定義及一般參數
如本說明書中所用，以下術語及片語一般意欲具有如在下文中闡述之含義，使用其之上下文另外指示的方面除外。 如本文所使用，在定量量測之情境下所使用的術語「約」意味著指定含量±10%，或者指定含量±5%或±1%。 術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留本文所揭示之化合物的生物學有效性及特性且在生物學上或其他方面並非不合需要的鹽。存在酸加成鹽及鹼加成鹽。醫藥學上可接受之酸加成鹽可自無機酸及有機酸製備。 適用於與基本化合物反應形成醫藥學上可接受之鹽(分別為酸加成或鹼加成鹽)之酸及鹼為熟習此項技術者所已知。類似地，自基本化合物(上文所揭示)製備醫藥學上可接受之鹽之方法為熟習此項技術者所已知且揭示於例如Berge等人
Journal of Pharmaceutical Science
, 1977年1月 第66卷, 第1期及其他來源中。 如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括賦形劑或諸如溶劑、稀釋劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑之劑、等滲劑及吸收延緩及類似者，該等劑對本發明化合物或其之使用為無毒的。這類載劑及劑製備醫藥學上活性物質之組合物的用途在所屬領域中為熟知的(參見例如Remington's
Pharmaceutical Sciences
, Mace Publishing Co., 費城, 賓夕法尼亞州 第17版(1985)；及
Modern Pharmaceutics
, Marcel Dekker, Inc. 第3版(G.S. Banker & C.T. Rhodes, 編)。 術語「治療有效量」及「有效量」可互換地使用且係指當以一個或多個劑量向需要此類治療之患者(例如人類)投與時，足以實現如下文所定義之治療的化合物的量。治療有效量應視患者、所治療的疾病、患者的體重及/或年齡、疾病的嚴重程度或由合格處方者或護理者決定的投與方式而變化。 術語「治療(treatment/treating)」意味著投與式(I)化合物或醫藥學上可接受之鹽，以便：(i)延遲疾病發作，即導致疾病的臨床症狀不發展或延緩其發展；(ii)抑制疾病，即遏制臨床症狀的發展；及/或(iii)緩解疾病，即導致臨床症狀或其嚴重程度的消退。
肝臟疾病
肝臟疾病基於疾病持續時間對肝臟的急性或慢性損害。肝臟損傷可以由感染、損傷、暴露於藥物或毒性化合物、酒精、食品中的雜質、及血液中正常物質之異常堆積、自體免疫程序、基因缺陷(諸如血色素沈積症)或其他未知的原因引起。例示性肝臟疾病包括但不限於肝硬化、肝纖維化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、酒精性脂肪變性肝炎(ASH)、肝缺血再灌注損傷、原發性膽汁性肝硬化(PBC)及及肝炎(包括病毒性肝炎及酒精性肝炎兩者)。 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)為肝臟細胞中並非由酒精引起的額外脂肪堆積。NAFLD可引起肝臟脹大(亦即脂肪變性肝炎)，其繼而可隨時間引起瘢痕形成(亦即肝硬化)且可引起肝癌或肝臟衰竭。NAFLD藉由肝細胞中脂肪的聚積表徵且常常與代謝症候群(例如2型糖尿病、胰島素抗性、高脂質血症、高血壓)的一些態樣有關。由於攝取富含碳水化合物及高脂的飲食，這一疾病的頻率變得愈加常見。NAFLD患者的子集(約20%)罹患非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。 NASH係脂肪肝病的子類型，其為NAFLD的更嚴重形式。其藉由巨泡性脂肪變性、肝細胞氣球樣變性及/或炎症表徵，最終引起肝瘢痕形成(亦即纖維化)。診斷患有NASH的患者進展為晚期肝纖維化且最終為肝硬化。對於患有末期疾病的肝硬化NASH患者，目前治療為肝臟移植。 研究顯示相當大比例(39%)的經診斷NASH患者未進行肝臟活體組織檢驗以確認診斷。更高比例的經診斷NASH患者具有除文獻所報告之外的代謝症候群參數(II型糖尿病54%、肥胖71%、代謝症候群59%)。82%的醫師使用下臨限值來界定與實踐指南建議相比的大量酒精攝入。88%的醫師對於NASH開立一些形式的藥理學治療處方(維生素E：開給53%NASH患者的處方；史他汀類(statins)：57%；二甲雙胍：50%)。因此，即使缺少確定的診斷或大量資料以支持干預，且排除NASH的酒精臨限值係低於預期，但絕大部分患者仍被開出藥物處方。 另一種常見肝臟疾病為原發性硬化性膽管炎(PSC)。其為緩慢損害膽管內部及肝臟外部的慢性或長期肝臟疾病。在患有PSC的患者中，膽汁由於膽管阻塞聚積在肝臟中，在此處其逐漸損害肝臟細胞且造成肝硬化或肝臟瘢痕形成。目前，沒有治癒PSC的有效治療。許多患有PSC的患者最終由於肝臟衰竭而需要肝臟移植，通常在診斷患有該疾病之後約10年。PSC還可引起膽管癌症。 肝纖維化發生在大部分類型的慢性肝病中，係細胞外基質蛋白(包括膠原蛋白)過度聚積。晚期肝纖維化導致肝硬化、肝臟衰竭及門靜脈高血壓且常常需要肝臟移植。
方法
本文中揭示在有需要之患者中治療及/或預防肝臟疾病的方法，該方法包含向患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之FXR促效劑的組合。可藉由血液中升高之酵素含量的存在來偵測活性肝臟疾病的存在。具體言之，已知超過臨床上可接受的正常範圍之丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)的血液含量為持續肝臟損傷的指示。在臨床上採用例行監測肝臟疾病患者的ALT及AST血液含量，以量測接受醫學治療時肝臟疾病的進展。使升高的ALT及AST降低至可接受的正常範圍內視為反映病患之持續肝臟損傷的嚴重程度降低的臨床跡象。 在某些實施例中，肝臟疾病為慢性肝臟疾病。慢性肝臟疾病涉及肝臟柔組織之進行性損壞及再生，引起纖維化及肝硬化。大體而言，慢性肝臟疾病可由病毒(諸如B型肝炎、C型肝炎、巨細胞病毒(CMV)或Epstein-Barr二氏病毒(EBV))、毒性劑或藥物(諸如酒精、甲胺喋呤(methotrexate)或呋喃妥因(nitrofurantoin)、代謝疾病(諸如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、血色素沈積症或威爾森氏病(Wilson’s disease))、自體免疫疾病(諸如自體免疫慢性肝炎、原發性膽汁膽管炎(先前稱為原發性膽汁性肝硬化)或原發性硬化性膽管炎)、或其他原因(諸如右心衰竭)引起。 在一個實施例中，本發明提供用於降低肝硬化程度的方法。在一個實施例中，肝硬化在病理上藉由正常微觀小葉架構的損失伴隨纖維化及結節性再生表徵。用於量測肝硬化程度的方法為此項技術中所熟知。在一個實施例中，肝硬化程度降低了約5%至約100%。在一個實施例中，個體中肝硬化程度降低了至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。 在某些實施例中，肝臟疾病為代謝肝臟疾病。在一個實施例中，肝臟疾病為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。NAFLD與胰島素抗性及代謝症候群(肥胖、合併高脂質血症、糖尿病(II型)及高血壓)相關。NAFLD視為涵蓋一定範圍的疾病活動，且以肝臟中的脂肪聚積開始(肝脂肪變性)。 已顯示肥胖及胰島素抗性兩者很可能在NAFLD的疾病程序中起重要作用。除不良飲食以外，NAFLD具有數個其他已知原因。舉例而言，NAFLD可由某些藥劑引起，該等藥劑例如胺碘酮、抗病毒藥物(例如核苷類似物)、阿司匹林(罕見地在兒童中作為雷氏症候群之部分)、皮質類固醇甲胺喋呤、他莫昔芬(tamoxifen)或四環素。藉由高果糖玉米糖漿的存在NAFLD還與攝取清涼飲料有關，該糖漿可引起腹中脂肪沈積增加，不過攝取蔗糖顯示類似效果(很可能由於其分解成果糖)。已知遺傳亦起作用，因為已經確認對此易感性的兩種基因突變。 若未經治療，則NAFLD可能發展成非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)，其為NAFLD之最極端形式，係其中脂肪變性與炎症及纖維化組合的狀態。NASH視為肝臟之肝硬化的主要原因。因此，本發明提供在有需要之患者中治療及/或預防非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的方法，該方法包含向患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之FXR促效劑的組合。 本發明亦提供在有需要之患者中治療及/或預防肝纖維化的方法，該方法包含向患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之FXR促效劑的組合。肝纖維化係在大部分類型的慢性肝病中發生的細胞外基質蛋白(包括膠原蛋白)的過度聚積。在某些實施例中，晚期肝纖維化導致肝硬化及肝臟衰竭。用於量測肝臟組織學(例如纖維化程度之變化、小葉肝炎及門靜脈周圍橋連壞死)的方法為此項技術中所熟知。 在一個實施例中，肝纖維化(其為纖維組織、類纖維瘤或纖維變性之形成)之程度降低了超過約90%。在一個實施例中，纖維化(其為纖維組織、類纖維瘤或纖維變性之形成)之程度降低了至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約40%、至少約30%、至少約20%、至少約10%、至少約5%或至少約2%。 在一個實施例中，本文所提供之化合物降低肝臟中纖維生成之程度。肝臟纖維生成係引起過量胞外基質成分在肝臟中沈積的稱為纖維化之過程。其在多種病症中觀察到，例如慢性病毒性B型及C型肝炎、酒精性肝臟疾病、藥物誘導之肝臟疾病、血色素沉著症、自體免疫肝炎、威爾森氏病、原發性膽汁膽管炎(先前稱為原發性膽汁性肝硬化)、硬化性膽管炎、肝臟血吸蟲病及其他。在一個實施例中，纖維生成之程度降低了超過約90%。在一個實施例中，纖維生成之程度降低了至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少40%、至少約30%、至少約20%、至少約10%、至少約5%或至少2%。 在再其他實施例中，本發明提供在有需要之患者中治療及/或預防原發性硬化性膽管炎(PSC)的方法，該方法包含向患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之FXR促效劑的組合。 已觀察到患有NASH的患者在表觀遺傳測試中比健康的患者平均年長約2.8歲。由此，在一個實施例中適用於治療NASH的化合物將適用於減緩、改善或逆轉表觀遺傳年齡或因NASH所致的衰老效應。在另一實施例中，用於治療NASH的組合療法(諸如如本文所揭示之ASK1抑制劑與FXR促效劑的組合)可以適用於改善或逆轉因NASH所致的衰老效應。 在一個實施例中，ASK1抑制劑與FXR促效劑可以在組合調配物中一起投與，或在分開的醫藥組合物中投與，其中各抑制劑可以任何適合之劑型調配。在某些實施例中，本文所提供之方法包含分開地投與包含ASK1抑制劑及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物及包含FXR促效劑及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。根據本發明的組合調配物包含ASK1抑制劑及FXR促效劑及一種或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，及視情況其他治療劑。含有活性成分之組合調配物可呈適用於預期投與方法之任何形式。
ASK1 抑制劑
在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為具有式(I)結構的化合物：
，或其醫藥學上可接受之鹽。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為具有式(II)結構的化合物：
，或其醫藥學上可接受之鹽。 式(I)及式(II)化合物可以使用熟習此項技術者已知的方法來合成及特徵化，諸如描述於美國專利申請公開案第2011/0009410號及第2013/0197037號中的彼等方法。在一個實施例中，ASK1抑制劑為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，ASK1抑制劑為式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
FXR 促效劑
在本文所揭示之方法及醫藥組合物的一些實施例中，FXR促效劑為具有式(III)結構的化合物：
，或其醫藥學上可接受之鹽。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，FXR促效劑為具有式(IV)結構的化合物：
，或其醫藥學上可接受之鹽。 式(III)及式(IV)化合物可以使用熟習此項技術者已知的方法來合成及特徵化，諸如描述於中美國公開案第2014/0221659號中的彼等方法。
給藥及投與
雖然可能單獨投與活性成份，但較佳係呈如下文所述的醫藥調配物或醫藥組合物。本發明之用於獸醫學及用於人類用途的調配物均包含至少一種活性成分、與其對應的一種或多種可接受載劑及視情況選用之其他治療性成分。載劑必須在與調配物之其他成分相容及對其受體生理學無害之意義上為「可接受」的。 各活性成分可與習知載劑及賦形劑一起調配，該等載劑及賦形劑將根據一般操作法選擇。錠劑可能含有賦形劑、滑動劑、填充劑、結合劑及其類似物。水性調配物以無菌形式製備，且在意欲藉由除經口投藥以外的方式遞送時通常為等滲性。所有調配物將視情況含有賦形劑，諸如Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986)中所闡述之賦形劑。賦形劑包括抗壞血酸及其他抗氧化劑、螯合劑(諸如EDTA)、碳水化合物(諸如糊精)、羥烷基纖維素、羥基烷基甲基纖維素、硬脂酸及其類似物。調配物之pH值在約3至約11範圍內，但通常為約7至10。 活性成份之治療有效量可容易地藉由熟練臨床醫師使用常規劑量遞增試驗來確定。通常，活性成份將以0.01毫克至2克的劑量投與。在一個實施例中，劑量將為約10毫克至450毫克。在另一實施例中，劑量將為約25至約250毫克。在另一實施例中，劑量將為約50或100毫克。在一個實施例中，劑量將為約100毫克。在一個實施例中，投與18 mg ASK1抑制劑。在一具體實施例中，投與18 mg式(II)化合物。在一個實施例中，投與30 mg FXR促效劑。在一具體實施例中，投與30 mg式(III)化合物。預期活性成份可以一天投與一次、兩次或三次。另外，活性成份可以一週投與一次或兩次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次或每六週一次。 活性成份之醫藥組合物可包括適合於前述投與途徑的彼等醫藥組合物。調配物可宜以單位劑型呈現且可藉由藥劑學技術中熟知之任何方法來製備。技術及調配物一般見於Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)中。此類方法包括使活性成分與構成一或多種附屬成分之載劑締合的步驟。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密結合且隨後必要時使產物成形來製備調配物。 適合於經口投與的調配物可呈現為分散單元形式，諸如各含有預定量之活性成份的膠囊、扁囊劑或錠劑；粉末或顆粒形式；於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式；或呈水包油液體乳液或油包水液體乳液形式。活性成分亦可以大丸劑、舐劑或糊劑形式呈現。在某些實施例中，活性成份可以皮下注射形式投與。 錠劑可藉由視情況與一或多種輔助成分一起壓縮或成型來製造。壓製錠劑可藉由在合適的機器中壓縮視情況與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑或界面活性劑混合之自由流動形式(諸如粉末或顆粒)的活性成分來製備。可藉由在適合機器中模製經惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀活性成分之混合物來製備模製錠劑。可將錠劑視情況包覆或刻痕且視情況調配，以便提供自其緩慢或控制釋放之活性成分。 活性成份可藉由任何適於病症的途徑投與。適合途徑包括經口、直腸、經鼻、局部(包括口腔及舌下)、陰道及非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、鞘內及硬膜外)及其類似途徑。應瞭解，較佳途徑可隨例如接受者之病狀而變化。在某些實施例中，活性成分為經口生物可利用的且可因此經口給藥。在一個實施例中，患者為人類。 當以組合用於本文所揭示之方法中時，ASK1抑制劑及FXR促效劑可在單一醫藥組合物中一起投與或在超過一個醫藥組合物中分開(同時或依序)投與。在某些實施例中，ASK1抑制劑與FXR促效劑一起投與。在其他實施例中，ASK1抑制劑與FXR促效劑分開地投與。在一些態樣中，ASK1抑制劑在FXR促效劑之前投與。在一些態樣中，FXR促效劑在ASK1抑制劑之前投與。當分開投與時，ASK1抑制劑及FXR促效劑可藉由相同或不同的遞送途徑向患者投與。
醫藥組合物
本發明之醫藥組合物包含有效量的選自由式(I)化合物及式(II)化合物組成之群的ASK1抑制劑，及有效量的選自由式(III)化合物及式(IV)化合物組成之群的FXR促效劑。 當用於例如經口使用時，可製備錠劑、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬膠囊或軟膠囊、糖漿或酏劑。可根據製造醫藥組合物之技術中已知的任何方法製備意欲用於口服使用的組合物，且該等組合物可含有一或多種劑，包括甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以便提供可口製劑。含有與醫藥學上可接受之無毒賦形劑摻合的活性成分之錠劑為可接受的，其中該賦形劑適於製造錠劑。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、單水合乳糖、交聯羧甲基纖維素鈉、普維酮(povidone)、磷酸鈣或磷酸鈉；製粒劑及崩解劑，諸如玉米澱粉或褐藻酸；結合劑，諸如纖維素、微晶纖維素、澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包覆或可利用已知技術(包括微囊封裝)包覆以延緩在胃腸道中之崩解及吸附，且因此提供較長時段的持久作用。舉例而言，可單獨或伴以蠟使用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之時間延遲材料。 用於經口使用之調配物亦可呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(諸如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。 本發明化合物之水性懸浮液含有與適於製造水性懸浮液之賦形劑摻合的活性材料。該等賦形劑包括懸浮劑，諸如羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；及分散劑或潤濕劑，諸如天然存在之磷脂(例如卵磷脂)、環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物(例如十七伸乙基氧基十六醇)、環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己醣醇酐之偏酯的縮合產物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑，諸如乙基或對羥基苯甲酸正丙酯；一種或多種著色劑；一種或多種調味劑及一種或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。 油性懸浮液可藉由使活性成分懸浮於植物油(諸如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油(諸如液體石蠟)中來調配。口服懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或十六醇。可添加甜味劑(諸如上述甜味劑)及調味劑，以提供可口的經口製劑。此等組合物可藉由添加抗氧化劑(諸如抗壞血酸)來保存。 適用於藉由添加水來製備水性懸浮液之本發明之分散性散劑及粒劑提供活性成分與分散劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之摻合物。適合之分散劑或濕潤劑及懸浮劑由上文已揭示之試劑例示。亦可存在其他賦形劑，例如甜味劑、調味劑及著色劑。 本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物油，諸如橄欖油或花生油；礦物油，諸如液體石蠟，或此等油之混合物。適合之乳化劑包括天然存在之膠狀物，諸如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然存在之磷脂，例如大豆卵磷脂；酯或衍生自脂肪酸及己醣醇酐之偏酯，諸如山梨糖醇酐單油酸酯，及此等偏酯與環氧乙烷之縮合產物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑及調味劑。糖漿及酏劑可用諸如甘油、山梨糖醇或蔗糖之甜味劑來調配。此類調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、調味劑或著色劑。 本發明之醫藥組合物可呈無菌可注射製劑形式，諸如無菌可注射水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據已知技術使用上文已提及之適合的分散劑或潤濕劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，諸如於1,3-丁二醇中之溶液；或製備成凍乾粉末。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用的有水、林格氏溶液及等張氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發性油可習知地用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸亦可用於製備可注射劑。 可與載體材料組合以產生單一劑型的活性成份之量將視所治療的主體及特定投與模式(諸如經口投與或皮下注射)而變化。舉例而言，意欲用於向人類經口投與之限時釋放調配物可含有約1至1000 mg活性材料與適當且適宜量之載劑材料的混配物，該量可在總組合物之約5%至約95% (重量:重量)範圍內變化。醫藥組合物可製備成提供容易量測之量以供投與。舉例而言，欲用於靜脈內輸注之水溶液每毫升溶液可含有約3 μg至500 μg活性成分，以便可以約30 mL/hr之速率進行適合體積之輸注。當經調配用於皮下投與時，調配物通常在約兩個月至約四個月的時段內投與約一個月兩次。 適於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者之血液等滲之溶質的水性及非水性無菌注射溶液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。 調配物可於單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿及小瓶)中呈現，且可在冷凍乾燥(凍乾)條件下儲存，其僅需要在臨使用前添加無菌液體載劑(例如注射用水)。即用型注射溶液及懸浮液由先前所描述之種類之無菌散劑、粒劑及錠劑製備。較佳單位劑量調配物為含有如上文中所述之日劑量或單位每日亞劑量或其適當部分之活性成分的調配物。
實例 實例 1. 在 NASH 大鼠模型 中之療效
進行以下研究以評估ASK1抑制劑與FXR促效劑之組合在非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)之嚙齒動物模型中的療效，相對於僅單獨的劑在該模型中之療效。在雄性韋斯大鼠中藉由投與膽鹼不足的高脂飲食(CDHFD)與長期投與亞硝酸鈉(CDHFD/NaNO
2
)組合以引起NASH。該模型利用NASH之「雙重受創理論(two hit theory)」，藉由在肝臟中誘導代謝功能異常(CDHFD)及氧化應激(NaNO
2
)以引起肝纖維化，其類似於在患有晚期NASH的患者中可見的特徵及嚴重程度。 大鼠經飼餵CDHFD共14週且在第4週至第14週投與NaNO
2
。在第4週至第14週投與式(III)化合物(作為飲食中之摻合物給予，調節為遞送30 mg/kg/天)、式(I)化合物(作為飲食中之0.2%摻合物投與)或媒劑。在14週研究完成時評估以下終點：i)肝纖維化，藉由肝臟羥脯胺酸(OHP)含量及藉由利用Picosirius紅(PSR)染色的膠原蛋白含量之定量形態量測分析來量測；ii)肝臟切片中的肌纖維母細胞活性，如藉由肌纖維母細胞標記物結蛋白(desmin)之定量IHC所量測；及iii)肝臟組織中之Col1a1及Timp1，由RT-PCR量測。
方法 動物
在研究中使用雄性韋斯大鼠(研究開始時年齡為6至8週)。所有動物在標準飼養箱條件下圈養且在研究開始之前使其使適應新環境14天。
CDHFD/NaNO2 大鼠模型 之生前實驗方案
實驗設計展示於表1中。所有CDHFD/NaNO
2
動物被飼餵膽鹼不足的高脂飲食(CDHFD；Research Diets, Inc)持續14週且此外以25 mg/kg之劑量(第4至10週)及以12.5 mg/kg之劑量(第10至14週)投與NaNO
2
的腹膜內注射(每週3次注射；Sigma Aldrich #31443) 式(III) (作為CDHFD飲食中的摻合物給予，調節為遞送30 mg/kg/天，n=10隻動物每組)及式(I) (作為CDHFD飲食中的0.2%摻合物給予，n=10每組)自第4週至第14週投與藥物。媒劑對照動物自第4週至第14週投與相同CDHFD飲食而不添加藥物(媒劑；n=10隻動物每組)。健康對照動物被飼餵正常飲食且不接受NaNO
2
(對照組，n=10每組)。在研究的最後一天，動物安樂死的四個小時之前大鼠接受式(I)或式(III)任一者之以30 mg/kg之劑量的單一口服管飼，且收集組織用於分析。在14週研究方案完成時評估所有終點。
表 1. 實驗設計及劑量組 PSR 及結蛋白 IHC 之定量形態量測分析
使用Leica AT2掃描儀以40X放大率捕捉天狼猩紅(Picrosirius Red，PSR)及結蛋白染色之載玻片之完整載玻片圖像。數位載玻片圖像對掃描質量進行檢查、經標註且導出至Leica Digital Image Hub檔案內適當的網路文件夾中。對完整載玻片掃描圖像使用Definiens Tissue Studio Architect XD (Definiens Inc.)進行定量圖像分析，以測定PSR及結蛋白之範圍及強度。Definiens Composer功能用以自周圍玻璃載片區分肝臟組織且用以分離及去除光學異常及組織缺陷。總PSR染色面積及結蛋白IHC染色經量測且表示為總肝臟染色面積之百分比。
藉由 qRT-PCR 之基因表現
兩個靶器官，回腸及肝臟，經受藉由qRT-PCR之基因表現分析。使用RNAzol RT試劑(Sigma Aldrich, 目錄號#R4533)及RNA分離套組(Qiagen, 目錄號#74182)遵循製造商之指令自25 mg經研磨之冷凍組織分離總RNA。cDNA由0.5 μg總RNA使用SuperscriptIITM逆轉錄酶(Life Technologies, 目錄號#18064-014)合成，該逆轉錄酶用50 pmol隨機六聚物引發。使用Absolute QPCR Rox Mix (Life Technologies, 目錄號#AB-1132)及384-格式ABI 7900HT序列偵測系統(Applied Biosystems)進行及分析定量PCR。在肝臟組織中反向及正向特定引物及探針(Integraded DNA Technologies, USA)用於Col1A1及TIMP1之表現分析。
肝臟羥脯胺酸計數
肝臟羥脯胺酸藉由利用氧化羥脯胺酸與4-(二甲胺基)苯甲醛(DMAB)之反應的酶方法來定量，其產生與存在的羥脯胺酸成比例的比色(560 nm)產物。急速冷凍肝臟樣品在液氮下製成粉末隨後在水(100 µl/10 mg)中均質化，且在120℃下於12 N HCl溶液中水解18 h。在水解完成之後，樣品以13,000 g在室溫下離心5分鐘，隨後轉移至96孔板且在60℃下乾燥。乾燥的樣品用100 μl氯胺-T氧化，且在室溫下培育20分鐘。將100 μl新製DMAB溶液添加至各孔中且培育樣品30分鐘。藉由量測在560 nm下的吸光度來光度地測定羥脯胺酸含量。使用標準曲線測定各樣品之羥脯胺酸含量。
結果 肝臟 OHP 含量及膠原蛋白藉由 PSR 定量之形態量測分析
組織學肝臟切片經天狼猩紅(PSR)染色，使12週CDHFD/NaNO
2
之後的肝臟膠原蛋白含量可視化。PSR染色藉由形態量測圖像分析來定量。資料展示於圖1中。與健康的對照組大鼠相比，投與CDHFD/NaNO
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之大鼠的肝臟膠原蛋白增加5倍(PSR面積自健康的對照組大鼠中之1.7±0.3%增加至經媒劑處理的CDHFD/NaNO
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大鼠中之8.5±0.6%，p＜0.001)。用式(I)化合物治療使肝臟膠原蛋白減少27% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
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大鼠中PSR面積自8.5±0.6%減少至6.2±1.1%，p＜0.05)。用式(III)化合物治療使肝臟膠原蛋白減少22% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
2
大鼠中PSR面積自8.5±0.6%減少至6.6±0.9%，p＜0.05)。用式(I)化合物及式(III)化合物之組合治療使膠原蛋白減少54% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
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大鼠中PSR面積自8.5±0.6%減少至3.9±0.6%，p＜0.001)。式(I)化合物及式(III)化合物之組合治療降低肝臟膠原蛋白的效果比僅投與任一劑顯著較好(p＜0.05)。 藉由量測肝臟羥脯胺酸含量進行肝纖維化之生物化學評估。資料展示於圖2中。在與健康的對照組大鼠相比時，投與CDHFD/NaNO
2
之大鼠的肝臟羥脯胺酸含量增加1.6倍(肝臟羥脯胺酸自健康的對照組大鼠中之4.0±0.3 μmol/g增加至經媒劑處理之CDHFD/NaNO
2
大鼠中之6.5±0.5 μmol/g，p＜0.001)。用作為單一劑投與的式(I)化合物或式(III)化合物任一者治療未顯著降低肝臟羥脯胺酸含量。用式(I)化合物及式(III)化合物之組合治療使肝臟羥脯胺酸降低33% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
2
大鼠中肝臟羥脯胺酸含量自6.5±0.5 μmol/g降低至4.4±0.5 μmol/g，p＜0.01)。式(I)化合物與式(III)化合物之組合治療降低肝臟羥脯胺酸的效果顯著超過僅投與式(III)化合物(p＜0.05相對於僅式(III)化合物)。
肌纖維母細胞標記物結蛋白之定量 IHC
組織學肝臟切片經結蛋白染色，結蛋白為活化肌纖維母細胞之標記物的標記物。資料展示於圖3中。結蛋白染色藉由形態量測圖像分析定量且表示為%結蛋白標記物面積。在與健康的對照組大鼠相比時，投與CDHFD/NaNO
2
之大鼠的肝臟結蛋白染色增加15倍(肝臟%結蛋白標記物面積自健康的對照組大鼠中之0.7±0.1%增加至經媒劑處理之CDHFD/NaNO
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大鼠中之10.3±0.8%，p＜0.001)。用式(I)化合物治療使肝臟結蛋白染色降低46% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
2
大鼠中肝臟%結蛋白標記物面積自10.3±0.8%降低至5.6±0.7%，p＜0.001)。用式(III)化合物治療使肝臟結蛋白染色降低43% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
2
大鼠中肝臟%結蛋白標記物面積自10.3±0.8%降低至5.9±0.7%，p＜0.001)。用式(I)化合物及式(III)化合物之組合治療使肝臟結蛋白染色降低39% (在經媒劑處理之CDHFD/NaNO
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大鼠中肝臟%結蛋白標記物面積自10.3±0.8%降低至6.2±1.0%，p＜0.001)。
Col1a1 及 Timp1 之肝表現
在12週研究結束時與健康的對照組大鼠相比，投與CDHFD/NaNO
2
之後肝纖維化基因Col1a1及TIMP -1之肝表現分別增加40倍及13倍(p＜0.001)。Col1a1之資料展示於圖4中，且TIMP-1之資料展示於圖5中。用式(I)化合物治療使藉由CDHFD/NaNO
2
引起的Col1a1降低65% (p＜0.01相對於媒劑)且使TIMP-1降低28% (p＜0.05相對於媒劑)。用式(III)化合物治療使藉由CDHFD/NaNO
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引起的肝Col1a1表現降低44% (p＜0.05相對於媒劑)但未使TIMP-1顯著降低。式(I)化合物與式(III)化合物之合併治療使藉由CDHFD/NaNO
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引起的肝Col1a1表現降低80% (p＜0.001相對於媒劑)。與僅投與式(I)化合物或式(III)化合物任一者相比，式(I)化合物與式(III)化合物之合併治療降低Col1a1基因表現的效果在統計學上顯著較高(p＜0.05相對於媒劑)。與僅藉由式(I)化合物治療所觀察到的降低相比，式(I)化合物及式(III)化合物之合併治療降低TIMP-1基因表現的效果在統計學上無顯著不同。 總而言之，來自此研究之資料展現在NASH之嚙齒動物模型中ASK1抑制劑與FXR促效劑之合併治療比僅投與任一劑引起更強的抗纖維化療效。
實例 2. 在 NASH 之小鼠模型中的療效
進行以下研究以評估ASK1抑制劑與FXR促效劑之組合在非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)之小鼠模型中的療效，相對於僅單獨的劑在該模型中之療效。在雄性C57BL/6小鼠中藉由長期投與高飽和脂肪、膽固醇及糖的「速食」飲食(FFD)總共10個月來誘發NASH，而偏瘦對照組動物保持正常飲食。截至7個月，與對照組相比FFD小鼠中建立NASH表現型，且其藉由肥胖、高膽固醇血症及AST/ALT升高表徵；以及藉由NASH之組織學特徵(諸如肝細胞巨泡性脂肪變性及氣球樣變性)表徵。參見Charlton M, 等人 Fast food diet mouse: novel small animal model of NASH with ballooning,progressive fibrosis,and high physiological fidelity to the human condition. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology 2011; 301 (5):G825-34。 在7個月之後，FFD小鼠隨後用安慰劑(媒劑)、ASK1抑制劑(式(I))、FXR促效劑(式(III))，或用式(I)與式(III)之組合治療3個月。對照組小鼠對於整個10個月研究時段保持正常飲食。終點分析包括肝臟脂肪變性(%脂肪肝面積)之形態量測定量、肝臟膽固醇含量、血清ALT/AST水準、血清膽酸水準及基因表現之nanostring評估。
方法 動物
在研究中使用雄性C57BL/6小鼠(研究開始時年齡為12週)。所有動物在標準飼養箱條件下圈養且在研究開始之前使其使適應新環境7天。
FFD 小鼠模型之生前實驗方案
實驗設計展示於表2中。動物經投與可商購的高脂、高膽固醇飲食(D12079B；Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)及含有每1000 mL自來水23.1 g果糖(Sigma，F2543)及17.2 g葡萄糖(Sigma，49158)的飲用水以代表速食飲食(FFD)，持續總共10個月。所有研究小鼠為單獨籠養(1隻小鼠/籠)。在研究的最後3個月(7月-10月)投與用僅式(I)化合物或式(III)化合物之治療、或用式(I)與式(III)化合物之組合的治療。單獨的一組年齡匹配的小鼠在整個研究持續時間接受標準嚙齒動物食物(Teklad diet TD2014, Indianapolis, IN)以代表正常對照組。 式(I)化合物作為FFD飲食中之0.15%摻合物投與(n=x每組)，式(III)化合物經由口服管飼投與一天一次(10 mg/kg，PO，QD)。用於投與式(III)化合物之媒劑由CMC鈉、1% w/w乙醇、98.5% w/w 50 mM Tris緩衝液(pH 8)形成。媒劑對照組動物在無不添加藥物之情況下經投與相同媒劑。
表 2. 實驗設計及劑量組 肝脂肪變性之測量
使用Leica SCN400掃描儀以40X放大率捕捉經蘇木精及曙紅(H&E)及天狼猩紅(PSR)染色之完整載玻片掃描圖像。數位載玻片圖像對掃描質量進行檢查、經標註且導出至Leica Digital Image Hub檔案內適當的網路文件夾中。使用Definiens顯影劑套裝軟體確定H&E染色組織切片上脂肪變性之範圍。允許對總體組織截面積(但不包括光學異常及受損組織區域)之適當測量的分析參數。肝臟軟組織內脂肪肝脂質泡可作為低光密度(白色)區域觀測到。此等區域之數目及尺寸經計數且總脂肪肝面積表示為總肝臟組織截面積之百分比。基於血管尺寸及維度，此分析不包括肝內血管(諸如門靜脈及中樞靜脈之分支)。自動分析之結果經人工審查以便測定結果之準確度。不符合預定QC標準之樣品(組織之不準確識別及脂肪肝面積之不準確識別)自報告排除。
總肝臟膽固醇之測定
組織樣品(25±5mg，在冷凍狀態下稱重)經均質化且用不可與水混溶的有機溶劑混合物萃取，該有機溶劑混合物將游離及酯化膽固醇餾分萃取至有機相中。在離心之後，分析含有膽固醇及膽固醇酯之有機上層的等分試樣。 將內標溶液(膽固醇-d6)及1 M氫氧化鉀乙醇溶液添加至適當樣品稀釋液之等分試樣中。混合物在70℃下培育一小時以便將膽固醇酯水解為游離脂肪酸及膽固醇。然後，反應混合物用冰醋酸酸化且用己烷萃取。去除己烷層，汽化且在乙腈中復原。隨後將經復原萃取物之等分試樣注射至配備有C18逆相柱的Waters Acquity/AB Sciex QTrap 4000 LC MS/MS系統上。m/z 369 [M-H2O]+→161+膽固醇之產物離子的峰面積相對m/z 375 [M-H2O]+→167+之膽固醇-D6產物離子之峰面積量測。使用加權(1/x)線性最小平方回歸分析進行定量，該回歸分析由強化校準標準使用油酸膽固醇酯作為參考標準產生。藉由與組織樣品相同的萃取及水解步驟取得校正標準樣品。原始數據使用AB SCIEX軟體Analyst 1.5.1收集及處理。數據簡化、權重校正、油酸膽固醇酯相對於膽固醇水解之校正及濃度計算使用Microsoft Excel 2013進行。最終組織含量以mg總膽固醇/g肝臟組織給出。
膽酸之量測
將血漿樣品發送至Metabolon, Inc. (Durham，NC)用於初級及次級膽酸及其結合物藉由LC-MS/MS之定量。
基因表現
在DC3 Therapeutics，South San Francisco進行RNA分離、逆轉錄及qPCR。使用Precellys 24均質機根據製造商指令將肝均質化。RNA使用E.Z.N.A. HP 總RNA套組(Omega Biotek #R6812)與DNA酶I分解裝置(Omega Biotek #E1091)根據製造商指令分離。Nanostring nCounter XT Reporter CodeSet及Capture ProbeSet使其在室溫下融化。主混合物藉由將70 μL混成化緩衝液添加至Reporter CodeSet管產生。隨後將8 μL主混合物添加至12個混成化條管之每一者中。將5 μL RNA添加至各管中，繼之以2 μL Capture ProbeSet。隨後將管置於經預加熱之65℃熱循環器(Veriti, Applied Biosystems)中持續16小時。隨後將混成化條管置於具有來自nCounter Master套組之試劑及消耗品的nCounter Prep Station (NanoString Technologies, Inc. 目錄號NCT-PREP-120)中用於樣品加工且置於Digital Analyzer (NanoString Technologies, Inc，目錄號NCT-DIGA-120)中用於資料獲取。資料使用nSolver分析軟體(Nanostring)分析，且呈現為倍數變化。
結果
H&E染色肝臟切片之定量證實式(I)化合物、式(III)化合物及式(I)與式(III)化合物之組合使得脂肪變性分別降低39%、27%及75% (圖6)。此外，對於式(I)化合物、式(III)化合物及式(I)與式(III)化合物之組合，肝臟膽固醇含量分別降低74%、36%及88% (圖7)。與用僅任一劑治療相比，用式(I)及式(III)化合物之組合治療引起空泡形成面積及肝臟膽固醇含量在統計學上更大程度的降低。 在對照組FFD小鼠中血漿膽酸之水準顯著升高。投與式(I)化合物、式(III)化合物及式(I)與式(III)化合物之組合使得血漿膽酸水準分別降低52%、46%及82% (圖8)。用式(I)與式(III)化合物之組合治療引起膽酸水準最大程度的降低。此外，藉由用式(I)與式(III)化合物之組合治療顯著降低發炎性基因IL1-β之肝表現(圖9)。 總而言之，來自此研究之資料展現在NASH之嚙齒動物模型中ASK1抑制劑與FXR促效劑之合併治療比僅投與任一劑引起更高的抗脂肪肝療效。