CN109069865A - 抑制高脂肪饮食相关病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病前期受试者的方法，其中所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和/或MNK2的生物活性。所述方法可以防止和/或延迟糖尿病前期进展至2型糖尿病。所述方法还可以防止糖尿病前期由空腹血糖受损(IFG)阶段进展至葡萄糖耐量受损(IGT)阶段。

Description

抑制高脂肪饮食相关病症的方法
技术领域
本公开涉及抑制高脂肪饮食，特别是糖尿病前期的影响。在特定形式中，本公开涉及抑制MAP激酶相互作用激酶的表达或功能。
优先权文件
本申请要求2016年3月31日提交的名称为“抑制高脂肪饮食相关病症的方法”的澳大利亚临时专利申请第2016901192号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
过度食用食物，特别是饱和脂肪的后果在全世界造成重要且迅速增加的健康问题，导致肥胖和相关病症，例如脂肪组织炎症、胰岛素抗性和2型糖尿病。西方世界近四分之一的成年人患有糖尿病或糖尿病前期，并且由于肥胖率的增加，发病率正在上升。糖尿病前期是与异常高的血糖水平相关的病症，但血糖水平没有高到足以将此人诊断为糖尿病患者。糖尿病前期患者经常超重，并且所述病症通常与不健康的饮食有关，例如高脂肪饮食。因此，糖尿病前期的管理经常涉及通过低脂饮食减肥的建议。然而，许多患有糖尿病前期的患者要么不愿意，要么不能坚持所需的生活方式改变，以达到并维持建议的体重减轻来治疗他们的病症；或者，现有疗法可能已经失败。因此需要糖尿病前期的替代治疗和/或管理。
丝裂原活化蛋白(MAP)激酶相互作用激酶(MNK)是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，其是MAPK信号传导的下游效应因子，并且涉及致癌性转化和进展。鼠MNK1和MNK2分别由Mknk1和Mknk2基因编码。相应的蛋白(MNK1和MNK2)与MAP激酶(例如细胞外信号调节激酶(ERK))相互作用，特别是在MNK1的情况下与p38MAP激酶相互作用。MNK蛋白被MAP激酶磷酸化，导致刺激MNK活性(Waskiewicz等人，1997)。MNK蛋白最著名的底物是真核翻译起始因子4E(eIF4E)，它是蛋白质合成机制的关键组分(Waskiewicz等人，1997；Scheper等人，2001)，尽管已经描述了一些额外的底物(参见Buxade等人，2008)。由于MNK是唯一作用于eIF4E的激酶，因此可以通过测量磷酸化eIF4E(P-eIF4E)的水平来测量MNK蛋白的生物活性。
尽管在其基本序列方面非常相似，但MNK1和MNK2在许多关键方面存在差异。例如，鼠MNK1(相当于人MNK1a)主要是细胞质的，而鼠MNK2(类似于人MNK2a)在细胞核和细胞质中发现。在刺激ERK或p38MAP激酶途径后，MNK1被强烈激活(Scheper等人，2001；Waskiewicz等人，(1999)；Wang等人，1999)，而MNK2显示出高基础活性，仅略微进一步受这些途径的刺激。已知MNK1和MNK2mRNA在肝脏、骨骼肌和心脏中表达；然而，MNK1和MNK2在不同小鼠组织中的表达模式不同，表明MNK1和MNK2发挥不同的作用。破坏敲除小鼠中MKNK1和MKNK2基因中的一个或两个没有报道不利影响，双MNK1/2敲除小鼠是有活力的并且是可育的，没有报道异常(Ueda等人，2004)。
本发明人已经认识到MNK活性可能涉及高脂肪饮食的影响，包括肥胖、脂肪形成以及脂肪生成，和相关病症，例如脂肪组织炎症、胰岛素抗性、葡萄糖耐受不良、糖尿病前期以及2型糖尿病。如本文所述，抑制MNK表达或生物活性可抑制高脂肪饮食的影响，并提供治疗和/或管理高脂肪饮食相关病症如糖尿病前期的新方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种治疗糖尿病前期受试者的方法，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平，包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和/或MNK2的生物活性。
在一个实施方案中，MNK抑制剂是小有机分子、肽抑制剂、抑制性抗体或其片段、干扰核苷酸分子或适体。
附图说明
图1提供了MKNK1和MKNK2mRNA表达的分析，其中(A)通过qPCR在肝脏和性腺脂肪组织中测定的MKNK1(MNK1)和MKNK2(MNK2)的相对表达(n＝8)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验，其比较每个组织的MNK1和MNK2)；(B)肝脏、脂肪组织、心肌和骨骼肌中MNK1蛋白水平的免疫印迹分析，代表4个独立实验；(C)分化3T3-L1脂肪细胞中Pparγ、Cebpα、Srebp1c、Glut4以及Cd36的mRNA表达(n＝3)，数据为平均值±SEM；(D)分化3T3L1脂肪细胞中的Mknk1(MNK1)和Mknk2(MNK2)mRNA表达(n＝3)，数据为平均值±SEM(单因素ANOVA和Tukey事后检验)**P<0.01，***P<0.001，***P<0.0001；(E)显示在脂肪细胞分化的3T3-L1模型中Mknk1、Mknk2和CebpβmRNA表达随时间的表达(在加入分化混合物后)的图解结果；
图2提供了MNK1敲除(KO)和MNK2KO小鼠对高脂喂养的反应，其中(A)野生型(WT)、MNK1-KO和MNK2-KO在食物或高脂肪饮食(HFD)20周后的体重，(n＝6-9)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001；(B)性腺脂肪组织重量表示为体重的百分比(n＝6-9)，数据是平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；(C)显示HFD 20周后来自WT、MNK1-KO和MNK2-KO小鼠的性腺脂肪堆积的代表性图像；(D)在食物或HFD 20周后，WT、MNK1-KO和MNK2-KO的空腹血糖，n＝6-9，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05，***P<0.001，(E)在食物或HFD20周后，WT、MNK1-KO和MNK2-KO的空腹血浆胰岛素(n＝3-5)。数据是平均值±SEM；(F)胰岛素抗性的稳态模型评估(HOMA-IR)作为胰岛素抗性的“读数”；
图3提供敲除或抑制MNK对脂肪细胞的影响，其中(A)通过图像J软件分析和量化WT和MNK2-KO小鼠中脂肪细胞的平均大小(WT食物，n＝3，WT HFD n＝3，MNK2-KO食物n＝3，MNK2-KO HFD n＝3)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)，**P<0.01；(B)以下条件的两个视野中的脂肪细胞的平均数(WT食物n＝3，WT HFD n＝3，MNK2-KO食物n＝3，MNK2-KOHFD n＝3)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05；(C)(i)用指定浓度的CGP57380处理未分化3T3-L1细胞72小时的裂解物的免疫印迹分析，代表三个独立实验；(ii)(i)中显示的数据的量化，数据为平均值±SEM(单因素ANOVA和Tukey事后检验)****P<0.0001；(D)在不存在或存在20μM CGP57380的情况下分化9天的3T3-L1细胞的油红O染色，显示代表性的微观视野，(n＝3)；数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)；(E)在存在或不存在20μM CGP57380的情况下经受分化方案的3T3-L1脂肪细胞中Pparγ、Cbpα、Srebp1c、Glut4以及Cd36的mRNA表达(n＝3)；数据为平均值±SEM(单因素ANOVA和Tukey事后检验)；
图4提供了喂食HFD的MNK1-KO或MNK2-KO小鼠的代谢研究的图解结果，其中(A)在食物或HFD 15周后进行葡萄糖耐量测试(n＝6-21)，数据为平均值±SEM；(B)曲线下面积计算(AUC)(n＝6-21)，数据为平均值±SEM(双因素ANOVA和Tukey事后检验)；(C)在食物或HFD20周后小鼠的胰岛素抗性测试(n＝3-4)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05，**P<0.01；
图5提供了喂食食物或喂食HFD的WT、MNK1-KO以及MNK2-KO小鼠的组织的总蛋白裂解物的免疫印迹分析，显示(A)性腺脂肪组织中P-eIF4E和eIF4E水平的分析，代表3个独立实验；(B)胰岛素抗性测试后对性腺脂肪组织中PKB、磷酸化PKB以及肌动蛋白水平的分析，(n＝3)；(C)用腹膜内注射0.75U/kg胰岛素处理(如果指出)的小鼠骨骼肌中PKB、磷酸化PKB以及微管蛋白水平的免疫印迹分析，在30分钟后处死，并收集组织以使用所示的抗体进行免疫印迹分析；(D)上图，GLUT 4水平的分析；下图，在每种情况下来自三只小鼠的(D，上图)数据的定量，表示为标准化为肌动蛋白的GLUT4，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05；(E)分析骨骼肌中的P-eIF4E和eIF4E水平(n＝3)；(F)在每种情况下来自三只小鼠的骨骼肌中的GLUT4蛋白水平(标准化为eIF4E)的数据定量；
图6提供了从食物喂养和HFD喂养的WT、MNK1-KO以及MNK2-KO小鼠的性腺脂肪组织中分离的总RNA的来自WT和MNK-KO小鼠的脂肪组织中的巨噬细胞标记物的qPCR分析，显示了下列的mRNA的相对表达：(A)一般巨噬细胞标记物Cd68，(B)一般巨噬细胞标记物F4/80，(C)M1极化巨噬细胞标记物Tnfα，(D)M1极化巨噬细胞标记物Cd11c，(E)M1极化巨噬细胞标记物MhcII(n＝3-4)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05,**P<0.01；
图7提供了通过ELISA测量的来自食物喂养和HFD喂养的WT、MNK1-KO以及MNK2-KO小鼠的(A)IL-5和(B)IL-10的血浆水平的分析(n＝6-9)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05；和从在IL-4存在或不存在下培养24小时的WT或MNK2-KO小鼠分离的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中分离的总RNA中使BMDM向M2表型极化的M2标志物(C)Il-10，(D)Cd206，(E)Pparγ以及(F)Stat6(n＝6)的mRNA表达水平的qPCR分析，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001；
图8提供了从食物喂养和HFD喂养的WT和MNK2-KO小鼠的肝组织分离的总RNA的(A)Nrf2和(B)其下游靶血红素加氧酶1(Ho-1)的mRNA的相对表达的qPCR分析，(n＝4)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05；和来自食物喂养和HFD喂食的WT和MNK2-KO小鼠肝脏中参与脂肪从头合成(C)Srebp1c，(D)Fas，(E)Acc1以及(F)β-氧化(Cpt1a)的基因的相对mRNA表达的qPCR分析，(n＝4)，数据为平均值±SEM(双尾未配对学生t检验)*P<0.05，**P<0.01；
图9提供了来自C2C12骨骼肌细胞的裂解物的免疫印迹分析，其在用100nM胰岛素刺激之前(10和60分钟)已用4mM脂肪酸棕榈酸酯，并且如果指出的话，用3μM的MNK抑制剂MNK-I1处理16小时。棕榈酸酯诱导这些细胞中的胰岛素抗性，如在用棕榈酸酯预处理的细胞中胰岛素在关键调节位点Thr308处增加PKB磷酸化的能力受损所示。标志物P-308-PKB的水平显示MNK抑制剂能够在细胞暴露于棕榈酸酯后恢复胰岛素信号传导；
图10提供了图解结果，显示MNK1-KO、MNK2-KO以及MNK1+MNK2双KO(DKO)动物对卡路里过量的反应(即通过从4周到15周龄喂饲富含能量的高脂肪饮食(HFD))；显示了HFD的重量增加减去食物喂养动物的重量增加的数据。6-16/组。*,p<0.05双尾未配对t test；
图11提供了与食物(CD)或HFD喂养的WT小鼠相比，MNK1-KO和DKO小鼠中葡萄糖耐量测试(GTT)的结果，显示为血糖浓度。
图12提供了柱状图，显示在用“分化混合物”处理指定时间的3T3-L1成纤维细胞中随时间(0至24小时)的MNK2表达；裂解细胞并进行Mnk2mRNA表达的RT-qPCR分析。数据表示为相对于未处理的细胞＝1；
图13提供了使用MNK抑制剂尾孢酰胺(CSPM)处理3T3-L1细胞(尾孢酰胺(10μM))进行的研究的图解结果。(A)通过RT-qPCR分析样品的指定mRNA。数据来自三次重复实验，并标准化为β2-微球蛋白mRNA。(B)分析样品的脂质累积；
图14显示了以下结果：(A)用指定浓度的MNK抑制剂MNK-I1和MNK-I2处理3T3-L1细胞1小时，然后通过免疫印迹分析样品的磷酸化和总eIF4E。在三次重复实验中获得类似数据。(B)MNK-I1和MNK-I2的数据定量。(C)用指定浓度的MNK-I1和MNK-I2处理3T3-L1细胞指定的时间，然后通过免疫印迹分析样品的磷酸化和总eIF4E；
图15显示了研究的图解结果，其中：(A)在不存在或存在MNK-1的情况下用分化混合物处理3T3-L1细胞指定的时间。通过RT-qPCR分析样品的指定mRNA。数据来自三次重复实验，并标准化为β2-微球蛋白。第0天的数据设置为1。(B)与(A)相同，除了使细胞分化9天，然后裂解并分析脂质(甘油三酸酯)累积；
图16提供了对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)：MNK1-KO(A)或MNK2-KO(B)进行的研究的结果。用指定浓度的MNK-I1或MNKI2处理MEF 1小时，然后分析样品的P-eIF4E和总eIF4E。该图显示了来自三个实验的组合数据。*,p<0.05vs.未处理对照；****,p<0.0001,vs.未处理对照。Pos，用30μMCGP57380处理的细胞；以及
图17显示了研究的图解结果，其中：(A)在不存在或存在MNK-12的情况下用分化混合物处理3T3-L1细胞指定的时间。通过RT-qPCR分析样品的指定mRNA。数据来自三次重复实验，并标准化为β2-微球蛋白mRNA。第0天的水平＝1。(B)与(A)相同，除了允许细胞分化9天，然后裂解并分析甘油三酸酯。
具体实施方式
本公开描述了MNK1和MNK2在食用正常食物饮食(CD)或高脂肪饮食(HFD)的小鼠中的作用的研究，所述研究使用其中已敲除MNK1或MNK2的小鼠(分别为MNK1-KO和MNK2-KO)在脂肪细胞分化的细胞模型中进行。发现使用MNK抑制剂抑制MNK1和/或MNK2的表达，或降低MNK1和/或MNK2的生物活性，可以抑制高脂肪饮食的影响，包括葡萄糖耐受不良、胰岛素抗性和脂肪生成。
本文提供的数据表明MNK1和MNK2在脂肪组织中表达，其参与胰岛素对身体代谢的调节。MNK2mRNA在脂肪细胞分化的细胞模型中被迅速诱导，表明所述蛋白参与脂肪形成过程。值得注意的是，使MNK2-KO小鼠免受在WT/HFD小鼠中观察到的HFD诱导的脂肪增加的影响。观察到MNK2-KO/HFD小鼠的脂肪细胞的大小不大于它们的食物喂养对应物。然而，相比之下，与食物饮食(WT/CD)的WT小鼠相比，WT/HFD小鼠的脂肪细胞的大小显著增加。与WT/HFD小鼠相比，MNK1-KO/HFD和MNK2-KO/HFD小鼠均不受受胰岛素抗性指标的影响，其循环葡萄糖和胰岛素水平降低，并且HOMA-IR(胰岛素抗性指标)降低，葡萄糖耐量更佳和胰岛素抵抗降低，如PKB信号传导途径(PKB磷酸化)的更强响应所表明的。另外，MNK2-KO/HFD小鼠显示脂肪组织中炎症减少。这些结果证实MNK1特别是MNK2参与介导高脂肪饮食的不利影响。
在存在MNK1和MNK2二者的小分子抑制剂CGP57380(即N3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并-[3,4-d]嘧啶-3,4-二胺；或4-氨基-3-(对氟苯基氨基)吡唑并[3,4-d]嘧啶)的情况下，脂质在脂肪细胞模型中的累积被显著抑制。此外，CGP57380抑制脂肪细胞分化所需的多个基因的表达，表明MNK1和MNK2在脂肪形成和脂质储存中的重要作用。这些结果表明，降低MNK1和/或MNK2的生物学功能可抑制脂肪形成和脂质储存。另外，对于在CGP57380存在下分化的细胞，与在不存在CGP57380的情况下分化的细胞相比，在脂解测定中释放的甘油较少，证实了CGP57380处理的细胞中甘油三酸酯的储存减少。
MNK1和MNK2是已知磷酸化eIF4E的唯一激酶。在两种饮食条件下，与WT小鼠相比，MNK2-KO小鼠显示P-eIF4E显著降低，而与WT动物相比，食物饮食的MNK1-KO小鼠显示P-eIF4E没有变化，并且HFD的MNK1-KO小鼠显示P-eIF4E仅略微减少。这表明在脂肪组织中MNK2是更活跃的MNK同种型。
因此，在第一方面，本公开提供了治疗糖尿病前期受试者的方法，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平，包括向受试者施用治疗有效量的至少一种丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和/或MNK2的生物活性。
糖尿病前期受试者的葡萄糖代谢受损。认识到两个阶段：(1)空腹血糖受损(IFG)糖尿病前期，和(2)葡萄糖耐量受损(IGT)糖尿病前期。基本上，人类受试者中的标准口服葡萄糖耐量测试(GTT)将提供确定四种诊断之一的结果。用于诊断葡萄糖代谢的GTT和“临界”葡萄糖水平的确切方案在不同国家之间是不同的，但是一个常用的例子是测量空腹血糖水平，然后在5分钟的时间范围内口服测量剂量的葡萄糖溶液(通常含有75g葡萄糖)，然后通常在2小时后再次测量血糖。诊断通常如表1所示。然而，通常引用表1中所示数字的一些小变化。出于本公开的目的，所述方法可以用于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l(即100mg/dl至125mg/dl)的空腹血糖水平的糖尿病前期受试者。
表1：用于诊断糖尿病前期和糖尿病的典型血糖水平
诊断 空腹血糖水平 GTT测试后2小时的血糖水平
正常葡萄糖水平 <6.1mmol/L <7.8mmol
空腹血糖受损糖尿病前期 ≥6.1mmol/L<7.0mmol/L <7.8mmol
葡萄糖耐量受损糖尿病前期 ≥6.1mmol/L<7.0mmol/L ≥7.8mmol<11.1mmol/L
2型糖尿病 ≥7.0mmol/L ≥11.1mmol/L
许多糖尿病前期受试者仍然在，例如，3至15年内处于糖尿病前期，症状没有任何显著变化；而对于其他人来说，症状恶化会更加迅速，从而进展为2型糖尿病。重要的是，虽然糖尿病前期的诊断被认为是最终发展为2型糖尿病的高风险因素，但糖尿病前期的两个阶段彼此不同并且与2型糖尿病不同，因为并非所有被诊断为空腹血糖受损糖尿病前期的受试者都将发展为葡萄糖耐量受损糖尿病前期或2型糖尿病。同样地，并非葡萄糖耐量受损糖尿病前期的所有受试者都将进展为2型糖尿病。
本公开的方法可以防止和/或延迟从糖尿病前期进展到2型糖尿病。所述方法还可以防止糖尿病前期由空腹血糖受损(IFG)阶段进展至葡萄糖耐量受损(IGT)阶段。所述方法还可以避免或减少与糖尿病前期相关的症状和/或作用，例如肥胖，体重增加，脂肪组织重量增加，脂肪组织炎症增加，循环葡萄糖和/或葡萄糖抗性增加，循环胰岛素和/或胰岛素抵抗增加。
如上所述，糖尿病前期受试者经常超重，并且所述病症通常与不健康的饮食相关，例如高脂肪饮食。术语“高脂肪饮食”在本文中用于指与正常饮食相比通常具有更高百分比的卡路里(从饮食中的脂肪获得)的饮食。饮食中的脂肪可包括所有类型的膳食脂肪，无论是动物还是蔬菜，以及无论单不饱和、多不饱和、饱和等。因此，高脂肪饮食具有比正常饮食更高的热量。在一个实施方案中，根据所公开的方法治疗的糖尿病前期受试者具有高脂肪饮食，其包含具有等于或大于30％的来自脂肪的总能量的饮食。在另一个实施方案中，根据所公开的方法治疗的糖尿病前期受试者具有高脂肪饮食，其包含具有等于或大于35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％的来自脂肪的总能量的饮食。另外或可替代地，根据所公开的方法治疗的糖尿病前期受试者具有高脂肪饮食，其特征在于比正常饮食更高的总能量值。例如，表2显示了中年成人正常饮食的推荐能量摄入。
表2：成人正常饮食中的推荐能量摄入
*久坐-坐着工作，很少或没有剧烈休闲活动。
**中等-站立或行走工作，或久坐工作，经常锻炼至少30分钟。
本领域技术人员将理解，推荐的能量摄入值表示正常饮食的能量摄入水平。但是，这些值会根据年龄、性别、身高和活动水平而有所不同。因此，高脂肪饮食可以具有与正常饮食大致相同的能量摄入，或者具有比正常饮食更高的总能量摄入，例如与正常饮食相比，总能量摄入高10-30％、20-40％、30-50％或30-60％。因此，根据所公开的方法治疗的糖尿病前期受试者可具有高脂肪饮食，其能量摄入值比正常饮食能量摄入值高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。
HFD喂养的雄性小鼠是广泛使用和接受的模型，用于研究高脂肪饮食的影响(Panchal等人，2011)。这些动物在增加脂肪组织、脂肪组织炎症和胰岛素反应缺陷(例如受损葡萄糖耐量)方面表现出多种与人类肥胖相关代谢综合征相关的反应(Hariri和Thibault,2010)。例如，与包含7％kcal脂肪，18％kcal蛋白质，75％kcal碳水化合物的标准食物饮食相比，小鼠的高脂肪饮食可包含45％kcal脂肪，20％kcal蛋白质，35％kcal碳水化合物。然而，本领域技术人员将理解，用于小鼠的高脂肪饮食可以具有32％至60％的来自脂肪的能量。
如本文所公开的，与WT/HFD动物相比，MNK1-KO/HFD和MNK2-KO/HFD小鼠都具有更高的葡萄糖耐量。在所述测试中，在接受腹膜内注射2g/kg葡萄糖之前将动物禁食过夜，并且在葡萄糖施用之前和之后的几个时间点直至2小时测量血液中的葡萄糖。在测量的每个时间点，MNK1-KO/HFD和MNK2-KO/HFD小鼠与WT/HFD动物相比具有较低的葡萄糖水平。这是特别相关的，因为它表明在相同的高脂肪饮食中，具有降低的MNK1和/或MNK2生物活性可增加葡萄糖耐量，因此，表明降低MNK生物活性将有助于治疗或预防糖尿病前期。因此，在一个实施方案中，MNK抑制剂治疗或预防的病症是糖尿病前期。
人MNK包含通过可变剪接从两个基因(基因符号：MKNK1和MKNK2)衍生的一组四种蛋白质。MNK1a/1b的C末端不同，MNK2a/2b也是如此。在每种情况下，a-形式具有比b-形式更长的C-末端区域，其缺少MAP激酶结合区。所有形式的N末端含有结合输入蛋白α的多碱基区和翻译因子支架蛋白真核起始因子4G(eIF4G)。MNK1a/b和MNK2a/b的催化结构域共享三个不寻常的特征：两个短插入物和DFD特征，其中其它激酶具有DFG。MNK同种型在其活性和调节以及亚细胞定位方面显著不同。表征最佳的MNK底物是eIF4E。eIF4E磷酸化的细胞作用仍不清楚；它可能促进某些mRNA从细胞核中的输出。其它MNK底物结合富含AU的元件，其调节特定mRNA的稳定性/翻译。MNK还可以控制炎性介质的产生和酪氨酸激酶受体的信号传导，以及细胞增殖或存活。
人MNK的序列可以如下发现：人MNK1mRNA和氨基酸序列：基因库登录号AB000409.1；人MNK1氨基酸序列变体：基因库登录号NM-003684.2；人MNK2a mRNA序列：基因库登录号AF237775；人MNK2b mRNA和氨基酸序列：基因库登录号AF237776，和标记为NM-17572.2的核酸序列变体。术语“基因库登录号”涉及国家生物技术信息中心(NCBI)基因库数据库条目(Benson等人，2000)。在每个上述基因库登录号中公开的信息通过引用并入本文。
本文使用的术语“MNK抑制剂”意指降低MNK1(包括降低剪接变体MNK1a和MNK1b中的一种或两种的生物活性)和/或MNK2(包括降低剪接变体MNK2a和MNK2b中的一种或两种的生物活性)的生物活性的任何化合物，包括通过减少表达的MNK1和/或MNK2的量降低其生物活性。例如，MNK抑制剂可以是小有机分子(本文中也称为“小分子”)、肽拮抗剂、抑制性抗体或其片段、干扰核苷酸分子、适体或如本领域技术人员所理解的抑制表达或生物活性的其它MNK抑制剂。可以多种方式测量MNK1和MNK2的生物活性，例如，通过使用本领域技术人员已知的任何合适的方法测量其底物eIF4E磷酸化为P-eIF4E，例如，通过利用特异性抗P-eIF4E抗体进行免疫印迹或ELISA，例如由默克密理博(Merck Millipore)分销的抗磷酸化eIF4E(Ser209)抗体，目录号07-823(默克密理博(Merck Millipore，比勒利卡，马萨诸塞州，美国)。因此，与不存在MNK抑制剂的相应样品相比，含有MNK抑制剂的样品中P-eIF4E的量相对减少表明MNK的生物活性已降低。本领域技术人员将知道在测量P-eIF4E水平时如何进行合适的对照。另外，可以使用可以检测MNK1和/或MNK2生物活性水平的细胞测定来测量MNK1和/或MNK2生物活性。也可以使用特异性检测磷酸化MNK的抗体，例如，抗-P-MNK1(磷酸化-Mnk1(Thr197/202)抗体#2111；细胞传导技术公司(Cell Signaling Technology Inc)，丹弗斯，马萨诸塞州，美国)。另外，本领域技术人员将理解，MNK抑制剂应该可安全地用于其预期目的。
在一些实施方案中，MNK抑制剂可优选地显示对MNK2的选择性和/或增加的抑制效力。评估MNK抑制剂选择性的简单测试可以通过用MNK抑制剂处理来自已敲除MNK1或MNK2的动物(例如来自MNK1-KO和MNK2-KO小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))的合适细胞来进行。因为，在MNK1-KO MEF中，eIF4E磷酸化依赖于MNK2，反之亦然，监测不同浓度的目标MNK抑制剂对MNK-KO MEF中P-eIF4E水平的影响报告所述化合物抑制MNK2(MNK1-KO MEF)或MNK1(MNK2-KO MEF)的能力。因此，通过比较两种细胞的数据，可以确定测试的MNK抑制剂对MNK1或MNK2显示的选择性程度。
MNK抑制剂可选自由小有机分子，肽抑制剂，抑制性抗体或其片段，包含干扰RNA分子的抑制性核苷酸分子和适体组成的群组。MNK抑制剂可包括本领域已知的那些。在一个实施方案中，可以使用MNK抑制剂的组合。
在一个实施方案中，MNK抑制剂是小有机分子。以下描述了合适的MNK1和/或MNK2小分子抑制剂的多个实例。
式I显示CGP57380(N3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并-[3,4-d]嘧啶-3,4-二胺；或4-氨基-3-(对氟苯基氨基)吡唑并[3,4-d]嘧啶；WO 03/037362；Chrestensen等人，2007；Buxade等人，2005；Worch等人，2004，Rowlett等人，2008)，其可商购获得。它是MNK1和MNK2二者的抑制剂(Hou等人，2012)。
式II显示尾孢酰胺((9aS)-8-乙酰基-9,9a-二氢-1,3,7-三羟基-9a-甲基-9-氧代-4-二苯并呋喃甲酰胺；Sussman等人，2004)，其可商购获得。
式III显示ETP 45835二盐酸盐(4-[5-(4-哌啶基)-1H-吡唑-3-基]吡啶二盐酸盐；Oyarzabal等人，2010)，其可商购获得。
式IV显示CGP052088(Tschopp等人,2000)，其是十字孢碱衍生物。
式V表示MNK-I1(4-(2-(2-氟丙氧基)-4-氟苯基氨基)-N-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺；Beggs等人2015)。
式VI显示MNK-I2(4-(2-异丙氧基)-4-氟苯基氨基)-N-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺)。
有关这些化合物中的一些的IC50详情如表3所示。
表3：小分子MNK抑制剂的半数最大抑制浓度(IC50)值
在一些实施方案中，用于本公开的方法的小有机分子型MNK抑制剂将选自由称为“ATP竞争剂”或“I型激酶抑制剂”的化合物组成的群组(Hou等人，2012；Liu和Gray，2006)，其与MNK的ATP结合域相互作用(例如CGp57380和尾孢酰胺；Hou等人，2012)。
在一些实施方案中，用于本公开方法的小有机分子型MNK抑制剂选自由噻吩并嘧啶化合物组成的群组。此类化合物的实例包括WO 06/136402和WO 2007/115822中描述的那些；Teo等人，2015中描述的噻吩并嘧啶基衍生物(包括MNK2选择性抑制剂)以及含有取代烷基的噻吩并嘧啶基衍生物，例如WO2011/104340和US8,633,201中描述的那些；本段中提到的所有说明书的内容通过引用整体并入本文。合适的噻吩并嘧啶化合物的优选实例可包括WO2011/104340(其内容通过引用整体并入本文)中描述的那些和上述具体化合物，MNK-I1和MNK-I2。合适的噻吩并嘧啶化合物的特别优选的实例可以具有如下所示的通式：
其中：X选自CH和N；R1为H、卤素原子(例如F)、CN、C1-6烷基(优选C1-3烷基)或CONH2基团；R2为直链或支链C1-6烷基(优选C1-3烷基)，其可以独立地被卤素原子(例如F)或一个或两个三卤代甲基(例如三氟甲基)、四氢吡喃基、环丙基、H2N-CO-、R5NHCO-或(R5)2N-CO-基团取代，其中环丙基可以被一个或两个卤素原子(例如F)或-CH2-CN取代，并且其中在化合物包含(R5)2N-CO-基团的情况下，两个R5基团可以与它们所连接的N原子一起形成4-至8-元环，其中碳原子可以被O、S、SO或SO2替换和/或可以被OH、NH2、N(C1-3-烷基)2、NH(C1-3烷基)、CF3、C1-3-烷基取代，或R2是直链或支链C2-6烷基，其在2至6位独立地被一个或两个OH、C1-3烷氧基、氨基、CN、R6NH-、(R6)2N-、R6OCONH-、R6CONH-、R6SO2NH-或R6NHCONH-基团取代，其中R6是C1-5烷基(优选C1-4烷基，例如CH3、i-Pr以及t-Bu)，各自任选地被一个CF3、NH2、NH(C1-3烷基)、N(C1-3烷基)2或CH3O-基团取代，并且其中任何上述NH部分的氢原子可以被CH3替换；R3为H或C1-3烷基(优选CH3)；并且R4选自羧基、C1-3烷氧基-羰基、-CONH2、-CONHR7、-CONH-OR7、-CONH-SO2R7以及-CO-NH-L-R7基团，
其中L为-(CH2)n-(其中n为2、3或4)或C3-6支链烷基残基(例如–CH2-C(CH3)2-CH2-)，-CH2-C≡C-CH2-或并且R7选自OH、-NH2、-NHR8、-N(R8)2、-NH-CO2R8或3-至6-元环(例如苯基或吗啉基团或环胺(例如吡咯烷或哌啶)，和R8为C1-3烷基(优选CH3)或其互变异构体、对映异构体或盐。更特别地，优选的式(VII)化合物是那些化合物，其中X如上所定义(但优选CH2)，R1为H或更优选F，R2是直链或支链C1-3烷基，其可以独立地被卤素原子(例如F)或一个或两个三卤代甲基(例如三氟甲基)、四氢吡喃基、环丙基、H2N-CO-、R5NHCO-或(R5)2N-CO-基团取代，R3为CH3以及R4选自羧基、C1-3烷氧基-羰基、-CONH2、-CONHR7、-CONH-OR7、-CONH-SO2R7以及-CO-NH-L-R8基团，其中L为-(CH2)n-(其中n为2或3)或C3-6支链烷基残基(例如–CH2-C(CH3)2-CH2-)，其中R7选自OH、-NH2、-NHR8和-N(R8)2、-NH-CO2R8(其中R8为C1-3烷基，优选CH3)以及3-至6-元环，例如环胺(优选吡咯烷)，或其互变异构体或盐。甚至更优选的式(VII)化合物可以是那些化合物，其中X如上所定义(但优选CH2)，R1为F，R2为直链或支链C1-3烷基，其可独立地被卤素原子(例如F)取代，R3为CH3，并且R4可以是-CONHR7或-CONH-OR7，但更优选是-CO-NH-L-R8基团，其中L为-(CH2)n-(其中n为2或3)或C3-6支链烷基残基(例如–CH2-C(CH3)2-CH2-)，其中R7选自OH、-NH2、-NHR8和-N(R8)2、-NH-CO2R8(其中R8是C1-3烷基，优选CH3)以及3-至6-元环，如环胺(优选吡咯烷)，或其互变异构体或盐。
降低MNK1和/或MKN2的生物活性的其它小分子也可适用于本文所述的用途。此类化合物的实例包括EP 0819129中描述的那些，吡啶和吡嗪衍生物，例如WO 2007/147874中描述的那些，以及8-杂芳基嘌呤化合物，例如US 7,951,803中描述的那些；所有这些都通过引用并入本文。然而，本领域技术人员将理解，其它小分子适用于本公开的方法，条件是它们如本文所述可抑制MNK生物活性和/或表达，并且被认为对其目的是安全的。筛选用于MNK抑制功能的小化合物的方法描述于US 8,633,201中。此外，Hou等人(2012)描述了设计另外的小有机分子MNK抑制剂的考虑因素，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，MNK抑制剂是肽抑制剂。
肽抑制剂是能够以使MNK1和/或2的生物活性降低的方式与靶标(例如MNK1和/或MNK2)结合的肽或蛋白质或其片段。肽抑制剂可以是天然存在的MNK结合配偶体或是其它肽，无论是衍生自天然来源还是人工合成的。已知大量肽文库，并且可以通过本领域技术人员已知的许多技术筛选这些文库。可以使用这些方法鉴定MNK1和/或MKN2的新肽抑制剂，并使用本领域技术人员熟知的技术生产。
在一个实施方案中，MNK抑制剂可以是抑制性抗体或其片段，例如，对MNK特异的抗体，其可以直接用于抑制或拮抗MNK1和/或MNK2的生物学活性。或者，抑制性抗体可称为中和抗体。
可以使用本领域技术人员熟知的方法产生合适的抗体，然后筛选以鉴定具有MNK抑制特性的抗体，即降低MNK1和/或MNK2的生物活性的抗体。此类抗体可包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。制备具有MNK抑制特性的抗体的方法是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中，MNK抑制剂可以是抑制性适体，例如，对MNK特异的适体，其可以直接用于抑制或拮抗MNK1和/或MNK2的生物活性。适体是与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子，寡核苷酸分子由(通常)短链寡核苷酸组成，肽适体通常由短可变肽结构域(或环)组成，两端均连接至蛋白质支架。适体能够以高亲和力和特异性抑制蛋白质，例如MNK1和MNK2。产生适体并筛选它们的所需抑制作用的任何合适方法可用于产生MNK抑制剂。用于核苷酸适体的此类方法的实例描述于US 7,960,102和WO 91/19813；然而，其它方法也可能是合适的。肽适体也可以选自通过噬菌体展示和其它表面展示技术例如mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示构建的组合肽文库。用于产生抑制性肽适体的方法的其它实例描述于WO 2012/096978中。
在一个实施方案中，MNK抑制剂可以是抑制性核苷酸分子。如本领域技术人员所熟知的，双链或单链干扰RNA分子可以诱导给定基因的mRNA转录物的序列特异性降解，从而抑制mRNA翻译成蛋白质。或者，编码MNK的多核苷酸的反义分子可以用于需要阻断mRNA转录的情况。因此，通过减少产生的MNK蛋白的量，抑制性核苷酸分子可用于抑制MNK生物活性。这种技术现在是本领域技术人员公知的，并且可以沿着编码MNK的序列的编码或控制区域的不同位置设计有义或反义寡聚体或更大的片段。衍生自逆转录病毒、腺病毒、疱疹或痘苗病毒或来自各种细菌质粒的表达载体可用于将核苷酸序列递送至靶器官、组织或细胞群。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组载体，其将表达与编码MNK的基因的多核苷酸互补的反义分子。编码MNK的基因可以通过用表达高水平的编码MNK的多核苷酸或其片段的表达载体转化细胞或组织来关闭。此类构建体可用于将不可翻译的有义或反义序列引入细胞中。即使没有整合到DNA中，这些载体也可以继续转录RNA分子，直到它们被内源性核酸酶抑制。使用非复制载体瞬时表达可以持续一个月或更长时间，如果适当的复制元素是载体系统的一部分，则瞬时表达可以持续甚至更长时间。抑制性核苷酸分子可以通过本领域技术人员已知的用于合成核酸分子的任何方法制备。
MNK抑制剂可以通过任何可接受的肠内施用方式(例如口服或直肠)或通过肠胃外施用(例如皮下、肌内、静脉内和皮内途径)或通过任何其它合适的途径(例如鼻内途径)施用给受试者。注射可以是推注或通过恒定或间歇输注。在一个实施方案中，MNK抑制剂是口服施用的。因此，MNK抑制剂可以配制成口服剂型，例如胶囊、片剂、囊片、颗粒或粉末(可悬浮或溶解在水中以提供饮料)，或作为强化食品。
MNK抑制剂可以使其具有生物可利用性的任何形式或模式施用。制备制剂领域的技术人员可以根据所选MNK抑制剂的特定特征，待治疗的病症，待治疗病症的阶段和其它相关情况，容易地选择适当的施用形式模式(更多信息参见《雷明登药学大全(RemingtonsPharmaceutical Sciences)》，第19版，马克出版有限公司(Mack Publishing Co.)(1995))。在一个实施方案中，制剂可任选地与药学上或兽医学上可接受的填充剂、载剂、稀释剂和/或赋形剂组合。填充剂、载剂、稀释剂或赋形剂可以是本领域技术人员已知的任何合适的底物，例如，磷酸氢二钙(DCPD)、磷酸氢钙、硬脂酸镁、淀粉、糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、碳酸钙、纤维素、纤维素衍生物或改性纤维素如微晶纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、醇如木糖醇、山梨糖醇或麦芽糖醇、水、醇、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠和/或气相二氧化硅吸收剂。优选地，填充剂、载剂、稀释剂或赋形剂可以是硬脂酸镁、DCPD、羟基乙酸淀粉钠、气相二氧化硅吸收剂或其组合。
MNK抑制剂可以与一种或多种另外的药物组合使用或施用，用于治疗本文所述的病症。组分可以以相同的制剂或不同的制剂施用。如果以不同的制剂施用，MNK抑制剂可以与其它药物相继施用(即在例如数秒或数分钟或甚至数小时(例如2至48小时)内以任何顺序相继使用)或与其它药物同时施用。
除了能够与一种或多种另外的药物组合施用之外，MNK抑制剂可以用于联合治疗。当这样做时，MNK抑制剂通常彼此组合施用。因此，一种或多种MNK抑制剂可以同时(作为组合制剂)或相继(即在例如数秒或数分钟或甚至数小时(例如2至48小时)内以任何顺序相继)施用以达到期望效果。当每种MNK抑制剂的治疗特征不同使得两种药物的组合效果提供改善的治疗结果时，这是特别理想的。
如果需要，并且为了更有效的分布，MNK抑制剂可以掺入缓释或靶向递送系统，例如聚合物基质、脂质体和微球。
MNK抑制剂的“治疗有效量”可以根据，例如，所用的特定选择的MNK抑制剂或MNK抑制剂的组合，给药模式，所治疗的特定病症和所需结果而变化。它还取决于病症的阶段和严重程度，待治疗的受试者包括受试者的年龄和身体状况，同时治疗的性质，如果有的话，以及与医师的熟知度等因素。对于预防性(防止性)应用，通常是足以延迟试图预防的特定病症的发作，抑制其进展或完全停止其的量。对于治疗应用，通常是足以达到医学上所需结果的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。对于任何化合物，最初可以在细胞培养测定(例如前脂肪细胞细胞系的细胞培养测定)或动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效量。动物模型也可用于确定合适的浓度范围和施用途径。然后可以使用这些信息来确定有用剂量和人体施用途径。治疗效果和任何毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定，例如通过测定ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(使50％的群体致死的剂量)确定。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比率LD50/ED50。具有大治疗指数的药物组合物是优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于配制供人类使用的一系列剂量。这种组合物中含有的剂量优选在包括ED50的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。剂量在该范围内变化，这取决于所用的剂型，患者的敏感性和施用途径。所使用的确切剂量和治疗有效量将由医师根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和施用途径/频率以提供足够水平的活性部分或维持所需效果。可以考虑的因素包括病症的严重程度，受试者的一般健康状况，受试者的年龄、体重和性别，饮食，施用时间和频率，药物组合，反应敏感性，以及对治疗的耐受性/反应。药物组合物可以每天数次，每天一次，每3至4天一次，每周一次或每两周一次施用，这取决于特定制剂和/或活性部分的半衰期和清除率。治疗有效量可以在0.1至100,000mg之间变化，直至总剂量为约1g，这取决于施用途径。在一个实例中，治疗有效量通常可为约1至2000mg/天，优选约10至约1000mg/天，最优选约10至约500mg/天，其可以一或多剂量施用。
意图是本公开的方法的任何或所有上述实施方案可以容易地用于本公开的其它方面，包括以下：
本公开内容的另一方面提供一种治疗有效量的至少一种MNK抑制剂用于治疗糖尿病前期受试者的用途，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平，其中所述MNK抑制剂可降低MNK1和/或MNK2的生物活性。
本公开内容的另一方面提供一种至少一种降低MNK1和/或MNK2的生物活性的MNK抑制剂在制备用于治疗糖尿病前期受试者的药物中的用途，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平。
实施例
实施例1MNK1和MNK2介导高脂肪饮食的不利影响，并且抑制MNK1和MNK2生物学功能可减少这些影响
材料和方法
材料和化学品
所有细胞培养溶液和补充剂均购自美国生命技术公司(Life Technologies)(卡尔斯巴德，加利福尼亚，美国)。用于SDS-PAGE的试剂购自伯乐生命医学产品有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)(赫拉克勒斯，加利福尼亚，美国)。对于脂肪形成实验，胰岛素，地塞米松，IBMX和罗格列酮获自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation)(圣路易斯，密苏里州，美国)。对于巨噬细胞极化，脂多糖(LPS)购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，白细胞介素(IL)-4和干扰素(IFN)γ购自派普泰克(Peprotech)(洛基山，新泽西州，美国)。MNK抑制剂CGP57380获自艾碧康生物(Abcam PLC)(剑桥，英国)。
动物使用和饮食
MNK1-KO和MNK2-KO小鼠在C57BL/6J背景上产生，由Rikiro Fukunaga博士友情提供(大阪大学，日本；Ueda等人，2004)。将4周龄雄性野生型(WT)、MNK1-KO或MNK2-KO小鼠保持在12小时光照/黑暗循环(在07:00开灯)和22±2℃的恒定温度下，自由采食食物和水。他们被分配到高脂肪饮食(HFD；45％kcal脂肪，20％kcal蛋白质，35％kcal碳水化合物；特殊饮食服务(Special Dietary Services)，埃塞克斯，英国)或标准食物饮食(C；7％kcal脂肪，18％kcal蛋白质，75％kcal碳水化合物；特殊饮食服务(Special Dietary Services))，持续20周。饮食中的脂肪由猪油(17.89％w/w)和大豆油(4.32％w/w)提供。饮食的营养价值见表4。
表4：高脂肪饮食和标准食物饮食的营养价值
每kg饲料的能量 高脂肪饮食 标准食物饮食
总能量(MJ/kg) 20.30 14.74
可消化能量(MJ/kg) 18.61 11.90
可代谢能量(MJ/kg) 17.19 10.74
Atwater燃料能量(Kcal/kg) 4568.36 3289.41
代谢研究
在食物或HFD 15周后，在过夜禁食后进行葡萄糖耐量测试(GTT)。在对小鼠腹膜内(ip)注射D-葡萄糖(2g/kg小鼠体重；Baxter Healthcare Ltd，阿德莱德，澳大利亚))之前，从尾静脉获得的全血测量空腹血糖浓度，并且在ip注射后15、30、60和120分钟使用AvivaAccu-Chek血糖仪(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，里施，瑞士)从尾静脉测量血糖浓度。
为了测试胰岛素抗性，将单独的一群小鼠禁食过夜，并且在ip注射胰岛素(0.75U/kg小鼠体重；Actrapid，诺和诺德(Novo Nordisk)，丹麦)之前测量从尾部获得的全血中的空腹血糖浓度。然后在ip注射后15和30分钟从尾静脉测量血糖浓度。在ip注射后30分钟读取葡萄糖读数后立即处死小鼠，立即冷冻组织用于通过蛋白质印迹分析以测量下游胰岛素信号传导。
血浆胰岛素、IL-5和IL-10的测量通过由英国剑桥的核心生化分析实验室(CoreBiochemical Assay Laboratory(CBAL))实施的酶联免疫吸附测定(ELISA)进行。
蛋白印迹
在含有50mM TrisHCl，pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，50mMβ-甘油磷酸盐，0.5mM NaVO3，0.1％2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA裂解缓冲液中收获组织。裂解后，通过在4℃下以12,000g离心10分钟除去不溶物质。通过Bradford蛋白质测定(Bio-Rad)测定蛋白质含量。如Liu等人(2014)所述进行免疫印迹。使用定量成像系统显现印迹。表5中所示的一抗来自细胞传导技术(Cell Signaling Technologies)，除了抗-P-eIF4E(默克密理博(Merck Millipore))。二抗获自赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Inc.)(沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)并以1:20,000稀释使用。
表5：试验中使用的抗体
基因表达分析
根据制造商的说明，使用Trizol试剂(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))从组织(取样时冷冻)分离总RNA。通过260nm处的吸光度测定RNA浓度，同时使用NanoDrop分光光度计(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))通过260/230和260/280比率评估质量和完整性。使用ImProm-II逆转录系统(A3800；普洛麦格(Promega)，麦迪逊，威斯康星州，美国)按照制造商的方案使用随机引物进行RT-实时PCR扩增。随后，使用Moore CEJ等人，2016，中的补充表S1中描述的引物序列进行实时定量(q)PCR，其内容通过引用整体并入本文)。与β2微球蛋白(B2M)mRNA相比，使用比较CT方法测量靶mRNA水平的扩增。在图1A中，使用等式2-dCt确定每个转录物的相对量，其中dCt＝(Ct目的基因–Ct内参基因)，并且Ct＝循环阈值。
BMDM的分离
如前所述从成年WT或MNK2-KO小鼠产生骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)(Weischenfeldt和Porse，2008)。简而言之，使用26号针将小鼠的双侧股骨和胫骨冲洗到无Ca2+和Mg2+的无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)(美国生命技术公司(Life Technologies))中。通过移液并使悬浮液通过40μm细胞过滤器破坏细胞簇。将得到的细胞悬浮液离心(10分钟，400x g)，将细胞团块重悬于含有30％L929细胞条件培养基(L929细胞分泌促进骨髓细胞分化为巨噬细胞的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))，20％胎牛血清(FBS)，50％DMEM(高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基；DMEM，Life Technologies)以及1％(w/v)青霉素/链霉素(美国生命技术公司(Life Technologies)))的完全巨噬细胞培养基(CMM)中。
巨噬细胞极化
在IFNγ(20ng/ml)存在下用LPS(100ng/ml；西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，来自大肠杆菌0111:B4的L2630-脂多糖)处理BMDM细胞24小时以使其向M1巨噬细胞表型极化；或者用IL-4(20ng/ml；派普泰克(Peprotech))单独处理细胞24小时以使其向M2表型极化。
3T3-L1细胞的分化和油红O染色
为了诱导3T3-L1(成纤维细胞)细胞分化，使前脂肪细胞在补充有10％FBS的DMEM中生长至汇合后2天(第0天)，并将培养基更换为补充有10％FBS，胰岛素(167nM)，地塞米松(0.5μM)，异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)(0.5mM)和罗格列酮(2μM)的DMEM。48小时后，用含有补充有10％(v/v)FBS和167nM胰岛素的DMEM的培养基替换培养基。在第4天，诱导分化后，将细胞在含有10％FBS的DMEM中培养。每48小时更换维持培养基直至细胞用于实验(从分化开始起9天)。在第0天将20μM的CGP57380加入细胞中，并在整个分化程序中的随后的培养基更换期间保持。
如其他人所述(Smith等人，1988)，使用油红O染色进行细胞内甘油三酸酯水平的评估。简而言之，在3T3-L1细胞分化的第9天，将其在10％福尔马林中固定1小时。将细胞在60％异丙醇中洗涤，然后在新制备的油红O染料中染色10分钟。为了定量，用水彻底洗涤细胞以除去未结合的染料，并向染色的6孔培养板中加入1ml异丙醇。5分钟后，测量油红提取物在510nm处的吸光度，增加的吸光度指示细胞内脂质水平增加。
组织学
将脂肪组织切片在10％中性缓冲福尔马林中固定6小时，并在包埋在石蜡中之前脱水作为标准物。切割切片(4μm)并将其固定在带正电荷的载玻片上，并进行苏木精和伊红(H&E)染色作为标准物。使用Panoramic 250Flash II扫描仪(3DHISTECH，匈牙利)扫描载玻片。使用具有脂肪细胞工具宏的图像J分析图像。然后计数脂肪细胞，计算每个物体的绝对像素面积并转换为μm2。
统计学
分析是通过双尾未配对学生t检验，单因素或双因素ANOVA进行的，如图例中所示。P值小于0.05被认为是显著的。使用统计程序GraphPad Prism(ver.6；GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)进行统计学测试。
脂解测定
如上所述使3T3L1细胞分化9天。根据制造商说明(Abcam脂解测定试剂盒，ab185433，艾碧康生物(Abcam))进行脂解测定。简而言之，在分化后，用脂解测定缓冲液洗涤细胞两次。使用100nM异丙肾上腺素刺激脂解作用3小时。使用比色强度测量释放的甘油量。
甘油三酸酯测量
使用甘油三酸酯定量试剂盒(艾碧康生物(Abcam)，ab65336)测量组织释放的甘油三酸酯(TAG)的量。
肝组织学
通过用油红O(西格玛(Sigma))染色将新鲜冷冻切片(5μm厚)用于检测脂质累计。将冷冻切片在60％异丙醇中固定10分钟，并用0.3％油红O在60％异丙醇中染色30分钟，随后用60％异丙醇洗涤。将细胞核用苏木精染色2分钟，然后用自来水冲洗。使用Pannoramic250Flash II扫描仪(3DHISTECH，匈牙利)扫描载玻片。
结果和讨论
MNK1和2在参与胰岛素调节代谢的正常小鼠组织中表达
之前已经证明MNK1和MNK2mRNA在肝脏、骨骼肌和心脏中表达。本发明人已经证明，除了确认在肝脏中表达外，MKNK1和MKNK2mRNA分子也在脂肪组织中表达(参见图1A)。免疫印迹分析显示MNK1蛋白在肝脏、骨骼和心肌以及脂肪组织中的表达(图1B)。
为了检测脂肪细胞分化过程中MNK2的表达，使用了3T3-L1成纤维细胞，这是一种广泛应用的脂肪细胞分化模型，用于分析标准标记物的表达，如转录因子PPARγ、C/EBPα以及SREBP1c，以及葡萄糖和脂肪酸转运蛋白GLUT4和CD36，证实了分化方案的功效(图1C)。在诱导分化方案后，MNK2mRNA的水平迅速上升，其水平是一天水平的三倍(其至少与最早的其它标志物一样快)(图1D)。该结果表明MNK2在脂肪细胞分化早期起作用。到第6天，MNK2mRNA水平降至大约为分化前期水平。相比之下，MKNK1mRNA水平在此期间仅略有增加。在进一步的工作中(参见图1E)，发现MNK2而非MNK1在3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞期间很早就被上调，然后出现大多数参与脂肪生成的关键基因(除了C/EBPβ)。
MNK2-KO小鼠免受HFD诱导的脂肪增加和胰岛素抗性指数的影响
与野生型(WT)小鼠相比，研究了MNK1-敲除(KO)或MNK2-KO小鼠对高肪饮食(HFD)与正常饮食(食物)相比的反应以确定MNK-1和MNK-2的作用。与食物饮食相比，喂食野生型(WT)C57B16/J小鼠HFD导致体重和性腺脂肪增加(图2A-2C)。高脂肪喂养的MNK1-KO小鼠显示出与HFD喂养的WT小鼠相似的体重和性腺脂肪重量的增加(图2A-2C)。相反，喂食纯合的MNK2-KO小鼠相同的HFD导致体重和性腺脂肪的较小增加。在WT小鼠中，HFD还引起葡萄糖和胰岛素循环水平的显著增加(分别为图2D，2E)。喂食HFD的MNK1-KO和MNK2-KO动物的这种增加都显著降低，表明HFD的不利影响减弱。值得注意的是，喂食食物饮食的MNK1-KO和MNK2-KO小鼠具有与WT小鼠相似的体重，性腺脂肪重量，基础葡萄糖和胰岛素水平。与野生型对照相比，MNK-KO小鼠的食物摄入未观察到存在差异。
胰岛素抗性的稳态模型评估(HOMA-IR)被广泛用作胰岛素抗性指数；它是根据血液胰岛素和葡萄糖水平计算的(Matthews等人1985)。HOMA-IR在WT/HFD小鼠中升高(图2F)。然而，在MNK2-KO/HFD小鼠中，观察到与喂食食物的动物相比，HOMA-IR的增加少得多，表明MNK2-KO动物在很大程度上免受HFD的不利影响，如胰岛素抗性尽管喂食HFD的MNK1-KO小鼠显示出与WT小鼠相似的体重和脂肪增加，但它们也显示出较低的血液胰岛素和葡萄糖水平，因此具有比WT/HFD小鼠更好的HOMA-IR(图2D-2F)。
与喂食食物饮食的那些相比，在喂食HFD的WT小鼠中脂肪细胞大小显著增加，如通过细胞面积所评估的(1.7倍；图3A)。假设这些细胞大致呈球形，这相当于脂肪细胞体积增加约3倍。与此相一致，与喂食食物的小鼠相比，观察到的HFD喂养的WT的脂肪细胞的数量相应减少(图3B)。相反，与食物喂养的对照相比，MNK2-KO/HFD小鼠中脂肪细胞的大小没有增加(图3A，3B)。这表明当将这些动物置于HFD时脂肪细胞脂质储存可能存在缺陷。有趣的是，发现MNK2/食物动物的脂肪细胞大小比WT对照更大，虽然不希望受理论束缚，但这可能表明MNK2-KO小鼠的脂肪形成存在缺陷，因此脂肪细胞较少，并且每个脂肪细胞因此变得更大。在HFD喂养的MNK2-KO小鼠中观察到脂肪细胞大小没有增加，这可能有助于降低高脂肪喂养的MNK2-KO小鼠的重量的增加。
MNK是脂肪细胞分化所必需的
与WT/HFD对照相比，MNK2-KO/HFD小鼠中观察到的脂肪组织增加减少，脂肪细胞分化期间MNK2表达增加(图1C)促使检查MNK2是否在细胞分化为脂肪细胞中发挥作用。为此，使用标准方案将3T3-L1细胞分化为脂肪细胞，并通过评估脂质含量和评价脂肪细胞标志物如PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4以及CD36的mRNA来监测分化。
研究了CGP57380，即广泛使用的MNK1和MNK2二者的活性抑制剂(Tschopp等人，2000)对3T3-L1细胞分化的影响。进行剂量-反应研究以确定阻断MNK功能所需的CGP57380浓度，如使用真核翻译起始因子4E(eIF4E)的磷酸化作为读数所评估的。MNK是已知磷酸化eIF4E的唯一激酶，因此，eIF4E的磷酸化(P-eIF4E)提供了MNK生物活性的直接读数。结果显示
20μM CGP57380是有效的，几乎完全阻断了3T3-L1细胞中的MNK活性(图3C)。此外，如图3D所示，20μM CGP57380抑制脂质累积入经受分化方案的3T3-L1细胞。
为了研究抑制脂质累积是否反映了参与脂肪形成分化的其它基因的表达改变，检测了PPARγ、C/EBPα、SREBP1c、GLUT4以及CD36的mRNA水平。如图3E所示，与在不存在CGP57380的情况下分化的3T3-L1细胞相比，CGP57380在分化方案的第3天和第6天都基本上阻断了所有这些基因的诱导。这些数据表明MNK在3T3-L1细胞分化为脂肪细胞中起作用，并且它们也可能在体内脂肪细胞分化中起作用，并证实MNK对脂肪细胞大小和数量的作用，如图3A和图3B所示。
MNK2-KO/HFD小鼠未显示肝脏脂质累积增加
鉴于MNK2-KO小鼠中观察到的脂肪组织增加减弱，与喂食HFD的WT动物相比，进行了研究以评估来自饮食的额外脂质负荷可能会转移到肝脏并导致脂肪累积在肝脏。HFDMNK2-KO小鼠显示与HFD WT小鼠相似的肝脏重量(数据未显示)。喂食HFD的WT和MNK2-KO小鼠的总肝脏脂质水平相似(数据未显示)。这些数据表明，在MNK2-KO小鼠中，HFD中的额外脂质不会重新导向肝脏。
与喂食HFD的WT小鼠相比，MNK-KO小鼠表现出改善的葡萄糖耐量
为了直接评估HFD对WT和MNK2-KO动物的葡萄糖耐量的影响，进行了葡萄糖耐量测试(GTT)。食物喂养的MNK1-KO或MNK2-KO小鼠在GTT中显示出与食物喂养的WT动物相似的反应，表明MNK在正常(食物)条件下不影响葡萄糖耐量。然而，相对于WT/HFD小鼠，MNK1-KO和MNK2-KO/HFD小鼠在葡萄糖施用后始终显示出显著更低的血糖水平，表明MNK1和MNK2在调节葡萄糖处理中的作用(图4A，4B)，以及因此更高的葡萄糖耐量。因此，根据这些结果，敲除MNK1或MNK2似乎可以使小鼠免受HFD诱导的葡萄糖耐受不良的影响。
为了评估胰岛素的作用，用胰岛素处理喂食食物或HFD的WT、MNK1-KO和MNK2-KO小鼠以评估这些动物降低血糖水平的能力。与WT/HFD小鼠相比，胰岛素在MNK1-KO或MNK2-KO/HFD动物中更有效地降低血糖，表明胰岛素在MNK1-KO/HFD和MNK2-KO/HFD小鼠中更有效地起作用(图4C)。实际上，MNK1-KO或MNK2-KO/HFD小鼠中由胰岛素引起的血糖水平降低百分比与喂食食物饮食的动物中观察到的相似。这些数据表明MNK1-KO和MNK2-KO小鼠各自在很大程度上免受HFD诱导的胰岛素抗性的影响。
MNK2-KO小鼠显示出比喂食HFD的WT小鼠更好的胰岛素信号传导
为了评估脂肪组织中MNK1和MNK2活性的相对水平，检测了eIF4E(MNK1和MNK2的共同底物)的磷酸化。HFD引起WT小鼠脂肪组织中磷酸化(P)-eIF4E(图5A)的小幅增加。在两种饮食条件下，MNK2-KO小鼠显示P-eIF4E显著降低，而与食物饮食的WT动物相比，食物饮食的MNK1-KO小鼠显示P-eIF4E没有变化。这表明在脂肪组织中MNK2是最活跃的MNK同种型。在MNK1-KO小鼠中，HFD-喂养的小鼠脂肪组织中的P-eIF4E低于食物喂养的小鼠(图5A)。
胰岛素通过葡萄糖转运蛋白GLUT4向质膜的易位刺激葡萄糖摄入组织，如脂肪，并且尤其是肌肉。与胰岛素的许多代谢作用一样，这种作用是通过蛋白激酶B(PKB，也称为Akt)介导的，其在磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)下游被磷酸化并激活。为了评估胰岛素激活该途径的能力，向喂食食物或HFD的WT和MNK2-KO小鼠施用胰岛素并在30分钟后处死以测试胰岛素抗性。从血液以及脂肪组织和骨骼(腓肠肌)肌中取样。通过免疫印迹分析组织样品的胰岛素信号传导的各种参数。在WT小鼠中，胰岛素施用引起Ser473和Thr308处PKB磷酸化的增加，其主要位点参与其在脂肪组织(图5B)和肌肉(图5B，5C)中的活化。在喂食HFD的WT动物中这些影响减少，表明对胰岛素影响的部分抗性。在食物饮食的MNK1-KO或MNK2-KO小鼠中，胰岛素诱导的PKB磷酸化与食物饮食的WT动物相似，但胰岛素诱导的PKB磷酸化在喂食HFD的MNK1-KO或MNK2小鼠中比在WT/HFD动物中高，表明在两种MNK-KO/HFD小鼠中胰岛素抗性都减弱(图5B，5C)。
与WT或食物喂养的MNK2-KO动物相比，在MNK2-KO/HFD小鼠的脂肪组织中观察到总GLUT4蛋白的增加(图5D)。GLUT4是关键的胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白，其响应于所述激素介导葡萄糖摄入胰岛素响应组织。胰岛素通过涉及PKB的信号传导途径促进其向质膜的易位。因此，与WT/HFD小鼠相比，MNK2KO/HFD动物的改善的葡萄糖耐量可能涉及改善的胰岛素敏感性和/或信号传导与更高水平的GLUT4蛋白的组合。与WT动物相比，喂食食物或HFD的MNK2-KO动物的脂肪组织中Glut4mRNA水平略低(数据未显示)。与野生型动物相比，MNK1-KO动物的脂肪中GLUT4蛋白水平倾向于更低(图5D)。在骨骼肌中，MNK2-KO小鼠中eIF4E磷酸化降低，但MNK1-KO小鼠中eIF4E磷酸化未降低(图5E)，表明MNK2是该组织中最活跃的MNK同种型，但MNK1也有贡献。与食物饮食相比，喂食HFD的WT小鼠中胰岛素诱导的PKB磷酸化降低，而其在MNK1-KO或MNK2-KO动物中没有受损。MNK2-KO小鼠肌肉中GLUT4蛋白水平倾向于更高，尤其是喂食HFD的那些，但差异没有达到显著性(图5E-5F)。因此，MNK1和MNK2都在损害HFD喂养的小鼠的脂肪组织和肌肉中的胰岛素信号传导中起作用。
MNK2-KO小鼠免受HFD诱导的脂肪炎症的影响
除了重量增加和胰岛素抗性之外，消耗HFD的结果是炎症，尤其是在脂肪组织中，它会被促炎性M1巨噬细胞浸润。检查来自已喂食食物或HFD的WT、MNK1-KO以及MNK2-KO小鼠的脂肪组织中的巨噬细胞和M1极化巨噬细胞的标记物。与WT/HFD动物相比，WT/HFD和MNK1-KO/HFD小鼠显示巨噬细胞标记物如Cd68和F4/80的mRNA水平增加(图6A，6B)。鉴于MNK2-KO/HFD小鼠中巨噬细胞标记物的改变，促炎性(M1巨噬细胞)标记物Cd11c和Tnfα(图6C，6D)，趋化因子受体Ccr2和Ccr5(在巨噬细胞运输中很重要；数据未显示)以及Mmp12(基质金属蛋白酶12；数据未显示)和Adam8(数据未显示)，其参与消化细胞外基质以允许细胞迁移。与之形成鲜明对比的是，与食物饮食的相同动物相比，MNK2-KO/HFD小鼠，而非MNK1-KO/HFD小鼠显示炎症显著减少，而Cd68、F4/80、Tnfα、Cd11c、Mhc II mRNAs(图6A-6D)，以及Ccr2、Ccr5、Mmp12或Adam8mRNA(数据未显示)的增加较少或没有增加。总之，这些数据表明，喂食HFD的MNK2-KO小鼠的脂肪组织不会被巨噬细胞严重浸润(基于缺乏Cd68和F4/80mRNA的正常显著增加)或显示促炎性M1巨噬细胞增加，如Cd11c和Tnf水平的明显钝化所示α。MNK2-KO小鼠中MhcII增加缺乏是令人感兴趣的，因为据报道在HFD喂养的动物中脂肪细胞MHCII对将免疫细胞吸引到脂肪组织中起重要作用。此外，据报道，富含饱和脂肪的饮食通过激活c-jun氨基末端激酶(JNK)引起胰岛素抗性。然而，JNK没有激活MNK，排除了JNK在HFD-MNK2-KO小鼠中观察到的表型中的作用(Waskiewicz等人，1997)。
因此，结果显示HFD在WT小鼠的脂肪组织中引发广泛的炎症，而MNK2-KO小鼠免受HFD的促炎作用的影响。有趣的是，尽管MNK1-KO/HFD小鼠显示出对胰岛素抗性和葡萄糖耐量的部分保护，但它们仍然表现出与WT/HFD动物类似的脂肪组织炎症。这强调了MNK1和MNK2在高脂肪喂养反应中的独特作用。然而，令人吃惊的是，保护的基础似乎有所不同；MNK2-KO小鼠显示减少的脂肪增加和炎症以及它们的保护，而MNK1-KO小鼠增加体重和脂肪组织，与WT小鼠类似，但仍然免受胰岛素抗性的影响。
巨噬细胞生物学
对来自MNK2-KO小鼠的巨噬细胞进行评估，以确定它们是否在产生细胞因子如TNFα和IL-6方面具有内在缺陷。MNK1和MNK2均有助于骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)中的eIF4E磷酸化(数据未显示)。与其调节特征一致，WT BMDM中脂多糖(LPS)诱导的eIF4E的增加在MNK1-KO细胞中丧失(数据未显示)。在体外用脂多糖(LPS)刺激来自野生型或MNK2-KO小鼠的BMDM，并评估细胞因子mRNA水平。LPS将野生型和MNK2-KO BMDM中的Tnfα和Il-6mRNA水平提高至相似的程度(数据未显示)。这些数据表明MNK2-KO BMDM对LPS反应和产生细胞因子的能力没有内在缺陷。
检查LPS和IFNγ组合的较长期(24小时)效应以评估BMDM向促炎M1表型的极化。WT和MNK2-KO BMDM类似地响应，表明BMDM不需要MNK2来产生这些炎症性细胞因子(数据未显示)。
在MNK2-KO/HFD小鼠的血浆中，与WT/HFD小鼠相比，观察到两种抗炎标志物Il-10和Il-5的mRNA水平显著增加(图7A，7B)。研究了来自WT和MNK2-KO小鼠的BMDM向M2抗炎表型极化的内在能力。有趣的是，发现与WT BMDM相比，来自MNK2-KO小鼠的BMDM在对照条件下具有升高的Il-10和Pparγ水平，并且在用IL-4刺激24小时后检查的所有M2极化标记物均增加(图7C-7F)。磷酸化eIF4E的数据表明MNK2是巨噬细胞中的主要同种型(数据未显示)。总之，数据表明来自MNK2-KO小鼠的巨噬细胞具有更高的抗炎表型倾向。
高脂肪喂养诱导MNK2-KO，而不是野生型小鼠，中的Nrf2表达
核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)在免受氧化应激影响方面起重要作用，这可能是由于广泛的脂肪酸氧化引起的，并且据报道也可以免受代谢综合征发展的影响。鉴于MNK2-KO小鼠显示出免受代谢综合征指数的影响，检测了WT和MNK2-KO小鼠肝脏中Nrf2的表达。喂食食物饮食的小鼠的水平相似。在喂食HFD的MNK2-KO小鼠中Nrf2mRNA水平显著增加，但在相应的对照动物中其没有增加(图8A)。肝脏Nrf2蛋白水平也显示在MNK2-KO小鼠中增加，但该变化没有达到显著性。因此，为了证实增加的Nrf2功能，还测试了充分表征的Nrf2靶基因血红素加氧酶-1(HO-1)的表达，其显示出与Nrf2自身的蛋白表达类似的模式(图8B)。有趣的是，据报道，Nrf2的激活使免受脂肪变性的影响。Nrf2可以由PPARα转录控制；然而，喂食HFD的MNK2-KO或WT小鼠的肝脏中未观察到PPARα水平的变化(数据未显示)。
治疗棕榈酸酯诱导的胰岛素抗性
使用胰岛素抗性的C2C12骨骼肌模型，观察到棕榈酸酯(在高脂肪饮食中血液水平升高的游离脂肪酸)处理增加P-eIF4E；从而表明棕榈酸酯激活MNK酶。在用100nM胰岛素刺激10和60分钟之前，使用由4mM棕榈酸酯处理16小时的C2C12细胞进行进一步的实验。用3μM的MNK抑制剂Mnk-I1进一步处理一些细胞。结果(参见图9)显示抑制剂灭活MNK1和MNK2(参见处理细胞中P-eIF4E水平降低)，但胰岛素信号传导标记物P-PKB308显示MNK抑制剂能够在棕榈酸酯暴露期间恢复胰岛素信号传导。
实施例2MNK1和MNK2双敲除动物的产生和高脂肪饮食(HFD)研究
WT和MNK-KO小鼠研究
使用如实施例1中所述的小鼠，将其回交到原种C57Bl/6小鼠的5-6代，来进行本实施例中描述的研究。然后将杂合的MNK1-KO(Mknk1+/-)和MNK2-KO(Mknk2+/-)小鼠杂交以获得WT和MNK1+MNK2双KO(Mknk1-/-；Mknk2-/-；DKO))动物，以及MNK1-KO(Mknk1-/-)和MNK-KO(Mkn2-/-)动物。先前已经报道，敲除MNK1和MNK2不影响小鼠的发育、活力或生育力(Ueda等人，2004)，并且与此一致，在喂食食物或高脂肪饮食的小鼠中没有观察到敲除MNK1加MNK2的不利影响。食物饮食和HFD与实施例1中描述的类似。在这种情况下，食物饮食制剂是Teklad Global 18％蛋白质啮齿动物饮食(Envigo，麦迪逊，威斯康星州，美国)，且HFD制剂源自专业饲料有限公司(Specialty Feeds Pty Ltd)(饮食SF15-095；格伦福雷斯特，西澳大利亚州，澳大利亚)。
HFD的重量增加
在食物饮食时，WT和DKO小鼠在研究的16周期间重量增加到相似的程度(数据未显示)，尽管在4周龄时，MNK1-KO比MNK2-KO或WT小鼠略重(数据未显示)。由于GTT在第15-16周进行，因此在所述时间点之后获得的数据由于小鼠遇到的干扰而不完全可靠。
为了测试动物对卡路里超负荷的反应，从断奶开始(即从4周龄开始)饲喂食物(对照)或富含能量的高脂肪饮食(HFD)另外16周(直至20周龄)。喂食HFD的WT小鼠重量增加了很多(25或28g，喂食HFD的第11周或15周)。重要的是，并且与实施例1中描述的观察结果一致，喂食HFD的MNK2-KO小鼠获得比WT对照显著更小的重量(图10)，证实MNK2的缺失使免受喂食HFD重量增加的影响。然而，与实施例1中描述的结果相反，在这种情况下，MNK1-KO小鼠实际上与WT对照相似地增加了体重(图10)；这种差异的原因可能在于下列事实：这些动物在遗传上与先前使用的那些不同，所使用的HFD的差异或其它因素。使用DKO小鼠，发现动物在15周时显示出比MNK2-KO小鼠稍微更大的重量增加，尽管增加仍然比WT或MNK1-KO动物观察到的更小(图10)。这是出乎意料的，因为据推测，两种MNK的敲除将提供比单独的每种MNK同种型的KO更大的保护使免受重量增加影响，这提供了部分保护。因此，数据显示禁用MNK1和MNK2并不比单独MNK2缺失提供更大的益处，并且实际上可能在防止重量增加方面提供较少的优势。
GTT数据
如实施例1中所述进行葡萄糖耐量测试，以评估喂食HFD的动物是否发生葡萄糖耐受不良(其通常由该环境中的胰岛素抗性引起)。在喂食食物或HFD 11周后，在禁食6小时后进行葡萄糖耐量测试(GTT)。在对小鼠腹膜内(ip)注射25％D-葡萄糖溶液(2g/kg体重；西格玛奥德里奇(Sigma-Adrich)，澳大利亚)之前，从尾尖的出血测量空腹血糖浓度，并且在ip注射后15、30、60和120分钟使用Freestyle Lite血糖仪(雅培(Abbott)，麦觉理公园，新南威尔士州，澳大利亚)测量血糖浓度。喂食HFD的小鼠显示葡萄糖耐量受损。鉴于实施例1中描述的研究显示HFD喂养的MNK1-KO或MNK2-KO小鼠显示出比相应WT动物更好的葡萄糖耐量，预期MNK1+2-DKO小鼠将显示甚至更好的葡萄糖耐量。但是，如图11所示，情况并非如此。实际上，发现MNK1-KO小鼠没有比WT-HFD小鼠显示出更好的葡萄糖耐量。此外，在推注葡萄糖后，在HFD喂养的MNK-DKO小鼠中，血浆葡萄糖水平在120分钟时几乎返回到基线，类似于任何这些基因型的食物喂养小鼠的情况。因此，与MNK2-KO小鼠(参见实施例1)一样，DKO动物显示出比喂食HFD的WT小鼠更好的葡萄糖耐量，如通过计算这些数据的曲线下面积(AUC)所见(数据未显示)。对AUC的评估还显示，MNK1-KO/HFD小鼠实际上显示出比WT/HFD动物更差，并且比MNK-DKO/HFD小鼠差得多的葡萄糖耐量，在MNK1-KO/HFD小鼠中葡萄糖浓度保持显著更高(图11)。
因此，MNK1的缺失似乎不能始终如一地防止HFD诱导的葡萄糖耐受不良的影响。这可能有助于解释对于它们在HFD喂养的小鼠的GTT中的表现而言为什么MNK1和MNK2的缺失没有给出优于单独MNK2缺失的进一步的益处。
总之，本实施例中提供的数据表明喂食HFD时敲除MNK2在改善的葡萄糖耐量(代谢健康)方面始终是有益的。相反，MNK1缺失的影响似乎有所不同，可能取决于确切的遗传背景和/或饮食的精确成分。此外，两种MNK的敲除相对于单独MNK2的缺失没有提供优异的效果。因此，在根据本公开的治疗糖尿病前期的方法中，使用MNK2的特异性抑制剂而不是影响两种酶的双重抑制剂将更加可靠和有效。
实施例3 MNK2特异性抑制对3T3-L1细胞中eIF4E磷酸化的影响
3T3-L1细胞研究
如实施例1中所述，发现正常食物饮食的MNK2-KO小鼠含有相同量的性腺脂肪组织，但是这种组织具有更少、更大的脂肪细胞(fat cell)(脂肪细胞(adipocyte))。这表明脂肪细胞产生中的缺陷(即脂肪细胞分化)。喂食HFD时，脂肪细胞通常变大，允许动物储存更多脂肪并变得更重。然而，在MNK2-KO小鼠中，脂肪细胞在喂食HFD时没有变大，这可能解释了为什么这些小鼠不会变得像WT/HFD小鼠一样重。虽然不希望受到理论的束缚，但这种缺乏进一步的大小增加可能反映出(i)MNK2-KO小鼠中较大的脂肪细胞已达到储存容量并且无法增加其脂肪含量和/或(ii)这种细胞储存脂肪的内在能力受损。
为了研究MNK2在脂肪细胞分化中的作用，以与实施例1中所述类似的方式使用3T3-L1细胞。当与异丁基甲基黄嘌呤(IBMX，500μM；cAMP升高)，胰岛素(350nM)，地塞米松(0.5μM；类固醇)以及罗格列酮(2μM；刺激转录因子PPARγ转录)的组合一起孵育时，3T3-L1成纤维细胞分化为脂肪细胞。响应这种刺激的“混合”，这些细胞首先进行克隆扩增，然后诱导一系列转录因子，导致脂肪形成中涉及的基因表达：
结果(如图12所示)显示Mnk2mRNA在加入分化混合物后被非常迅速地诱导(3小时时>3倍，持续至约6小时，之后Mnk2mRNA表达下降)，定位它以在脂肪形成中发挥的作用。实施例1证明MNK抑制剂CGP57380损害了关键转录因子的诱导，所述转录因子例如C/EBPα、PPARγ以及SREBP1c(其驱动参与脂质储存的基因的表达)。还发现CGP57380抑制葡萄糖和脂质转运蛋白GLUT4和CD36的表达，这可以至少部分地解释为什么脂肪储存在体内MNK2-KO脂肪细胞中受到限制。在这里，进行了研究以测试另一种非常不同的化合物，其也抑制MNK，即尾孢酰胺。如图13所示，尾孢酰胺损害了诸如PPARγ的基因的诱导(图13A)，并且还降低了脂质累积(图13B)。
然而，除了MNK之外，CGP57380和尾孢酰胺确实抑制其它蛋白激酶，并且不是非常有效的MNK抑制剂(Bain等人，2007；Konicek等人，2011)；例如，它必须在浓度≥20μM下使用以强烈抑制P-eIF4E。因此，研究了另一种抑制剂化合物MNK-I1(Beggs等人，2015)。MNK-I1在结构上不同于CGP57380和尾孢酰胺，其更具特异性并且不抑制受CGP57380影响的其它激酶(Beggs等人，2015)。它也更有效并且以更低浓度强烈抑制3T3-L1细胞中的MNK活性(3μM；参见图14A，14B；参照CGP57380，需要50μM才能看到相似的p-eIF4E抑制程度(参见图3c))。重要的是，鉴于细胞必须孵育至少三天以进行分化，MNK-I1对P-eIF4E的作用持续至少这段时间。
发现MNK-I1损伤所有研究的脂肪形成基因的诱导，包括转录因子Cebpα、Cebpβ、Cebpδ和Pparγ，以及脂肪酸合成酶和乙酰基-CoA羧化酶(Fas和Acc；脂肪生成的关键酶)和脂质转运蛋白Cd36(参见图15A)。它还阻止脂质累积，如通过油红O染色(数据未显示)或直接甘油三酸酯测定(图15B)所判断的。MNK-I1的作用不完全(即不是完全抑制)的事实与MNK2-KO小鼠中脂肪细胞数减少但未完全消融的观察相匹配。这也与MNK-2KO小鼠在喂食对照饮食时显示相似的总脂肪量的重要发现相匹配，尽管当喂食HFD时它们的脂肪增加强烈减少。这具有重要的临床意义，因为这意味着患者的重量增加会减少或逆转，但这不会导致脂肪组织的极端损失。
在进一步的研究中，产生了一系列与MNK-I1类似的化合物，并测试了它们抑制3T3-L1细胞中MNK的能力。化合物的结构如下表6所示。由于eIF4E仅被MNK磷酸化，其磷酸化状态是细胞内MNK活性的可靠读数。一些新化合物抑制这些细胞中的eIF4E磷酸化，表明它们对MNK具有活性(表6)。特别地，MNK-I2在3T3-L1细胞中强烈抑制P-eIF4E(参见图14A)，表明它是有效的MNK抑制剂。此外，为了评价MNK-1和MNK-I2对MNK1与MNK2的相对作用，使用来自MNK1-KO或MNK2-KO动物的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在MNK1-KO MEF中，MNK-I2在所有测试浓度下几乎完全抑制P-eIF4E水平(最低为0.1μM)。这类似于MNK-I1的作用(图16A)。相反，在MNK2-KO细胞中，其中eIF4E磷酸化依赖于MNK1，MNK-I2具有比MNK-I1更弱的抑制作用，表明它对MNK1的活性低于MNK-I1(图16B)。因此，这些结果显示MNK-I2抑制剂对MNK2的选择性超过MNK1。MNK2是3T3-L1细胞和脂肪组织中的主要MNK(Moore等人，2016)。
在另外的研究中，进行测试以评估MNK-I2抑制剂对3T3-L1细胞中分化标志物的诱导的影响。发现MNK-I2损害了所研究的脂肪形成程序中所有基因的诱导(图17A)。MNK-I2的影响程度与MNK-I1相似，或者在某些情况下，大于MNK-I1(比较图15A和17A)。这些结果是显著的，因为它们显示MNK2选择性抑制剂，如MNK1+MNK2抑制剂CGP57380和MNK-I1，也损害脂肪生成并支持MNK2是脂肪组织中关键的MNK2同种型的结论。
因此，基于从KO小鼠研究获得的数据(参见实施例2)和用3T3-L1细胞在体外进行的实验(参见实施例3)，MNK-2选择性抑制剂提供了相当大的希望并且可能比MNK1和MNK2的抑制剂更有益于糖尿病前期受试者的治疗。
表6
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”和“包含(include)”以及诸如“包括(comprising)”和“包含(including)”的变体将被理解为暗示包括所述整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。
本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被视为承认任何形式的这种现有技术构成公知常识的一部分的建议。
本领域技术人员将理解，本发明的用途不限于所描述的特定应用。关于本文描述或描绘的特定元件和/或特征，本发明不限于其优选实施方案。应当理解，本发明不限于所公开的实施方案，而是能够在不脱离由所附权利要求阐述和限定的本发明的范围内进行多种调整、修改和替换。
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Claims (29)

1.一种治疗糖尿病前期受试者的方法，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平，包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和/或MNK2的生物活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MNK抑制剂降低MNK2的生物活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述MNK抑制剂显示对MNK2的选择性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述MNK抑制剂降低MNK1的生物活性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和MNK2的生物活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述MNK抑制剂选自由小有机分子、肽抑制剂、抑制性抗体或其片段、干扰核苷酸分子或适体组成的群组。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述MNK抑制剂是ATP竞争剂。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述MNK抑制剂选自N3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并-[3,4-d]嘧啶-3,4-二胺；或4-氨基-3-(对氟苯基氨基)吡唑并[3,4-d]嘧啶、(9aS)-8-乙酰基-9,9a-二氢-1,3,7-三羟基-9a-甲基-9-氧代-4-二苯并呋喃甲酰胺、4-[5-(4-哌啶基)-1H-吡唑-3-基]吡啶二盐酸盐、4-(2-(2-氟丙氧基)-4-氟苯基氨基)-N-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺以及4-(2-异丙氧基)-4-氟苯基氨基)-N-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述MNK抑制剂任选地与药学上或兽医学上可接受的填充剂、载剂、稀释剂和/或赋形剂组合配制成药物组合物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者具有空腹血糖受损糖尿病前期。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者具有葡萄糖耐量受损糖尿病前期。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法防止和/或延迟糖尿病前期进展至2型糖尿病。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法防止糖尿病前期由空腹血糖受损(IFG)阶段进展至葡萄糖耐量受损(IGT)阶段。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者的特征在于空腹血糖水平为6.1mmol/l至6.9mmol/l。
15.一种治疗有效量的至少一种MNK抑制剂在治疗糖尿病前期受试者中的用途，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和/或MNK2的生物活性。
16.一种至少一种降低MNK1和/或MNK2的生物活性的MNK抑制剂在制备用于治疗糖尿病前期受试者的药物中的用途，所述受试者的特征在于具有5.5mmol/l至6.9mmol/l的空腹血糖水平。
17.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述MNK抑制剂降低MNK2的生物活性。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的用途，其中所述MNK抑制剂显示对MNK2的选择性。
19.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述MNK抑制剂降低MNK1的生物活性。
20.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述MNK抑制剂降低MNK1和MNK2的生物活性。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的用途，其中所述MNK抑制剂选自由小有机分子、肽抑制剂、抑制性抗体或其片段、干扰核苷酸分子或适体组成的群组。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的用途，其中所述MNK抑制剂是ATP竞争剂。
23.根据权利要求15至21中任一项所述的用途，其中所述MNK抑制剂选自N3-(4-氟苯基)-1H-吡唑并-[3,4-d]嘧啶-3,4-二胺；或4-氨基-3-(对氟苯基氨基)吡唑并[3,4-d]嘧啶、(9aS)-8-乙酰基-9,9a-二氢-1,3,7-三羟基-9a-甲基-9-氧代-4-二苯并呋喃甲酰胺、4-[5-(4-哌啶基)-1H-吡唑-3-基]吡啶二盐酸盐、4-(2-(2-氟丙氧基)-4-氟苯基氨基)-N-(3-(二甲基氨基)丙基)-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺以及4-(2-异丙氧基)-4-氟苯基氨基)-N-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-5-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺。
24.根据权利要求15至21中任一项所述的用途，其中将所述MNK抑制剂任选地与药学上或兽医学上可接受的填充剂、载剂、稀释剂和/或赋形剂组合配制成药物组合物。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的用途，其中所述受试者患有空腹血糖受损糖尿病前期。
26.根据权利要求15至24中任一项所述的用途，其中所述受试者患有葡萄糖耐量受损糖尿病前期。
27.根据权利要求15至24中任一项所述的用途，其中所述方法防止和/或延迟糖尿病前期进展至2型糖尿病。
28.根据权利要求15至25中任一项所述的用途，其中所述方法防止糖尿病前期由空腹血糖受损(IFG)阶段进展至葡萄糖耐量受损(IGT)阶段。
29.根据权利要求15至28中任一项所述的用途，其中所述受试者的特征在于空腹血糖水平为6.1mmol/l至6.9mmol/l。
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