ、通常の食事よりも高い総エネルギー摂取量、例えば、通常の食事と比較して10〜30%、20〜40%、30〜50%、または30〜60%高い総エネルギー摂取量を有する。したがって、開示された方法に従って治療された前糖尿病対象は、通常の食事のエネルギー摂取値より少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、または200%高いエネルギー摂取値を伴う高脂肪食を有し得る。
HFD摂取雄マウスは、高脂肪食の作用を研究するために広く使用され、受け入れられているモデルである(Panchalら、2011)。これらの動物は、脂肪組織の増加、脂肪組織の炎症、及びインスリン応答の欠陥(例えば、グルコース耐性障害)に関して、ヒトの肥満関連メタボリックシンドロームに関連する応答と同じ応答の多くを示す(Hariri及びThibault、2010)。例として、マウスの高脂肪食は、7%kcalの脂肪、18%kcalのタンパク質、75%kcalの炭水化物を含む標準飼料食と比較して、45%kcalの脂肪、20%kcalのタンパク質、35%kcalの炭水化物を含み得る。しかしながら、当業者は、マウスの高脂肪食は、脂肪からのエネルギーが32%〜60%の範囲にあり得ることを理解するであろう。
本明細書に開示されるように、MNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスの両方は、WT/HFD動物と比較してより高いグルコース耐性を有した。本試験では、動物は、2g/kgのグルコースの腹腔内注射を受ける前に動物を一晩絶食させ、グルコース投与前及び投与後2時間までのいくつかの時点で血液中のグルコースが測定された。MNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスの両方は、測定された各時点でWT/HFD動物と比較してより低いグルコース値を有した。これは、同じ高脂肪食で、減少したMNK1及び/またはMNK2の生物活性を有することは、グルコース耐性を増加させることを証明し、したがって、MNK生物活性を減少させることは、前糖尿病の治療または予防を援助するであろうと示すため、特に関連がある。したがって、実施形態では、MNK阻害剤によって治療または予防される疾患は、前糖尿病である。
ヒトMNKは、選択的スプライシングによる2つの遺伝子(遺伝子記号:MKNK1及びMKNK2)に由来する4つのタンパク質の群を含む。MNK1a/1bは、MNK2a/2bと同様にそれらのC末端で異なる。いずれの場合も、a型は、MAPキナーゼ結合領域を欠くb型よりも長いC末端領域を有する。全ての型のN末端は、インポーチンα及び翻訳因子スカフォールドタンパク質真核生物開始因子4G(eIF4G)に結合する多塩基性領域を含有する。MNK1a/b及びMNK2a/bの触媒ドメインは、3つの珍しい特徴を共有する:2つの短いインサート、及び他のキナーゼがDFGを有するDFD特徴。MNKアイソフォームは、それらの活性及び調節、ならびに細胞内局在において著しく異なる。最も特徴付けられたMNK基質は、eIF4Eである。eIF4Eリン酸化の細胞の役割は、不明であり、それは核から特定のmRNAの輸出を促進するかもしれない。他のMNK基質は、特異的mRNAの安定性/翻訳を調節するAUが豊富な要素に結合する。MNKはまた、炎症メディエーターの産出、及びチロシンキナーゼ受容体からのシグナル伝達、ならびに細胞増殖または生存を制御し得る。
ヒトMNKの配列は、以下のように見出され得る:ヒトMNK1 mRNA及びアミノ酸配列:Genbank受入番号AB000409.1;ヒトMNK1アミノ酸配列変異体:Genbank受入番号NM−003684.2;ヒトMNK2a mRNA配列:Genbank受入番号AF237775;ヒトMNK2b mRNA及びアミノ酸配列:Genbank受入番号AF237776、及びNM−17572.2と標識付けられた核酸配列の変異体。「GenBank受入番号」という用語は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information(NCBI))のGenBankデータベースエントリ(Bensonら、2000)に関連する。上記のGenBank受入番号の各々に開示される情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「MNK阻害剤」という用語は、MNK1の生物活性を低下させる(スプライス変異体MNK1a及びMNK1bの一方または両方の生物活性を低下させることを含む)及び/またはMNK2の生物活性を低下させる(スプライス変異体MNK2a及びMNK2bの一方または両方の生物活性を低下させることを含む)、任意の化合物を指すように意図され、発現されるMNK1及び/またはMNK2の量を減少させることを含む。例えば、MNK阻害剤は、有機小分子(本明細書では「小分子」とも称される)、ペプチドアンタゴニスト、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、アプタマー、または当業者に理解されるような発現または生物活性を阻害する他のMNK阻害剤であってもよい。MNK1及びMNK2の生物活性は、様々な方法、例えば、当業者に知られている任意の適切な方法を用いて、例えば、Merck Millipore、カタログ番号07−823(Merck Millipore、米国、マサチューセッツ州、ビルリカ)によって流通される抗リン酸化eIF4E(Ser209)抗体などの、例えば、特異的抗P−eIF4E抗体を使用する免疫ブロットまたはELISAを行うことによって、その基質eIF4EのP−eIF4Eへのリン酸化を測定することによって測定され得る。したがって、MNK阻害剤の非存在下における対応する試料と比較して、MNK阻害剤を含有する試料中のP−eIF4Eの量の相対的低下は、MNKの生物活性が低下したことを証明する。当業者は、P−eIF4Eレベルを測定するとき、適切な対照群をどのように実行するかを知っているであろう。MNK1及び/またはMNK2の生物活性は、そうでなければ、MNK1及び/またはMNK2の生物活性のレベルを検出することができる細胞アッセイを用いて測定され得る。リン酸化されたMNKを特定的に検出する抗体もまた、使用され得、例えば、抗P−MNK1(Phospho−Mnk1(Thr197/202)抗体番号2111;Cell Signaling Technology Inc、米国、マサチューセッツ州、ダンバーズ)がある。更に、当業者は、MNK阻害剤は、その意図された目的のための使用に対して安全であるべきであることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、MNK阻害剤は、好ましくは、MNK2に対する選択性及び/または阻害能力の増加を示し得る。MNK阻害剤の選択性を評価するための簡単な試験は、MNK1またはMNK2のいずれかがノックアウトされた動物からの適切な細胞(例えば、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスからのマウス胚線維芽細胞(MEF))をMNK阻害剤で処理することによって実行され得る。MNK1−KO MEFにおいて、eIF4Eリン酸化は、MNK2に依存し、逆もまた同様であるため、MNK−KO MEFにおける、異なる濃度の対象とするMNK阻害剤のP−eIF4Eレベルへの効果を監視することは、その化合物の、MNK2(MNK1−KO MEFs)またはMNK1(MNK2−KO MEFs)を阻害する能力に関して報告する。したがって、2種類の細胞のデータを比較することにより、試験されたMNK阻害剤がMNK1またはMNK2に対して示す選択性の程度が決定され得る。
MNK阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉RNA分子を含む阻害性ヌクレオチド分子、及びアプタマーから成る群から選択されてもよい。MNK阻害剤は、当技術分野で既に知られているものを含んでもよい。実施形態では、MNK阻害剤の組み合わせが使用されてもよい。
実施形態では、MNK阻害剤は、有機小分子である。MNK1及び/またはMNK2の適切な小分子阻害剤の多くの例を以下に記載する。
式Iは、市販されているCGP57380(N3−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ−[3,4−d]ピリミジン−3,4−ジアミン;または4−アミノ−3−(p−フルオロフェニルアミノ)ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン;WO03/037362;Chrestensenら、2007;Buxadeら、2005;Worchら、2004、Rowlettら、2008)を示す。これは、MNK1及びMNK2の両方の阻害剤である(Houら、2012)。
式IIは、市販されているセラコスラミド((9aS)−8−アセチル−9,9a−ジヒドロ−1,3,7−トリヒドロキシ−9a−メチル−9−オキソ−4−ジベンゾフランカボキサミド;Sussmanら、2004)を示す。
式IIIは、市販されているETP45835二塩酸塩(4−[5−(4−ピペリジニル)−1H−ピラゾール−3−イル]ピリジン二塩酸塩;Oyarzabalら、2010年)を示す。
式IVは、スタウロスポリンの誘導体であるCGP052088(Tschoppら、2000)を示す。
式Vは、MNK−I1(4−(2−(2−フルオロプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ジメチルアミノ)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミドを示す。Beggsら、2015)を示す。
式VIは、MNK−I2(4−(2−イソプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ピロリジン−1−イル)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミド)を示す。
これらの化合物のいくつかに関するIC50の詳細を表3に示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型MNK阻害剤は、「ATP競合剤」またはMNKのATP結合ドメイン(例えば、CGp57380及びセルコスポラミド;Houら、2012)と相互作用する「I型キナーゼ阻害剤」(Houら、2012、Liu及びGray、2006)として知られている化合物の群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型MNK阻害剤は、チエノピリミジン化合物の群から選択される。そのような化合物の例としては、WO06/136402及びWO2007/115822に記載されるもの、Teoら、2015に記載されるチエノピリミジニル誘導体(MNK2選択的阻害剤を含む)、及びWO2011/104340及びUS8,633,201に記載されるものなどの置換アルキル基を含有するチエノピリミジニル誘導体が挙げられ、この段落で言及される全ての仕様の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切なチエノピリミジン化合物の好ましい例は、WO2011/104340に記載されるもの(その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、ならびに上記の特定の化合物、MNK−I1及びMNK−I2を含んでもよい。適切なチエノピリミジン化合物の特に好ましい例は、以下に示される一般式のものであってもよい。
式VII
式中、Xは、CH及びNから選択され;R1は、H、ハロゲン原子(Fなど)、CN、C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、またはCONH2基であり;R2は、ハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、ここで、シクロプロピル基は、1つもしくは2つのハロゲン原子(複数可)(Fなど)、または−CH2−CNで置換されてもよく、ここで、化合物が(R5)2N−CO−基を含む場合、2つのR5基は、それらが付着されるN原子と一緒に、炭素原子がO、S、SO、もしくはSO2によって置き換えられてもよく、及び/またはOH、NH2、N(C1−3−アルキル)2、NH(C1−3アルキル)、CF3、C1−3−アルキル基で置換されてもよい4−〜8−員環を形成してもよく、またはR2は、2〜6位で1つもしくは2つのOHで独立して置換される直鎖もしくは分枝C2−6アルキル基、C1−3アルコキシ、アミノ、CN、R6NH−、(R6)2N−、R6OCONH−、R6CONH−、R6SO2NH−、またはR6NHCONH−基であり、ここで、R6は、C1−5アルキル基(好ましくはC1−4アルキル基、例えば、CH3、i−Pr、及びT−BU)であり、各々、1つのCF3、NH2、NH(C1−3アルキル)、N(C1−3アルキル)2またはCH3O−基で任意に置換され、上記のNH部分のいずれかの水素原子は、CH3で置換されてもよく;R3は、HまたはC1−3アルキル基(好ましくはCH3)であり;R4は、カルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R7基から選択され、
Lは、−(CH2)n−(nが2、3、または4である場合)もしくはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)、−CH2−C≡C−CH2−、または
であり、R7は、OH、−NH2、−NHR8、−N(R8)2、−NH−CO2R8、または3−〜6−員環(例えば、フェニルまたはモルホリン基)、または環状アミン(例えば、ピロリジンもしくはピペリジン)から選択され、R8は、C1−3アルキル(好ましくはCH3)、またはその互変異性体、鏡像異性体、もしくは塩である。より具体的には、式(VII)の好ましい化合物は、Xが上記で定義されたもの(ただし、好ましくはCH2)であり、R1がHまたはより好ましくはFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、R3がCH3であり、R4がカルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R8基から選択され、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分岐鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものである。式(VII)の更に好ましい化合物は、Xが上記で定義されたものであり(ただし、好ましくはCH2)、R1がFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基であり、R3がCH3であり、R4が−CONHR7または−CONH−OR7であってもよいが、より好ましくは−CO−NH−LR8基であり、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものであってもよい。
式中、Xは、CH及びNから選択され;R1は、H、ハロゲン原子(Fなど)、CN、C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、またはCONH2基であり;R2は、ハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、ここで、シクロプロピル基は、1つもしくは2つのハロゲン原子(複数可)(Fなど)、または−CH2−CNで置換されてもよく、ここで、化合物が(R5)2N−CO−基を含む場合、2つのR5基は、それらが付着されるN原子と一緒に、炭素原子がO、S、SO、もしくはSO2によって置き換えられてもよく、及び/またはOH、NH2、N(C1−3−アルキル)2、NH(C1−3アルキル)、CF3、C1−3−アルキル基で置換されてもよい4−〜8−員環を形成してもよく、またはR2は、2〜6位で1つもしくは2つのOHで独立して置換される直鎖もしくは分枝C2−6アルキル基、C1−3アルコキシ、アミノ、CN、R6NH−、(R6)2N−、R6OCONH−、R6CONH−、R6SO2NH−、またはR6NHCONH−基であり、ここで、R6は、C1−5アルキル基(好ましくはC1−4アルキル基、例えば、CH3、i−Pr、及びT−BU)であり、各々、1つのCF3、NH2、NH(C1−3アルキル)、N(C1−3アルキル)2またはCH3O−基で任意に置換され、上記のNH部分のいずれかの水素原子は、CH3で置換されてもよく;R3は、HまたはC1−3アルキル基(好ましくはCH3)であり;R4は、カルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R7基から選択され、
Lは、−(CH2)n−(nが2、3、または4である場合)もしくはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)、−CH2−C≡C−CH2−、または
であり、R7は、OH、−NH2、−NHR8、−N(R8)2、−NH−CO2R8、または3−〜6−員環(例えば、フェニルまたはモルホリン基)、または環状アミン(例えば、ピロリジンもしくはピペリジン)から選択され、R8は、C1−3アルキル(好ましくはCH3)、またはその互変異性体、鏡像異性体、もしくは塩である。より具体的には、式(VII)の好ましい化合物は、Xが上記で定義されたもの(ただし、好ましくはCH2)であり、R1がHまたはより好ましくはFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、R3がCH3であり、R4がカルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R8基から選択され、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分岐鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものである。式(VII)の更に好ましい化合物は、Xが上記で定義されたものであり(ただし、好ましくはCH2)、R1がFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基であり、R3がCH3であり、R4が−CONHR7または−CONH−OR7であってもよいが、より好ましくは−CO−NH−LR8基であり、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものであってもよい。
MNK1及び/またはMKN2の生物活性を低下させる他の小分子もまた、本明細書に記載される使用に適切であってもよい。そのような化合物の例としては、EP0819129に記載されるもの、ピリジン及びピラジン誘導体、例えば、WO2007/147874に記載されるもの、ならびに8−ヘテロアリールプリン化合物、例えば、US7951803に記載されるものが挙げられ、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、当業者は、他の小分子が、本明細書に記載されるようなMNKの生物活性及び/または発現を阻害する場合、それらは、本開示の方法における使用に適切であり、それらの目的のために安全であると考えられる。MNK阻害機能のための小化合物をスクリーニングするための方法は、US8,633,201に記載されている。更に、追加の有機小分子MNK阻害剤を設計するための考慮事項が、Houら(2012)に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施形態では、MNK阻害剤は、ペプチド阻害剤である。
ペプチド阻害剤は、MNK1及び/またはMNK2の生物活性が減少するような様式で、MNK1及び/またはMNK2などの標的と結合することができるペプチドもしくはタンパク質またはその断片である。ペプチド阻害剤は、天然源由来、または人工的に合成されたものに関わらず、天然に存在するMNK結合パートナーであってもよい、または他のペプチドであってもよい。多数のペプチドライブラリーが知られており、そのようなライブラリーは、当業者に知られている多くの技術によってスクリーニングされ得る。MNK1及び/またはMKN2の新規ペプチド阻害剤は、そのような方法を用いて同定され、当業者に周知の技術を用いて産出され得る。
実施形態では、MNK阻害剤は、阻害性抗体またはその断片、例えば、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいMNKに特異的な抗体であってもよい。代替として、阻害抗体は、中和抗体として知られていてもよい。
適切な抗体は、当業者に周知の方法を用いて生成され、次いで、MNK阻害特性を有する、すなわち、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる抗体を同定するためにスクリーニングされてもよい。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリーによって産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。MNK阻害特性を有する抗体を作製する方法は、当業者に周知である。
実施形態では、MNK阻害剤は、阻害性アプタマー、例えば、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいMNKに特異的なアプタマーであってもよい。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子であり、(通常は)短いオリゴヌクレオチド鎖から成るオリゴヌクレオチド分子及び典型的には短い可変ペプチドドメイン(またはループ)から成るペプチドアプタマーが、両端部でタンパク質の骨組に付着している。アプタマーは、MNK1及びMNK2などのタンパク質を高い親和性及び特異性で阻害することができる。アプタマーを産生し、所望の阻害作用についてそれらをスクリーニングする任意の適切な方法を使用してMNK阻害剤を産生してもよい。ヌクレオチドアプタマーのためのそのような方法の例は、US7,960,102及びWO91/19813に記載されるが、しかしながら、他の方法もまた適切であり得る。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイ、ならびにmRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、及び酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術によって構築された組み合わせペプチドライブラリーから選択され得る。阻害性ペプチドアプタマーを産生するための方法の更なる例は、WO2012/096978に記載される。
実施形態では、MNK阻害剤は、阻害性ヌクレオチド分子であってもよい。二本鎖または一本鎖干渉RNA分子は、当業者に周知のように、所与の遺伝子のmRNA転写産物の配列特異的分解を誘発し、それにより、mRNAのタンパク質への翻訳を阻害することができる。MNKをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子は、mRNAの転写をブロックすることが望ましい状況で代替的に使用されてもよい。したがって、阻害性ヌクレオチド分子は、産生されるMNKタンパク質の量を減少させることによって、MNK生物活性を阻害するために使用されてもよい。そのような技術は現在、当業者に周知であり、センスもしくはアンチセンスオリゴマーまたはより大きな断片は、MNKをコードする配列のコードまたは制御領域に沿った様々な位置から設計され得る。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、もしくはワクシニアウイルスから、または種々な細菌プラスミドから誘導された発現ベクターは、標的臓器、組織、または細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために使用されてもよい。当業者に周知の方法が、MNKをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築するために使用され得る。MNKをコードする遺伝子は、MNKをコードする高レベルのポリヌクレオチドまたはその断片を発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することによってオフにされ得る。そのような構築物は、翻訳不可能なセンスまたはアンチセンス配列を細胞に導入するために使用されてもよい。DNAへの組み込みがない場合でも、そのようなベクターは、RNA分子が内因性ヌクレアーゼによって無効にされるまでRNA分子を転写し続けることがある。一過性発現は、非複製ベクターで1ヶ月以上続き、更に適した複製要素がベクターシステムの一部である場合、更に長くことがある。阻害性ヌクレオチド分子は、核酸分子の合成のための、当業者に知られている任意の方法によって調製されてもよい。
MNK阻害剤は、経口または直腸などの経腸投与のための許容される方法のいずれかによって、または皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内経路などの非経口投与によって、または鼻腔内経路などの他の適切な経路によって対象に投与されてもよい。注射は、ボーラス投与、または一定もしくは間欠的注入を介し得る。実施形態では、MNK阻害剤は、経口投与される。したがって、MNK阻害剤は、例えば、カプセル、錠剤、カプレット、顆粒、もしくは粉末(飲料を提供するために水中に懸濁または溶解されてもよい)などの経口剤形で、または補強食品として製剤化されてもよい。
MNK阻害剤は、それを生体利用可能にする任意の形態または様式で投与され得る。製剤を調製する当業者は、選択されるMNK阻害剤の特定の特性、治療される疾患、治療される疾患の段階、及び他の関連状況に応じて、適切な投与形態及び様式を容易に選択することができる(Remingtons Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing Co.(1995)を参照されたい)。実施形態では、製剤は、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び/または賦形剤と任意に組み合わせられてもよい。充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、当業者に知られている任意の適切な物質、例えば、リン酸二カルシウム二塩基(DCPD)、第二リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、糖類、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、セルロース、セルロース誘導体または変性セルロース、例えば、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、キシリトール、ソルビトール、もしくはマルチトールのようなアルコール類、水、アルコール、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及び/またはヒュームドシリカ吸収剤であってもよい。好ましくは、充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、ステアリン酸マグネシウム、DCPD、デンプングリコール酸ナトリウム、ヒュームドシリカ吸収剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。
MNK阻害剤は、本明細書に記載される疾患の治療のために、1つ以上の追加の薬物(複数可)と併用または共に投与されてもよい。成分は、同じ製剤または別々の製剤で投与されえる。別々の製剤で投与される場合、MNK阻害剤は、連続して(すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間(例えば2〜48時間)以内に任意の順序で連続して)、または他の薬物(複数可)と同時に投与されてもよい。
1つ以上の追加の薬物と組み合わせて投与可能であることに加えて、MNK阻害剤は、併用療法で使用されてもよい。これが行われるとき、MNK阻害剤は、典型的には、互いに組み合わせて投与される。したがって、MNK阻害剤の1つ以上は、所望の効果を達成するために、同時(組み合わされた調合剤として)、または連続(すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間(例えば2〜48時間)以内に任意の順序で連続して)のいずれかで投与されてもよい。これは、2つの薬物の組み合わされた効果が、改善された治療結果を提供するように、各MNK阻害剤の治療プロファイルが異なる場合に特に望ましい。
必要に応じて、より効果的な分布のために、MNK阻害剤は、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びマイクロスフェアなどの徐放性または標的送達系に組み込まれ得る。
「治療上有効な量」のMNK阻害剤は、例えば、特定の選択されたMNK阻害剤または使用されるMNK阻害剤の組み合わせ、投与方法、治療される特定の疾患、及び所望の転帰によって変動してもよい。それはまた、疾患の段階及び重症度、患者の年齢及び身体状態を含む治療される対象、もしある場合、同時療法の性質、及び医師に周知の同様の要因にもよる。防止的(予防的)な適用に関しては、それは、概して、予防されるように探される特定の疾患の発症を遅らせる、進行を阻害する、または共に停止させるのに十分なその量である。治療的適用に関しては、それは、概して、医学的に望ましい結果を達成するのに十分なその量である。
治療上有効な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。いずれの化合物についても、治療上有効な量は、細胞培養アッセイ(例えば、前脂肪細胞株)、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタのいずれかで最初に推定され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用されてもよい。そのような情報は、その後、ヒトにおける投与のための有用な投与量及び経路を決定するために使用され得る。治療有効性及び任意の毒性は、例えば、ED50(集団の50%において治療上有効な用量)及びLD50(集団の50%に対して致命的である用量)の決定を通して、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定されてもよい。治療効果と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、それは、LD50/ED50の比として表され得る。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投与量の範囲を定式化するのに使用される。そのような組成物に含有される投与量は、好ましくは、毒性がほとんどない、または全くないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形、患者の感受性、及び投与経路によって、この範囲内で変化する。使用される正確な投薬量及び治療上有効な量は、処理を必要とする対象に関連する因子を考慮して、開業医によって決定される。投与量及び投与経路/頻度は、十分なレベルの活性部分を提供するために、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る因子としては、病状の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ(複数可)、反応感受性、ならびに療法に対する耐性/応答が挙げられる。薬学的組成物は、特定の製剤及び/または活性部分の半減期及びクリアランス速度によって、1日数回、1日1回、3〜4日ごと、毎週、または2週間に1回投与されてもよい。治療上有効な量は、投与経路によって、0.1〜100,000mg、最大約1gの総量まで変動してもよい。一例では、治療上有効な量は、概して、約1〜2000mg/日、好ましくは約10〜約1000mg/日、最も好ましくは約10〜約500mg/日であってもよく、単回または複数回投与されてもよい。
本開示の方法の上記の実施形態のいずれかまたは全てが、以下を含む本開示の他の態様において容易に使用され得ることが意図される。
本開示の別の態様は、5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも1つのMNK阻害剤の使用を提供し、該MNK阻害剤MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる。
本開示の更なる態様は、5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための医薬品の製造における、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる少なくとも1つのMNK阻害剤の使用を提供する。
実施例1 MNK1及びMNK2は、高脂肪食の有害作用を媒介し、MNK1及びMNK2の生物学的機能を阻害することは、これらの作用を減少させる
材料及び方法
材料及び化学物質
全ての細胞培養液及びサプリメントは、Life Technologies(米国、カリフォルニア州、カールスバッド)から購入した。SDS−PAGEの試薬は、Bio−Rad Laboratories,Inc.(米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)から購入した。脂肪生成実験のために、インスリン、デキサメタゾン、IBMX、及びロシグリタゾンは、Sigma−Aldrich Corporation(米国、ミズーリ州、セントルイス)から得た。マクロファージ分極化については、リポ多糖(LPS)をSigma−Aldrichから購入し、インターロイキン(IL)−4及びインターフェロン(IFN)γをPeprotech(米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル)から購入した。MNK阻害剤CGP57380は、Abcam PLC(英国、ケンブリッジ)から得た。
材料及び方法
材料及び化学物質
全ての細胞培養液及びサプリメントは、Life Technologies(米国、カリフォルニア州、カールスバッド)から購入した。SDS−PAGEの試薬は、Bio−Rad Laboratories,Inc.(米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)から購入した。脂肪生成実験のために、インスリン、デキサメタゾン、IBMX、及びロシグリタゾンは、Sigma−Aldrich Corporation(米国、ミズーリ州、セントルイス)から得た。マクロファージ分極化については、リポ多糖(LPS)をSigma−Aldrichから購入し、インターロイキン(IL)−4及びインターフェロン(IFN)γをPeprotech(米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル)から購入した。MNK阻害剤CGP57380は、Abcam PLC(英国、ケンブリッジ)から得た。
動物の使用及び食餌
MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、C57BL/6J背景で作製され、Rikiro Fukunaga博士(日本、大阪大学;Uedaら、2004)によって快く提供された。4週齢の雄野生型(WT)、MNK1−KO、またはMNK2−KOマウスを、12時間の明/暗サイクル(07:00に点灯)及び22±2℃の一定温度で、食料と水は自由に入手可能な状態で保持した。それらを、20週間の高脂肪食(HFD;45%kcalの脂肪、20%kcalのタンパク質、35%kcalの炭水化物;Special Dietary Services、英国、エセックス)または標準飼料食(C;7%kcalの脂肪、18%kcalのタンパク質、75%kcalの炭水化物;Special Dietary Services)のいずれかに割り当てた。食餌中の脂肪は、ラード(17.89%w/w)及び大豆油(4.32%w/w)によって提供した。食餌の栄養価を表4に示す。
MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、C57BL/6J背景で作製され、Rikiro Fukunaga博士(日本、大阪大学;Uedaら、2004)によって快く提供された。4週齢の雄野生型(WT)、MNK1−KO、またはMNK2−KOマウスを、12時間の明/暗サイクル(07:00に点灯)及び22±2℃の一定温度で、食料と水は自由に入手可能な状態で保持した。それらを、20週間の高脂肪食(HFD;45%kcalの脂肪、20%kcalのタンパク質、35%kcalの炭水化物;Special Dietary Services、英国、エセックス)または標準飼料食(C;7%kcalの脂肪、18%kcalのタンパク質、75%kcalの炭水化物;Special Dietary Services)のいずれかに割り当てた。食餌中の脂肪は、ラード(17.89%w/w)及び大豆油(4.32%w/w)によって提供した。食餌の栄養価を表4に示す。
代謝研究
飼料食またはHFDのいずれかで15週間後、グルコース負荷試験(GTT)を一晩の絶食後に行った。空腹時グルコース濃度を、マウスがD−グルコース(2g/マウス体重1kg;Baxter Healthcare Ltd、豪州、アデレード)を腹腔内(ip)注射される前に尾静脈から得られた全血から測定し、血中グルコース濃度を、Aviva Accu−Chekグルコメ―ター(Roche Diagnostics、スイス、Risch−Rotkreuz)を用いて腹腔内注射の15、30、60、及び120分後に尾静脈から測定した。
飼料食またはHFDのいずれかで15週間後、グルコース負荷試験(GTT)を一晩の絶食後に行った。空腹時グルコース濃度を、マウスがD−グルコース(2g/マウス体重1kg;Baxter Healthcare Ltd、豪州、アデレード)を腹腔内(ip)注射される前に尾静脈から得られた全血から測定し、血中グルコース濃度を、Aviva Accu−Chekグルコメ―ター(Roche Diagnostics、スイス、Risch−Rotkreuz)を用いて腹腔内注射の15、30、60、及び120分後に尾静脈から測定した。
インスリン抵抗性を試験するために、マウスの別個のコホートを一晩絶食させ、腹腔内インスリン注射(0.75U/マウス体重1kg;Actrapid、Novo Nordisk、デンマーク、バウスベア)の前に尾から得た全血中の絶食グルコース濃度を測定した。次いで、血液グルコース濃度を、腹腔内注射の15及び30分後に尾静脈から測定した。マウスは、腹腔内注射の30分後にグルコース測定値を得た後、直ちに屠殺し、組織を、下流のインスリンシグナル伝達を測定するためのウェスタンブロッティングによる分析のために直ちに凍結した。
血漿インスリン、IL−5、及びIL−10の測定は、英国、ケンブリッジのCore Biochemical Assay Laboratory(CBAL)によって実施された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行った。
ウェスタンブロッティング
組織を、50mMのTrisHCl、pH7.4、150mMのNaCl、1%Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50mMのβ−グリセロールホスフェート、0.5mMのNaVO3、0.1%2−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含有するRIPA溶解緩衝液中で採取した。溶解後、不溶性物質を4℃で、12,000gで10分間遠心分離することによって除去した。タンパク質含量は、Bradfordタンパク質アッセイ(Bio−Rad)によって決定した。イムノブロッティングは、Liuら(2014)に記載される通りに行った。ブロットは、LI−COR Odyssey(登録商標)Quantitative Imaging Systemを用いて視覚化した。表5に示される一次抗体は、抗P−eIF4E(Merck Millipore)を除いて、Cell Signaling Technologiesからのものであった。二次抗体は、Thermo Fisher Scientific Inc.(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム)から入手し、1:20,000希釈で使用した。
組織を、50mMのTrisHCl、pH7.4、150mMのNaCl、1%Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50mMのβ−グリセロールホスフェート、0.5mMのNaVO3、0.1%2−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含有するRIPA溶解緩衝液中で採取した。溶解後、不溶性物質を4℃で、12,000gで10分間遠心分離することによって除去した。タンパク質含量は、Bradfordタンパク質アッセイ(Bio−Rad)によって決定した。イムノブロッティングは、Liuら(2014)に記載される通りに行った。ブロットは、LI−COR Odyssey(登録商標)Quantitative Imaging Systemを用いて視覚化した。表5に示される一次抗体は、抗P−eIF4E(Merck Millipore)を除いて、Cell Signaling Technologiesからのものであった。二次抗体は、Thermo Fisher Scientific Inc.(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム)から入手し、1:20,000希釈で使用した。
遺伝子発現解析
全RNAは、メーカーの説明書に従ってTrizol試薬(Sigma−Aldrich)を使用して組織から単離した(サンプリング時に凍結された)。RNA濃度を260nmでの吸光度によって決定すると同時に、品質及び完全性を、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いて260/230及び260/280比で評価した。RTリアルタイムPCR増幅を、製造業者のプロトコルに従ってランダムプライマーでImProm−II Reverse Transcription System(A3800;Promega、米国、ウィスコンシン州、マジソン)を使用して実行した。続いて、リアルタイム定量(q)PCRを、Moore CEJら、2016の補足表S1に記載されるプライマー配列を用いて行い、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。比較CT法を使用して、β2ミクログロブリン(B2M)mRNAと比較して標的mRNAレベルの増幅を測定した。図1Aにおいて、各転写産物の相対量は、dCt=(Ct標的遺伝子−Ct ref遺伝子)である式2−dCt及びCt=サイクル閾値を用いて決定した。
全RNAは、メーカーの説明書に従ってTrizol試薬(Sigma−Aldrich)を使用して組織から単離した(サンプリング時に凍結された)。RNA濃度を260nmでの吸光度によって決定すると同時に、品質及び完全性を、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いて260/230及び260/280比で評価した。RTリアルタイムPCR増幅を、製造業者のプロトコルに従ってランダムプライマーでImProm−II Reverse Transcription System(A3800;Promega、米国、ウィスコンシン州、マジソン)を使用して実行した。続いて、リアルタイム定量(q)PCRを、Moore CEJら、2016の補足表S1に記載されるプライマー配列を用いて行い、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。比較CT法を使用して、β2ミクログロブリン(B2M)mRNAと比較して標的mRNAレベルの増幅を測定した。図1Aにおいて、各転写産物の相対量は、dCt=(Ct標的遺伝子−Ct ref遺伝子)である式2−dCt及びCt=サイクル閾値を用いて決定した。
BMDMの単離
骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、成体WTまたはMNK2−KOマウス(Weischenfeldt及びPorse、2008)から前述のように生成した。簡潔には、マウスの両側大腿骨及び脛骨を、Ca2+及びMg2+(Life Technologies)を有さない滅菌ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に26ゲージの針を用いてフラッシュした。細胞クラスターをピペッティングし、懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通すことによって破壊した。得られた細胞懸濁液を遠心分離し(10分、400×g)、細胞ペレットを、30%L929細胞馴化培地(L929細胞は、マクロファージへの骨髄細胞の分化を促進するために必要とされるマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)を分泌する)、20%ウシ胎仔血清(FBS)、50%DMEM(高グルコースダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、Life Technologies)を含有する完全マクロファージ培地(CMM)に1%(重量/体積)ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)と共に再懸濁した。
骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、成体WTまたはMNK2−KOマウス(Weischenfeldt及びPorse、2008)から前述のように生成した。簡潔には、マウスの両側大腿骨及び脛骨を、Ca2+及びMg2+(Life Technologies)を有さない滅菌ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に26ゲージの針を用いてフラッシュした。細胞クラスターをピペッティングし、懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通すことによって破壊した。得られた細胞懸濁液を遠心分離し(10分、400×g)、細胞ペレットを、30%L929細胞馴化培地(L929細胞は、マクロファージへの骨髄細胞の分化を促進するために必要とされるマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)を分泌する)、20%ウシ胎仔血清(FBS)、50%DMEM(高グルコースダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、Life Technologies)を含有する完全マクロファージ培地(CMM)に1%(重量/体積)ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)と共に再懸濁した。
マクロファージ極性化
BMDM細胞を、IFNγ(20ng/ml)の存在下でLPS(100ng/ml;Sigma−Aldrich、Escherichia coli0111:B4からのL2630−リポ多糖体)で24時間処理して、M1マクロファージ表現型に分極するか、または細胞を、IL−4(20ng/ml;Peprotech)単独で24時間処理して、M2表現型に分極した。
BMDM細胞を、IFNγ(20ng/ml)の存在下でLPS(100ng/ml;Sigma−Aldrich、Escherichia coli0111:B4からのL2630−リポ多糖体)で24時間処理して、M1マクロファージ表現型に分極するか、または細胞を、IL−4(20ng/ml;Peprotech)単独で24時間処理して、M2表現型に分極した。
3T3−L1細胞の分化及びオイルレッドO染色
3T3−L1(線維芽細胞)細胞分化の誘導のために、前脂肪細胞を、10%FBSで補充されたDMEM(0日目)でコンフルエンス後2日まで増殖させ、培地を、10%FBS、インスリン(167nM)、デキサメタゾン(0.5μM)、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)(0.5mM)、及びロシグリタゾン(2μM)で補充されたDMEMに交換した。48時間後、培地を、10%(v/v)FBS及び167nMのインスリンで補充されたDMEMを含有する培地と置き換えた。4日目に、分化を誘導した後、そしてそれ以降、細胞を、10%FBSを伴うDMEM中で培養した。維持培地は、細胞が実験に利用されるまで(分化開始から9日)まで48時間毎に交換した。20μMのCGP57380を、0日目に細胞に添加し、分化プログラムを通じてその後の培地交換の間維持した。
3T3−L1(線維芽細胞)細胞分化の誘導のために、前脂肪細胞を、10%FBSで補充されたDMEM(0日目)でコンフルエンス後2日まで増殖させ、培地を、10%FBS、インスリン(167nM)、デキサメタゾン(0.5μM)、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)(0.5mM)、及びロシグリタゾン(2μM)で補充されたDMEMに交換した。48時間後、培地を、10%(v/v)FBS及び167nMのインスリンで補充されたDMEMを含有する培地と置き換えた。4日目に、分化を誘導した後、そしてそれ以降、細胞を、10%FBSを伴うDMEM中で培養した。維持培地は、細胞が実験に利用されるまで(分化開始から9日)まで48時間毎に交換した。20μMのCGP57380を、0日目に細胞に添加し、分化プログラムを通じてその後の培地交換の間維持した。
細胞内トリグリセリドレベルの評価は、他の文献(Smithら、1988)に記載されているようにオイルレッドO染色を用いて行った。簡潔には、3T3−L1細胞の分化の9日目に、10%ホルマリン中で1時間固定した。細胞を、新たに調製したオイルレッドO染色液で10分間染色する前に、60%イソプロパノールで洗浄した。定量のために、細胞を水で広範囲に洗浄して未結合の色素を除去し、1mlのイソプロパノールを、染色された6ウェル培養プレートに添加した。5分後、510nmでのオイルレッド抽出物の吸光度を測定し、吸光度の増加は、細胞内の脂質レベルの増加を示した。
組織学
脂肪組織切片を10%中性緩衝ホルマリン中で6時間固定し、パラフィンワックスに包埋する前に標準物として脱水した。切片(4μm)を切断し、正に帯電したガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色を標準物として行った。スライドを、Panoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を使用してスキャンした。画像を、脂肪細胞ツールマクロを有するImage Jを用いて分析した。次いで、脂肪細胞を計数し、各被写体の絶対画素面積を計算し、μm2に変換した。
脂肪組織切片を10%中性緩衝ホルマリン中で6時間固定し、パラフィンワックスに包埋する前に標準物として脱水した。切片(4μm)を切断し、正に帯電したガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色を標準物として行った。スライドを、Panoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を使用してスキャンした。画像を、脂肪細胞ツールマクロを有するImage Jを用いて分析した。次いで、脂肪細胞を計数し、各被写体の絶対画素面積を計算し、μm2に変換した。
統計
分析は、図の説明文に示されるように、両側かつ対応のないスチューデントのt検定、一元または二元配置分散分析によって行った。0.05未満のAP値は、有意であると考えられた。統計的検定は、統計的プログラムGraphPad Prism(バージョン6;GraphPad Software Inc.、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いて行った。
分析は、図の説明文に示されるように、両側かつ対応のないスチューデントのt検定、一元または二元配置分散分析によって行った。0.05未満のAP値は、有意であると考えられた。統計的検定は、統計的プログラムGraphPad Prism(バージョン6;GraphPad Software Inc.、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いて行った。
脂質分解アッセイ
3T3L1細胞を9日間上記のように分化させた。脂肪分解アッセイは、メーカーの説明書(Abcam Lipolysisアッセイキット、ab185433、Abcam)に従って行った。簡潔には、分化後、細胞を脂肪分解アッセイ緩衝液で2回洗浄した。脂質分解を、100nMイソプロテレノールを用いて3時間刺激した。放出されたグリセロールの量を、比色強度を用いて測定した。
3T3L1細胞を9日間上記のように分化させた。脂肪分解アッセイは、メーカーの説明書(Abcam Lipolysisアッセイキット、ab185433、Abcam)に従って行った。簡潔には、分化後、細胞を脂肪分解アッセイ緩衝液で2回洗浄した。脂質分解を、100nMイソプロテレノールを用いて3時間刺激した。放出されたグリセロールの量を、比色強度を用いて測定した。
トリグリセリド測定
組織放出トリグリセリド(TAG)の量は、トリグリセリド定量キット(Abcam、ab65336)を用いて測定した。
組織放出トリグリセリド(TAG)の量は、トリグリセリド定量キット(Abcam、ab65336)を用いて測定した。
肝臓組織学
新鮮な低温切片(厚さ5μm)を用いて、オイルレッドO(Sigma)で染色することにより脂質蓄積を検出した。低温切片を60%イソプロパノール中で10分間固定し、60%イソプロパノール中の0.3%オイルレッドOで30分間染色し、続いて、60%イソプロパノールで洗浄した。核をヘマトキシリンで2分間染色し、次いで、水道水で濯いだ。スライドをPannoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を用いてスキャンした。
新鮮な低温切片(厚さ5μm)を用いて、オイルレッドO(Sigma)で染色することにより脂質蓄積を検出した。低温切片を60%イソプロパノール中で10分間固定し、60%イソプロパノール中の0.3%オイルレッドOで30分間染色し、続いて、60%イソプロパノールで洗浄した。核をヘマトキシリンで2分間染色し、次いで、水道水で濯いだ。スライドをPannoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を用いてスキャンした。
結果と考察
MNK1及び2は、インスリン調節代謝に関与する正常なマウス組織において発現される
以前に、MNK1及びMNK2 mRNAが肝臓、骨格筋、及び心臓において発現されることが示されている。本発明者らは、肝臓での発現を確認することに加えて、MKNK1及びMKNK2 mRNA分子が脂肪組織でも発現することを示している(図1A参照)。免疫ブロット分析は、肝臓、骨格筋、及び心筋、ならびに脂肪組織におけるMNK1タンパク質の発現を明らかにした(図1B)。
MNK1及び2は、インスリン調節代謝に関与する正常なマウス組織において発現される
以前に、MNK1及びMNK2 mRNAが肝臓、骨格筋、及び心臓において発現されることが示されている。本発明者らは、肝臓での発現を確認することに加えて、MKNK1及びMKNK2 mRNA分子が脂肪組織でも発現することを示している(図1A参照)。免疫ブロット分析は、肝臓、骨格筋、及び心筋、ならびに脂肪組織におけるMNK1タンパク質の発現を明らかにした(図1B)。
脂肪細胞分化中のMNK2の発現を調べるために、広範に使用される脂肪細胞分化モデルである3T3−L1線維芽細胞を使用して、転写因子PPARγ、C/EBPα、及びSREBP1c、ならびにグルコース及び脂肪酸輸送体GLUT4及びCD36などの標準マーカーの発現を分析し、分化プロトコルの有効性を確認した(図1C)。MNK2 mRNAのレベルは、分化プロトコルの誘導後に急速に上昇し、1日で3倍のレベル(他のマーカーの最も早いものと少なくとも同じ速さ)であった(図1D)。この結果は、MNK2が脂肪細胞分化の初期に役割を果たすことを示す。MNK2 mRNAレベルは、6日目までにほぼ分化前レベルまで低下した。対照的に、MKNK1 mRNAレベルは、この期間にほんの少し増加した。更なる研究(図1E参照)では、脂肪生成に関与する主要遺伝子の大部分の出現の前に(C/EBPβ以外に)、MNK1ではなくMNK2が3T3−L1前脂肪細胞の脂肪細胞への分化の間、非常に早く上方制御されることが見出された。
MNK2−KOマウスは、HFD誘発性脂肪増加及びインスリン抵抗性の指標に対して保護されている
野生型(WT)マウスと比較したMNK1ノックアウト(KO)またはMNK2−KOマウスの、正常食(飼料食)と比較した高脂肪食(HFD)に対する応答を調べて、MNK−1及びMNK−2の役割を決定した。飼料食と比較して、野生型(WT)C57Bl6/JマウスにHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加した(図2A〜2C)。高脂肪摂取MNK1−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の身体及び性腺重量の増加を示した(図2A〜2C)。対照的に、同型のMNK2−KOマウスに同じHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加がより小さくなった。WTマウスでは、HFDもまた、グルコース及びインスリンの循環レベルの顕著な増加を引き起こした(それぞれ図2D、2E)。そのような増加は、HFDのMNK1−KO動物及びMNK2−KO動物の両方において顕著に低下し、HFDの有害作用の減弱を示した。とりわけ、飼料食では、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、WTマウスの体重、性腺脂肪重量、基礎グルコース及びインスリンレベルと同様のものを有した。野生型対照群と比較して、MNK−KOマウスの食物摂取量の差は観察されなかった。
野生型(WT)マウスと比較したMNK1ノックアウト(KO)またはMNK2−KOマウスの、正常食(飼料食)と比較した高脂肪食(HFD)に対する応答を調べて、MNK−1及びMNK−2の役割を決定した。飼料食と比較して、野生型(WT)C57Bl6/JマウスにHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加した(図2A〜2C)。高脂肪摂取MNK1−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の身体及び性腺重量の増加を示した(図2A〜2C)。対照的に、同型のMNK2−KOマウスに同じHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加がより小さくなった。WTマウスでは、HFDもまた、グルコース及びインスリンの循環レベルの顕著な増加を引き起こした(それぞれ図2D、2E)。そのような増加は、HFDのMNK1−KO動物及びMNK2−KO動物の両方において顕著に低下し、HFDの有害作用の減弱を示した。とりわけ、飼料食では、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、WTマウスの体重、性腺脂肪重量、基礎グルコース及びインスリンレベルと同様のものを有した。野生型対照群と比較して、MNK−KOマウスの食物摂取量の差は観察されなかった。
インスリン抵抗性の恒常性モデル評価(HOMA−IR)は、インスリン抵抗性の指標として広く使用され、それは、血中インスリン及びグルコース値から計算される(Matthewsら、1985)。HOMA−IRは、WT/HFDマウスにおいて上昇した(図2F)。しかしながら、MNK2−KO/HFDマウスでは、飼料食摂取動物と比較して、HOMA−IRのはるかに少ない増加が観察され、MNK2−KO動物が、インスリン抵抗性などのHFDの有害作用に対して大きく保護されていることを示した。MNK1−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の重量及び脂肪増加を示すが、それらは、より低い血中インスリン及びグルコース値、したがって、WT/HFDマウスよりも良好なHOMA−IRを示した(図2D〜2F)。
HFDのWTマウスでは、脂肪細胞のサイズは、細胞面積によって評価されるように、飼料食のものと比較して実質的に増加した(1.7倍;図3A)。これらの細胞が大体球状であると仮定すると、これは、脂肪細胞体積の約3倍の増加になる。これと一致して、飼料食摂取マウスと比較して、HFD摂取WTの脂肪細胞の観察された数において対応する減少が存在した(図3B)。対照的に、飼料食摂取対照群と比較した場合、MNK2−KO/HFDマウスにいて脂肪細胞のサイズの増加はなかった(図3A、3B)。これは、これらの動物がHFDに置かれるときに、脂肪細胞の脂質貯蔵における起こり得る欠陥を示唆する。興味深いことに、脂肪細胞のサイズは、WT対照群よりもMNK2/飼料食動物でより大きいことが見出され、理論に縛られることは望まないが、これは、MNK2−KOマウスにおける脂肪生成の欠損の存在を示し得るため、より少ない脂肪細胞が存在し、その結果、それぞれがより大きくなる。脂肪細胞サイズがMNK2−KOマウスにおけるHFDで増加しなかったという観察は、高脂肪摂食MNK2−KOマウスの体重増加の減少に寄与する可能性が高い。
MNKは、脂肪細胞の分化に必要とされる
WT/HFD対照群と比較したMNK2−KO/HFDマウスで観察された脂肪組織の少ない増加、及び脂肪細胞分化中のMNK2の発現増加(図1C)は、MNK2が細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすか否かの試験を促した。この目的のために、3T3−L1細胞を、標準プロトコルを用いて脂肪細胞に分化させ、脂質含量を評価し、PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4、及びCD36に対するmRNAなどの脂肪細胞マーカーを評価することによって分化を監視した。
WT/HFD対照群と比較したMNK2−KO/HFDマウスで観察された脂肪組織の少ない増加、及び脂肪細胞分化中のMNK2の発現増加(図1C)は、MNK2が細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすか否かの試験を促した。この目的のために、3T3−L1細胞を、標準プロトコルを用いて脂肪細胞に分化させ、脂質含量を評価し、PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4、及びCD36に対するmRNAなどの脂肪細胞マーカーを評価することによって分化を監視した。
MNK1及びMNK2の両方の活性の広く使用されている阻害剤、CGP57380(Tschoppら、2000)の、3T3−L1細胞の分化に対する効果を調べた。用量応答試験を、真核生物翻訳開始因子4E(eIF4E)のリン酸化を読取りとして用いて評価するように、MNK機能を遮断するために必要とされるCGP57380の濃度を決定するために行った。MNKは、eIF4Eをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼであり、したがって、eIF4E(P−eIF4E)のリン酸化は、MNK生物活性の直接の読み出しを提供する。結果は、20μMのCGP57380が効果的であり、3T3−L1細胞におけるMNK活性をほぼ完全に遮断することを示した(図3C)。更に、図3Dに示すように、20μのMCGP57380は、分化プロトコルに供された3T3−L1細胞への脂質の蓄積を阻害した。
脂質蓄積の阻害が脂肪生成分化に関与する他の遺伝子の発現の変化を反映するかどうかを研究するために、PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4、及びCD36に対するmRNAレベルを調べた。図3Eに示すように、CGP57380は、CGP57380の非存在下で分化された3T3−L1細胞と比較して、分化プロトコルの3日目及び6日目の両方でこれらの遺伝子の全ての誘導を実質的に遮断した。これらのデータは、MNKが3T3−L1細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすこと、及びインビボでの脂肪細胞分化においても役割を果たす可能性があることを示し、図3A及び3Bに示される脂肪細胞のサイズ及び数に対するMNKの役割を確認する。
MNK2−KO/HFDマウスは、肝臓脂質蓄積の増加を示さない
HFDのWT動物と比較して、MNK2−KOマウスで観察された脂肪組織の増加の減弱を考慮して、食事からの余分な脂質負荷が肝臓に転用され、そこの脂肪蓄積に寄与する可能性があるかどうかを調べる調査を行った。HFD MNK2−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の肝臓重量を示した(データ示さず)。HFDのWT及びMNK2−KOマウスの総肝脂質レベルは、同様であった(データ示さず)。これらのデータは、HFD中の余分な脂質がMNK2−KOマウスの肝臓に転嫁されていないことを示している。
HFDのWT動物と比較して、MNK2−KOマウスで観察された脂肪組織の増加の減弱を考慮して、食事からの余分な脂質負荷が肝臓に転用され、そこの脂肪蓄積に寄与する可能性があるかどうかを調べる調査を行った。HFD MNK2−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の肝臓重量を示した(データ示さず)。HFDのWT及びMNK2−KOマウスの総肝脂質レベルは、同様であった(データ示さず)。これらのデータは、HFD中の余分な脂質がMNK2−KOマウスの肝臓に転嫁されていないことを示している。
MNK−KOマウスは、HFDのWTマウスと比較してグルコース耐性の改善を示す
WT及びMNK2−KO動物におけるグルコース耐性に対するHFDの作用を直接評価するために、グルコース負荷試験(GTT)を行った。飼料食摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスは、GTTにおいて飼料食摂取WT動物と同様の応答を示し、MNKが正常(飼料食)条件下でグルコース耐性に影響しないことを示した。しかしながら、MNK1−KO及びMNK2−KO/HFDマウスは、WT/HFDマウスと比べて、グルコース投与後、常に著しく低い血中グルコース値を示し、グルコース処理を調節することにおけるMNK1及びMNK2の役割(図4A、4B)、したがって、より高いグルコース耐性を示した。したがって、これらの結果から、MNK1またはMNK2のいずれかのノックアウトは、HFD誘導性のグルコース不耐性に対してマウスを保護するように思われる。
WT及びMNK2−KO動物におけるグルコース耐性に対するHFDの作用を直接評価するために、グルコース負荷試験(GTT)を行った。飼料食摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスは、GTTにおいて飼料食摂取WT動物と同様の応答を示し、MNKが正常(飼料食)条件下でグルコース耐性に影響しないことを示した。しかしながら、MNK1−KO及びMNK2−KO/HFDマウスは、WT/HFDマウスと比べて、グルコース投与後、常に著しく低い血中グルコース値を示し、グルコース処理を調節することにおけるMNK1及びMNK2の役割(図4A、4B)、したがって、より高いグルコース耐性を示した。したがって、これらの結果から、MNK1またはMNK2のいずれかのノックアウトは、HFD誘導性のグルコース不耐性に対してマウスを保護するように思われる。
インスリンの作用を評価するために、飼料食またはHFDのWT、MNK1−KO、及びMNK2−KOマウスをインスリンで処理して、これらの動物の、血中グルコース値を低下させる能力を評価した。インスリンは、MNK1−KOまたはMNK2−KO/HFD動物において、WT/HFDマウスよりも血中グルコースをより効果的に低下させ、インスリンがMNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスにおいてより効率的に作用することを示した(図4C)。実際に、MNK1−KOまたはMNK2−KO/HFDマウスにおけるインスリンによって引き起こされる血中グルコース値の低下率は、飼料食摂取動物で観察されたものと同様である。これらのデータは、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスがそれぞれ、HFD誘発性のインスリン抵抗性に対してかなりの程度まで保護されていることを示している。
MNK2−KOマウスは、HFDのWTマウスよりも良好なインスリンシグナル伝達を示す
脂肪組織におけるMNK1及びMNK2活性の相対レベルを評価するために、eIF4E(MNK1及びMNK2の共通基質)のリン酸化を調べた。HFDは、WTマウスの脂肪組織におけるリン酸化(P)−eIF4Eのわずかな増加を引き起こした(図5A)。MNK2−KOマウスは、両方の食餌条件下でP−eIF4Eの実質的な低下を示したが、MNK1−KOマウスは、飼料食のWT動物と比較して、飼料食でP−eIF4Eに変化を示さなかった。これは、MNK2が脂肪組織における最も活性なMNKアイソフォームであることを実証する。MNK1−KOマウスでは、P−eIF4Eは、飼料食摂取マウスよりもHFD摂取の脂肪組織においてより低かった(図5A)。
脂肪組織におけるMNK1及びMNK2活性の相対レベルを評価するために、eIF4E(MNK1及びMNK2の共通基質)のリン酸化を調べた。HFDは、WTマウスの脂肪組織におけるリン酸化(P)−eIF4Eのわずかな増加を引き起こした(図5A)。MNK2−KOマウスは、両方の食餌条件下でP−eIF4Eの実質的な低下を示したが、MNK1−KOマウスは、飼料食のWT動物と比較して、飼料食でP−eIF4Eに変化を示さなかった。これは、MNK2が脂肪組織における最も活性なMNKアイソフォームであることを実証する。MNK1−KOマウスでは、P−eIF4Eは、飼料食摂取マウスよりもHFD摂取の脂肪組織においてより低かった(図5A)。
インスリンは、グルコーストランスポーターGLUT4の、細胞膜への転座を介して、脂肪、特に筋肉などの組織へのグルコースの取り込みを刺激する。この効果は、インスリンの代謝作用の多くと同様に、ホスファチジルイノシトイド3−キナーゼ(PI3−キナーゼ)の下流でリン酸化され、活性化されるタンパク質キナーゼB(PKB、Aktとも呼ばれる)を介して媒介される。インスリンの、この経路を活性化する能力を評価するために、飼料食またはHFDを摂取したWT及びMNK2−KOマウスにインスリンを投与し、30分後に屠殺してインスリン抵抗性を試験した。試料を血液から採取し、脂肪組織及び骨格筋(腓腹筋)も採取した。組織試料を、インスリンシグナル伝達の様々なパラメータについて免疫ブロットにより分析した。WTマウスにおいて、インスリン投与は、脂肪組織(図5B)及び筋肉(図5B、5C)におけるその活性化に関与する主部位であるSer473及びThr308におけるPKBのリン酸化の増加を引き起こした。これらの効果は、HFDを摂取したWT動物で減少し、インスリンの効果に対する部分的な抵抗性を示した。飼料食のMNK1−KOまたはMNK2−KOマウスにおいて、インスリン誘発性PKBリン酸化は、飼料食のWT動物と同様であったが、インスリン誘発性PKBリン酸化は、HFD上のMNK1−KOまたはMNK2−KOマウスにおいて、WT/HFD動物より高く、インスリン抵抗性がMNK−KO/HFDマウスの両方において減弱されたことを示した(図5B、5C)。
総GLUT4タンパク質の増加が、WTまたは飼料食摂取MNK2−KO動物のいずれかと比較して、MNK2−KO/HFDマウスの脂肪組織で観察された(図5D)。GLUT4は、このホルモンに応答してグルコースのインスリン応答性組織への取り込みを媒介する、重要なインスリン調節されたグルコース輸送体である。インスリンは、PKBを含むシグナル伝達経路を介して細胞膜へのその転座を促進する。したがって、WT/HFDマウスと比較して、MNK2 KO/HFD動物の改善されたグルコース耐性は、改善されたインスリン感受性及び/またはシグナル伝達と、より高いレベルのGLUT4タンパク質との組み合わせを含む可能性が高い。Glut4 mRNAレベルは、WT動物と比較して、飼料食またはHFDのMNK2−KO動物の脂肪組織においてわずかに低かった(データ示さず)。GLUT4タンパク質のレベルは、野生型動物と比較して、MNK1−KO動物の脂肪においてより低い傾向があった(図5D)。骨格筋において、eIF4Eリン酸化は、MNK2−KOマウスでは低下したが、MNK1−KO動物では低下せず(図5E)、MNK2がこの組織において最も活性なMNKアイソフォームであるが、MNK1も寄与することを示す。インスリン誘発性PKBリン酸化は、飼料食と比較してHFDを摂取したWTマウスでは減少したが、それは、MNK1−KOまたはMNK2−KO動物では損なわれなかった。GLUT4タンパク質のレベルは、MNK2−KOマウス、特にHFDのマウスの筋肉においてより高い傾向があったが、その差は、有意性に達しなかった(図5E〜5F)。したがって、MNK1及びMNK2は両方とも、HFD摂取マウスの脂肪組織及び筋肉におけるインスリンシグナル伝達を損なう役割を果たす。
MNK2−KOマウスは、HFD誘発性脂肪炎症に対して保護される
体重増加及びインスリン抵抗性に加えて、HFDを消費する結果として、炎症誘発性M1マクロファージで浸潤される、特に脂肪組織における炎症がある。飼料食またはHFDのいずれかを摂取していたWT、MNK1−KO、及びMNK2−KOマウスからの脂肪組織におけるマクロファージ及びM1−極性化マクロファージのマーカーを調べた。WT/HFD及びMNK1−KO/HFDマウスは、WT/HFD動物と比較して、Cd68及びF4/80などのマクロファージマーカーのためのmRNAレベルにおいて増加を示した(図6A、6B)。MNK2−KO/HFDマウスにおける変化したマクロファージマーカーを考慮して、炎症誘発性(M1マクロファージ)マーカーCd11c及びTnfα(図6C、6D)、ケモカイン受容体Ccr2及びCcr5(マクロファージ輸送において重要;データ示さず)、ならびに細胞移動を可能にする細胞外マトリックスの消化に関与するMmp12(マトリックスメタロプロテイナーゼ12;データ示さず)及びAdam8(データ示さず)。著しく対照的に、MNK1−KO/HFDマウスではなくMNK2−KO/HFDマウスは、飼料食での同じ動物と比較して、急減した炎症を示し、Cd68、F4/80、Tnfα、Cd11c、MhcII mRNAs(図6A〜6D)、及びCcr2、Ccr5、Mmp12、またはAdam8 mRNA(データ示さず)の増加がほとんどない、またはまったくなかった。まとめると、これらのデータは、HFDでは、MNK2−KOマウスの脂肪組織は、(Cd68及びF4/80 mRNAの正常な顕著な増加がないことに基づいて)マクロファージで大きく浸潤されることはない、またはCd11c及びTnfαのレベルの著しい鈍化によって示されるように、炎症誘発性M1マクロファージにおける増加を示す。脂肪細胞MHCIIは、免疫細胞をHFD摂食動物における脂肪組織に誘引する際に重要な役割を果たすことが報告されているため、MNK2−KOマウスにおけるMhcIIの増加の欠如が興味深い。更に、飽和脂肪が多い食事は、c−junアミノ末端キナーゼ(JNK)の活性化を介してインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。しかしながら、MNKは、JNKによって活性化されず、HFD−MNK2−KOマウスで観察された表現型におけるJNKの役割を排除する(Waskiewiczら、1997)。
体重増加及びインスリン抵抗性に加えて、HFDを消費する結果として、炎症誘発性M1マクロファージで浸潤される、特に脂肪組織における炎症がある。飼料食またはHFDのいずれかを摂取していたWT、MNK1−KO、及びMNK2−KOマウスからの脂肪組織におけるマクロファージ及びM1−極性化マクロファージのマーカーを調べた。WT/HFD及びMNK1−KO/HFDマウスは、WT/HFD動物と比較して、Cd68及びF4/80などのマクロファージマーカーのためのmRNAレベルにおいて増加を示した(図6A、6B)。MNK2−KO/HFDマウスにおける変化したマクロファージマーカーを考慮して、炎症誘発性(M1マクロファージ)マーカーCd11c及びTnfα(図6C、6D)、ケモカイン受容体Ccr2及びCcr5(マクロファージ輸送において重要;データ示さず)、ならびに細胞移動を可能にする細胞外マトリックスの消化に関与するMmp12(マトリックスメタロプロテイナーゼ12;データ示さず)及びAdam8(データ示さず)。著しく対照的に、MNK1−KO/HFDマウスではなくMNK2−KO/HFDマウスは、飼料食での同じ動物と比較して、急減した炎症を示し、Cd68、F4/80、Tnfα、Cd11c、MhcII mRNAs(図6A〜6D)、及びCcr2、Ccr5、Mmp12、またはAdam8 mRNA(データ示さず)の増加がほとんどない、またはまったくなかった。まとめると、これらのデータは、HFDでは、MNK2−KOマウスの脂肪組織は、(Cd68及びF4/80 mRNAの正常な顕著な増加がないことに基づいて)マクロファージで大きく浸潤されることはない、またはCd11c及びTnfαのレベルの著しい鈍化によって示されるように、炎症誘発性M1マクロファージにおける増加を示す。脂肪細胞MHCIIは、免疫細胞をHFD摂食動物における脂肪組織に誘引する際に重要な役割を果たすことが報告されているため、MNK2−KOマウスにおけるMhcIIの増加の欠如が興味深い。更に、飽和脂肪が多い食事は、c−junアミノ末端キナーゼ(JNK)の活性化を介してインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。しかしながら、MNKは、JNKによって活性化されず、HFD−MNK2−KOマウスで観察された表現型におけるJNKの役割を排除する(Waskiewiczら、1997)。
したがって、結果は、HFDがWTマウスの脂肪組織において広範囲の炎症を誘発するが、MNK2−KOマウスは、HFDの炎症誘発性の作用に対して保護されることを示す。興味深いことに、MNK1−KO/HFDマウスは、インスリン抵抗性及びグルコース不耐性に対する部分的な保護を示すが、それらは、WT/HFD動物と同様の脂肪組織炎症を依然として呈示する。これは、高脂肪摂食に応答するMNK1及びMNK2の異なる役割を明確に示す。しかしながら、保護の根拠が異なるように思われることは注目に値し、MNK1−KOマウスは、それらの保護と同時に、脂肪増加及び炎症の減少を示す一方、MNK2−KOマウスは、WTマウスと同様に、体重及び脂肪組織を増加させるが、それでもなお、インスリン抵抗性に対して保護されている。
マクロファージ生物学
MNK2−KOマウスからのマクロファージを、それらがTNFα及びIL−6などのサイトカインの産出において本質的に欠陥があるかどうかを判断するために評価した。MNK1及びMNK2の両方は、骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるeIF4Eリン酸化に寄与する(データ示さず)。それらの調節特徴と一致して、WT BMDMにおけるリポ多糖(LPS)によって誘発されたeIF4Eの増加は、MNK1−KO細胞において失われた(データ示さず)。野生型またはMNK2−KOマウスからのBMDMを、リポ多糖(LPS)によってインビトロで刺激し、サイトカインmRNAレベルを評価した。LPSは、野生型及びMNK2−KO BMDMのTnfα及びIL−6 mRNAのレベルを同様の程度まで増加させた(データ示さず)。これらのデータは、MNK2−KO BMDMの、LPSに応答し、サイトカインを産出する能力に本質的な欠陥がないことを示す。
MNK2−KOマウスからのマクロファージを、それらがTNFα及びIL−6などのサイトカインの産出において本質的に欠陥があるかどうかを判断するために評価した。MNK1及びMNK2の両方は、骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるeIF4Eリン酸化に寄与する(データ示さず)。それらの調節特徴と一致して、WT BMDMにおけるリポ多糖(LPS)によって誘発されたeIF4Eの増加は、MNK1−KO細胞において失われた(データ示さず)。野生型またはMNK2−KOマウスからのBMDMを、リポ多糖(LPS)によってインビトロで刺激し、サイトカインmRNAレベルを評価した。LPSは、野生型及びMNK2−KO BMDMのTnfα及びIL−6 mRNAのレベルを同様の程度まで増加させた(データ示さず)。これらのデータは、MNK2−KO BMDMの、LPSに応答し、サイトカインを産出する能力に本質的な欠陥がないことを示す。
LPSとIFNγとの組み合わせによる長期間(24時間)の効果を調べて、炎症誘発性M1表現型に対するBMDMの極性化を評価した。WT及びMNK2−KO BMDMは、同様に応答し、MNK2が、BMDMによるこれらの炎症誘発性サイトカインの産出に必要とされないことを示した(データ示さず)。
MNK2−KO/HFDマウスの血漿において、2つの抗炎症マーカー、Il−10及びIl−5のmRNAレベルの有意な増加が、WT/HFDマウスと比較して観察された(図7A、7B)。WT及びMNK2−KOマウスからのBMDMの、M2抗炎症性表現型に分極する固有の能力を調べた。興味深いことに、MNK2−KOマウスからのBMDMは、WT BMDMと比較して、制御条件下でIL−10及びPparγレベルの上昇を示し、調べられたM2極性化の全てのマーカーは、IL−4での24時間の刺激後に増加した(図7C−7F)。リン酸化されたeIF4Eに関するデータは、MNK2がマクロファージにおける主アイソフォームであることを示す(データ示さず)。まとめると、このデータは、MNK2−KOマウスからのマクロファージが、抗炎症性表現型に対するより高い傾向を有することを示唆する。
高脂肪摂取は、野生型マウスではなくMNK2−KOにおいてNrf2発現を誘導する
核因子赤血球2関連因子2(Nrf2)は、広範な脂肪酸酸化から生じ得る酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、また、メタボリックシンドロームの発症を防ぐことも報告される。MNK2−KOマウスがメタボリックシンドロームの指標に対する保護を示すことを前提として、WT及びMNK2−KOマウスの肝臓におけるNrf2の発現を調べた。レベルは、飼料食を摂取したマウスにおいて同様であった。Nrf2 mRNAレベルは、HFDを摂取したMNK2−KOマウスで顕著に増加したが、対応する対照動物では増加しなかった(図8A)。肝Nrf2タンパク質レベルも、MNK2−KOマウスにおいて増加を示したが、その変化は、有意に達しなかった。したがって、Nrf2機能の増加を確認するために、よく特徴付けられたNrf2標的遺伝子であるハエムオキシゲナーゼ(haem oxygenase)−1(HO−1)の発現も試験し、それは、Nrf2自体のタンパク質発現と同様のパターンを示した(図8B)。興味深いことに、Nrf2の活性化は、脂肪症を予防すると報告される。Nrf2は、PPARαによって転写的に制御され得るが、しかしながら、HFDのMNK2−KOまたはWTマウスの肝臓では、PPARαレベルの変化は観察されなかった(データ示さず)。
核因子赤血球2関連因子2(Nrf2)は、広範な脂肪酸酸化から生じ得る酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、また、メタボリックシンドロームの発症を防ぐことも報告される。MNK2−KOマウスがメタボリックシンドロームの指標に対する保護を示すことを前提として、WT及びMNK2−KOマウスの肝臓におけるNrf2の発現を調べた。レベルは、飼料食を摂取したマウスにおいて同様であった。Nrf2 mRNAレベルは、HFDを摂取したMNK2−KOマウスで顕著に増加したが、対応する対照動物では増加しなかった(図8A)。肝Nrf2タンパク質レベルも、MNK2−KOマウスにおいて増加を示したが、その変化は、有意に達しなかった。したがって、Nrf2機能の増加を確認するために、よく特徴付けられたNrf2標的遺伝子であるハエムオキシゲナーゼ(haem oxygenase)−1(HO−1)の発現も試験し、それは、Nrf2自体のタンパク質発現と同様のパターンを示した(図8B)。興味深いことに、Nrf2の活性化は、脂肪症を予防すると報告される。Nrf2は、PPARαによって転写的に制御され得るが、しかしながら、HFDのMNK2−KOまたはWTマウスの肝臓では、PPARαレベルの変化は観察されなかった(データ示さず)。
パルミテート誘発性のインスリン抵抗性の治療
インスリン抵抗性のC2C12骨格筋モデルを使用して、パルミテート(レベル高脂肪食に血液中の増加遊離脂肪酸)処理がP−eIF4Eを増加させることが観察され、したがって、パルミテートがMNK酵素を活性化することを示した。更なる実験を、100mMのインスリンで10及び60分間刺激する前に、4mMのパルミテートで16時間処理されたC2C12細胞を用いて行った。細胞のいくつかを3μMのMNK阻害剤、Mnk−I1で更に処理した。結果(図9参照)は、阻害剤がMNK1及びMNK2を不活性化したことを示したが(処理された細胞におけるP−eIF4Eのレベル低下を参照されたい)、インスリンシグナル伝達マーカー、P−PKB308は、MNK阻害剤がパルミテート暴露の間にインスリンシグナリングを回復させることができることを示した。
インスリン抵抗性のC2C12骨格筋モデルを使用して、パルミテート(レベル高脂肪食に血液中の増加遊離脂肪酸)処理がP−eIF4Eを増加させることが観察され、したがって、パルミテートがMNK酵素を活性化することを示した。更なる実験を、100mMのインスリンで10及び60分間刺激する前に、4mMのパルミテートで16時間処理されたC2C12細胞を用いて行った。細胞のいくつかを3μMのMNK阻害剤、Mnk−I1で更に処理した。結果(図9参照)は、阻害剤がMNK1及びMNK2を不活性化したことを示したが(処理された細胞におけるP−eIF4Eのレベル低下を参照されたい)、インスリンシグナル伝達マーカー、P−PKB308は、MNK阻害剤がパルミテート暴露の間にインスリンシグナリングを回復させることができることを示した。
実施例2 MNK1及びMNK2ダブルノックアウト動物の作製、及び高脂肪食(HFD)を用いた研究
WT及びMNK−KOマウスにおける研究
本実施例に記載される研究は、5〜6世代にわたるストックC57Bl/6マウスに対して戻し交配した、実施例1に記載されているようなマウスを用いて行った。次いで、ヘテロ接合MNK1−KO(Mknk1+/−)及びMNK2−KO(Mknk2+/−)マウスを交配して、WT及びMNK1+MNK2ダブルKO(Mknk1−/−;Mknk2−/−;DKO)動物、ならびにMNK1−KO(Mknk1−/−)及びMNK−KO(Mkn2−/−)動物を得た。MNK1及びMNK2のノックアウトは、マウスの発達、生存能力、または生殖能に影響を及ぼさず(Uedaら、2004)、これと一致することが既に報告されており、MNK1及びMNK2のノックアウトの有害作用は、飼料食または高脂肪食を摂取したマウスにおいて観察されなかった。飼料食及びHFDは、実施例1に記載したものと同様であった。この場合、飼料食製剤は、Teklad Global 18%Protein Rodent Diet(Envigo、米国、ウィスコンシン州、マジソン)であり、HFD製剤は、Specialty Feeds Pty Ltd(Diet SF15−095;豪州、西オーストラリア州、グレンフォレスト)から調達した。
WT及びMNK−KOマウスにおける研究
本実施例に記載される研究は、5〜6世代にわたるストックC57Bl/6マウスに対して戻し交配した、実施例1に記載されているようなマウスを用いて行った。次いで、ヘテロ接合MNK1−KO(Mknk1+/−)及びMNK2−KO(Mknk2+/−)マウスを交配して、WT及びMNK1+MNK2ダブルKO(Mknk1−/−;Mknk2−/−;DKO)動物、ならびにMNK1−KO(Mknk1−/−)及びMNK−KO(Mkn2−/−)動物を得た。MNK1及びMNK2のノックアウトは、マウスの発達、生存能力、または生殖能に影響を及ぼさず(Uedaら、2004)、これと一致することが既に報告されており、MNK1及びMNK2のノックアウトの有害作用は、飼料食または高脂肪食を摂取したマウスにおいて観察されなかった。飼料食及びHFDは、実施例1に記載したものと同様であった。この場合、飼料食製剤は、Teklad Global 18%Protein Rodent Diet(Envigo、米国、ウィスコンシン州、マジソン)であり、HFD製剤は、Specialty Feeds Pty Ltd(Diet SF15−095;豪州、西オーストラリア州、グレンフォレスト)から調達した。
HFDでの体重増加
飼料食では、WT及びDKOマウスは、研究の16週間の期間にわたって同様の程度まで体重を増加させたが(データは示されていない)、4週齢では、MNK1−KOは、MNK2−KOまたはWTマウスよりもわずかに重かった(データ示さず)。GTTは、15〜16週目に行われたため、その時点以降に得られたデータは、マウスが直面した騒乱のために完全に信頼できるものではない。
飼料食では、WT及びDKOマウスは、研究の16週間の期間にわたって同様の程度まで体重を増加させたが(データは示されていない)、4週齢では、MNK1−KOは、MNK2−KOまたはWTマウスよりもわずかに重かった(データ示さず)。GTTは、15〜16週目に行われたため、その時点以降に得られたデータは、マウスが直面した騒乱のために完全に信頼できるものではない。
カロリー過負荷に対する動物の応答を試験するために、マウスは、離乳時(すなわち、4週齢から)から更に16週間(20週齢まで)、飼料食(対照群)または高エネルギー高脂肪食(HFD)を与えられた。HFDでは、WTマウスは、大幅により多く体重が増加した(HFDで、11週間または15週間で25または28g)。重要なことに、かつ実施例1に記載された観察と一致して、MNK2−KOマウスは、HFDにおいてWT対照群よりも実質的により少なく体重が増加し(図10)、MNK2の喪失がHFDでの体重増加に対して保護することを確認した。しかしながら、実施例1に記載された結果とは対照的に、この場合のMNK1−KOマウスは、実際に、WT対照群と同様に体重が増加し(図10)、この差異の理由は、これらの動物が以前に使用された動物と遺伝的に同一でないという事実、使用されたHFDの相違、または他の要因にあるかもしれない。DKOマウスでは、動物が15週までにMNK2−KOマウスよりもわずかに大きな体重増加を示したことが見出されたが、その増加は、WTまたはMNK1−KO動物に関して見られるものよりもまだ少ない(図10)。これは、両方のMNKのノックアウトが、部分的な保護を提供する各MNKアイソフォーム単独のKOよりも、体重増加に対するより大きな保護を提供すると推測されたため、予想外であった。したがって、データは、MNK1及びMNK2を無効にすることが、MNK2単独の損失よりも大きな利益をもたらさず、実際に、体重増加を防止することに関して、それほど有利でない可能性があることを示す。
GTTデータ
グルコース負荷試験を実施例1に記載したように行って、HFD摂食動物がグルコース不耐性(この設定では一般にインスリン抵抗性によって引き起こされる)を発症したかどうかを評価した。飼料食またはHFDのいずれかで11週間後、6時間の絶食後にグルコース負荷試験(GTT)を行った。空腹時グルコース濃度を、マウスに25%D−グルコース溶液(2g/kg体重;Sigma−Adrich、豪州)を腹腔内(ip)注射する前に、尾の先端から血液した出血から測定し、血中グルコース濃度をFreestyle Liteグルコメーター(Abbott、豪州、ニューサウスウェールズ州、マッコリ―パーク)を使用して腹腔内注射後15、30、60、及び120分に測定した。HFDを摂取したマウスは、グルコース耐性障害を示す。実施例1に記載の研究が、HFD摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスが、対応するWT動物よりも良好なグルコース耐性を示すということを示したことを前提として、MNK1+2−DKOマウスは、更に良好なグルコース耐性を示すであろうと予測された。しかしながら、図11に示すように、これは、事実ではない。実際に、MNK1−KOマウスは、WT−HFDマウスより良好なグルコース耐性を示さないことが見出された。更に、グルコースのボーラス投与後、HFD摂取MNK−DKOマウスにおいて、血漿グルコース値は、これらの遺伝子型のいずれの飼料食摂取マウスの状況と同様に、120分までにほぼベースラインまで戻った。したがって、MNK2−KOマウス(実施例1参照)と同様に、DKO動物は、これらのデータの曲線下面積(AUC)を計算することによって見られるように(データ示さず)、HFDを摂取したWTマウスより良好なグルコース耐性を示す。AUCの評価はまた、MNK1−KO/HFDマウスが、実際に、WT/HFD動物より劣り、MNK−DKO/HFDマウスよりはるかに劣るグルコース耐性を示し、グルコース濃度がMNK1−KO/HFDマウスにおいて著しく高いままであったことを明らかにした(図11)。
グルコース負荷試験を実施例1に記載したように行って、HFD摂食動物がグルコース不耐性(この設定では一般にインスリン抵抗性によって引き起こされる)を発症したかどうかを評価した。飼料食またはHFDのいずれかで11週間後、6時間の絶食後にグルコース負荷試験(GTT)を行った。空腹時グルコース濃度を、マウスに25%D−グルコース溶液(2g/kg体重;Sigma−Adrich、豪州)を腹腔内(ip)注射する前に、尾の先端から血液した出血から測定し、血中グルコース濃度をFreestyle Liteグルコメーター(Abbott、豪州、ニューサウスウェールズ州、マッコリ―パーク)を使用して腹腔内注射後15、30、60、及び120分に測定した。HFDを摂取したマウスは、グルコース耐性障害を示す。実施例1に記載の研究が、HFD摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスが、対応するWT動物よりも良好なグルコース耐性を示すということを示したことを前提として、MNK1+2−DKOマウスは、更に良好なグルコース耐性を示すであろうと予測された。しかしながら、図11に示すように、これは、事実ではない。実際に、MNK1−KOマウスは、WT−HFDマウスより良好なグルコース耐性を示さないことが見出された。更に、グルコースのボーラス投与後、HFD摂取MNK−DKOマウスにおいて、血漿グルコース値は、これらの遺伝子型のいずれの飼料食摂取マウスの状況と同様に、120分までにほぼベースラインまで戻った。したがって、MNK2−KOマウス(実施例1参照)と同様に、DKO動物は、これらのデータの曲線下面積(AUC)を計算することによって見られるように(データ示さず)、HFDを摂取したWTマウスより良好なグルコース耐性を示す。AUCの評価はまた、MNK1−KO/HFDマウスが、実際に、WT/HFD動物より劣り、MNK−DKO/HFDマウスよりはるかに劣るグルコース耐性を示し、グルコース濃度がMNK1−KO/HFDマウスにおいて著しく高いままであったことを明らかにした(図11)。
したがって、MNK1の喪失は、HFD誘発性グルコース不耐性に対して一貫して保護しないと思われる。これは、なぜMNK1及びMNK2の喪失が、HFD摂取マウスのGTTにおけるそれらの能力に関して、MNK2単独の喪失よりも更なる利益を与えないのかを説明するのに役立つかもしれない。
まとめると、この実施例で提供されたデータは、MNK2をノックアウトすることが、HFDでのグルコース耐性の改善(代謝の健康)に関して、一貫して有益であることを示す。対照的に、MNK1の喪失の効果は、おそらく、正確な遺伝的背景及び/または食餌の正確な成分よって変化すると思われる。更に、両方のMNKのノックアウトは、MNK2単独の損失より優れた効果を提供しない。したがって、本開示に従って前糖尿病を治療する方法において、両方の酵素に影響を与える二重阻害剤ではなく、MNK2の特異的阻害剤を使用する方が、はるかに信頼性が高く、有効であろう。
実施例3 3T3−L1細胞におけるeIF4Eリン酸化に対するMNK2特異的阻害の効果
3T3−L1細胞における研究
実施例1で説明されたように、正常飼料食でのMNK2−KOマウスは、同量の性腺脂肪組織の同じ量を含有するが、そのような組織は、より少なく、より大きい脂肪細胞(脂肪細胞)を有することが見出された。これは、脂肪細胞の産出(すなわち、脂肪細胞の分化)における欠陥を示唆する。HFDでは、脂肪細胞は、通常、より大きくなり、動物がより多くの脂肪を貯蔵し、より重くなることを可能にする。しかしながら、MNK2−KOマウスでは、脂肪細胞は、HFDで大きくならず、なぜこれらのマウスがWT/HFDマウスほど重くならないのかを説明する可能性が高い。理論に縛られることを望まないが、この更なるサイズ増加の欠如は、(i)MNK2−KOマウスにおけるより大きな脂肪細胞が貯蔵容量に達し、それらの脂肪含有量を増加させることができないという事実、及び/または(ii)そのような細胞の、脂肪を貯蔵する本来の能力が損なわれるということ、を反映し得る。
3T3−L1細胞における研究
実施例1で説明されたように、正常飼料食でのMNK2−KOマウスは、同量の性腺脂肪組織の同じ量を含有するが、そのような組織は、より少なく、より大きい脂肪細胞(脂肪細胞)を有することが見出された。これは、脂肪細胞の産出(すなわち、脂肪細胞の分化)における欠陥を示唆する。HFDでは、脂肪細胞は、通常、より大きくなり、動物がより多くの脂肪を貯蔵し、より重くなることを可能にする。しかしながら、MNK2−KOマウスでは、脂肪細胞は、HFDで大きくならず、なぜこれらのマウスがWT/HFDマウスほど重くならないのかを説明する可能性が高い。理論に縛られることを望まないが、この更なるサイズ増加の欠如は、(i)MNK2−KOマウスにおけるより大きな脂肪細胞が貯蔵容量に達し、それらの脂肪含有量を増加させることができないという事実、及び/または(ii)そのような細胞の、脂肪を貯蔵する本来の能力が損なわれるということ、を反映し得る。
脂肪細胞分化におけるMNK2の役割を研究するために、3T3−L1細胞を実施例1に記載したのと同様の方法で使用した。3T3−L1線維芽細胞は、イソブチルメチルキサンチン(IBMX、500μM;cAMPを上昇させる)、インスリン(350nM)、デキサメタゾン(0.5μM;ステロイド)、及びロシグリタゾン(2μM;転写因子PPARγを刺激する)の組み合わせでインキュベートされた時、脂肪細胞に分化する。この刺激の「カクテル」に応答して、これらの細胞は、まずクローン増殖を受け、続いて、転写因子のカスケードの誘導が後続し、脂肪生成に関与する遺伝子の発現を引き起こす。
結果(図12に示される)は、Mnk2 mRNAが分化カクテルの添加後に非常に急速に誘導される(>3倍×3時間、Mnk2 mRNA発現が低下してから約6時間まで持続する)ことを明らかにし、それを脂肪生成において役割を果たすように位置付けた。実施例1では、MNK阻害剤、CGP57380が、C/EBPα、PPARγ、及びSREBP1c(脂質貯蔵に関与する遺伝子の発現を促進する)などの重要な転写因子の誘導を損なうことが示された。また、CGP57380がグルコース、ならびに脂質トランスポーターGLUT4及びCD36の発現を阻害することも見出され、なぜ脂肪貯蔵がインビボでMNK2−KO脂肪細胞において制限されるのかを少なくとも部分的に説明することができる。ここでは、MNKも阻害する別の、別の全く異なる化合物、すなわち、セルコスポラミドを試験するための研究を行った。図13に示すように、セルコスポラミドは、PPARγなどの遺伝子の誘導(図13A)及び脂質蓄積の減少(図13B)も損なう。
しかしながら、CGP57380及びセルコスポラミドは、MNKに加えて他のタンパク質キナーゼを阻害し、非常に強力なMNK阻害剤ではなく(Bainら、2007;Konicekら、2011)、例えば、P−eIF4Eを強く阻害するためには≧20μMの濃度で使用されなければならない。その結果、更なる阻害化合物、MNK−I1(Beggsら、2015)が研究された。MNK−I1は、CGP57380及びセルコスポラミドとは構造的に異なり、はるかにより特異的であり、CGP57380によって影響を受け追加のキナーゼを阻害しない(Beggsら、2015)。それはまた、はるかにより強力であり、3T3−L1細胞におけるMNK活性を、はるかに低い濃度(3μM;図14A、14B参照;CGP57380と比較して、同程度のp−eIF4Eの阻害を見るために50μMが必要とされた(図3c参照))で強く阻害する。重要なことに、細胞が、分化を受けるために細胞を少なくとも3日間インキュベートされなければならないことを前提として、MNK−I1のP−eIF4Eに対する効果は、少なくともこの期間持続する。
MNK−I1は、転写因子Cebpα、Cebpβ、Cebpδ、及びPparγ、ならびに脂肪酸シンターゼ及びアセチル−CoAカルボキシラーゼ(Fas及びAcc;脂質生成の重要な酵素)、ならびに脂質輸送体Cd36を含む、研究された脂肪生成遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された(図15A参照)。それはまた、オイルレッドO染色(データ示さず)または直接トリグリセリドアッセイ(図15B)によって判断されるように、脂質蓄積を遮断した。MNK−I1の効果が完全ではない(すなわち、総阻害ではない)という事実は、脂肪細胞数がMNK2−KOマウスにおいて減少したが、完全になくならないという観察と一致する。これはまた、MNK−2 KOマウスは、対照食餌において同様の総脂肪量を示すが、HFDを摂取した場合、それらの脂肪増加が大きく減少するという重要な知見と一致する。これは、患者の体重増加が減少または逆転することを意味するため、重要な臨床的意味を有するが、これは、脂肪組織の極度の喪失につながらない。
更なる研究において、MNK−I1と同様の一連の化合物を生成し、3T3−L1細胞におけるMNKを阻害するそれらの能力について試験した。化合物の構造を以下の表6に示す。eIF4Eは、MNKのみによってリン酸化されるため、そのリン酸化状態は、細胞内MNK活性の信頼できる読み出しである。新しい化合物のいくつかは、これらの細胞におけるeIF4Eリン酸化を阻害し、それらがMNKに対して活性であることを示した(表6)。特に、MNK−I2は、3T3−L1細胞においてP−eIF4Eを強く阻害し(図14A参照)、それが強力なMNK阻害剤であることを示す。更に、MNK1対MNK2に対するMNK−I1及びMNK−I2の相対的効果を評価するために、MNK1−KOまたはMNK2−KO動物からのマウス胚線維芽細胞(MEF)を使用した。MNK1−KO MEFにおいて、MNK−I2は、試験した全ての濃度でP−eIF4Eレベルをほとんど完全に阻害した(最低0.1μM)。これは、MNK−I1の効果と同様である(図16A)。対照的に、eIF4Eリン酸化がMNK1に依存するMNK2−KO細胞では、MNK−I2は、MNK−I1よりも弱い阻害効果を有し、それがMNK−I1よりもMNK1に対する低い活性を有することを示す(図16B)。したがって、これらの結果は、MNK1よりもMNK2に対するMNK−I2阻害剤の選択性を示す。MNK2は、3T3−L1細胞及び脂肪組織における主要なMNKである(Mooreら、2016)。
追加の研究では、3T3−L1細胞における分化マーカーの誘導に対するMNK−I2阻害剤の効果を評価するために試験を行った。MNK−I2が、研究された脂肪生成プログラムにおける遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された(図17A)。MNK−I2の効果の大きさは、MNK−I1のそれと同様であるか、場合によっては、より大きかった(図15Aと17Aとを比較)。これらの結果は、それらが、MNK2選択的阻害剤、例えば、MNK1+MNK2阻害剤CGP57380及びMNK−I1もまた、脂肪生成を損なうことを示し、MNK2が脂肪組織における重要なMNK2アイソフォームであるという結論を支持するという点において重要である。
したがって、KOマウス試験から得られたデータ(実施例2参照)及び3T3−L1細胞を用いてインビトロで実施された実験に基づいて(実施例3参照)、MNK−2選択的阻害剤は、かなり有望であり、MNK1及びMNK2の阻害剤よりも、前糖尿病対象の治療において有益である可能性が高い。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」及び「含む(include)」という語及び「含んでいる(comprising)」及び「含んでいる(including)」などの変形は、任意の他の整数または整数の群の除外ではなく、記載された整数または整数の群の包括を暗示すると理解されるであろう。
本明細書にある任意の先行技術への言及は、そのような先行技術が共通の一般知識の一部を形成するといういかなる形態の示唆の認知ではなく、そのように取られるべきではない。
本発明は、その使用において、記載された特定の用途に限定されないということは、当業者によって理解されるであろう。また、本発明は、本明細書に記載もしくは図示される特定の要素及び/または特徴に関して、その好ましい実施形態において限定されない。本発明は、開示された1つまたは複数の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によって記載され、定義された本発明の範囲から逸脱することなく多数の再構成、修正、及び置換が可能であることが理解されるであろう。
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本開示は、高脂肪食の作用、特に前糖尿病を阻害することに関する。特定の形態において、本開示は、MAPキナーゼ相互作用キナーゼの発現または機能を阻害することに関する。
優先権書類
本出願は、2016年3月31日出願の「Method of inhibiting high fat diet−related conditions」と題される豪州仮特許出願第2016/901192号の優先権を主張するものであり、この内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、2016年3月31日出願の「Method of inhibiting high fat diet−related conditions」と題される豪州仮特許出願第2016/901192号の優先権を主張するものであり、この内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
食物、特に飽和脂肪の過剰消費の結果、主要かつ急速に増加する健康問題が世界的に生じ、肥満、ならびに脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、及び2型糖尿病などの関連疾患を引き起こす。西欧諸国の成人4人に1人近くが、糖尿病または前糖尿病のいずれかであり、肥満の有病率の増加のため、発生率が上昇している。前糖尿病は、異常に高いが、その人が糖尿病であると診断するのに十分な高さではない血中グルコース値に関連する疾患である。前糖尿病患者は、しばしば肥満であり、この疾患は、概して、高脂肪食などの不健康な食事と関連している。したがって、前糖尿病の管理には、低脂肪食を介した減量の勧告が頻繁に関与する。しかしながら、前糖尿病の多くの患者は、彼らの疾患を治療するための推奨された減量を達成及び維持するために必要な生活習慣の変化を遵守したくない、もしくはできない、または代替として、既存の療法が失敗した可能性がある。したがって、前糖尿病の代替治療及び/または管理の必要性が存在する。
マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)は、MAPKシグナル伝達の下流エフェクターであるセリン/スレオニンキナーゼ群であり、発癌の形質転換及び進行に関与している。ネズミMNK1及びMNK2は、それぞれ、Mknk1及びMknk2遺伝子によってコードされる。対応するタンパク質(MNK1及びMNK2)は、MAPキナーゼ(例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK))と、特にMNK1の場合は、p38MAPキナーゼと相互作用する。MNKタンパク質は、MAPキナーゼによりリン酸化され、MNK活性の刺激を引き起こす(Waskiewiczら、1997)。MNKタンパク質の最もよく知られた基質は、いくつかの更なる基質が記載されているが(Buxadeら、2008に掲載される)、タンパク質合成機構の重要な成分である真核生物翻訳開始因子4E(eIF4E)である(Waskiewiczら、1997;Scheperら、2001)。MNKがeIF4Eに作用する唯一のキナーゼであるため、MNKタンパク質の生物活性は、リン酸化されたeIF4E(P−eIF4E)のレベルを測定することによって測定され得る。
それらの一次配列に関して非常に類似しているが、MNK1及びMNK2は、多数の重要な点で異なる。例えば、ネズミMNK1(ヒトMNK1aに相当)は、主に細胞質であるが、ネズミMNK2(ヒトMNK2aと類似)は、核及び細胞質で見られる。MNK1は、ERKまたはp38MAPキナーゼ経路の刺激後に強く活性化されるが(Scheperら、2001;Waskiewiczら、(1999);Wangら、1999)、MNK2は、これらの経路によってわずかに更に刺激されるのみである高い定常活性を示す。MNK1及びMNK2 mRNAは、肝臓、骨格筋、及び心臓で発現することが知られているが、しかしながら、異なるマウス組織におけるMNK1及びMNK2の発現パターンは、異なり、MNK1及びMNK2が違う役割を果たすことを示唆する。ノックアウトマウスにおけるMKNK1及びMKNK2遺伝子の一方または両方の破壊は、有害作用の報告がなく、ダブルMNK1/2ノックアウトマウスは、生存可能、かつ繁殖可能であり、異常は報告されなかった(Uedaら、2004)。
本発明者らは、MNK活性が、肥満、脂肪生成及び脂質生成、ならびに関連疾患、例えば、脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、前糖尿病、及び2型糖尿病を含む高脂肪食の作用と関連し得ることを認識した。本明細書に記載されるように、MNK発現または生物活性を阻害することは、高脂肪食の作用を阻害し、前糖尿病などの高脂肪食関連疾患を治療及び/または管理することに対する新しい手段を提供し得る。
本開示の第1の態様によると、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療する方法が提供され、該対象は、5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、該方法は治療上有効な量の少なくとも1つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤を対象に投与することを含み、該MNK阻害剤は、MNK2、及び任意に、MNK1の生物活性を低下させる。
一実施形態において、MNK阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーである。
本開示は、MNK1またはMNK2がノックアウトされたマウス(それぞれ、MNK1−KO及びMNK2−KO)を用いて、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて、正常飼料食(CD)または高脂肪食(HFD)を消費したマウスにおけるMNK1及びMNK2の役割の調査を記載する。MNK1及び/またはMNK2の発現の阻害、またはMNK阻害剤を用いたMNK1及び/またはMNK2の生物活性の低下が、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、及び脂質生成を含む高脂肪食の作用を阻害し得ることが見出された。
本明細書で提供されるデータは、MNK1及びMNK2が、インスリンによる身体代謝の調節に関与する脂肪組織で発現されることを実証する。MNK2 mRNAが、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて急速に誘導され、脂肪生成中のこのタンパク質の関与が示される。注目すべきことに、MNK2−KOマウスは、WT/HFDマウスで観察されるHFD誘発性脂肪増加に対して保護されていた。MNK2−KO/HFDマウスの脂肪細胞のサイズは、それらの飼料食摂取対応物よりも大きくないことが観察された。しかしながら、比較において、WT/HFDマウスの脂肪細胞のサイズは、飼料食(WT/CD)のWTマウスと比べて著しく増加した。MNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスの両方は、インスリン抵抗性の指標に対して保護され、WT/HFDマウスと比較して、減少した循環グルコース及びインスリンのレベル、及び減少したHOMA−IR(インスリン抵抗性の指標)、より良好なグルコース耐性、及びPKBシグナル伝達経路(PKBリン酸化)の強い応答によって示される減少したインスリン抵抗性を有した。更に、MNK2−KO/HFDマウスは、脂肪組織における炎症の低下を示した。これらの結果は、高脂肪食の有害作用の媒介におけるMNK1、特にMNK2の関与を確認する。
MNK1及びMNK2の両方の小分子阻害剤、CGP57380(すなわち、N3−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ−[3,4−d]ピリミジン−3,4−ジアミン、または4−アミノ−3−(p−フルオロフェニルアミノ)ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン)の存在下で、脂肪細胞の細胞モデルにおける脂質の蓄積が顕著に阻害された。更に、CGP57380は、脂肪細胞の分化に必要な多くの遺伝子の発現を阻害し、脂肪生成及び脂質貯蔵におけるMNK1及びMNK2の重要な役割を示す。これらの結果は、MNK1及び/またはMNK2の生物学的機能の低下が脂肪生成及び脂質貯蔵を阻害することを実証する。更に、CGP57380の存在下で分化された細胞では、より少ないグリセロールが、CGP57380の非存在下で分化された細胞と比較して、脂肪分解アッセイにおいて放出され、CGP57380処理細胞におけるトリグリセリドの貯蔵の低下が確認された。
MNK1及びMNK2は、eIF4Eをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼである。MNK2−KOマウスは、両方の食餌条件下で、WTマウスと比較して、P−eIF4Eの実質的な低下を示したが、MNK1−KOマウスは、飼料食でP−eIF4Eの変化を示さず、WT動物と比較して、HFDでP−eIF4Eのわずかな減少を示すのみであった。これは、MNK2が脂肪組織におけるより活性なMNKアイソフォームであることを示す。
前糖尿病対象は、グルコース代謝障害を有する。2つの段階が認められる:(1)空腹時グルコース障害(IFG)の前糖尿病、及び(2)グルコース耐性障害(IGT)の前糖尿病。本質的に、ヒト対象における標準的な経口グルコース負荷試験(GTT)は、4つの診断のうちの1つを決定する結果を提供する。グルコース代謝を診断するために使用されるGTT及び「カットオフ」グルコース値の正確なプロトコルは、国によって異なるが、一般的に用いられる一例は、空腹時血中グルコース値を測定し、次いで、グルコース溶液の測定された用量(通常、75gのグルコース)が5分以内に経口摂取され、次いで、血中グルコース値が、通常2時間後に再度測定される。診断は、典型的に、表1に示すように行われる。しかしながら、表1に示される数値のいくつかの小さな変化が一般的に引用されている。本開示の目的のために、本方法は、5.5mmol/l〜6.9mmol/l(すなわち、100mg/dl〜125mg/dl)の空腹時血漿グルコース値を有する前糖尿病対象に対して使用され得る。
多くの前糖尿病対象は、症状のいかなる顕著な変化も伴わずに、例えば、3年から15年の間、糖尿病前の状態のままであるが、他の症例では、症状は、より迅速に悪化し、2型糖尿病に進行する。重要なことに、前糖尿病の診断は、最終的に2型糖尿病を発症する高リスク因子と考慮されるが、前糖尿病の2つの段階は、互いに、かつ2型糖尿病とは区別され、それは、空腹時グルコース障害の前糖尿病と診断された全ての対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病または2型糖尿病障害に進行するわけではないからである。同様に、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する全ての対象が、2型糖尿病に進行するわけではない。
本開示の方法は、前糖尿病から2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させ得る。
したがって、第1の態様では、本開示は、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療する方法を提供し、該対象は5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、該方法は治療上有効な量の少なくとも1つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤を対象に投与することを含み、該MNK阻害剤は、MNK2、及び任意に、MNK1の生物活性を低下させる。
本開示の方法はまた、空腹時グルコース障害(IFG)の段階にある前糖尿病のグルコース耐性障害(IGT)の段階への進行を予防し得る。加えて、本方法はまた、肥満、体重増加、脂肪組織重量の増加、脂肪組織炎症の増加、循環グルコース及び/またはグルコース耐性の増加、循環インスリン及び/またはインスリン抵抗性の増加などの前糖尿病に関連する症状及び/または作用を回避または軽減し得る。
上記のように、前糖尿病対象は、しばしば体重過剰であり、この状態は一般に、高脂肪食などの不健康な食事と関連する。「高脂肪食」という用語は、本明細書では、通常の食事と比較して、典型的に、カロリーの高い割合(食事中の脂肪から得られる)を有する食餌を指すために使用される。食餌中の脂肪は、動物性であろうと植物性であろうと、一価不飽和性、多価不飽和性、飽和性などであろうと、全ての種類の食物脂肪を含み得る。したがって、高脂肪食は、通常の食事より高いカロリー含量を有する。一実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの30%以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。別の実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの35%、40%、45%、50%、55%、60%、または65%以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。加えて、または代替として、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、通常の食事より高い総エネルギー値を特徴とする高脂肪食を有する。例えば、中年成人に対する通常の食事に関して推奨されるエネルギー摂取量が表2に示される。
当業者は、推奨されるエネルギー摂取量値が通常の食事エネルギー摂取レベルを示すことを理解するであろう。しかしながら、これらの値は、年齢、性別、身長、活動レベルによって異なる。したがって、高脂肪食は、通常の食事とほぼ同じエネルギー摂取量を有するか、そうでなければ、通常の食事よりも高い総エネルギー摂取量、例えば、通常の食事と比較して10〜30%、20〜40%、30〜50%、または30〜60%高い総エネルギー摂取量を有する。したがって、開示された方法に従って治療された前糖尿病対象は、通常の食事のエネルギー摂取値より少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、または200%高いエネルギー摂取値を伴う高脂肪食を有し得る。
HFD摂取雄マウスは、高脂肪食の作用を研究するために広く使用され、受け入れられているモデルである(Panchalら、2011)。これらの動物は、脂肪組織の増加、脂肪組織の炎症、及びインスリン応答の欠陥(例えば、グルコース耐性障害)に関して、ヒトの肥満関連メタボリックシンドロームに関連する応答と同じ応答の多くを示す(Hariri及びThibault、2010)。例として、マウスの高脂肪食は、7%kcalの脂肪、18%kcalのタンパク質、75%kcalの炭水化物を含む標準飼料食と比較して、45%kcalの脂肪、20%kcalのタンパク質、35%kcalの炭水化物を含み得る。しかしながら、当業者は、マウスの高脂肪食は、脂肪からのエネルギーが32%〜60%の範囲にあり得ることを理解するであろう。
本明細書に開示されるように、MNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスの両方は、WT/HFD動物と比較してより高いグルコース耐性を有した。本試験では、動物は、2g/kgのグルコースの腹腔内注射を受ける前に動物を一晩絶食させ、グルコース投与前及び投与後2時間までのいくつかの時点で血液中のグルコースが測定された。MNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスの両方は、測定された各時点でWT/HFD動物と比較してより低いグルコース値を有した。これは、同じ高脂肪食で、減少したMNK1及び/またはMNK2の生物活性を有することは、グルコース耐性を増加させることを証明し、したがって、MNK生物活性を減少させることは、前糖尿病の治療または予防を援助するであろうと示すため、特に関連がある。したがって、実施形態では、MNK阻害剤によって治療または予防される疾患は、前糖尿病である。
ヒトMNKは、選択的スプライシングによる2つの遺伝子(遺伝子記号:MKNK1及びMKNK2)に由来する4つのタンパク質の群を含む。MNK1a/1bは、MNK2a/2bと同様にそれらのC末端で異なる。いずれの場合も、a型は、MAPキナーゼ結合領域を欠くb型よりも長いC末端領域を有する。全ての型のN末端は、インポーチンα及び翻訳因子スカフォールドタンパク質真核生物開始因子4G(eIF4G)に結合する多塩基性領域を含有する。MNK1a/b及びMNK2a/bの触媒ドメインは、3つの珍しい特徴を共有する:2つの短いインサート、及び他のキナーゼがDFGを有するDFD特徴。MNKアイソフォームは、それらの活性及び調節、ならびに細胞内局在において著しく異なる。最も特徴付けられたMNK基質は、eIF4Eである。eIF4Eリン酸化の細胞の役割は、不明であり、それは核から特定のmRNAの輸出を促進するかもしれない。他のMNK基質は、特異的mRNAの安定性/翻訳を調節するAUが豊富な要素に結合する。MNKはまた、炎症メディエーターの産出、及びチロシンキナーゼ受容体からのシグナル伝達、ならびに細胞増殖または生存を制御し得る。
ヒトMNKの配列は、以下のように見出され得る:ヒトMNK1 mRNA及びアミノ酸配列:Genbank受入番号AB000409.1;ヒトMNK1アミノ酸配列変異体:Genbank受入番号NM−003684.2;ヒトMNK2a mRNA配列:Genbank受入番号AF237775;ヒトMNK2b mRNA及びアミノ酸配列:Genbank受入番号AF237776、及びNM−17572.2と標識付けられた核酸配列の変異体。「GenBank受入番号」という用語は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information(NCBI))のGenBankデータベースエントリ(Bensonら、2000)に関連する。上記のGenBank受入番号の各々に開示される情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「MNK阻害剤」という用語は、MNK1の生物活性を低下させる(スプライス変異体MNK1a及びMNK1bの一方または両方の生物活性を低下させることを含む)及び/またはMNK2の生物活性を低下させる(スプライス変異体MNK2a及びMNK2bの一方または両方の生物活性を低下させることを含む)、任意の化合物を指すように意図され、発現されるMNK1及び/またはMNK2の量を減少させることを含む。例えば、MNK阻害剤は、有機小分子(本明細書では「小分子」とも称される)、ペプチドアンタゴニスト、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、アプタマー、または当業者に理解されるような発現または生物活性を阻害する他のMNK阻害剤であってもよい。MNK1及びMNK2の生物活性は、様々な方法、例えば、当業者に知られている任意の適切な方法を用いて、例えば、Merck Millipore、カタログ番号07−823(Merck Millipore、米国、マサチューセッツ州、ビルリカ)によって流通される抗リン酸化eIF4E(Ser209)抗体などの、例えば、特異的抗P−eIF4E抗体を使用する免疫ブロットまたはELISAを行うことによって、その基質eIF4EのP−eIF4Eへのリン酸化を測定することによって測定され得る。したがって、MNK阻害剤の非存在下における対応する試料と比較して、MNK阻害剤を含有する試料中のP−eIF4Eの量の相対的低下は、MNKの生物活性が低下したことを証明する。当業者は、P−eIF4Eレベルを測定するとき、適切な対照群をどのように実行するかを知っているであろう。MNK1及び/またはMNK2の生物活性は、そうでなければ、MNK1及び/またはMNK2の生物活性のレベルを検出することができる細胞アッセイを用いて測定され得る。リン酸化されたMNKを特定的に検出する抗体もまた、使用され得、例えば、抗P−MNK1(Phospho−Mnk1(Thr197/202)抗体番号2111;Cell Signaling Technology Inc、米国、マサチューセッツ州、ダンバーズ)がある。更に、当業者は、MNK阻害剤は、その意図された目的のための使用に対して安全であるべきであることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、MNK阻害剤は、好ましくは、MNK2に対する選択性及び/または阻害能力の増加を示し得る。MNK阻害剤の選択性を評価するための簡単な試験は、MNK1またはMNK2のいずれかがノックアウトされた動物からの適切な細胞(例えば、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスからのマウス胚線維芽細胞(MEF))をMNK阻害剤で処理することによって実行され得る。MNK1−KO MEFにおいて、eIF4Eリン酸化は、MNK2に依存し、逆もまた同様であるため、MNK−KO MEFにおける、異なる濃度の対象とするMNK阻害剤のP−eIF4Eレベルへの効果を監視することは、その化合物の、MNK2(MNK1−KO MEFs)またはMNK1(MNK2−KO MEFs)を阻害する能力に関して報告する。したがって、2種類の細胞のデータを比較することにより、試験されたMNK阻害剤がMNK1またはMNK2に対して示す選択性の程度が決定され得る。
MNK阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉RNA分子を含む阻害性ヌクレオチド分子、及びアプタマーから成る群から選択されてもよい。MNK阻害剤は、当技術分野で既に知られているものを含んでもよい。実施形態では、MNK阻害剤の組み合わせが使用されてもよい。
実施形態では、MNK阻害剤は、有機小分子である。MNK1及び/またはMNK2の適切な小分子阻害剤の多くの例を以下に記載する。
式Iは、市販されているCGP57380(N3−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ−[3,4−d]ピリミジン−3,4−ジアミン;または4−アミノ−3−(p−フルオロフェニルアミノ)ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン;WO03/037362;Chrestensenら、2007;Buxadeら、2005;Worchら、2004、Rowlettら、2008)を示す。これは、MNK1及びMNK2の両方の阻害剤である(Houら、2012)。
式IIは、市販されているセラコスラミド((9aS)−8−アセチル−9,9a−ジヒドロ−1,3,7−トリヒドロキシ−9a−メチル−9−オキソ−4−ジベンゾフランカボキサミド;Sussmanら、2004)を示す。
式IIIは、市販されているETP45835二塩酸塩(4−[5−(4−ピペリジニル)−1H−ピラゾール−3−イル]ピリジン二塩酸塩;Oyarzabalら、2010年)を示す。
式IVは、スタウロスポリンの誘導体であるCGP052088(Tschoppら、2000)を示す。
式Vは、MNK−I1(4−(2−(2−フルオロプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ジメチルアミノ)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミドを示す。Beggsら、2015)を示す。
式VIは、MNK−I2(4−(2−イソプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ピロリジン−1−イル)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミド)を示す。
これらの化合物のいくつかに関するIC50の詳細を表3に示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型MNK阻害剤は、「ATP競合剤」またはMNKのATP結合ドメイン(例えば、CGp57380及びセルコスポラミド;Houら、2012)と相互作用する「I型キナーゼ阻害剤」(Houら、2012、Liu及びGray、2006)として知られている化合物の群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型MNK阻害剤は、チエノピリミジン化合物の群から選択される。そのような化合物の例としては、WO06/136402及びWO2007/115822に記載されるもの、Teoら、2015に記載されるチエノピリミジニル誘導体(MNK2選択的阻害剤を含む)、及びWO2011/104340及びUS8,633,201に記載されるものなどの置換アルキル基を含有するチエノピリミジニル誘導体が挙げられ、この段落で言及される全ての仕様の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切なチエノピリミジン化合物の好ましい例は、WO2011/104340に記載されるもの(その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、ならびに上記の特定の化合物、MNK−I1及びMNK−I2を含んでもよい。適切なチエノピリミジン化合物の特に好ましい例は、以下に示される一般式のものであってもよい。
式VII
式中、Xは、CH及びNから選択され;R1は、H、ハロゲン原子(Fなど)、CN、C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、またはCONH2基であり;R2は、ハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、ここで、シクロプロピル基は、1つもしくは2つのハロゲン原子(複数可)(Fなど)、または−CH2−CNで置換されてもよく、ここで、化合物が(R5)2N−CO−基を含む場合、2つのR5基は、それらが付着されるN原子と一緒に、炭素原子がO、S、SO、もしくはSO2によって置き換えられてもよく、及び/またはOH、NH2、N(C1−3−アルキル)2、NH(C1−3アルキル)、CF3、C1−3−アルキル基で置換されてもよい4−〜8−員環を形成してもよく、またはR2は、2〜6位で1つもしくは2つのOHで独立して置換される直鎖もしくは分枝C2−6アルキル基、C1−3アルコキシ、アミノ、CN、R6NH−、(R6)2N−、R6OCONH−、R6CONH−、R6SO2NH−、またはR6NHCONH−基であり、ここで、R6は、C1−5アルキル基(好ましくはC1−4アルキル基、例えば、CH3、i−Pr、及びT−BU)であり、各々、1つのCF3、NH2、NH(C1−3アルキル)、N(C1−3アルキル)2またはCH3O−基で任意に置換され、上記のNH部分のいずれかの水素原子は、CH3で置換されてもよく;R3は、HまたはC1−3アルキル基(好ましくはCH3)であり;R4は、カルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R7基から選択され、
Lは、−(CH2)n−(nが2、3、または4である場合)もしくはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)、−CH2−C≡C−CH2−、または
であり、R7は、OH、−NH2、−NHR8、−N(R8)2、−NH−CO2R8、または3−〜6−員環(例えば、フェニルまたはモルホリン基)、または環状アミン(例えば、ピロリジンもしくはピペリジン)から選択され、R8は、C1−3アルキル(好ましくはCH3)、またはその互変異性体、鏡像異性体、もしくは塩である。より具体的には、式(VII)の好ましい化合物は、Xが上記で定義されたもの(ただし、好ましくはCH2)であり、R1がHまたはより好ましくはFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、R3がCH3であり、R4がカルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R8基から選択され、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分岐鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものである。式(VII)の更に好ましい化合物は、Xが上記で定義されたものであり(ただし、好ましくはCH2)、R1がFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基であり、R3がCH3であり、R4が−CONHR7または−CONH−OR7であってもよいが、より好ましくは−CO−NH−LR8基であり、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものであってもよい。
式中、Xは、CH及びNから選択され;R1は、H、ハロゲン原子(Fなど)、CN、C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、またはCONH2基であり;R2は、ハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基(好ましくはC1−3アルキル基)、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、ここで、シクロプロピル基は、1つもしくは2つのハロゲン原子(複数可)(Fなど)、または−CH2−CNで置換されてもよく、ここで、化合物が(R5)2N−CO−基を含む場合、2つのR5基は、それらが付着されるN原子と一緒に、炭素原子がO、S、SO、もしくはSO2によって置き換えられてもよく、及び/またはOH、NH2、N(C1−3−アルキル)2、NH(C1−3アルキル)、CF3、C1−3−アルキル基で置換されてもよい4−〜8−員環を形成してもよく、またはR2は、2〜6位で1つもしくは2つのOHで独立して置換される直鎖もしくは分枝C2−6アルキル基、C1−3アルコキシ、アミノ、CN、R6NH−、(R6)2N−、R6OCONH−、R6CONH−、R6SO2NH−、またはR6NHCONH−基であり、ここで、R6は、C1−5アルキル基(好ましくはC1−4アルキル基、例えば、CH3、i−Pr、及びT−BU)であり、各々、1つのCF3、NH2、NH(C1−3アルキル)、N(C1−3アルキル)2またはCH3O−基で任意に置換され、上記のNH部分のいずれかの水素原子は、CH3で置換されてもよく;R3は、HまたはC1−3アルキル基(好ましくはCH3)であり;R4は、カルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R7基から選択され、
Lは、−(CH2)n−(nが2、3、または4である場合)もしくはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)、−CH2−C≡C−CH2−、または
であり、R7は、OH、−NH2、−NHR8、−N(R8)2、−NH−CO2R8、または3−〜6−員環(例えば、フェニルまたはモルホリン基)、または環状アミン(例えば、ピロリジンもしくはピペリジン)から選択され、R8は、C1−3アルキル(好ましくはCH3)、またはその互変異性体、鏡像異性体、もしくは塩である。より具体的には、式(VII)の好ましい化合物は、Xが上記で定義されたもの(ただし、好ましくはCH2)であり、R1がHまたはより好ましくはFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)または1つもしくは2つのトリハロゲン−メチル(例えば、トリフルオロメチル)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、H2N−CO−、R5NHCO−、または(R5)2N−CO−基であり、R3がCH3であり、R4がカルボキシ基、C1−3アルコキシ−カルボニル、−CONH2、−CONHR7、−CONH−OR7、−CONH−SO2R7、及び−CO−NH−L−R8基から選択され、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分岐鎖アルキル残基(例えば、−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものである。式(VII)の更に好ましい化合物は、Xが上記で定義されたものであり(ただし、好ましくはCH2)、R1がFであり、R2がハロゲン原子(複数可)(Fなど)で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝C1−6アルキル基であり、R3がCH3であり、R4が−CONHR7または−CONH−OR7であってもよいが、より好ましくは−CO−NH−LR8基であり、ここで、Lは、−(CH2)n−(nが2または3である場合)またはC3−6分枝鎖アルキル残基(例えば−CH2−C(CH3)2−CH2−)であり、R7がOH、−NH2、−NHR8及びN(R8)2、−NH−CO2R8(R8がC1−3アルキル、好ましくはCH3である場合)、ならびに環状アミン(好ましくはピロリジン)などの3−〜6−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものであってもよい。
MNK1及び/またはMKN2の生物活性を低下させる他の小分子もまた、本明細書に記載される使用に適切であってもよい。そのような化合物の例としては、EP0819129に記載されるもの、ピリジン及びピラジン誘導体、例えば、WO2007/147874に記載されるもの、ならびに8−ヘテロアリールプリン化合物、例えば、US7951803に記載されるものが挙げられ、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、当業者は、他の小分子が、本明細書に記載されるようなMNKの生物活性及び/または発現を阻害する場合、それらは、本開示の方法における使用に適切であり、それらの目的のために安全であると考えられる。MNK阻害機能のための小化合物をスクリーニングするための方法は、US8,633,201に記載されている。更に、追加の有機小分子MNK阻害剤を設計するための考慮事項が、Houら(2012)に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施形態では、MNK阻害剤は、ペプチド阻害剤である。
ペプチド阻害剤は、MNK1及び/またはMNK2の生物活性が減少するような様式で、MNK1及び/またはMNK2などの標的と結合することができるペプチドもしくはタンパク質またはその断片である。ペプチド阻害剤は、天然源由来、または人工的に合成されたものに関わらず、天然に存在するMNK結合パートナーであってもよい、または他のペプチドであってもよい。多数のペプチドライブラリーが知られており、そのようなライブラリーは、当業者に知られている多くの技術によってスクリーニングされ得る。MNK1及び/またはMKN2の新規ペプチド阻害剤は、そのような方法を用いて同定され、当業者に周知の技術を用いて産出され得る。
実施形態では、MNK阻害剤は、阻害性抗体またはその断片、例えば、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいMNKに特異的な抗体であってもよい。代替として、阻害抗体は、中和抗体として知られていてもよい。
適切な抗体は、当業者に周知の方法を用いて生成され、次いで、MNK阻害特性を有する、すなわち、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる抗体を同定するためにスクリーニングされてもよい。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリーによって産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。MNK阻害特性を有する抗体を作製する方法は、当業者に周知である。
実施形態では、MNK阻害剤は、阻害性アプタマー、例えば、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいMNKに特異的なアプタマーであってもよい。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子であり、(通常は)短いオリゴヌクレオチド鎖から成るオリゴヌクレオチド分子及び典型的には短い可変ペプチドドメイン(またはループ)から成るペプチドアプタマーが、両端部でタンパク質の骨組に付着している。アプタマーは、MNK1及びMNK2などのタンパク質を高い親和性及び特異性で阻害することができる。アプタマーを産生し、所望の阻害作用についてそれらをスクリーニングする任意の適切な方法を使用してMNK阻害剤を産生してもよい。ヌクレオチドアプタマーのためのそのような方法の例は、US7,960,102及びWO91/19813に記載されるが、しかしながら、他の方法もまた適切であり得る。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイ、ならびにmRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、及び酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術によって構築された組み合わせペプチドライブラリーから選択され得る。阻害性ペプチドアプタマーを産生するための方法の更なる例は、WO2012/096978に記載される。
実施形態では、MNK阻害剤は、阻害性ヌクレオチド分子であってもよい。二本鎖または一本鎖干渉RNA分子は、当業者に周知のように、所与の遺伝子のmRNA転写産物の配列特異的分解を誘発し、それにより、mRNAのタンパク質への翻訳を阻害することができる。MNKをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子は、mRNAの転写をブロックすることが望ましい状況で代替的に使用されてもよい。したがって、阻害性ヌクレオチド分子は、産生されるMNKタンパク質の量を減少させることによって、MNK生物活性を阻害するために使用されてもよい。そのような技術は現在、当業者に周知であり、センスもしくはアンチセンスオリゴマーまたはより大きな断片は、MNKをコードする配列のコードまたは制御領域に沿った様々な位置から設計され得る。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、もしくはワクシニアウイルスから、または種々な細菌プラスミドから誘導された発現ベクターは、標的臓器、組織、または細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために使用されてもよい。当業者に周知の方法が、MNKをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築するために使用され得る。MNKをコードする遺伝子は、MNKをコードする高レベルのポリヌクレオチドまたはその断片を発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することによってオフにされ得る。そのような構築物は、翻訳不可能なセンスまたはアンチセンス配列を細胞に導入するために使用されてもよい。DNAへの組み込みがない場合でも、そのようなベクターは、RNA分子が内因性ヌクレアーゼによって無効にされるまでRNA分子を転写し続けることがある。一過性発現は、非複製ベクターで1ヶ月以上続き、更に適した複製要素がベクターシステムの一部である場合、更に長くことがある。阻害性ヌクレオチド分子は、核酸分子の合成のための、当業者に知られている任意の方法によって調製されてもよい。
MNK阻害剤は、経口または直腸などの経腸投与のための許容される方法のいずれかによって、または皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内経路などの非経口投与によって、または鼻腔内経路などの他の適切な経路によって対象に投与されてもよい。注射は、ボーラス投与、または一定もしくは間欠的注入を介し得る。実施形態では、MNK阻害剤は、経口投与される。したがって、MNK阻害剤は、例えば、カプセル、錠剤、カプレット、顆粒、もしくは粉末(飲料を提供するために水中に懸濁または溶解されてもよい)などの経口剤形で、または補強食品として製剤化されてもよい。
MNK阻害剤は、それを生体利用可能にする任意の形態または様式で投与され得る。製剤を調製する当業者は、選択されるMNK阻害剤の特定の特性、治療される疾患、治療される疾患の段階、及び他の関連状況に応じて、適切な投与形態及び様式を容易に選択することができる(Remingtons Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing Co.(1995)を参照されたい)。実施形態では、製剤は、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び/または賦形剤と任意に組み合わせられてもよい。充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、当業者に知られている任意の適切な物質、例えば、リン酸二カルシウム二塩基(DCPD)、第二リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、糖類、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、セルロース、セルロース誘導体または変性セルロース、例えば、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、キシリトール、ソルビトール、もしくはマルチトールのようなアルコール類、水、アルコール、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及び/またはヒュームドシリカ吸収剤であってもよい。好ましくは、充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、ステアリン酸マグネシウム、DCPD、デンプングリコール酸ナトリウム、ヒュームドシリカ吸収剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。
MNK阻害剤は、本明細書に記載される疾患の治療のために、1つ以上の追加の薬物(複数可)と併用または共に投与されてもよい。成分は、同じ製剤または別々の製剤で投与されえる。別々の製剤で投与される場合、MNK阻害剤は、連続して(すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間(例えば2〜48時間)以内に任意の順序で連続して)、または他の薬物(複数可)と同時に投与されてもよい。
1つ以上の追加の薬物と組み合わせて投与可能であることに加えて、MNK阻害剤は、併用療法で使用されてもよい。これが行われるとき、MNK阻害剤は、典型的には、互いに組み合わせて投与される。したがって、MNK阻害剤の1つ以上は、所望の効果を達成するために、同時(組み合わされた調合剤として)、または連続(すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間(例えば2〜48時間)以内に任意の順序で連続して)のいずれかで投与されてもよい。これは、2つの薬物の組み合わされた効果が、改善された治療結果を提供するように、各MNK阻害剤の治療プロファイルが異なる場合に特に望ましい。
必要に応じて、より効果的な分布のために、MNK阻害剤は、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びマイクロスフェアなどの徐放性または標的送達系に組み込まれ得る。
「治療上有効な量」のMNK阻害剤は、例えば、特定の選択されたMNK阻害剤または使用されるMNK阻害剤の組み合わせ、投与方法、治療される特定の疾患、及び所望の転帰によって変動してもよい。それはまた、疾患の段階及び重症度、患者の年齢及び身体状態を含む治療される対象、もしある場合、同時療法の性質、及び医師に周知の同様の要因にもよる。防止的(予防的)な適用に関しては、それは、概して、予防されるように探される特定の疾患の発症を遅らせる、進行を阻害する、または共に停止させるのに十分なその量である。治療的適用に関しては、それは、概して、医学的に望ましい結果を達成するのに十分なその量である。
治療上有効な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。いずれの化合物についても、治療上有効な量は、細胞培養アッセイ(例えば、前脂肪細胞株)、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタのいずれかで最初に推定され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用されてもよい。そのような情報は、その後、ヒトにおける投与のための有用な投与量及び経路を決定するために使用され得る。治療有効性及び任意の毒性は、例えば、ED50(集団の50%において治療上有効な用量)及びLD50(集団の50%に対して致命的である用量)の決定を通して、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定されてもよい。治療効果と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、それは、LD50/ED50の比として表され得る。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投与量の範囲を定式化するのに使用される。そのような組成物に含有される投与量は、好ましくは、毒性がほとんどない、または全くないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形、患者の感受性、及び投与経路によって、この範囲内で変化する。使用される正確な投薬量及び治療上有効な量は、処理を必要とする対象に関連する因子を考慮して、開業医によって決定される。投与量及び投与経路/頻度は、十分なレベルの活性部分を提供するために、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る因子としては、病状の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ(複数可)、反応感受性、ならびに療法に対する耐性/応答が挙げられる。薬学的組成物は、特定の製剤及び/または活性部分の半減期及びクリアランス速度によって、1日数回、1日1回、3〜4日ごと、毎週、または2週間に1回投与されてもよい。治療上有効な量は、投与経路によって、0.1〜100,000mg、最大約1gの総量まで変動してもよい。一例では、治療上有効な量は、概して、約1〜2000mg/日、好ましくは約10〜約1000mg/日、最も好ましくは約10〜約500mg/日であってもよく、単回または複数回投与されてもよい。
本開示の方法の上記の実施形態のいずれかまたは全てが、以下を含む本開示の他の態様において容易に使用され得ることが意図される。
本開示の別の態様は、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも1つのMNK阻害剤の使用を提供し、該対象は5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、該MNK阻害剤は、MNK2、及び任意に、MNK1の生物活性を低下させる。
本開示の更なる態様は、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療するための、医薬品の製造における、MNK2、及び任意に、MNK1の生物活性を低下させる少なくとも1つのMNK阻害剤の使用を提供し、該対象は5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする。
実施例1 MNK1及びMNK2は、高脂肪食の有害作用を媒介し、MNK1及びMNK2の生物学的機能を阻害することは、これらの作用を減少させる
材料及び方法
材料及び化学物質
全ての細胞培養液及びサプリメントは、Life Technologies(米国、カリフォルニア州、カールスバッド)から購入した。SDS−PAGEの試薬は、Bio−Rad Laboratories,Inc.(米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)から購入した。脂肪生成実験のために、インスリン、デキサメタゾン、IBMX、及びロシグリタゾンは、Sigma−Aldrich Corporation(米国、ミズーリ州、セントルイス)から得た。マクロファージ分極化については、リポ多糖(LPS)をSigma−Aldrichから購入し、インターロイキン(IL)−4及びインターフェロン(IFN)γをPeprotech(米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル)から購入した。MNK阻害剤CGP57380は、Abcam PLC(英国、ケンブリッジ)から得た。
材料及び方法
材料及び化学物質
全ての細胞培養液及びサプリメントは、Life Technologies(米国、カリフォルニア州、カールスバッド)から購入した。SDS−PAGEの試薬は、Bio−Rad Laboratories,Inc.(米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)から購入した。脂肪生成実験のために、インスリン、デキサメタゾン、IBMX、及びロシグリタゾンは、Sigma−Aldrich Corporation(米国、ミズーリ州、セントルイス)から得た。マクロファージ分極化については、リポ多糖(LPS)をSigma−Aldrichから購入し、インターロイキン(IL)−4及びインターフェロン(IFN)γをPeprotech(米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル)から購入した。MNK阻害剤CGP57380は、Abcam PLC(英国、ケンブリッジ)から得た。
動物の使用及び食餌
MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、C57BL/6J背景で作製され、Rikiro Fukunaga博士(日本、大阪大学;Uedaら、2004)によって快く提供された。4週齢の雄野生型(WT)、MNK1−KO、またはMNK2−KOマウスを、12時間の明/暗サイクル(07:00に点灯)及び22±2℃の一定温度で、食料と水は自由に入手可能な状態で保持した。それらを、20週間の高脂肪食(HFD;45%kcalの脂肪、20%kcalのタンパク質、35%kcalの炭水化物;Special Dietary Services、英国、エセックス)または標準飼料食(C;7%kcalの脂肪、18%kcalのタンパク質、75%kcalの炭水化物;Special Dietary Services)のいずれかに割り当てた。食餌中の脂肪は、ラード(17.89%w/w)及び大豆油(4.32%w/w)によって提供した。食餌の栄養価を表4に示す。
MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、C57BL/6J背景で作製され、Rikiro Fukunaga博士(日本、大阪大学;Uedaら、2004)によって快く提供された。4週齢の雄野生型(WT)、MNK1−KO、またはMNK2−KOマウスを、12時間の明/暗サイクル(07:00に点灯)及び22±2℃の一定温度で、食料と水は自由に入手可能な状態で保持した。それらを、20週間の高脂肪食(HFD;45%kcalの脂肪、20%kcalのタンパク質、35%kcalの炭水化物;Special Dietary Services、英国、エセックス)または標準飼料食(C;7%kcalの脂肪、18%kcalのタンパク質、75%kcalの炭水化物;Special Dietary Services)のいずれかに割り当てた。食餌中の脂肪は、ラード(17.89%w/w)及び大豆油(4.32%w/w)によって提供した。食餌の栄養価を表4に示す。
代謝研究
飼料食またはHFDのいずれかで15週間後、グルコース負荷試験(GTT)を一晩の絶食後に行った。空腹時グルコース濃度を、マウスがD−グルコース(2g/マウス体重1kg;Baxter Healthcare Ltd、豪州、アデレード)を腹腔内(ip)注射される前に尾静脈から得られた全血から測定し、血中グルコース濃度を、Aviva Accu−Chekグルコメ―ター(Roche Diagnostics、スイス、Risch−Rotkreuz)を用いて腹腔内注射の15、30、60、及び120分後に尾静脈から測定した。
飼料食またはHFDのいずれかで15週間後、グルコース負荷試験(GTT)を一晩の絶食後に行った。空腹時グルコース濃度を、マウスがD−グルコース(2g/マウス体重1kg;Baxter Healthcare Ltd、豪州、アデレード)を腹腔内(ip)注射される前に尾静脈から得られた全血から測定し、血中グルコース濃度を、Aviva Accu−Chekグルコメ―ター(Roche Diagnostics、スイス、Risch−Rotkreuz)を用いて腹腔内注射の15、30、60、及び120分後に尾静脈から測定した。
インスリン抵抗性を試験するために、マウスの別個のコホートを一晩絶食させ、腹腔内インスリン注射(0.75U/マウス体重1kg;Actrapid、Novo Nordisk、デンマーク、バウスベア)の前に尾から得た全血中の絶食グルコース濃度を測定した。次いで、血液グルコース濃度を、腹腔内注射の15及び30分後に尾静脈から測定した。マウスは、腹腔内注射の30分後にグルコース測定値を得た後、直ちに屠殺し、組織を、下流のインスリンシグナル伝達を測定するためのウェスタンブロッティングによる分析のために直ちに凍結した。
血漿インスリン、IL−5、及びIL−10の測定は、英国、ケンブリッジのCore Biochemical Assay Laboratory(CBAL)によって実施された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行った。
ウェスタンブロッティング
組織を、50mMのTrisHCl、pH7.4、150mMのNaCl、1%Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50mMのβ−グリセロールホスフェート、0.5mMのNaVO3、0.1%2−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含有するRIPA溶解緩衝液中で採取した。溶解後、不溶性物質を4℃で、12,000gで10分間遠心分離することによって除去した。タンパク質含量は、Bradfordタンパク質アッセイ(Bio−Rad)によって決定した。イムノブロッティングは、Liuら(2014)に記載される通りに行った。ブロットは、LI−COR Odyssey(登録商標)Quantitative Imaging Systemを用いて視覚化した。表5に示される一次抗体は、抗P−eIF4E(Merck Millipore)を除いて、Cell Signaling Technologiesからのものであった。二次抗体は、Thermo Fisher Scientific Inc.(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム)から入手し、1:20,000希釈で使用した。
組織を、50mMのTrisHCl、pH7.4、150mMのNaCl、1%Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50mMのβ−グリセロールホスフェート、0.5mMのNaVO3、0.1%2−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含有するRIPA溶解緩衝液中で採取した。溶解後、不溶性物質を4℃で、12,000gで10分間遠心分離することによって除去した。タンパク質含量は、Bradfordタンパク質アッセイ(Bio−Rad)によって決定した。イムノブロッティングは、Liuら(2014)に記載される通りに行った。ブロットは、LI−COR Odyssey(登録商標)Quantitative Imaging Systemを用いて視覚化した。表5に示される一次抗体は、抗P−eIF4E(Merck Millipore)を除いて、Cell Signaling Technologiesからのものであった。二次抗体は、Thermo Fisher Scientific Inc.(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム)から入手し、1:20,000希釈で使用した。
遺伝子発現解析
全RNAは、メーカーの説明書に従ってTrizol試薬(Sigma−Aldrich)を使用して組織から単離した(サンプリング時に凍結された)。RNA濃度を260nmでの吸光度によって決定すると同時に、品質及び完全性を、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いて260/230及び260/280比で評価した。RTリアルタイムPCR増幅を、製造業者のプロトコルに従ってランダムプライマーでImProm−II Reverse Transcription System(A3800;Promega、米国、ウィスコンシン州、マジソン)を使用して実行した。続いて、リアルタイム定量(q)PCRを、Moore CEJら、2016の補足表S1に記載されるプライマー配列を用いて行い、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。比較CT法を使用して、β2ミクログロブリン(B2M)mRNAと比較して標的mRNAレベルの増幅を測定した。図1Aにおいて、各転写産物の相対量は、dCt=(Ct標的遺伝子−Ct ref遺伝子)である式2−dCt及びCt=サイクル閾値を用いて決定した。
全RNAは、メーカーの説明書に従ってTrizol試薬(Sigma−Aldrich)を使用して組織から単離した(サンプリング時に凍結された)。RNA濃度を260nmでの吸光度によって決定すると同時に、品質及び完全性を、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いて260/230及び260/280比で評価した。RTリアルタイムPCR増幅を、製造業者のプロトコルに従ってランダムプライマーでImProm−II Reverse Transcription System(A3800;Promega、米国、ウィスコンシン州、マジソン)を使用して実行した。続いて、リアルタイム定量(q)PCRを、Moore CEJら、2016の補足表S1に記載されるプライマー配列を用いて行い、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。比較CT法を使用して、β2ミクログロブリン(B2M)mRNAと比較して標的mRNAレベルの増幅を測定した。図1Aにおいて、各転写産物の相対量は、dCt=(Ct標的遺伝子−Ct ref遺伝子)である式2−dCt及びCt=サイクル閾値を用いて決定した。
BMDMの単離
骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、成体WTまたはMNK2−KOマウス(Weischenfeldt及びPorse、2008)から前述のように生成した。簡潔には、マウスの両側大腿骨及び脛骨を、Ca2+及びMg2+(Life Technologies)を有さない滅菌ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に26ゲージの針を用いてフラッシュした。細胞クラスターをピペッティングし、懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通すことによって破壊した。得られた細胞懸濁液を遠心分離し(10分、400×g)、細胞ペレットを、30%L929細胞馴化培地(L929細胞は、マクロファージへの骨髄細胞の分化を促進するために必要とされるマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)を分泌する)、20%ウシ胎仔血清(FBS)、50%DMEM(高グルコースダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、Life Technologies)を含有する完全マクロファージ培地(CMM)に1%(重量/体積)ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)と共に再懸濁した。
骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、成体WTまたはMNK2−KOマウス(Weischenfeldt及びPorse、2008)から前述のように生成した。簡潔には、マウスの両側大腿骨及び脛骨を、Ca2+及びMg2+(Life Technologies)を有さない滅菌ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に26ゲージの針を用いてフラッシュした。細胞クラスターをピペッティングし、懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通すことによって破壊した。得られた細胞懸濁液を遠心分離し(10分、400×g)、細胞ペレットを、30%L929細胞馴化培地(L929細胞は、マクロファージへの骨髄細胞の分化を促進するために必要とされるマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)を分泌する)、20%ウシ胎仔血清(FBS)、50%DMEM(高グルコースダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、Life Technologies)を含有する完全マクロファージ培地(CMM)に1%(重量/体積)ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)と共に再懸濁した。
マクロファージ極性化
BMDM細胞を、IFNγ(20ng/ml)の存在下でLPS(100ng/ml;Sigma−Aldrich、Escherichia coli0111:B4からのL2630−リポ多糖体)で24時間処理して、M1マクロファージ表現型に分極するか、または細胞を、IL−4(20ng/ml;Peprotech)単独で24時間処理して、M2表現型に分極した。
BMDM細胞を、IFNγ(20ng/ml)の存在下でLPS(100ng/ml;Sigma−Aldrich、Escherichia coli0111:B4からのL2630−リポ多糖体)で24時間処理して、M1マクロファージ表現型に分極するか、または細胞を、IL−4(20ng/ml;Peprotech)単独で24時間処理して、M2表現型に分極した。
3T3−L1細胞の分化及びオイルレッドO染色
3T3−L1(線維芽細胞)細胞分化の誘導のために、前脂肪細胞を、10%FBSで補充されたDMEM(0日目)でコンフルエンス後2日まで増殖させ、培地を、10%FBS、インスリン(167nM)、デキサメタゾン(0.5μM)、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)(0.5mM)、及びロシグリタゾン(2μM)で補充されたDMEMに交換した。48時間後、培地を、10%(v/v)FBS及び167nMのインスリンで補充されたDMEMを含有する培地と置き換えた。4日目に、分化を誘導した後、そしてそれ以降、細胞を、10%FBSを伴うDMEM中で培養した。維持培地は、細胞が実験に利用されるまで(分化開始から9日)まで48時間毎に交換した。20μMのCGP57380を、0日目に細胞に添加し、分化プログラムを通じてその後の培地交換の間維持した。
3T3−L1(線維芽細胞)細胞分化の誘導のために、前脂肪細胞を、10%FBSで補充されたDMEM(0日目)でコンフルエンス後2日まで増殖させ、培地を、10%FBS、インスリン(167nM)、デキサメタゾン(0.5μM)、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)(0.5mM)、及びロシグリタゾン(2μM)で補充されたDMEMに交換した。48時間後、培地を、10%(v/v)FBS及び167nMのインスリンで補充されたDMEMを含有する培地と置き換えた。4日目に、分化を誘導した後、そしてそれ以降、細胞を、10%FBSを伴うDMEM中で培養した。維持培地は、細胞が実験に利用されるまで(分化開始から9日)まで48時間毎に交換した。20μMのCGP57380を、0日目に細胞に添加し、分化プログラムを通じてその後の培地交換の間維持した。
細胞内トリグリセリドレベルの評価は、他の文献(Smithら、1988)に記載されているようにオイルレッドO染色を用いて行った。簡潔には、3T3−L1細胞の分化の9日目に、10%ホルマリン中で1時間固定した。細胞を、新たに調製したオイルレッドO染色液で10分間染色する前に、60%イソプロパノールで洗浄した。定量のために、細胞を水で広範囲に洗浄して未結合の色素を除去し、1mlのイソプロパノールを、染色された6ウェル培養プレートに添加した。5分後、510nmでのオイルレッド抽出物の吸光度を測定し、吸光度の増加は、細胞内の脂質レベルの増加を示した。
組織学
脂肪組織切片を10%中性緩衝ホルマリン中で6時間固定し、パラフィンワックスに包埋する前に標準物として脱水した。切片(4μm)を切断し、正に帯電したガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色を標準物として行った。スライドを、Panoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を使用してスキャンした。画像を、脂肪細胞ツールマクロを有するImage Jを用いて分析した。次いで、脂肪細胞を計数し、各被写体の絶対画素面積を計算し、μm2に変換した。
脂肪組織切片を10%中性緩衝ホルマリン中で6時間固定し、パラフィンワックスに包埋する前に標準物として脱水した。切片(4μm)を切断し、正に帯電したガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色を標準物として行った。スライドを、Panoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を使用してスキャンした。画像を、脂肪細胞ツールマクロを有するImage Jを用いて分析した。次いで、脂肪細胞を計数し、各被写体の絶対画素面積を計算し、μm2に変換した。
統計
分析は、図の説明文に示されるように、両側かつ対応のないスチューデントのt検定、一元または二元配置分散分析によって行った。0.05未満のAP値は、有意であると考えられた。統計的検定は、統計的プログラムGraphPad Prism(バージョン6;GraphPad Software Inc.、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いて行った。
分析は、図の説明文に示されるように、両側かつ対応のないスチューデントのt検定、一元または二元配置分散分析によって行った。0.05未満のAP値は、有意であると考えられた。統計的検定は、統計的プログラムGraphPad Prism(バージョン6;GraphPad Software Inc.、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いて行った。
脂質分解アッセイ
3T3L1細胞を9日間上記のように分化させた。脂肪分解アッセイは、メーカーの説明書(Abcam Lipolysisアッセイキット、ab185433、Abcam)に従って行った。簡潔には、分化後、細胞を脂肪分解アッセイ緩衝液で2回洗浄した。脂質分解を、100nMイソプロテレノールを用いて3時間刺激した。放出されたグリセロールの量を、比色強度を用いて測定した。
3T3L1細胞を9日間上記のように分化させた。脂肪分解アッセイは、メーカーの説明書(Abcam Lipolysisアッセイキット、ab185433、Abcam)に従って行った。簡潔には、分化後、細胞を脂肪分解アッセイ緩衝液で2回洗浄した。脂質分解を、100nMイソプロテレノールを用いて3時間刺激した。放出されたグリセロールの量を、比色強度を用いて測定した。
トリグリセリド測定
組織放出トリグリセリド(TAG)の量は、トリグリセリド定量キット(Abcam、ab65336)を用いて測定した。
組織放出トリグリセリド(TAG)の量は、トリグリセリド定量キット(Abcam、ab65336)を用いて測定した。
肝臓組織学
新鮮な低温切片(厚さ5μm)を用いて、オイルレッドO(Sigma)で染色することにより脂質蓄積を検出した。低温切片を60%イソプロパノール中で10分間固定し、60%イソプロパノール中の0.3%オイルレッドOで30分間染色し、続いて、60%イソプロパノールで洗浄した。核をヘマトキシリンで2分間染色し、次いで、水道水で濯いだ。スライドをPannoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を用いてスキャンした。
新鮮な低温切片(厚さ5μm)を用いて、オイルレッドO(Sigma)で染色することにより脂質蓄積を検出した。低温切片を60%イソプロパノール中で10分間固定し、60%イソプロパノール中の0.3%オイルレッドOで30分間染色し、続いて、60%イソプロパノールで洗浄した。核をヘマトキシリンで2分間染色し、次いで、水道水で濯いだ。スライドをPannoramic250Flash IIスキャナー(3DHISTECH、ハンガリー)を用いてスキャンした。
結果と考察
MNK1及び2は、インスリン調節代謝に関与する正常なマウス組織において発現される
以前に、MNK1及びMNK2 mRNAが肝臓、骨格筋、及び心臓において発現されることが示されている。本発明者らは、肝臓での発現を確認することに加えて、MKNK1及びMKNK2 mRNA分子が脂肪組織でも発現することを示している(図1A参照)。免疫ブロット分析は、肝臓、骨格筋、及び心筋、ならびに脂肪組織におけるMNK1タンパク質の発現を明らかにした(図1B)。
MNK1及び2は、インスリン調節代謝に関与する正常なマウス組織において発現される
以前に、MNK1及びMNK2 mRNAが肝臓、骨格筋、及び心臓において発現されることが示されている。本発明者らは、肝臓での発現を確認することに加えて、MKNK1及びMKNK2 mRNA分子が脂肪組織でも発現することを示している(図1A参照)。免疫ブロット分析は、肝臓、骨格筋、及び心筋、ならびに脂肪組織におけるMNK1タンパク質の発現を明らかにした(図1B)。
脂肪細胞分化中のMNK2の発現を調べるために、広範に使用される脂肪細胞分化モデルである3T3−L1線維芽細胞を使用して、転写因子PPARγ、C/EBPα、及びSREBP1c、ならびにグルコース及び脂肪酸輸送体GLUT4及びCD36などの標準マーカーの発現を分析し、分化プロトコルの有効性を確認した(図1C)。MNK2 mRNAのレベルは、分化プロトコルの誘導後に急速に上昇し、1日で3倍のレベル(他のマーカーの最も早いものと少なくとも同じ速さ)であった(図1D)。この結果は、MNK2が脂肪細胞分化の初期に役割を果たすことを示す。MNK2 mRNAレベルは、6日目までにほぼ分化前レベルまで低下した。対照的に、MKNK1 mRNAレベルは、この期間にほんの少し増加した。更なる研究(図1E参照)では、脂肪生成に関与する主要遺伝子の大部分の出現の前に(C/EBPβ以外に)、MNK1ではなくMNK2が3T3−L1前脂肪細胞の脂肪細胞への分化の間、非常に早く上方制御されることが見出された。
MNK2−KOマウスは、HFD誘発性脂肪増加及びインスリン抵抗性の指標に対して保護されている
野生型(WT)マウスと比較したMNK1ノックアウト(KO)またはMNK2−KOマウスの、正常食(飼料食)と比較した高脂肪食(HFD)に対する応答を調べて、MNK−1及びMNK−2の役割を決定した。飼料食と比較して、野生型(WT)C57Bl6/JマウスにHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加した(図2A〜2C)。高脂肪摂取MNK1−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の身体及び性腺重量の増加を示した(図2A〜2C)。対照的に、同型のMNK2−KOマウスに同じHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加がより小さくなった。WTマウスでは、HFDもまた、グルコース及びインスリンの循環レベルの顕著な増加を引き起こした(それぞれ図2D、2E)。そのような増加は、HFDのMNK1−KO動物及びMNK2−KO動物の両方において顕著に低下し、HFDの有害作用の減弱を示した。とりわけ、飼料食では、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、WTマウスの体重、性腺脂肪重量、基礎グルコース及びインスリンレベルと同様のものを有した。野生型対照群と比較して、MNK−KOマウスの食物摂取量の差は観察されなかった。
野生型(WT)マウスと比較したMNK1ノックアウト(KO)またはMNK2−KOマウスの、正常食(飼料食)と比較した高脂肪食(HFD)に対する応答を調べて、MNK−1及びMNK−2の役割を決定した。飼料食と比較して、野生型(WT)C57Bl6/JマウスにHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加した(図2A〜2C)。高脂肪摂取MNK1−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の身体及び性腺重量の増加を示した(図2A〜2C)。対照的に、同型のMNK2−KOマウスに同じHFDを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加がより小さくなった。WTマウスでは、HFDもまた、グルコース及びインスリンの循環レベルの顕著な増加を引き起こした(それぞれ図2D、2E)。そのような増加は、HFDのMNK1−KO動物及びMNK2−KO動物の両方において顕著に低下し、HFDの有害作用の減弱を示した。とりわけ、飼料食では、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスは、WTマウスの体重、性腺脂肪重量、基礎グルコース及びインスリンレベルと同様のものを有した。野生型対照群と比較して、MNK−KOマウスの食物摂取量の差は観察されなかった。
インスリン抵抗性の恒常性モデル評価(HOMA−IR)は、インスリン抵抗性の指標として広く使用され、それは、血中インスリン及びグルコース値から計算される(Matthewsら、1985)。HOMA−IRは、WT/HFDマウスにおいて上昇した(図2F)。しかしながら、MNK2−KO/HFDマウスでは、飼料食摂取動物と比較して、HOMA−IRのはるかに少ない増加が観察され、MNK2−KO動物が、インスリン抵抗性などのHFDの有害作用に対して大きく保護されていることを示した。MNK1−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の重量及び脂肪増加を示すが、それらは、より低い血中インスリン及びグルコース値、したがって、WT/HFDマウスよりも良好なHOMA−IRを示した(図2D〜2F)。
HFDのWTマウスでは、脂肪細胞のサイズは、細胞面積によって評価されるように、飼料食のものと比較して実質的に増加した(1.7倍;図3A)。これらの細胞が大体球状であると仮定すると、これは、脂肪細胞体積の約3倍の増加になる。これと一致して、飼料食摂取マウスと比較して、HFD摂取WTの脂肪細胞の観察された数において対応する減少が存在した(図3B)。対照的に、飼料食摂取対照群と比較した場合、MNK2−KO/HFDマウスにいて脂肪細胞のサイズの増加はなかった(図3A、3B)。これは、これらの動物がHFDに置かれるときに、脂肪細胞の脂質貯蔵における起こり得る欠陥を示唆する。興味深いことに、脂肪細胞のサイズは、WT対照群よりもMNK2/飼料食動物でより大きいことが見出され、理論に縛られることは望まないが、これは、MNK2−KOマウスにおける脂肪生成の欠損の存在を示し得るため、より少ない脂肪細胞が存在し、その結果、それぞれがより大きくなる。脂肪細胞サイズがMNK2−KOマウスにおけるHFDで増加しなかったという観察は、高脂肪摂食MNK2−KOマウスの体重増加の減少に寄与する可能性が高い。
MNKは、脂肪細胞の分化に必要とされる
WT/HFD対照群と比較したMNK2−KO/HFDマウスで観察された脂肪組織の少ない増加、及び脂肪細胞分化中のMNK2の発現増加(図1C)は、MNK2が細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすか否かの試験を促した。この目的のために、3T3−L1細胞を、標準プロトコルを用いて脂肪細胞に分化させ、脂質含量を評価し、PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4、及びCD36に対するmRNAなどの脂肪細胞マーカーを評価することによって分化を監視した。
WT/HFD対照群と比較したMNK2−KO/HFDマウスで観察された脂肪組織の少ない増加、及び脂肪細胞分化中のMNK2の発現増加(図1C)は、MNK2が細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすか否かの試験を促した。この目的のために、3T3−L1細胞を、標準プロトコルを用いて脂肪細胞に分化させ、脂質含量を評価し、PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4、及びCD36に対するmRNAなどの脂肪細胞マーカーを評価することによって分化を監視した。
MNK1及びMNK2の両方の活性の広く使用されている阻害剤、CGP57380(Tschoppら、2000)の、3T3−L1細胞の分化に対する効果を調べた。用量応答試験を、真核生物翻訳開始因子4E(eIF4E)のリン酸化を読取りとして用いて評価するように、MNK機能を遮断するために必要とされるCGP57380の濃度を決定するために行った。MNKは、eIF4Eをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼであり、したがって、eIF4E(P−eIF4E)のリン酸化は、MNK生物活性の直接の読み出しを提供する。結果は、20μMのCGP57380が効果的であり、3T3−L1細胞におけるMNK活性をほぼ完全に遮断することを示した(図3C)。更に、図3Dに示すように、20μのMCGP57380は、分化プロトコルに供された3T3−L1細胞への脂質の蓄積を阻害した。
脂質蓄積の阻害が脂肪生成分化に関与する他の遺伝子の発現の変化を反映するかどうかを研究するために、PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4、及びCD36に対するmRNAレベルを調べた。図3Eに示すように、CGP57380は、CGP57380の非存在下で分化された3T3−L1細胞と比較して、分化プロトコルの3日目及び6日目の両方でこれらの遺伝子の全ての誘導を実質的に遮断した。これらのデータは、MNKが3T3−L1細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすこと、及びインビボでの脂肪細胞分化においても役割を果たす可能性があることを示し、図3A及び3Bに示される脂肪細胞のサイズ及び数に対するMNKの役割を確認する。
MNK2−KO/HFDマウスは、肝臓脂質蓄積の増加を示さない
HFDのWT動物と比較して、MNK2−KOマウスで観察された脂肪組織の増加の減弱を考慮して、食事からの余分な脂質負荷が肝臓に転用され、そこの脂肪蓄積に寄与する可能性があるかどうかを調べる調査を行った。HFD MNK2−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の肝臓重量を示した(データ示さず)。HFDのWT及びMNK2−KOマウスの総肝脂質レベルは、同様であった(データ示さず)。これらのデータは、HFD中の余分な脂質がMNK2−KOマウスの肝臓に転嫁されていないことを示している。
HFDのWT動物と比較して、MNK2−KOマウスで観察された脂肪組織の増加の減弱を考慮して、食事からの余分な脂質負荷が肝臓に転用され、そこの脂肪蓄積に寄与する可能性があるかどうかを調べる調査を行った。HFD MNK2−KOマウスは、HFDのWTマウスと同様の肝臓重量を示した(データ示さず)。HFDのWT及びMNK2−KOマウスの総肝脂質レベルは、同様であった(データ示さず)。これらのデータは、HFD中の余分な脂質がMNK2−KOマウスの肝臓に転嫁されていないことを示している。
MNK−KOマウスは、HFDのWTマウスと比較してグルコース耐性の改善を示す
WT及びMNK2−KO動物におけるグルコース耐性に対するHFDの作用を直接評価するために、グルコース負荷試験(GTT)を行った。飼料食摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスは、GTTにおいて飼料食摂取WT動物と同様の応答を示し、MNKが正常(飼料食)条件下でグルコース耐性に影響しないことを示した。しかしながら、MNK1−KO及びMNK2−KO/HFDマウスは、WT/HFDマウスと比べて、グルコース投与後、常に著しく低い血中グルコース値を示し、グルコース処理を調節することにおけるMNK1及びMNK2の役割(図4A、4B)、したがって、より高いグルコース耐性を示した。したがって、これらの結果から、MNK1またはMNK2のいずれかのノックアウトは、HFD誘導性のグルコース不耐性に対してマウスを保護するように思われる。
WT及びMNK2−KO動物におけるグルコース耐性に対するHFDの作用を直接評価するために、グルコース負荷試験(GTT)を行った。飼料食摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスは、GTTにおいて飼料食摂取WT動物と同様の応答を示し、MNKが正常(飼料食)条件下でグルコース耐性に影響しないことを示した。しかしながら、MNK1−KO及びMNK2−KO/HFDマウスは、WT/HFDマウスと比べて、グルコース投与後、常に著しく低い血中グルコース値を示し、グルコース処理を調節することにおけるMNK1及びMNK2の役割(図4A、4B)、したがって、より高いグルコース耐性を示した。したがって、これらの結果から、MNK1またはMNK2のいずれかのノックアウトは、HFD誘導性のグルコース不耐性に対してマウスを保護するように思われる。
インスリンの作用を評価するために、飼料食またはHFDのWT、MNK1−KO、及びMNK2−KOマウスをインスリンで処理して、これらの動物の、血中グルコース値を低下させる能力を評価した。インスリンは、MNK1−KOまたはMNK2−KO/HFD動物において、WT/HFDマウスよりも血中グルコースをより効果的に低下させ、インスリンがMNK1−KO/HFD及びMNK2−KO/HFDマウスにおいてより効率的に作用することを示した(図4C)。実際に、MNK1−KOまたはMNK2−KO/HFDマウスにおけるインスリンによって引き起こされる血中グルコース値の低下率は、飼料食摂取動物で観察されたものと同様である。これらのデータは、MNK1−KO及びMNK2−KOマウスがそれぞれ、HFD誘発性のインスリン抵抗性に対してかなりの程度まで保護されていることを示している。
MNK2−KOマウスは、HFDのWTマウスよりも良好なインスリンシグナル伝達を示す
脂肪組織におけるMNK1及びMNK2活性の相対レベルを評価するために、eIF4E(MNK1及びMNK2の共通基質)のリン酸化を調べた。HFDは、WTマウスの脂肪組織におけるリン酸化(P)−eIF4Eのわずかな増加を引き起こした(図5A)。MNK2−KOマウスは、両方の食餌条件下でP−eIF4Eの実質的な低下を示したが、MNK1−KOマウスは、飼料食のWT動物と比較して、飼料食でP−eIF4Eに変化を示さなかった。これは、MNK2が脂肪組織における最も活性なMNKアイソフォームであることを実証する。MNK1−KOマウスでは、P−eIF4Eは、飼料食摂取マウスよりもHFD摂取の脂肪組織においてより低かった(図5A)。
脂肪組織におけるMNK1及びMNK2活性の相対レベルを評価するために、eIF4E(MNK1及びMNK2の共通基質)のリン酸化を調べた。HFDは、WTマウスの脂肪組織におけるリン酸化(P)−eIF4Eのわずかな増加を引き起こした(図5A)。MNK2−KOマウスは、両方の食餌条件下でP−eIF4Eの実質的な低下を示したが、MNK1−KOマウスは、飼料食のWT動物と比較して、飼料食でP−eIF4Eに変化を示さなかった。これは、MNK2が脂肪組織における最も活性なMNKアイソフォームであることを実証する。MNK1−KOマウスでは、P−eIF4Eは、飼料食摂取マウスよりもHFD摂取の脂肪組織においてより低かった(図5A)。
インスリンは、グルコーストランスポーターGLUT4の、細胞膜への転座を介して、脂肪、特に筋肉などの組織へのグルコースの取り込みを刺激する。この効果は、インスリンの代謝作用の多くと同様に、ホスファチジルイノシトイド3−キナーゼ(PI3−キナーゼ)の下流でリン酸化され、活性化されるタンパク質キナーゼB(PKB、Aktとも呼ばれる)を介して媒介される。インスリンの、この経路を活性化する能力を評価するために、飼料食またはHFDを摂取したWT及びMNK2−KOマウスにインスリンを投与し、30分後に屠殺してインスリン抵抗性を試験した。試料を血液から採取し、脂肪組織及び骨格筋(腓腹筋)も採取した。組織試料を、インスリンシグナル伝達の様々なパラメータについて免疫ブロットにより分析した。WTマウスにおいて、インスリン投与は、脂肪組織(図5B)及び筋肉(図5B、5C)におけるその活性化に関与する主部位であるSer473及びThr308におけるPKBのリン酸化の増加を引き起こした。これらの効果は、HFDを摂取したWT動物で減少し、インスリンの効果に対する部分的な抵抗性を示した。飼料食のMNK1−KOまたはMNK2−KOマウスにおいて、インスリン誘発性PKBリン酸化は、飼料食のWT動物と同様であったが、インスリン誘発性PKBリン酸化は、HFD上のMNK1−KOまたはMNK2−KOマウスにおいて、WT/HFD動物より高く、インスリン抵抗性がMNK−KO/HFDマウスの両方において減弱されたことを示した(図5B、5C)。
総GLUT4タンパク質の増加が、WTまたは飼料食摂取MNK2−KO動物のいずれかと比較して、MNK2−KO/HFDマウスの脂肪組織で観察された(図5D)。GLUT4は、このホルモンに応答してグルコースのインスリン応答性組織への取り込みを媒介する、重要なインスリン調節されたグルコース輸送体である。インスリンは、PKBを含むシグナル伝達経路を介して細胞膜へのその転座を促進する。したがって、WT/HFDマウスと比較して、MNK2 KO/HFD動物の改善されたグルコース耐性は、改善されたインスリン感受性及び/またはシグナル伝達と、より高いレベルのGLUT4タンパク質との組み合わせを含む可能性が高い。Glut4 mRNAレベルは、WT動物と比較して、飼料食またはHFDのMNK2−KO動物の脂肪組織においてわずかに低かった(データ示さず)。GLUT4タンパク質のレベルは、野生型動物と比較して、MNK1−KO動物の脂肪においてより低い傾向があった(図5D)。骨格筋において、eIF4Eリン酸化は、MNK2−KOマウスでは低下したが、MNK1−KO動物では低下せず(図5E)、MNK2がこの組織において最も活性なMNKアイソフォームであるが、MNK1も寄与することを示す。インスリン誘発性PKBリン酸化は、飼料食と比較してHFDを摂取したWTマウスでは減少したが、それは、MNK1−KOまたはMNK2−KO動物では損なわれなかった。GLUT4タンパク質のレベルは、MNK2−KOマウス、特にHFDのマウスの筋肉においてより高い傾向があったが、その差は、有意性に達しなかった(図5E〜5F)。したがって、MNK1及びMNK2は両方とも、HFD摂取マウスの脂肪組織及び筋肉におけるインスリンシグナル伝達を損なう役割を果たす。
MNK2−KOマウスは、HFD誘発性脂肪炎症に対して保護される
体重増加及びインスリン抵抗性に加えて、HFDを消費する結果として、炎症誘発性M1マクロファージで浸潤される、特に脂肪組織における炎症がある。飼料食またはHFDのいずれかを摂取していたWT、MNK1−KO、及びMNK2−KOマウスからの脂肪組織におけるマクロファージ及びM1−極性化マクロファージのマーカーを調べた。WT/HFD及びMNK1−KO/HFDマウスは、WT/HFD動物と比較して、Cd68及びF4/80などのマクロファージマーカーのためのmRNAレベルにおいて増加を示した(図6A、6B)。MNK2−KO/HFDマウスにおける変化したマクロファージマーカーを考慮して、炎症誘発性(M1マクロファージ)マーカーCd11c及びTnfα(図6C、6D)、ケモカイン受容体Ccr2及びCcr5(マクロファージ輸送において重要;データ示さず)、ならびに細胞移動を可能にする細胞外マトリックスの消化に関与するMmp12(マトリックスメタロプロテイナーゼ12;データ示さず)及びAdam8(データ示さず)。著しく対照的に、MNK1−KO/HFDマウスではなくMNK2−KO/HFDマウスは、飼料食での同じ動物と比較して、急減した炎症を示し、Cd68、F4/80、Tnfα、Cd11c、MhcII mRNAs(図6A〜6D)、及びCcr2、Ccr5、Mmp12、またはAdam8 mRNA(データ示さず)の増加がほとんどない、またはまったくなかった。まとめると、これらのデータは、HFDでは、MNK2−KOマウスの脂肪組織は、(Cd68及びF4/80 mRNAの正常な顕著な増加がないことに基づいて)マクロファージで大きく浸潤されることはない、またはCd11c及びTnfαのレベルの著しい鈍化によって示されるように、炎症誘発性M1マクロファージにおける増加を示す。脂肪細胞MHCIIは、免疫細胞をHFD摂食動物における脂肪組織に誘引する際に重要な役割を果たすことが報告されているため、MNK2−KOマウスにおけるMhcIIの増加の欠如が興味深い。更に、飽和脂肪が多い食事は、c−junアミノ末端キナーゼ(JNK)の活性化を介してインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。しかしながら、MNKは、JNKによって活性化されず、HFD−MNK2−KOマウスで観察された表現型におけるJNKの役割を排除する(Waskiewiczら、1997)。
体重増加及びインスリン抵抗性に加えて、HFDを消費する結果として、炎症誘発性M1マクロファージで浸潤される、特に脂肪組織における炎症がある。飼料食またはHFDのいずれかを摂取していたWT、MNK1−KO、及びMNK2−KOマウスからの脂肪組織におけるマクロファージ及びM1−極性化マクロファージのマーカーを調べた。WT/HFD及びMNK1−KO/HFDマウスは、WT/HFD動物と比較して、Cd68及びF4/80などのマクロファージマーカーのためのmRNAレベルにおいて増加を示した(図6A、6B)。MNK2−KO/HFDマウスにおける変化したマクロファージマーカーを考慮して、炎症誘発性(M1マクロファージ)マーカーCd11c及びTnfα(図6C、6D)、ケモカイン受容体Ccr2及びCcr5(マクロファージ輸送において重要;データ示さず)、ならびに細胞移動を可能にする細胞外マトリックスの消化に関与するMmp12(マトリックスメタロプロテイナーゼ12;データ示さず)及びAdam8(データ示さず)。著しく対照的に、MNK1−KO/HFDマウスではなくMNK2−KO/HFDマウスは、飼料食での同じ動物と比較して、急減した炎症を示し、Cd68、F4/80、Tnfα、Cd11c、MhcII mRNAs(図6A〜6D)、及びCcr2、Ccr5、Mmp12、またはAdam8 mRNA(データ示さず)の増加がほとんどない、またはまったくなかった。まとめると、これらのデータは、HFDでは、MNK2−KOマウスの脂肪組織は、(Cd68及びF4/80 mRNAの正常な顕著な増加がないことに基づいて)マクロファージで大きく浸潤されることはない、またはCd11c及びTnfαのレベルの著しい鈍化によって示されるように、炎症誘発性M1マクロファージにおける増加を示す。脂肪細胞MHCIIは、免疫細胞をHFD摂食動物における脂肪組織に誘引する際に重要な役割を果たすことが報告されているため、MNK2−KOマウスにおけるMhcIIの増加の欠如が興味深い。更に、飽和脂肪が多い食事は、c−junアミノ末端キナーゼ(JNK)の活性化を介してインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。しかしながら、MNKは、JNKによって活性化されず、HFD−MNK2−KOマウスで観察された表現型におけるJNKの役割を排除する(Waskiewiczら、1997)。
したがって、結果は、HFDがWTマウスの脂肪組織において広範囲の炎症を誘発するが、MNK2−KOマウスは、HFDの炎症誘発性の作用に対して保護されることを示す。興味深いことに、MNK1−KO/HFDマウスは、インスリン抵抗性及びグルコース不耐性に対する部分的な保護を示すが、それらは、WT/HFD動物と同様の脂肪組織炎症を依然として呈示する。これは、高脂肪摂食に応答するMNK1及びMNK2の異なる役割を明確に示す。しかしながら、保護の根拠が異なるように思われることは注目に値し、MNK1−KOマウスは、それらの保護と同時に、脂肪増加及び炎症の減少を示す一方、MNK2−KOマウスは、WTマウスと同様に、体重及び脂肪組織を増加させるが、それでもなお、インスリン抵抗性に対して保護されている。
マクロファージ生物学
MNK2−KOマウスからのマクロファージを、それらがTNFα及びIL−6などのサイトカインの産出において本質的に欠陥があるかどうかを判断するために評価した。MNK1及びMNK2の両方は、骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるeIF4Eリン酸化に寄与する(データ示さず)。それらの調節特徴と一致して、WT BMDMにおけるリポ多糖(LPS)によって誘発されたeIF4Eの増加は、MNK1−KO細胞において失われた(データ示さず)。野生型またはMNK2−KOマウスからのBMDMを、リポ多糖(LPS)によってインビトロで刺激し、サイトカインmRNAレベルを評価した。LPSは、野生型及びMNK2−KO BMDMのTnfα及びIL−6 mRNAのレベルを同様の程度まで増加させた(データ示さず)。これらのデータは、MNK2−KO BMDMの、LPSに応答し、サイトカインを産出する能力に本質的な欠陥がないことを示す。
MNK2−KOマウスからのマクロファージを、それらがTNFα及びIL−6などのサイトカインの産出において本質的に欠陥があるかどうかを判断するために評価した。MNK1及びMNK2の両方は、骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるeIF4Eリン酸化に寄与する(データ示さず)。それらの調節特徴と一致して、WT BMDMにおけるリポ多糖(LPS)によって誘発されたeIF4Eの増加は、MNK1−KO細胞において失われた(データ示さず)。野生型またはMNK2−KOマウスからのBMDMを、リポ多糖(LPS)によってインビトロで刺激し、サイトカインmRNAレベルを評価した。LPSは、野生型及びMNK2−KO BMDMのTnfα及びIL−6 mRNAのレベルを同様の程度まで増加させた(データ示さず)。これらのデータは、MNK2−KO BMDMの、LPSに応答し、サイトカインを産出する能力に本質的な欠陥がないことを示す。
LPSとIFNγとの組み合わせによる長期間(24時間)の効果を調べて、炎症誘発性M1表現型に対するBMDMの極性化を評価した。WT及びMNK2−KO BMDMは、同様に応答し、MNK2が、BMDMによるこれらの炎症誘発性サイトカインの産出に必要とされないことを示した(データ示さず)。
MNK2−KO/HFDマウスの血漿において、2つの抗炎症マーカー、Il−10及びIl−5のmRNAレベルの有意な増加が、WT/HFDマウスと比較して観察された(図7A、7B)。WT及びMNK2−KOマウスからのBMDMの、M2抗炎症性表現型に分極する固有の能力を調べた。興味深いことに、MNK2−KOマウスからのBMDMは、WT BMDMと比較して、制御条件下でIL−10及びPparγレベルの上昇を示し、調べられたM2極性化の全てのマーカーは、IL−4での24時間の刺激後に増加した(図7C−7F)。リン酸化されたeIF4Eに関するデータは、MNK2がマクロファージにおける主アイソフォームであることを示す(データ示さず)。まとめると、このデータは、MNK2−KOマウスからのマクロファージが、抗炎症性表現型に対するより高い傾向を有することを示唆する。
高脂肪摂取は、野生型マウスではなくMNK2−KOにおいてNrf2発現を誘導する
核因子赤血球2関連因子2(Nrf2)は、広範な脂肪酸酸化から生じ得る酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、また、メタボリックシンドロームの発症を防ぐことも報告される。MNK2−KOマウスがメタボリックシンドロームの指標に対する保護を示すことを前提として、WT及びMNK2−KOマウスの肝臓におけるNrf2の発現を調べた。レベルは、飼料食を摂取したマウスにおいて同様であった。Nrf2 mRNAレベルは、HFDを摂取したMNK2−KOマウスで顕著に増加したが、対応する対照動物では増加しなかった(図8A)。肝Nrf2タンパク質レベルも、MNK2−KOマウスにおいて増加を示したが、その変化は、有意に達しなかった。したがって、Nrf2機能の増加を確認するために、よく特徴付けられたNrf2標的遺伝子であるハエムオキシゲナーゼ(haem oxygenase)−1(HO−1)の発現も試験し、それは、Nrf2自体のタンパク質発現と同様のパターンを示した(図8B)。興味深いことに、Nrf2の活性化は、脂肪症を予防すると報告される。Nrf2は、PPARαによって転写的に制御され得るが、しかしながら、HFDのMNK2−KOまたはWTマウスの肝臓では、PPARαレベルの変化は観察されなかった(データ示さず)。
核因子赤血球2関連因子2(Nrf2)は、広範な脂肪酸酸化から生じ得る酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、また、メタボリックシンドロームの発症を防ぐことも報告される。MNK2−KOマウスがメタボリックシンドロームの指標に対する保護を示すことを前提として、WT及びMNK2−KOマウスの肝臓におけるNrf2の発現を調べた。レベルは、飼料食を摂取したマウスにおいて同様であった。Nrf2 mRNAレベルは、HFDを摂取したMNK2−KOマウスで顕著に増加したが、対応する対照動物では増加しなかった(図8A)。肝Nrf2タンパク質レベルも、MNK2−KOマウスにおいて増加を示したが、その変化は、有意に達しなかった。したがって、Nrf2機能の増加を確認するために、よく特徴付けられたNrf2標的遺伝子であるハエムオキシゲナーゼ(haem oxygenase)−1(HO−1)の発現も試験し、それは、Nrf2自体のタンパク質発現と同様のパターンを示した(図8B)。興味深いことに、Nrf2の活性化は、脂肪症を予防すると報告される。Nrf2は、PPARαによって転写的に制御され得るが、しかしながら、HFDのMNK2−KOまたはWTマウスの肝臓では、PPARαレベルの変化は観察されなかった(データ示さず)。
パルミテート誘発性のインスリン抵抗性の治療
インスリン抵抗性のC2C12骨格筋モデルを使用して、パルミテート(レベル高脂肪食に血液中の増加遊離脂肪酸)処理がP−eIF4Eを増加させることが観察され、したがって、パルミテートがMNK酵素を活性化することを示した。更なる実験を、100mMのインスリンで10及び60分間刺激する前に、4mMのパルミテートで16時間処理されたC2C12細胞を用いて行った。細胞のいくつかを3μMのMNK阻害剤、Mnk−I1で更に処理した。結果(図9参照)は、阻害剤がMNK1及びMNK2を不活性化したことを示したが(処理された細胞におけるP−eIF4Eのレベル低下を参照されたい)、インスリンシグナル伝達マーカー、P−PKB308は、MNK阻害剤がパルミテート暴露の間にインスリンシグナリングを回復させることができることを示した。
インスリン抵抗性のC2C12骨格筋モデルを使用して、パルミテート(レベル高脂肪食に血液中の増加遊離脂肪酸)処理がP−eIF4Eを増加させることが観察され、したがって、パルミテートがMNK酵素を活性化することを示した。更なる実験を、100mMのインスリンで10及び60分間刺激する前に、4mMのパルミテートで16時間処理されたC2C12細胞を用いて行った。細胞のいくつかを3μMのMNK阻害剤、Mnk−I1で更に処理した。結果(図9参照)は、阻害剤がMNK1及びMNK2を不活性化したことを示したが(処理された細胞におけるP−eIF4Eのレベル低下を参照されたい)、インスリンシグナル伝達マーカー、P−PKB308は、MNK阻害剤がパルミテート暴露の間にインスリンシグナリングを回復させることができることを示した。
実施例2 MNK1及びMNK2ダブルノックアウト動物の作製、及び高脂肪食(HFD)を用いた研究
WT及びMNK−KOマウスにおける研究
本実施例に記載される研究は、5〜6世代にわたるストックC57Bl/6マウスに対して戻し交配した、実施例1に記載されているようなマウスを用いて行った。次いで、ヘテロ接合MNK1−KO(Mknk1+/−)及びMNK2−KO(Mknk2+/−)マウスを交配して、WT及びMNK1+MNK2ダブルKO(Mknk1−/−;Mknk2−/−;DKO)動物、ならびにMNK1−KO(Mknk1−/−)及びMNK−KO(Mkn2−/−)動物を得た。MNK1及びMNK2のノックアウトは、マウスの発達、生存能力、または生殖能に影響を及ぼさず(Uedaら、2004)、これと一致することが既に報告されており、MNK1及びMNK2のノックアウトの有害作用は、飼料食または高脂肪食を摂取したマウスにおいて観察されなかった。飼料食及びHFDは、実施例1に記載したものと同様であった。この場合、飼料食製剤は、Teklad Global 18%Protein Rodent Diet(Envigo、米国、ウィスコンシン州、マジソン)であり、HFD製剤は、Specialty Feeds Pty Ltd(Diet SF15−095;豪州、西オーストラリア州、グレンフォレスト)から調達した。
WT及びMNK−KOマウスにおける研究
本実施例に記載される研究は、5〜6世代にわたるストックC57Bl/6マウスに対して戻し交配した、実施例1に記載されているようなマウスを用いて行った。次いで、ヘテロ接合MNK1−KO(Mknk1+/−)及びMNK2−KO(Mknk2+/−)マウスを交配して、WT及びMNK1+MNK2ダブルKO(Mknk1−/−;Mknk2−/−;DKO)動物、ならびにMNK1−KO(Mknk1−/−)及びMNK−KO(Mkn2−/−)動物を得た。MNK1及びMNK2のノックアウトは、マウスの発達、生存能力、または生殖能に影響を及ぼさず(Uedaら、2004)、これと一致することが既に報告されており、MNK1及びMNK2のノックアウトの有害作用は、飼料食または高脂肪食を摂取したマウスにおいて観察されなかった。飼料食及びHFDは、実施例1に記載したものと同様であった。この場合、飼料食製剤は、Teklad Global 18%Protein Rodent Diet(Envigo、米国、ウィスコンシン州、マジソン)であり、HFD製剤は、Specialty Feeds Pty Ltd(Diet SF15−095;豪州、西オーストラリア州、グレンフォレスト)から調達した。
HFDでの体重増加
飼料食では、WT及びDKOマウスは、研究の16週間の期間にわたって同様の程度まで体重を増加させたが(データは示されていない)、4週齢では、MNK1−KOは、MNK2−KOまたはWTマウスよりもわずかに重かった(データ示さず)。GTTは、15〜16週目に行われたため、その時点以降に得られたデータは、マウスが直面した騒乱のために完全に信頼できるものではない。
飼料食では、WT及びDKOマウスは、研究の16週間の期間にわたって同様の程度まで体重を増加させたが(データは示されていない)、4週齢では、MNK1−KOは、MNK2−KOまたはWTマウスよりもわずかに重かった(データ示さず)。GTTは、15〜16週目に行われたため、その時点以降に得られたデータは、マウスが直面した騒乱のために完全に信頼できるものではない。
カロリー過負荷に対する動物の応答を試験するために、マウスは、離乳時(すなわち、4週齢から)から更に16週間(20週齢まで)、飼料食(対照群)または高エネルギー高脂肪食(HFD)を与えられた。HFDでは、WTマウスは、大幅により多く体重が増加した(HFDで、11週間または15週間で25または28g)。重要なことに、かつ実施例1に記載された観察と一致して、MNK2−KOマウスは、HFDにおいてWT対照群よりも実質的により少なく体重が増加し(図10)、MNK2の喪失がHFDでの体重増加に対して保護することを確認した。しかしながら、実施例1に記載された結果とは対照的に、この場合のMNK1−KOマウスは、実際に、WT対照群と同様に体重が増加し(図10)、この差異の理由は、これらの動物が以前に使用された動物と遺伝的に同一でないという事実、使用されたHFDの相違、または他の要因にあるかもしれない。DKOマウスでは、動物が15週までにMNK2−KOマウスよりもわずかに大きな体重増加を示したことが見出されたが、その増加は、WTまたはMNK1−KO動物に関して見られるものよりもまだ少ない(図10)。これは、両方のMNKのノックアウトが、部分的な保護を提供する各MNKアイソフォーム単独のKOよりも、体重増加に対するより大きな保護を提供すると推測されたため、予想外であった。したがって、データは、MNK1及びMNK2を無効にすることが、MNK2単独の損失よりも大きな利益をもたらさず、実際に、体重増加を防止することに関して、それほど有利でない可能性があることを示す。
GTTデータ
グルコース負荷試験を実施例1に記載したように行って、HFD摂食動物がグルコース不耐性(この設定では一般にインスリン抵抗性によって引き起こされる)を発症したかどうかを評価した。飼料食またはHFDのいずれかで11週間後、6時間の絶食後にグルコース負荷試験(GTT)を行った。空腹時グルコース濃度を、マウスに25%D−グルコース溶液(2g/kg体重;Sigma−Adrich、豪州)を腹腔内(ip)注射する前に、尾の先端から血液した出血から測定し、血中グルコース濃度をFreestyle Liteグルコメーター(Abbott、豪州、ニューサウスウェールズ州、マッコリ―パーク)を使用して腹腔内注射後15、30、60、及び120分に測定した。HFDを摂取したマウスは、グルコース耐性障害を示す。実施例1に記載の研究が、HFD摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスが、対応するWT動物よりも良好なグルコース耐性を示すということを示したことを前提として、MNK1+2−DKOマウスは、更に良好なグルコース耐性を示すであろうと予測された。しかしながら、図11に示すように、これは、事実ではない。実際に、MNK1−KOマウスは、WT−HFDマウスより良好なグルコース耐性を示さないことが見出された。更に、グルコースのボーラス投与後、HFD摂取MNK−DKOマウスにおいて、血漿グルコース値は、これらの遺伝子型のいずれの飼料食摂取マウスの状況と同様に、120分までにほぼベースラインまで戻った。したがって、MNK2−KOマウス(実施例1参照)と同様に、DKO動物は、これらのデータの曲線下面積(AUC)を計算することによって見られるように(データ示さず)、HFDを摂取したWTマウスより良好なグルコース耐性を示す。AUCの評価はまた、MNK1−KO/HFDマウスが、実際に、WT/HFD動物より劣り、MNK−DKO/HFDマウスよりはるかに劣るグルコース耐性を示し、グルコース濃度がMNK1−KO/HFDマウスにおいて著しく高いままであったことを明らかにした(図11)。
グルコース負荷試験を実施例1に記載したように行って、HFD摂食動物がグルコース不耐性(この設定では一般にインスリン抵抗性によって引き起こされる)を発症したかどうかを評価した。飼料食またはHFDのいずれかで11週間後、6時間の絶食後にグルコース負荷試験(GTT)を行った。空腹時グルコース濃度を、マウスに25%D−グルコース溶液(2g/kg体重;Sigma−Adrich、豪州)を腹腔内(ip)注射する前に、尾の先端から血液した出血から測定し、血中グルコース濃度をFreestyle Liteグルコメーター(Abbott、豪州、ニューサウスウェールズ州、マッコリ―パーク)を使用して腹腔内注射後15、30、60、及び120分に測定した。HFDを摂取したマウスは、グルコース耐性障害を示す。実施例1に記載の研究が、HFD摂取MNK1−KOまたはMNK2−KOマウスが、対応するWT動物よりも良好なグルコース耐性を示すということを示したことを前提として、MNK1+2−DKOマウスは、更に良好なグルコース耐性を示すであろうと予測された。しかしながら、図11に示すように、これは、事実ではない。実際に、MNK1−KOマウスは、WT−HFDマウスより良好なグルコース耐性を示さないことが見出された。更に、グルコースのボーラス投与後、HFD摂取MNK−DKOマウスにおいて、血漿グルコース値は、これらの遺伝子型のいずれの飼料食摂取マウスの状況と同様に、120分までにほぼベースラインまで戻った。したがって、MNK2−KOマウス(実施例1参照)と同様に、DKO動物は、これらのデータの曲線下面積(AUC)を計算することによって見られるように(データ示さず)、HFDを摂取したWTマウスより良好なグルコース耐性を示す。AUCの評価はまた、MNK1−KO/HFDマウスが、実際に、WT/HFD動物より劣り、MNK−DKO/HFDマウスよりはるかに劣るグルコース耐性を示し、グルコース濃度がMNK1−KO/HFDマウスにおいて著しく高いままであったことを明らかにした(図11)。
したがって、MNK1の喪失は、HFD誘発性グルコース不耐性に対して一貫して保護しないと思われる。これは、なぜMNK1及びMNK2の喪失が、HFD摂取マウスのGTTにおけるそれらの能力に関して、MNK2単独の喪失よりも更なる利益を与えないのかを説明するのに役立つかもしれない。
まとめると、この実施例で提供されたデータは、MNK2をノックアウトすることが、HFDでのグルコース耐性の改善(代謝の健康)に関して、一貫して有益であることを示す。対照的に、MNK1の喪失の効果は、おそらく、正確な遺伝的背景及び/または食餌の正確な成分よって変化すると思われる。更に、両方のMNKのノックアウトは、MNK2単独の損失より優れた効果を提供しない。したがって、本開示に従って前糖尿病を治療する方法において、両方の酵素に影響を与える二重阻害剤ではなく、MNK2の特異的阻害剤を使用する方が、はるかに信頼性が高く、有効であろう。
実施例3 3T3−L1細胞におけるeIF4Eリン酸化に対するMNK2特異的阻害の効果
3T3−L1細胞における研究
実施例1で説明されたように、正常飼料食でのMNK2−KOマウスは、同量の性腺脂肪組織の同じ量を含有するが、そのような組織は、より少なく、より大きい脂肪細胞(脂肪細胞)を有することが見出された。これは、脂肪細胞の産出(すなわち、脂肪細胞の分化)における欠陥を示唆する。HFDでは、脂肪細胞は、通常、より大きくなり、動物がより多くの脂肪を貯蔵し、より重くなることを可能にする。しかしながら、MNK2−KOマウスでは、脂肪細胞は、HFDで大きくならず、なぜこれらのマウスがWT/HFDマウスほど重くならないのかを説明する可能性が高い。理論に縛られることを望まないが、この更なるサイズ増加の欠如は、(i)MNK2−KOマウスにおけるより大きな脂肪細胞が貯蔵容量に達し、それらの脂肪含有量を増加させることができないという事実、及び/または(ii)そのような細胞の、脂肪を貯蔵する本来の能力が損なわれるということ、を反映し得る。
3T3−L1細胞における研究
実施例1で説明されたように、正常飼料食でのMNK2−KOマウスは、同量の性腺脂肪組織の同じ量を含有するが、そのような組織は、より少なく、より大きい脂肪細胞(脂肪細胞)を有することが見出された。これは、脂肪細胞の産出(すなわち、脂肪細胞の分化)における欠陥を示唆する。HFDでは、脂肪細胞は、通常、より大きくなり、動物がより多くの脂肪を貯蔵し、より重くなることを可能にする。しかしながら、MNK2−KOマウスでは、脂肪細胞は、HFDで大きくならず、なぜこれらのマウスがWT/HFDマウスほど重くならないのかを説明する可能性が高い。理論に縛られることを望まないが、この更なるサイズ増加の欠如は、(i)MNK2−KOマウスにおけるより大きな脂肪細胞が貯蔵容量に達し、それらの脂肪含有量を増加させることができないという事実、及び/または(ii)そのような細胞の、脂肪を貯蔵する本来の能力が損なわれるということ、を反映し得る。
脂肪細胞分化におけるMNK2の役割を研究するために、3T3−L1細胞を実施例1に記載したのと同様の方法で使用した。3T3−L1線維芽細胞は、イソブチルメチルキサンチン(IBMX、500μM;cAMPを上昇させる)、インスリン(350nM)、デキサメタゾン(0.5μM;ステロイド)、及びロシグリタゾン(2μM;転写因子PPARγを刺激する)の組み合わせでインキュベートされた時、脂肪細胞に分化する。この刺激の「カクテル」に応答して、これらの細胞は、まずクローン増殖を受け、続いて、転写因子のカスケードの誘導が後続し、脂肪生成に関与する遺伝子の発現を引き起こす。
結果(図12に示される)は、Mnk2 mRNAが分化カクテルの添加後に非常に急速に誘導される(>3倍×3時間、Mnk2 mRNA発現が低下してから約6時間まで持続する)ことを明らかにし、それを脂肪生成において役割を果たすように位置付けた。実施例1では、MNK阻害剤、CGP57380が、C/EBPα、PPARγ、及びSREBP1c(脂質貯蔵に関与する遺伝子の発現を促進する)などの重要な転写因子の誘導を損なうことが示された。また、CGP57380がグルコース、ならびに脂質トランスポーターGLUT4及びCD36の発現を阻害することも見出され、なぜ脂肪貯蔵がインビボでMNK2−KO脂肪細胞において制限されるのかを少なくとも部分的に説明することができる。ここでは、MNKも阻害する別の、別の全く異なる化合物、すなわち、セルコスポラミドを試験するための研究を行った。図13に示すように、セルコスポラミドは、PPARγなどの遺伝子の誘導(図13A)及び脂質蓄積の減少(図13B)も損なう。
しかしながら、CGP57380及びセルコスポラミドは、MNKに加えて他のタンパク質キナーゼを阻害し、非常に強力なMNK阻害剤ではなく(Bainら、2007;Konicekら、2011)、例えば、P−eIF4Eを強く阻害するためには≧20μMの濃度で使用されなければならない。その結果、更なる阻害化合物、MNK−I1(Beggsら、2015)が研究された。MNK−I1は、CGP57380及びセルコスポラミドとは構造的に異なり、はるかにより特異的であり、CGP57380によって影響を受け追加のキナーゼを阻害しない(Beggsら、2015)。それはまた、はるかにより強力であり、3T3−L1細胞におけるMNK活性を、はるかに低い濃度(3μM;図14A、14B参照;CGP57380と比較して、同程度のp−eIF4Eの阻害を見るために50μMが必要とされた(図3c参照))で強く阻害する。重要なことに、細胞が、分化を受けるために細胞を少なくとも3日間インキュベートされなければならないことを前提として、MNK−I1のP−eIF4Eに対する効果は、少なくともこの期間持続する。
MNK−I1は、転写因子Cebpα、Cebpβ、Cebpδ、及びPparγ、ならびに脂肪酸シンターゼ及びアセチル−CoAカルボキシラーゼ(Fas及びAcc;脂質生成の重要な酵素)、ならびに脂質輸送体Cd36を含む、研究された脂肪生成遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された(図15A参照)。それはまた、オイルレッドO染色(データ示さず)または直接トリグリセリドアッセイ(図15B)によって判断されるように、脂質蓄積を遮断した。MNK−I1の効果が完全ではない(すなわち、総阻害ではない)という事実は、脂肪細胞数がMNK2−KOマウスにおいて減少したが、完全になくならないという観察と一致する。これはまた、MNK−2 KOマウスは、対照食餌において同様の総脂肪量を示すが、HFDを摂取した場合、それらの脂肪増加が大きく減少するという重要な知見と一致する。これは、患者の体重増加が減少または逆転することを意味するため、重要な臨床的意味を有するが、これは、脂肪組織の極度の喪失につながらない。
更なる研究において、MNK−I1と同様の一連の化合物を生成し、3T3−L1細胞におけるMNKを阻害するそれらの能力について試験した。化合物の構造を以下の表6に示す。eIF4Eは、MNKのみによってリン酸化されるため、そのリン酸化状態は、細胞内MNK活性の信頼できる読み出しである。新しい化合物のいくつかは、これらの細胞におけるeIF4Eリン酸化を阻害し、それらがMNKに対して活性であることを示した(表6)。特に、MNK−I2は、3T3−L1細胞においてP−eIF4Eを強く阻害し(図14A参照)、それが強力なMNK阻害剤であることを示す。更に、MNK1対MNK2に対するMNK−I1及びMNK−I2の相対的効果を評価するために、MNK1−KOまたはMNK2−KO動物からのマウス胚線維芽細胞(MEF)を使用した。MNK1−KO MEFにおいて、MNK−I2は、試験した全ての濃度でP−eIF4Eレベルをほとんど完全に阻害した(最低0.1μM)。これは、MNK−I1の効果と同様である(図16A)。対照的に、eIF4Eリン酸化がMNK1に依存するMNK2−KO細胞では、MNK−I2は、MNK−I1よりも弱い阻害効果を有し、それがMNK−I1よりもMNK1に対する低い活性を有することを示す(図16B)。したがって、これらの結果は、MNK1よりもMNK2に対するMNK−I2阻害剤の選択性を示す。MNK2は、3T3−L1細胞及び脂肪組織における主要なMNKである(Mooreら、2016)。
追加の研究では、3T3−L1細胞における分化マーカーの誘導に対するMNK−I2阻害剤の効果を評価するために試験を行った。MNK−I2が、研究された脂肪生成プログラムにおける遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された(図17A)。MNK−I2の効果の大きさは、MNK−I1のそれと同様であるか、場合によっては、より大きかった(図15Aと17Aとを比較)。これらの結果は、それらが、MNK2選択的阻害剤、例えば、MNK1+MNK2阻害剤CGP57380及びMNK−I1もまた、脂肪生成を損なうことを示し、MNK2が脂肪組織における重要なMNK2アイソフォームであるという結論を支持するという点において重要である。
したがって、KOマウス試験から得られたデータ(実施例2参照)及び3T3−L1細胞を用いてインビトロで実施された実験に基づいて(実施例3参照)、MNK−2選択的阻害剤は、かなり有望であり、MNK1及びMNK2の阻害剤よりも、前糖尿病対象の治療において有益である可能性が高い。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」及び「含む(include)」という語及び「含んでいる(comprising)」及び「含んでいる(including)」などの変形は、任意の他の整数または整数の群の除外ではなく、記載された整数または整数の群の包括を暗示すると理解されるであろう。
本明細書にある任意の先行技術への言及は、そのような先行技術が共通の一般知識の一部を形成するといういかなる形態の示唆の認知ではなく、そのように取られるべきではない。
本発明は、その使用において、記載された特定の用途に限定されないということは、当業者によって理解されるであろう。また、本発明は、本明細書に記載もしくは図示される特定の要素及び/または特徴に関して、その好ましい実施形態において限定されない。本発明は、開示された1つまたは複数の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によって記載され、定義された本発明の範囲から逸脱することなく多数の再構成、修正、及び置換が可能であることが理解されるであろう。
参考文献
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Worch,J et al.,Oncogene 23(57):9162−9172(2004).
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Claims (29)
- 5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療する方法であって、治療上有効な量の少なくとも1つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(MNK)阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記MNK阻害剤は、MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる、方法。
- 前記MNK阻害剤が、前記MNK2の生物活性を低下させる、請求項1に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、MNK2に対する選択性を示す、請求項1または2に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、前記MNK1の生物活性を低下させる、請求項1に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、前記MNK1及びMNK2の生物活性を低下させる、請求項1に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーから成る群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、ATP競合剤である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、N3−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ−[3,4−d]ピリミジン−3,4−ジアミン、または4−アミノ−3−(p−フルオロフェニルアミノ)ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、(9aS)−8−アセチル−9,9a−ジヒドロ−1,3,7−トリヒドロキシ−9a−メチル−9−オキソ−4−ジベンゾフランカボキサミド(dibenzofurancaboxamide)、4−[5−(4−ピペリジニル)−1H−ピラゾール−3−イル]ピリジンジヒロドクロリド、4−(2−(2−フルオロプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ジメチルアミノ)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミド、及び4−(2−イソプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ピロリジン−1−イル)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミドから選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MNK阻害剤が、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び/または賦形剤と任意に組み合わせて薬学的組成物として製剤化される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記空腹時グルコース障害(IFG)の段階にある前糖尿病の前記グルコース耐性障害(IGT)の段階への進行を予防する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、6.1mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも1つのMNK阻害剤の使用であって、前記MNK阻害剤が、前記MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる、使用。
- 5.5mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための医薬品の製造における、前記MNK1及び/またはMNK2の生物活性を低下させる少なくとも1つのMNK阻害剤の使用。
- 前記MNK阻害剤が、前記MNK2の生物活性を低下させる、請求項15または16に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、MNK2に対する選択性を示す、請求項15〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、前記MNK1の生物活性を低下させる、請求項15または16に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、前記MNK1及びMNK2の生物活性を低下させる、請求項15または16に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーから成る群から選択される、請求項15〜20のいずれか1項に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、ATP競合剤である、請求項15〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、N3−(4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ−[3,4−d]ピリミジン−3,4−ジアミン、または4−アミノ−3−(p−フルオロフェニルアミノ)ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、(9aS)−8−アセチル−9,9a−ジヒドロ−1,3,7−トリヒドロキシ−9a−メチル−9−オキソ−4−ジベンゾフランカボキサミド(dibenzofurancaboxamide)、4−[5−(4−ピペリジニル)−1H−ピラゾール−3−イル]ピリジンジヒロドクロリド、4−(2−(2−フルオロプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ジメチルアミノ)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミド、及び4−(2−イソプロポキシ)−4−フルオロフェニルアミノ)−N−(3−(ピロリジン−1−イル)プロピル)−5−メチルチエノ[2,3−d]ピリミジン−6−カルボキサミドから選択される、請求項15〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記MNK阻害剤が、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び/または賦形剤と任意に組み合わせて薬学的組成物として製剤化される、請求項15〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記対象が、空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する、請求項15〜24のいずれか1項に記載の使用。
- 前記対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する、請求項15〜24のいずれか1項に記載の使用。
- 前記方法が、前糖尿病の2型糖尿病への進行を予防及び/または遅延させる、請求項15〜24のいずれか1項に記載の使用。
- 前記方法が、前記空腹時グルコース障害(IFG)の段階にある前糖尿病の前記グルコース耐性障害(IGT)の段階への進行を予防する、請求項15〜25のいずれか1項に記載の使用。
- 前記対象が、6.1mmol/l〜6.9mmol/lの空腹時血漿グルコース値を特徴とする、請求項15〜28のいずれか1項に記載の使用。
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