KR101889097B1 - 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TPH1(Trypotophan hydroxylase 1), HTR2A(5-hydroxytryptamine 2A receptor) 또는 HTR3(5-hydroxytryptamine 3 receptor) 억제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. HTR3의 억제는 대사질환의 치료에 대한 다양한 이로운 효능을 초래하며, 이는 비만에 대한 저항성, 지방 드랍립 크기의 감소, 열발생 유전자의 발현 증가, 대사 활성의 증가, 인슐린 민감성 증가 및 LDL 콜레스테롤과 렙틴의 감소를 포함한다.

Description

대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Metabolic Diseases}
본 발명은 대사질환, 특히 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대사회의 급속한 발전과 영양 섭취상태가 풍요로워 짐에 따라 원시시대와 차이가 없는 인체의 대사기관에 막대한 환경 변화가 발생하였다. 이에, 성인병 또는 현대병이라 불리는 비만, 제 2형 당뇨병, 고혈압, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화 등의 질환이 2 개 이상 복합적으로 나타나는 대사성 질환의 유병률이 2005년 국민건강 영양조사 자료에 의하면 전체적으로 32.3%(남자 32.9%, 여자 31.8%)로, 이로부터 발병되는 심장질환과 뇌졸중이 한국인 사망원인 2, 3위를 차지할 만큼 증가하고 있는 실정이다.
이는 균형있는 신진대사가 잘 이루어지지 않아 발생하는 대사성 노폐물과 독소를 방출시키지 못함으로 인해 인체 내에 쌓인 노폐물들이 각 인체의 기능을 상실시킴으로 발생하는 증상으로 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로도 알려져 있는 대사증후군(Metabolic Syndrome)으로 발전하고, 대사증후군은 곧 관상동맥 내 손상을 줘 심장질환 또는 중풍의 원인을 제공하거나, 신장에서 소금을 제거하는 능력이 떨어져서 고혈압을 일으키고, 심혈관 질환의 원인을 제공하는 중성지방 비율을 증가시키고, 혈액 응고의 위험을 가중시키며 또한, 2형 당뇨로인슐린 생산이 적어져 눈, 신장, 신경에 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.
당뇨병은 혈당 농도가 정상인에 비하여 높아 소변으로 포도당이 배출되는 질환으로, 췌장 내의 랑게르한스섬의 β-세포에서 인슐린(insulin)의 비정상적 대사과정 또는 이상 생리활성에 의하여 발병된다. 또한 당뇨병은 만성 대사성 질환으로 오랜 시간이 경과함에 따라 혈관장애와 신경, 신장 및 망막 등의 기능이상을 초래하고 이로 인해 생명까지 잃게 하는 질환이다. 당뇨병은 인슐린의 분비와 작용 여부에 따라 제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병으로 나누어진다.
제 1형 당뇨병)은 자가면역세포에 의해 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린을 분비하지 못하여 발생하고, 심한 인슐린 결핍상태에 있으므로 고혈당증과 케톤산증, 다갈, 다음, 다뇨, 체중감소 및 피로감을 나타낸다. 케톤증과 사망을 예방하기 위해 정기적으로 외부에서 인슐린을 공급해야 하며, 주로 청소년기 이전에 발생하므로 소아 당뇨병으로 불리기도한다. 반면에 전체 당뇨병 환자의 90% 이상인 제 2형 당뇨병은 유전적인 요인과 비정상적인 식생활, 스트레스, 운동, 비만, 노화 등과 같은 환경적인 요인이 복합적으로 관련되어 유발된 인슐린 저항성과 이에 대한 베타세포의 보상기전의 실패에서 기인한다. 제 2형 당뇨병은 일반적으로 당대사 및 지질대사 이상을 나타낸다. 즉, 상기 제 2형 당뇨병 환자의 경우 음식 섭취 후 인슐린 분비가 늦어지거나 충분한 양이 분비되지 못하여 간에서의 당 생성이 줄어들지 못하고 근육, 간 및 지방과 같은 말초 조직에 의한 혈당의 이용률이 증가되지 못한다. 이때문에 생긴 식후의 고혈당 증상은 인슐린 분비를 지속적으로 촉진시켜 결과적으로 만성적인 인슐린 과다증을 유발하고 이러한 상태가 계속되면 베타세포가 더 이상 증가된 인슐린 분비율을 유지하지 못하게 되어 궁극적으로 공복 고혈당을 동반한 당뇨병으로 나타난다.
지속적인 인슐린 저항성은 베타세포 기능부전을 초래하여 상대적 저인슐린혈증을 유도하게 된다. 특히 글루카곤에 대한 인슐린 비가 감소되면 간에서의 당신생이 증가된다. 또한, 인슐린 저항성의 원인으로 혈중 유리지방산의 증가가 제시되고 있다. 혈중 유리지방산의 증가는 말초조직에서 인슐린에 의한 당 이용을 억제시키고 간 조직에서 당 신생억제를 방해함으로써 혈당치를 높인다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병에서는 혈중 유리지방산 증가뿐만 아니라 혈중 콜레스테롤과 중성지질 증가 현상 및 HDL-콜레스테롤 감소 현상이 나타나며 이러한 지질이상혈증(dyslipidemia)의 발병은 정상인에 비해 2 내지 4배 정도 높다. 또한 이로 인해 비만이 유발되기도 한다. 한편 당뇨병과 당뇨 합병증에 관련된 연구에서 당뇨병이 산화적 스트레스와 밀접한 관련이 있음이 보고되고 있다. 당뇨병에서 나타나는 만성적인 고혈당은 포도당의 자동산화, 단백질 당화 등 다양한 경로에 의해 유리기의 생성을 증가시키고, 반응성이 높은 이들 물질에 의해 산화적 스트레스가 높아진다. 더구나 고혈당으로 유발된 산화적 스트레스를 방어하기에는 항산화 효소의 발현과 활성이 불충분하여 항산화 효소 활성이 비정상적으로 증가하게 되어 이들 효소사이에 유지되고 있던 균형상태가 무너지게 된다. 또한 당뇨병은 체내 고혈당환경으로 높은 삼투압 스트레스를 유발하여 백내장 및 신장질환과 같은 합병증을 유발한다(Campbell, R. K. and Steil, C. F. 1988. Diabetes, clinical pharmacy and therapeutics. William & Wilkins. 4, p.176). 당뇨병에는 인슐린을 비롯한 글루카콘(glucagon), 글루코콜티코이드(glucocorticoid) 등의 호르몬 불균형으로 탄수화물을 비롯한 단백질, 지질 및 전해질 대사 등 생리적 대사조절 기능이상으로 고혈당, 당뇨 등의 특징적인 증세를 나타내며, 만성으로 경과되면 당뇨병의 합병증으로 동맥경화증, 혈관장애, 신경장애, 골감소증 및 감염증 등이 주로 나타난다.
종래 당뇨 또는 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료를 위한 조성물로는, 대 한민국 등록특허 제0721508호에 위령선(ß%ß%ß%, Radix Clematidis) 추출물을 함유하는 당뇨병, 당뇨합병증, 인슐린저항성 및 그로 인한 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료용 약학조성물이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제1269208호에서는 삼백초 추출분획물로부터 분리한 사우치논을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2012-0122970호에서는 여우콩(Rhynchosia volubilis Lour.) 분말 또는 이의 추출물을 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 및 치료를 위한 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 당뇨 또는 인슐린저항성 증후군 치료에 유용한 신규 치료제의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
세로토닌은 5-HT(5-hydroxytryptamine)이라고도 한다. 세로토닌은 신경전달 물질이며, 식사, 수면, 각성, 고통 조절 및 꿈 등에 관련된 감정 조절에 관여한다. 세로토닌은 아미노산인 트립토판(tryptophan)에서 합성이 되며, 효소인 트립토판
하이드록실라제(tryptophan hydroxylase)가 -OH를 트립토판에 붙여서 중간물질인 5-HTP(5-hydroxytryptophan)가 생성된다. 그 후 또 다른 효소 5-HTP 디카르복실라제(aminoacid decarboxylase)가 5-HTP에서 -COOH를 제거함으로써, 5-HT,즉 세로토닌을 완성한다. P-클로로페닐알라닌(p-chlorophenylalanine, PCPA)은 합성 아미노산으로 세로토닌 합성의 속도제한효소인 트립토판 하이드록실라제의 비가역적 억제제로 전신적인 세로토닌 합성 억제를 유도한다.
현대사회의 급속한 발전과 영양 섭취상태가 풍요로워 짐에 따라 원시시대와 차이가 없는 인체의 대사기관에 막대한 환경 변화가 발생하였다. 이에, 성인병 또는 현대병이라 불리는 비만, 제 2형 당뇨병, 고혈압, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화 등의 질환이 2 개 이상 복합적으로 나타나는 대사성 질환의 유병률이 2005년 국민건강 영양조사 자료에 의하면 전체적으로 32.3%(남자 32.9%, 여자 31.8%)로, 이로부터 발병되는 심장질환과 뇌졸중이 한국인 사망원인 2, 3위를 차지할 만큼 증가하고 있는 실정이다.
이는 균형있는 신진대사가 잘 이루어지지 않아 발생하는 대사성 노폐물과 독소를 방출시키지 못함으로 인해 인체 내에 쌓인 노폐물들이 각 인체의 기능을 상실시킴으로 발생하는 증상으로 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로도 알려져 있는 대사증후군(Metabolic Syndrome)으로 발전하고, 대사증후군은 곧 관상동맥 내 손상을 줘 심장질환 또는 중풍의 원인을 제공하거나, 신장에서 소금을 제거하는 능력이 떨어져서 고혈압을 일으키고, 심혈관 질환의 원인을 제공하는 중성지방 비율을 증가시키고, 혈액 응고의 위험을 가중시키며 또한, 2형 당뇨로인슐린 생산이 적어져 눈, 신장, 신경에 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.
당뇨병은 혈당 농도가 정상인에 비하여 높아 소변으로 포도당이 배출되는 질환으로, 췌장 내의 랑게르한스섬의 β-세포에서 인슐린(insulin)의 비정상적 대사과정 또는 이상 생리활성에 의하여 발병된다. 또한 당뇨병은 만성 대사성 질환으로 오랜 시간이 경과함에 따라 혈관장애와 신경, 신장 및 망막 등의 기능이상을 초래하고 이로 인해 생명까지 잃게 하는 질환이다. 당뇨병은 인슐린의 분비와 작용 여부에 따라 제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병으로 나누어진다.
제 1형 당뇨병)은 자가면역세포에 의해 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린을 분비하지 못하여 발생하고, 심한 인슐린 결핍상태에 있으므로 고혈당증과 케톤산증, 다갈, 다음, 다뇨, 체중감소 및 피로감을 나타낸다. 케톤증과 사망을 예방하기 위해 정기적으로 외부에서 인슐린을 공급해야 하며, 주로 청소년기 이전에 발생하므로 소아 당뇨병으로 불리기도한다. 반면에 전체 당뇨병 환자의 90% 이상인 제 2형 당뇨병은 유전적인 요인과 비정상적인 식생활, 스트레스, 운동, 비만, 노화 등과 같은 환경적인 요인이 복합적으로 관련되어 유발된 인슐린 저항성과 이에 대한 베타세포의 보상기전의 실패에서 기인한다. 제 2형 당뇨병은 일반적으로 당대사 및 지질대사 이상을 나타낸다. 즉, 상기 제 2형 당뇨병 환자의 경우 음식 섭취 후 인슐린 분비가 늦어지거나 충분한 양이 분비되지 못하여 간에서의 당 생성이 줄어들지 못하고 근육, 간 및 지방과 같은 말초 조직에 의한 혈당의 이용률이 증가되지 못한다. 이때문에 생긴 식후의 고혈당 증상은 인슐린 분비를 지속적으로 촉진시켜 결과적으로 만성적인 인슐린 과다증을 유발하고 이러한 상태가 계속되면 베타세포가 더 이상 증가된 인슐린 분비율을 유지하지 못하게 되어 궁극적으로 공복 고혈당을 동반한 당뇨병으로 나타난다.
지속적인 인슐린 저항성은 베타세포 기능부전을 초래하여 상대적 저인슐린혈증을 유도하게 된다. 특히 글루카곤에 대한 인슐린 비가 감소되면 간에서의 당신생이 증가된다. 또한, 인슐린 저항성의 원인으로 혈중 유리지방산의 증가가 제시되고 있다. 혈중 유리지방산의 증가는 말초조직에서 인슐린에 의한 당 이용을 억제시키고 간 조직에서 당 신생억제를 방해함으로써 혈당치를 높인다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병에서는 혈중 유리지방산 증가뿐만 아니라 혈중 콜레스테롤과 중성지질 증가 현상 및 HDL-콜레스테롤 감소 현상이 나타나며 이러한 지질이상혈증(dyslipidemia)의 발병은 정상인에 비해 2 내지 4배 정도 높다. 또한 이로 인해 비만이 유발되기도 한다. 한편 당뇨병과 당뇨 합병증에 관련된 연구에서 당뇨병이 산화적 스트레스와 밀접한 관련이 있음이 보고되고 있다. 당뇨병에서 나타나는 만성적인 고혈당은 포도당의 자동산화, 단백질 당화 등 다양한 경로에 의해 유리기의 생성을 증가시키고, 반응성이 높은 이들 물질에 의해 산화적 스트레스가 높아진다. 더구나 고혈당으로 유발된 산화적 스트레스를 방어하기에는 항산화 효소의 발현과 활성이 불충분하여 항산화 효소 활성이 비정상적으로 증가하게 되어 이들 효소사이에 유지되고 있던 균형상태가 무너지게 된다. 또한 당뇨병은 체내 고혈당환경으로 높은 삼투압 스트레스를 유발하여 백내장 및 신장질환과 같은 합병증을 유발한다(Campbell, R. K. and Steil, C. F. 1988. Diabetes, clinical pharmacy and therapeutics. William & Wilkins. 4, p.176). 당뇨병에는 인슐린을 비롯한 글루카콘(glucagon), 글루코콜티코이드(glucocorticoid) 등의 호르몬 불균형으로 탄수화물을 비롯한 단백질, 지질 및 전해질 대사 등 생리적 대사조절 기능이상으로 고혈당, 당뇨 등의 특징적인 증세를 나타내며, 만성으로 경과되면 당뇨병의 합병증으로 동맥경화증, 혈관장애, 신경장애, 골감소증 및 감염증 등이 주로 나타난다.
종래 당뇨 또는 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료를 위한 조성물로는, 대 한민국 등록특허 제0721508호에 위령선(ß%ß%ß%, Radix Clematidis) 추출물을 함유하는 당뇨병, 당뇨합병증, 인슐린저항성 및 그로 인한 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료용 약학조성물이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제1269208호에서는 삼백초 추출분획물로부터 분리한 사우치논을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2012-0122970호에서는 여우콩(Rhynchosia volubilis Lour.) 분말 또는 이의 추출물을 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 및 치료를 위한 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 당뇨 또는 인슐린저항성 증후군 치료에 유용한 신규 치료제의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
세로토닌은 5-HT(5-hydroxytryptamine)이라고도 한다. 세로토닌은 신경전달 물질이며, 식사, 수면, 각성, 고통 조절 및 꿈 등에 관련된 감정 조절에 관여한다. 세로토닌은 아미노산인 트립토판(tryptophan)에서 합성이 되며, 효소인 트립토판
하이드록실라제(tryptophan hydroxylase)가 -OH를 트립토판에 붙여서 중간물질인 5-HTP(5-hydroxytryptophan)가 생성된다. 그 후 또 다른 효소 5-HTP 디카르복실라제(aminoacid decarboxylase)가 5-HTP에서 -COOH를 제거함으로써, 5-HT,즉 세로토닌을 완성한다. P-클로로페닐알라닌(p-chlorophenylalanine, PCPA)은 합성 아미노산으로 세로토닌 합성의 속도제한효소인 트립토판 하이드록실라제의 비가역적 억제제로 전신적인 세로토닌 합성 억제를 유도한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 TPH1(Trypotophan hydroxylase 1), HTR2A(5-hydroxytryptamine 2A receptor) 또는 HTR3(5-hydroxytryptamine 3 receptor) 억제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
* 본 발명자들은 대사질환, 특히 비만을 예방 또는 치료하기 신규한 전략을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 TPH1(Trypotophan hydroxylase 1), HTR2A(5-hydroxytryptamine 2A receptor) 및 HTR3(5-hydroxytryptamine 3 receptor)가 대사질환, 특히 비만에 대한 유력한 치료학적 타겟이 될 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 대사질환의 예방 또는 치료는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3의 억제를 통하여 달성된다.
HTR3는 HTR3A 및 HTR3B의 헤테로펜타머로서 세로토닌에 의해 활성화되는 양이온 채널로서 작용한다.23,24
TPH1, HTR2A 또는 HTR3의 억제는 다양한 방식으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 발현 억제제이다.
바람직하게는, TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 발현 억제제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 TPH1 mRNA(예컨대, GenBank Accession No. NM_004179.2), HTR2A mRNA(예컨대, GenBank Accession Nos. NM_000621.4 및 NM_001165947.2) 또는 HTR3A mRNA(예컨대, GenBank Accession Nos. NR_046363.1, NM_001161772.2, NM_000869.5 및 NM_213621.3)에 상보적이고 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, TPH1, HTR2A 또는 HTR3A mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 디자인은, GenBank에 공지된 TPH1 mRNA, HTR2A mRNA 또는 HTR3A mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다(Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 명세서에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다.
본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(TPH1 mRNA, HTR2A mRNA 또는 HTR3A mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(TPH1 mRNA, HTR2A mRNA 또는 HTR3A mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.
siRNA 말단 구조는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명에서 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제는 상기 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 안타고니스트(antagonist)이다.
다수의 TPH1의 안타고니스트가 공지되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, TPH1의 안타고니스트는 p-클로로페닐알라닌, p-에타이닐페닐알라닌, AGN-2979[3-(3-dimethylaminopropyl)-3-(3-methoxyphenyl)-4,4- dimethyl-piperidine-2,6-dione] 또는 LX1031[(2S)-2-amino-3-[4-[2-amino-6- [(1R)-2,2,2-trifluoro-1-[4-(3-methoxyphenyl)phenyl]ethoxy]pyrimidin-4-yl]phenyl]propanoic acid)이다.
다수의 HTR2A의 안타고니스트가 공지되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, HTR2A의 안타고니스트는 케탄세린(ketanserin)[3-{2-[4-(4-fluorobenzoyl)piperidin-1-yl]ethyl}quinazoline-2,4(1H,3H)-dione], 리탄세린(ritanserin) [6-[2-[4-[bis(4-fluorophenyl)methylidene]piperidin-1-yl] ethyl]-7-methyl-[1,3]thiazolo[2,3-b]pyrimidin-5-one], 네파조돈(nefazodone)[1-(3-[4-(3-chlorophenyl)piperazin-1-yl]propyl) -3-ethyl-4-(2-phenoxyethyl)-1H-1,2,4-triazol-5(4H)-one], 클로자핀(clozapine)[8-Chloro-11-(4-methylpiperazin-1-yl)-5H-dibenzo [b,e][1,4]diazepine], 올란자핀(olanzapine)[2-Methyl-4-(4-methyl-1-piperazinyl)-10H-thieno[2,3-b] [1,5]benzodiazepine], 퀘티아핀(quetiapine)[2-(2-(4-dibenzo[b,f][1,4] thiazepine-11-yl-1-piperazinyl)ethoxy)ethanol], 리스페리돈(risperidone)[4-[2-[4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)-1-piperidyl] ethyl]-3-methyl-2,6-diazabicyclo[4.4.0]deca-1,3-dien-5-one], 아세나핀(asenapine)[(3aRS,12bRS)-rel-5-Chloro-2,3,3a,12b-tetrahydro-2-methyl-1H-dibenz[2,3:6,7]oxepino[4,5-c]pyrrole], 볼리난세린(volinanserin)[(R)-(2,3- dimethoxyphenyl)-[1-[2-(4-fluorophenyl)ethyl]-4-piperidyl]methanol] 또는 AMDA[9-Aminomethyl-9,10-dihydroanthracene)]이다.
다수의 HTR3A의 안타고니스트가 공지되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, HTR3A의 안타고니스트는 온단세트론(ondansetron)[(RS)-9-methyl-3-[(2-methyl-1H-imidazol-1-yl)methyl]-2,3-dihydro-1H-carbazol-4(9H)-one], 그라니세트론(granisetron)[1-methyl-N-((1R,3r,5S)-9-methyl-9-azabicyclo[3.3.1]nonan-3-yl)-1H-indazole-3-carboxamide], 트로피세트론(tropisetron)[(1R,5S)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-yl 1methyl-indole-3-carboxylate], 돌라세트론(dolasetron)[(3R)-10-oxo-8-azatricyclo[5.3.1.03,8]undec-5-yl 1H-indole-3-carboxylate], 팔로노세트론(palonosetron)[(3aS)-2-[(3S)-1-Azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl]-2,3,3a,4,5,6-hexahydro-1H-benz[de]isoquinolin-1-one], 라모세트론(ramosetron)[(1-methyl-1H-indol-3-yl)[(5R)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-benzimidazol-5-yl]methanone], 알로세트론(alosetron)[5-methyl-2-[(4-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1H-pyrido[4,3-b]indol-1-one], 반타노프리드(batanopride)[4-amino-5-chloro-N-(2-diethylaminoethyl)-2-(3-oxobutan-2-yloxy)benzamide], 렌자프리드[4-amino-N-[(4S,5S)-1-azabicyclo[3.3.1]non-4-yl]-5-chloro-2-methoxybenzamide] 또는 자코프리드(zacopride)[4-amino-5-chloro-2-methoxy-N-(quinuclidin-3-yl)benzamide]이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 β3-아드레날린성 수용체의 활성화제를 추가적으로 포함한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, HTR2A 또는 HTR3의 억제와 함께 β3-아드레날린성 수용체를 활성화 하는 것은 백색 지방조직(WAT) 및 갈색 지방조직(BAT)에서 에너지 소비를 증가시키며, 이는 대사질환 특히 비만의 예방 또는 치료에 유용한 접근방식이다.
다수의 β3-아드레날린성 수용체의 활성화제가 공지되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, β3-아드레날린성 수용체의 활성화제는 제 7 항에 있어서, 상기 β3-아드레날린성 수용체의 활성화제는 CL-316243[5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-클로로페닐)-2-하이드록시에틸]아미노]프로필]-1,3-벤조디옥솔-2,2-다이카르복실산[5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-Chlorophenyl)- 2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3-benzodioxole-2,2-dicarboxylic acid]; 아미베그론(amibegron)[Ethyl([(7S)-7-([(2R)-2-(3-chlorophenyl)- 2-hydroxyethyl]amino)-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl]oxy)acetate]; 미라베그론(mirabegron)[2-(2-Amino-1,3-thiazol-4-yl)-N-[4-(2-{[(2R)-2- hydroxy-2-phenylethyl]amino}ethyl)phenyl]acetamide]; 솔라베그론(solabegron)[3'-[(2-{[(2R)-2-(3-chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino}ethyl)amino]biphenyl-3-carboxylic acid]; N-[4-[2-[[(2S)-2-하이드록시-3-(4-하이드록시페녹시)프로필]아미노]에틸]페닐]-4-요오도벤젠설폰아미드[N-[4-[2-[[(2S)-2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenoxy)propyl] amino]ethyl]phenyl]-4-iodobenzenesulfonamide]; 또는 L-742,791[(R)-N -[4-[2-[[2-하이드록시-2-(3-피리디닐)에틸]아미노]에틸]-페닐]-4-[4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]티아졸-2-일]-벤젠설폰아미드][(R)-N-[4-[2-[[2-hydroxy-2-(3-pyridinyl)ethyl ]amino]ethyl]-phenyl]-4-[4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]thiazol-2-yl]-benzenesulfonamide]]이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, TPH1, HTR2A 또는 HTR3의 억제제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명에서 이용될 수 있는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
TPH1, HTR2A 또는 HTR3A에 특이적으로 결합하여 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)).
TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 안타고니스트로서의 천연 추출물이다.
본 명세서에서 천연추출물은 천연물의 다양한 기관 또는 부분(예컨대, 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질, 열매 등)으로부터 얻는 추출물을 의미한다. 천연 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 예컨대 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 안타고니스트로서의 펩타이드이다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 아미노산 잔기 4-40개, 바람직하게는 4-30개, 가장 바람직하게는 4-20개로 이루어져 있다.
본 발명의 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 억제제 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem . Soc . , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem ., 34:595-598(1970)). 즉, α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 남은 α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다. 상기 본 발명의 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 억제제 펩타이드를 제조하기 위한 아미노산 서열은 종래의 방법을 참조하였다(Chen L, Hahn H, Wu G, Chen CH, Liron T, Schechtman D, Cavallaro G, Banci L, Guo Y, Bolli R, Dorn GW, Mochly-Rosen D., Proc . Natl . Acad . Sci ., 98, 11114-9(2001); Phillipson A, Peterman EE, Taormina P Jr, Harvey M, Brue RJ, Atkinson N, Omiyi D, Chukwu U, Young LH., Am. J. Physiol . Heart Circ . Physiol.,289, 898-907(2005);and Wang J, Bright R, Mochly-Rosen D, Giffard RG., Neuropharmacology.,47, 136-145(2004)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 안타고니스트로서의 앱타머이다. 앱타머는 올리고 핵산 (예컨대, RNA) 또는 펩타이드 물질이며, 이에 대한 상세한 내용은 Bock LC et al., Nature 355 (6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998)에 기재되어 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 본 발명의 조성물은 (i) 본 발명의 TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제의 유효량; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에서 용어 “유효량”은 상술한 본 발명의 치료 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 0.0001-100 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제제 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토오스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, HTR2A와 HTR3는 백색 지방조직(WAT) 및 갈색지방조직(BAT)에 존재한다. 실시예 및 도 3a-3p에 기재된 바와 같이, 백색 지방조직(WAT)의 HTR2A의 억제는 지방분해에 기여를 하며, 갈색 지방조직(BAT)의 HTR3A의 억제는 열발생에 기여를 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,본 발명에 의해 예방 또는 치료되는 대사질환은 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증 또는 고콜레스테롤증이고, 특히 비만이다.
실시예 및 도 3a-3p에 기재된 바와 같이, HTR3A의 억제 (예컨대, HTR3A 유전자의 녹-아웃 및 HTR3A 안타고니스트의 처치)는 비만에 대한 저항성을 초래한다. 또한, HTR3A의 억제는 BAT에서 지방 방울 크기의 감소, BAT에서 열발생 유전자(예컨대, Ucp1 및 Dio2)의 발현 증가(도 3c 및 3k), 이산화탄소 생성(VCO2)의 증가(도 3d) 및 인슐린 감수성의 증가(도 3g)를 초래한다. 흥미롭게는, HTR3A의 억제는, β3-아데르날린성 수용체의 아고니스트의 존재하에서만 BAT에서 cAMP 레벨과 PKA 경로의 인산화를 증가시키며(도 3h, 3i, 3j), β3-아데르날린성 수용체의 아고니스트와 함께 HTR3A의 억제는 시너직하게 BAT에서 산소 소비량을 증가시킨다(도 3l). 또한, HTR3A의 억제는 LDL 콜레스테롤과 렙틴을 감소시키며 유리 지방산 레벨을 증가시킨다(도 3r). HTR3A의 억제는 BAT에서 미토콘드리아의 크기 및 개수를 증가시킨다(도 3t). 실시예 및 도 3m, 3n 및 3o에 기재된 바와 같이, HTR2A는 지방생성에 관여를 한다.
종합적으로, TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제는 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증 또는 고콜레스테롤증을 포함하는 대사질환, 특히 비만의 예방 또는 치료를 위한 유용한 전략이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 대사질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다:
(a) TPH1(Trypotophan hydroxylase 1), HTR2A(5-hydroxytryptamine 2A receptor) 또는 HTR3(5-hydroxytryptamine 3 receptor)에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질이 TPH1, HTR2A 또는 HTR3를 억제하는지 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질이 TPH1, HTR2A 또는 HTR3를 억제하면 상기 시험물질은 대사질환의 치료제로 판정한다.
본 발명에 따르면, 우선 TPH1(Trypotophan hydroxylase 1), HTR2A(5-hydroxytryptamine 2A receptor) 또는 HTR3A를 분석대상의 시험물질과 접촉시킨다.
본 발명에 따르면, TPH1, HTR2A 또는 HTR3A는 세포에 있는 것 또는 세포로부터 분리 또는 정제된 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, HTR2A와 HTR3A는 백색 지방조직(WAT) 및 갈색 지방조직(BAT)에 존재하는 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 펩타이드, 항체, 앱타머, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시료는 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시료는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem . Int . Ed. Engl . 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed. Engl . 33, 2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay), 발현 분석 또는 활성 분석 기술들에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TPH1, HTR2A 또는 HTR3 억제는 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 발현의 억제이다.
TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 발현은 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 유전자의 발현을 측정하여 분석할 수 있다. TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 유전자의 발현의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 발현은 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 단백질의 발현을 측정하여 분석할 수 있다. TPH1, HTR2A 또는 HTR3A 단백질의 발현의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함한다.
택일적으로, 시험물질이 TPH1, HTR2A 또는 HTR3A를 억제하는지 여부를 분석하는 것은, TPH1, HTR2A 또는 HTR3A의 기능을 억제하는 것을 분석하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 갈색 지방조직(BAT)에 존재하는 HTR3와 상기 시험물질의 접촉은 β3-아드레날린성 수용체의 활성화와 함께 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 대사질환은 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증 또는 고콜레스테롤증이다.
본 발명의 특징 및 이점을 정리하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증 또는 고콜레스테롤증을 포함하는 대사질환, 특히 비만의 예방 또는 치료를 위한 신규한 접근 방식을 제공한다.
(b) 본 발명은 대사질환, 특히 비만의 치료 타겟으로서 TPH1, HTR2A 또는 HTR3, 특히 HTR3A를 제시한다.
(c) HTR3A의 억제는 대사질환의 치료에 대한 다양한 이로운 효능을 초래하며, 이는 비만에 대한 저항성, 지방 드랍립 크기의 감소, 열발생 유전자의 발현 증가, 대사 활성의 증가, 인슐린 민감성 증가 및 LDL 콜레스테롤과 렙틴의 감소를 포함한다.
(d) 흥미롭게는, HTR3A의 억제는 β3-아데르날린성 수용체의 아고니스트의 존재하에서만 BAT에서 cAMP 레벨과 PKA 경로의 인산화를 증가시키며, β3-아데르날린성 수용체의 아고니스트와 함께 HTR3A의 억제는 시너직하게 BAT에서 산소 소비량을 증가시킨다. 본 발명에 의해 규명된 이러한 사실은, HTR3A의 안타고니스트와 β3-아데르날린성 수용체의 아고니스트의 병용 투여는 대사질환, 특히 비만의 치료에 매우 유효함을 증명하는 것이다.
도 1a-1h는 세로토닌 결핍이 비만으로부터 마우스를 보호함을 보여준다. 도 1a은 LC-MS로 측정한 고-지방 식이(HFD: high-fat diet) 섭식 16주 후 C57BL/6J 수컷 마우스의 지방 조직의 세로토닌 레벨이다; 군 당 n=4 마우스. HFD은 eWAT 및 iWAT에서 세포토닌 레벨을 증가시켰다. 도 1b은, HFD 투여 2주 후 RT-PCR을 통하여 지방 조직의 Tph1 mRNA 발현을 측정한 것이다. 군 당 n=4 마우스. 도 1c는 표준 식단 식이(SCD) 또는 HFD을 섭식한 대조군 및 PCPA-처리 마우스의 성장 곡선을 나타낸다. 군 당 n=4 마우스. 상기 HFD 섭식 PCPA-처리 마우스는 HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 체중 증가의 감소 및 eWAT의 감소를 보였다. 도 1d는 SCD-섭식 또는 HFD-섭식 대조군 마우스 및 HFD 섭식 10주 후 PCPA-처리 마우스의 전체 이미지를 나타낸다. HFD 섭식 PCPA-처리 마우스는 HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 eWAT가 감소함을 보였다. 도 1e 및 1f에서, HFD 섭식 PCPA-처리 마우스가 HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 글루코오스 저항성은 증가하고(e) 인슐린 감수성은 향상됨(f)을 보였다. 도 1g 및 1h는 6주 동안의 HFD 섭식 대조군 및 PCPA-처리 마우스의 대사율을 나타낸다. 8-챔버 Oxymax 시스템을 이용하여 대사 파라미터를 측정하였다. 마우스를 24시간 동안 케이지에서 적응시키고, 추가적인 48시간 동안 데이터를 수집하였다. 상기 PCPA-처리 마우스는 이산화탄소 생성(VCO2: carbon dioxide production) 및 열 생성이 증가됨을 보였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05. LC-MS: 액체 크로마토그래피-질량 분석기 방법(Li(Liquid chromatography-mass spectrophotometer).
도 1i는 마우스 지방 조직 내 Tph1 및 5-HT 수용체 mRNAs 검출을 나타낸다. 지방 조직은 8주령 C57BL/6J 마우스의 eWAT(epididymal white adipose tissue), iWAT(inguinal white adipose tissue) 및 BAT(interscapular brown adipose tissue)에서 분리하였다. Tph1 mRNA, 5-HT 수용체 서브타입 및 5-HT 대사와 관련된 다른 유전자는 RT-PCR에 의하여 마우스 지방 조직 RNA로부터 증폭하였다.
도 1j는 지질 프로파일, 렙틴(leptin) 및 아디포넥틴(adiponectin)에서의 5-HT 결핍 효과를 나타낸다. 8주령 마우스에 6주 동안 부형제 또는 PCPA(300 mg/kg)를 처리하였다. 처리 기간 동안, 상기 마우스는 SCD 또는 HFD를 섭식하였다. 처리 6주 후, 꼬리정맥에서 혈액을 획득하였다. 총 콜레스테롤(a), LDL 콜레스테롤(b), FFA(c) 및 렙틴(d)의 혈청 레벨을 ELISA로 측정하였다. HFD 섭식 PCPA-처리 마우스는 HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 콜레스테롤, 렙틴 및 FFA 레벨이 감소함을 보였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05. 부형제: 폴리에틸렌 글리콜 400. LDL: 저밀도 지질 단백질; FFA: 유리 지방산; SCD: 표준 식단 식이; HFD: 고지방 식이.
도 1k는 체중 및 글루코오스 대사에 대한 말초 Tph1 억제제의 효과를 나타낸다. 8주령 마우스에 부형제 또는 LP-53340(30 mg/kg)를 10주 동안 구강으로 처리하였다. 처리 기간 동안, 상기 마우스는 SCD 또는 HFD를 섭식하였다. (a) SCD 또는 HFD 섭식 대조군 마우스 및 LP-533401-처리 마우스의 성장 곡선. (b) 오버나잇 금식 후 IPGTT를 수행하였다. 2 g/kg 글루코스의 복강 내 주입 후 혈액 글루코오스 레벨을 측정하였다. HFD 섭식 LP-533401-처리 마우스는 HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 글루코오스 저항성이 향상됨을 보였다. (c) 4시간 금식 후 IPITT를 수행하였다. 0.75 U/kg 복강 내 주입 후 이들의 혈액 글루코오스 레벨을 측정하였다. 군 당 n=4 마우스. (d) 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 대조군 및 LP-533401-처리 마우스의 대표적 BAT 구획. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05. LP-533401: 말초 Tph의 소분자 억제제; 부형제: 폴리에틸렌 글리콜 400; IPGTT: 복강 내 글루코오스 저항성 시험(Intraperitoneal glucose tolerance test); IPITT: 복강 내 인슐린 저항성 시험(intraperitoneal insulin tolerance test).
도 1l은 HFD 섭식 PCPA-처리 마우스의 음식 섭취 및 신체 활동을 나타낸다. 6주 동안 HFD를 섭식한 후 Oxymax 시스템을 이용하여 14주령 대조군 및 PCPA-처리 마우스의 대사 프로파일을 측정하였다. 마우스를 24시간 동안 적응시키고, 48시간 동안 데이터를 수집하였다. 매일의 음식 섭취(a) 및 신체 활동(b)은 두 그룹 모두 유사하였다. (c) PCPA-처리 마우스의 O2 소비가 증가하였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05. 부형제: PBS; VO2: O2 소비; RER: 호흡 교환 비율(respiratory exchange ratio).
도 1m은 SCD를 섭식하는 동안의 PCPA-처리 마우스의 음식 섭취 및 대사율을 나타낸다. 6주 동안 부형제 또는 PCPA(300 mg/kg)를 섭식한 후 Oxymax 시스템을 이용하여 14주령 SCD-처리 마우스의 대사 프로파일을 측정하였다. 대사 케이지 데이터는 부형제 및 PCPA-처리 마우스 간에 현저한 차이가 없음을 보여준다. 상기 대사 케이지 데이터는 매일의 음식 섭취(a), 신체 활동(b), 열 생성(c), 산소 소비(d), VCO2 제거(e) 및 호흡 교환 비율(f)을 포함한다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05. 부형제: PBS; VCO2: CO2 제거.
도 2a-2i은 마우스의 지방 조직에서의 세로토닌 결핍을 나타낸다. (도 2a) SCD 또는 HFD 섭식 8주 후 대조군 마우스 및 PCPA-처리 마우스의 eWAT의 대표적 이미지. 이 구획은 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (도 2b) H&E-염색 이미지로부터 측정한 평균 지방세포 크기. HFD는 대조군의 eWAT에서 지방세포 크기를 증가시켰으나 PCPA-처리 마우스의 지방세포 크기는 증가시키지 않았다. (도 2c) RT-PCR로 측정한 eWAT에서의 지질 생성과 연관된 유전자 발현. PCPA-처리 마우스는 SCD 및 HFD 섭식 상태 모두에서 대조군 마우스에 비해 eWAT에서의 지질 생성 유전자의 발현이 억제됨을 보였다. (도 2d, 2e) H&E로 염색된 iWAT의 대표적 이미지(도 2d) 및 Ucp1에 대한 면역조직화학 염색(도 2e). 은색은 Ucp1-양성 지방세포를 의미한다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (도 2f) RT-PCR로 측정한 iWAT에서의 열 발생과 연관된 유전자 발현. Ucp1 및 Dio2 레벨이 HFD 섭식 PCPA-처리 마우스에서 증가되었다. (도 2g) 대조군 마우스 및 PCPA-처리 마우스에서의 BAT의 H&E 염색. HFD 투여는 BAT의 지질 방울 크기를 증가시켰으나, PCPA-처리 BAT는 식이 소비에 관계없이 대조군 BAT에 비하여 지질 방울 크기가 감소함을 보였다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (도 2h) RT-PCR로 측정한 BAT에서의 열 발생과 연관된 유전자 발현. (도 2i) 18F-FDGPET/CT에 의하여 측정한 BAT의 글루코오스 사용. HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 HFD 섭식 PCPA-처리 마우스의 BAT는 글루코오스 흡수가 증가함을 보였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05.
도 2j는 Plin1 항체로 염색한 PCPA-처리 마우스 eWAT의 대표적 구획을 나타낸다. SCD 또는 HFD 섭식 6주 후 대조군 및 PCPA-처리 마우스 eWAT의 조직학. eWAT의 Plin 1(Perlipin1) 면역화학염색은 각 군의 온전한 지방세포를 나타낸다. 6주 동안의 PCPA 처리(300 mg/kg) 후 eWAT에서 총 세포의 손상은 관찰되지 않았다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. 부형제: PBS.
도 2k는 마우스 eWAT에서 세로토닌 결핍 효과를 나타낸다. 8주령 마우스에 6주 동안 부형제 또는 PCPA(300 mg/kg)를 처리하였다. 처리하는 동안 마우스는 SCD 또는 HFD를 섭식하였다. 처리 6주 후, eWAT를 분리하고 실시간 RT-PCR에 의하여 지질 대사 및 열 발생과 연관된 유전자의 mRNA 레벨을 측정하였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05. 부형제: 폴리에틸렌 글리콜 400.
도 2l은 iWAT의 지방세포 크기를 나타낸다. 이미지 J 소프트웨어를 이용하여 H&E 염색 이미지의 평균 지방세포 크기를 계산하였다. 10주 동안 HFD를 섭식한 18주령 PCPA-처리 마우스의 iWAT는 SCD를 섭식한 PCPA-처리 마우스에 비하여 지방세포 크기가 감소함을 보였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05.
도 2m-2o은 마우스 iWAT에서의 세로토닌 결핍 효과를 나타낸다. 8주령 마우스에 6주 동안 부형제 또는 PCPA(300 mg/kg)를 처리하였다. 처리하는 동안 마우스는 SCD 또는 HFD를 섭식하였다. 처리 6주 후, iWAT을 분리하고 실시간 RT-PCR에 의하여 지질 대사 및 열 발생과 연관된 유전자의 mRNA 레벨을 측정하였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05.
도 2p-2r은 마우스 BAT에서의 세로토닌 결핍 효과를 나타낸다. 8주령 마우스에 6주 동안 부형제 또는 PCPA(300 mg/kg)를 처리하였다. 처리하는 동안 마우스는 SCD 또는 HFD를 섭식하였다. 처리 6주 후, BAT을 분리하고 실시간 RT-PCR에 의하여 지질 대사 및 열 발생과 연관된 유전자의 mRNA 레벨을 측정하였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05.
도 2s는 PET-CT의 대표적 이미지를 나타낸다. BAT(삼각형) 및 심장 조직(화살표)는 하이라이트로 표시하였다. BAT 및 심장에서 18F-FDG 흡수가 증가하였다. WT 마우스의 BAT는 HFD 섭식 후 18F-FDG 흡수가 감소하였으나 HFD 섭식 PCPA-처리 마우스의 BAT는 HFD 섭식 대조군 마우스에 비하여 글루코오스 흡수가 증가함을 보였다.
도 2t는 PCPA-처리 마우스 BAT의 미토콘드리아의 TEM 이미지를 나타낸다. SCD 섭식 마우스, HFD-섭식 마우스 및 PCPA를 6주 동안 처리한 HFD-섭식 마우스에서 견갑간(Interscapular) BAT를 분리하였다. PCPA 처리 HFD-섭식 마우스의 BAT는 미토콘드리아 크기 및 수가 증가함을 보였다. 스케일 바는 1μm를 나타낸다. TEM: 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy).
도 3a-3p은 Htr3가 BAT에서 열 발생을 조절하고 Htr2a가 WAT에서 지질 생성을 조절함을 알려준다. (도 3a) SCD 또는 HFD 섭식 Htr3a KO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트의 성장곡선. Htr3a KO 마우스는 비만에 대하여 저항성을 가졌다. 군 당 n=4 마우스. (도 3b) 6주 동안의 SCD 또는 HFD 섭식 후 WT 및 Htr3a KO 마우스 BAT의 H&E 염색. KO 마우스의 BAT는 WT 리터메이트에 비하여 지질 방울 크기가 감소함을 보였다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (도 3c) BAT에서의 열 발생 유전자 발현 레벨. 군 당 n=4. (도 3d, 3e) HFD 섭식 WT 및 Htr3a KO 마우스의 대사율. Htr3a KO 마우스는 이산화탄소 생성(VCO2)(도 3d) 및 열 생성(도 3e)이 증가함을 보였다. 군 당 n=4 마우스. (도 3f, 3g) HFD 투여 6주 후 글루코오스 저항성 및 인슐린 저항성 시험. 군 당 n=4. (도 3h) cAMP ELISA를 이용하여 측정한 IBAs(immortalized brown adipocytes)에 Htr3 아고니스트/안타고니스트 처리에 따른 cAMP 레벨 변화. β3 아고니스트가 없는 경우 Htr3 아고니스트/안타고니스트는 갈색 지방세포에서 cAMP에 영향을 주지 않았다. 그러나 β3 자극 후, Htr3 안타고니스트-전처리 IBAs는 cAMP 레벨 증가를 보였다. Ondan: 온단세트론; CL: CL 316243. (도 3i) PKA 경로 컴포넌트 인산화의 웨스턴블롯 분석. Htr3 안타고니스트-전처리 IBAs는 β3 자극 후 PKA 경로 컴포넌트의 인산화 증가를 보였다. (도 3j) 온단세트론 처리 2시간 후 열 발생 유전자 발현 레벨이 증가되었다. CL: CL 316243. (도 3k) IBAs에 m-CBPG(Htr3 아고니스트) 처리 2시간 후 Ucp1 mRNA 레벨이 감소되었다. CL: CL-316243; m-CBPG: 1-(m-클로로페닐)-비구아니드. (도 3l) Seahorse XF 분석기를 이용한 IBAs 대사 분석. 전분화 후, Htr3 안타고니스트 전처리는 β3 아고니스트 자극에 따라 IBAs의 산소 소비율을 증가시켰다. 군 당 n=5. (도 3m) 3T3-L1 지방세포에서의 Htr2a 발현. 전분화 3T3-L1 지방세포에서 Htr2a mRNA가 증가되었다. 발현 레벨은 Day 0에서 측정하여 정규화하였다. (도 3n) 3T3-L1 성숙 지방세포의 Htr2a-아고니스트 처리 후 상대적 mRNA 발현. DOI: 2,5-디메톡시-4-아이오도암페타민, Htr2a 아고니스트. (도 3o) 3T3-L1 지방세포의 오일 레드 오 염색. 전분화된 3T3-L1 지방세포의 오일 레드 오 염색 후, 상기 세포에서 염료을 추출하여 상기 추출물의 흡광도를 분광법을 이용하여 측정하였다. 지방세포가 분화하는 동안의 Htr2a 아고니스트 케탄세린의 처리는 상기 추출물의 광학 밀도를 감소시켰다. (도 3p) 글리세롤 분비 분석. 5-HT 및 DOI는 3T3-L1 성숙 지방세포의 글리세롤 분비를 감소시켰다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05. 부형제: PBS.
도 3q는 HFD 섭식 Htr3a KO 마우스의 총 이미지를 나타낸다. 8주령 마우스에 6주 동안 SCD 또는 HFD를 섭식시켰다. 비록 HFD는 내장지방을 증가시켰으나, HFD-섭식 Htr3a KO 마우스는 WT 리터메이트보다 적은 내장지방을 가졌다.
도 3r은 Htr3a KO 마우스의 지질 프로파일 및 혈청 렙틴 레벨을 나타낸다. Htr3a KO 마우스는 6주 동안 SCD 또는 HFD를 섭식하였고 꼬리 정맥에서 혈액을 획득하였다. 총 콜레스테롤(a), LDL 콜레스테롤(b), FFA(c) 및 렙틴(d)의 혈청 레벨을 ELISA로 측정하였다. HFD 섭식 Htr3a KO 마우스는 LDL 및 렙틴 레벨이 감소하였으나 FFA 레벨은 증가하였다. 군 당 n=4 마우스. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05.
도 3s는 Htr3a KO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트의 eWAT 및 iWAT의 대표적 구획을 나타낸다. HFD 섭식 6주 후 Htr3a KO 마우스 및 WT 리터메이트에서 WAT를 분리하였다. 조직 구획을 H&E로 염색하였다. Htr3a KO 마우스의 eWAT 또는 iWAT에서는 평균 지방세포 크기가 현저하게 감소하지 않았다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다.
도 3t는 Htr3a KO BAT 미토콘드리아의 대표적 TEM 이미지를 나타낸다. HFD 섭식 6주 후 Htr3a KO 마우스 및 WT 리터메이트에서 견갑간 BAT를 분리하였다. Htr3a KO BAT는 미토콘드리아의 크기 및 수가 증가함을 보였다. 스케일 바는 1 μm를 나타낸다.
도 3u는 Htr3a KO BAT에서 상향-조절된 미토콘드리아 유전자를 나타낸다. HFD 섭식 6주 후 Htr3a KO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트에서 견갑간 BAT를 분리하였다. BAT에서 실시간 RT-PCR을 이용하여 미토콘드리아 생물 발생과 연관된 갈색 지방세포 mRNA 발현을 측정하였다. 군 당 n=4. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05.
도 3v는 HFD 섭식 동안의 대조군 및 Htr3a KO 마우스의 음식 흡수 및 대사율을 나타낸다. 6주 동안 HFD를 섭식한 후 Oxymax 시스템(Columbus instrument)을 이용하여 14주령에 Htr3a KO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트의 대사 프로파일을 측정하였다. Htr3a KO 마우스는 WT 리터메이트에 비하여 대사율이 증가함을 보였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성 vs. 비처리 대조군은 스튜던트 t 테스트에 의해 분석하였다: *, P<0.05.
도 3w는 3T3-L1 지방전구세포가 분화하는 동안의 5-HT 유도를 나타낸다. 분화하는 동안의 3T3-L1 지방세포 내 5-HT 면역조직화학 염색. 지질에 대한 Bodipy 염색은 녹색으로 나타내고 5-HT 형광은 적색으로 나타냈다. 겹친 이미지는 분화 4일(D4) 후 녹색 및 적색 지질 바디가 동시-위치하는 지질 방울을 보여준다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다.
도 4a-4m은 지방세포 내 5-HT의 세포 자율적 기능을 나타낸다. (도 4a) HFD 섭식 Tph1 FKO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트의 체중. 군 당 n=4. (도 4b) HFD 섭식 6주 후 Tph1 FKO 마우스 및 WT 리터메이트 지방조직의 대표적 이미지를 나타낸다. 구획은 H&E으로 염색하였다. (도 4c) Ucp1(은색 염료)에 대한 면역조직화학. Tph1 FKO 마우스의 iWAT에서 Ucp1-양성 다방성 지방세포가 증가되었다. (도 4d) 글루코오스 저항성 시험. HFD-섭식 Tph1 FKO 마우스는 HFD-섭식 WT 리터메이트에 비하여 글루코오스 저항성이 향상됨을 보였다. (도 4e) Tph1 FKO 마우스 및 WT 리터메이트 BAT의 SVF를 이용한 엑스 비보 연구. 분화 8일 후, Tph1 FKO SV 세포는 WT SV 세포에 비하여 Ucp1 mRNA 발현이 증가함을 보였다. 5-HT는 Tph1 FKO 마우스의 SV 세포에서 Ucp1 mRNA 레벨을 억제하였다. (도 4f) HFD 섭식 Tph1 AFKO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트의 성장곡선. 군 당 n=4. (도 4g, 4h) HFD 섭식 6주 후 HFD 섭식 Tph1 AFKO 마우스는 대조군 마우스에 비하여 글루코오스 저항성이 향상되고(도 4g) 인슐린 저항성은 감소됨(도 4h)을 보였다. (도 4i) HFD 섭식 6주 후 WT 리터메이트 및 Tph1 AFKO 마우스의 지방 조직의 대표적 이미지. 상기 구획은 H&E로 염색하였다. (도 4j) H&E 염색 이미지에서 평균 지방세포 크기를 측정하였다. (도 4k) Ucp1(은색 염료)에 대한 면역조직화학. (도 4l, 4m) 지방세포에서 세로토닌에 의한 에너지 대사 조절에 대한 제안된 모델. 적색 화살표는 활성을 나타내고 청색 화살표는 억제를 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05.
도 4n은 Tph1 FKO 마우스의 성장곡선을 나타낸다. SCD 섭식 8주령 Tph1 FKO 마우스는 WT 리터메이트보다 체중이 감소함을 보였으나, 이 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다.
도 4o는 SCD 섭식 Tph1 FKO 마우스 및 이들의 야생형 리터메이트의 eWAT, iWAT 및 BAT 구획을 나타낸다. 상기 구획은 H&E으로 염색하였다. SCD 섭식 상태에서, eWAT 및 BAT는 Tph1 FKO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트 간에 현저한 차이를 보이지 않았다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다.
도 4p는 SCD 섭식 Tph1 AFKO 마우스 및 이들의 야생형 리터메이트의 eWAT, iWAT 및 BAT 구획을 나타낸다. 상기 구획은 H&E으로 염색하였다. 6주령에서 타목시펜 IP 주입에 의하여 Tph1 AFKO 마우스의 Cre-재조합을 유도하였다. 이후, 14주령에 수컷 마우스의 지방 조직을 분리하였다. 스케일 바는 20 μm을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
시약
PCPA, D-글루코오스, 인슐린, CL-316243(β3-아드레날린 작동성 수용체 아고니스트), 온단세트론(ondansetron), m-CPBG, 트리아이오도티로닌(T3: triiodothyronine), 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX: 3-isobutyl-1-methylxanthine), 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 오일 레드 오 염료(Oil Red O dye), 케탄세린(ketanserin), DOI, 이소프로필 알코올(IPA: isopropyl alcohol), 포르말린(formalin), 아스코르브산(ascorbic acid), 과염소산(perchloric acid), 타목시펜(tamoxifen) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 400(PEG-400)은 시그마社(Sigma, 미국)에서 구입하였다. LP-533401은 달톤 파마 서비스社(Dalton Pharma Services, 캐나다)에서 구입하였다. TRIzol 시약, DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), 우아 혈청(calf serum), 우태 혈청(FBS:　fetal bovine serum)　 및 페니실린-스트렙토마이신(P/S: penicillin-streptomycin)은 인비트로젠社(Invitrogen, 미국)에서 구입하였다. 모든 항체는 따로 명시되어 있지 않는 한 셀 시그널링 테크놀로지社(Cell Signaling Technologies, 미국)에서 구입하였다.
실험동물 및 식이
Tph1flox/flox 마우스, Adipoq-cre 마우스 및 aP2-CreERT2 마우스 세대는 이전에 보고되었다17,30,31. C57BL/6J 마우스, Htr3a-표적 KO 마우스(B6.129X1-Htr3atm1jul/J, Htr3a KO) 및 렙틴-결핍 ob/ob 마우스(B6.V-Lepob/J)는 잭슨 실험실(Jackson Laboratory, 미국)에서 구입하였다. 지방조직(adipose tissue)-특이적 Tph1 KO 마우스를 제작하기 위하여, Tph1flox/flox 마우스를 Adipoq-Cre 마우스(Tph1 FKO 마우스) 및 aP2-CreERT2 마우스(Tph1 AFKO 마우스)와 교배하였다. 상기 마우스를 12h 명암 주기 하 기후-조절된 SPF(specific pathogen-free) 격리 시설에 수용하고, 음식 및 물을 임의로 제공하였다. 한국 과학 기술원(Korea Advanced Institute of Science and Technology)의 기관 동물 케어 및 사용 위원회(The Institutional Animal Care and Use Committee)가 본 연구에 대한 실험 프로토콜을 승인하였다. Htr3a KO 마우스 및 Tph1flox/flox 마우스는 10세대 이상을 위하여 C57BL/6J 마우스와 역교배하였다. 2 mg 타목시펜(tamoxifen, Sigma)을 1주일 동안 5회 복강 내 주입하여 6주령 Tph1 AFKO 마우스의 Cre-재조합을 유도하였다. 본 발명자들은 수컷 마우스(8-10주령)에 SCD(standard chow diet; 12% fat calories, Purina Laboratory Rodent Diets 38057) 또는 HFD(60% fat calories, Research Diets D12492)를 섭식시켰다. PBS 또는 300 mg/kg PCPA를 매일 복강 내 주입으로 투여하였다. LP-533401를 PEG-400 및 5% 덱스트로오스(dextrose)(40:60 비율)에서 용해하였다. 부형제 또는 30 mg/kg LP-533401를 피딩 니들로 매일 투여하였다. 본 발명자들은 C57BL/6J 마우스를 2-4개의 군으로 임의로 나누었다. 형질전환 마우스에 대하여, KO 마우스 및 이들의 WT 리터메이트(littermate)를 비교하였다. 맹검법은 실시하지 않았다.
세포 배양
뮤린 3T3-L1 세포(American Type Culture Collection)를 37℃ 5% CO2의 습한 대기 중에서 10% 우태 혈청(fetal calf serum) 및 100 μg/mL P/S가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 합류에 도달한 이틀 후, 상기 세포를 0.5 mM IBMX, 1 mg/mL 인슐린 및 1 μM 덱사메타손이 보충된 배지를 이용하여 분화를 유도하였다(day 0). 이틀 후, 상기 배지를 10% FBS 및 P/S에 1 mg/mL 인슐린이 보충된 DMEM 배지로 교체하고(day 2), 4일부터 8일까지 이틀마다 이를 교체하였다.
37℃ 5% CO2의 습한 대기 중에서 10% FBS 및 P/S가 보충된 DMEM에서 IBAs를 배양하였다32. 95% 합류에 도달한 후, 10% FBS, 0.5 μg/mL 인슐린, 1 nM T3, 0.125 mM 인도메타신, 2 μg/mL 덱사메타손, 0.5 μM IBMX 및 P/S가 보충된 DMEM을 이용하여 상기 세포의 분화를 유도하였다(day 0). 이틀 뒤, 상기 배지를 10% FBS, 0.5 μg/mL 인슐린, 1 nM T3 및 P/S 보충된 DMEM로 교체하고(day 2), 4일부터 8일까지 이틀마다 이를 교체하였다. 본 발명자들은 상기 세포주에 마이코플라즈마 감염이 없음을 확인하였다.
SVF 분리
콜라게나아제 분해(collagenase digestion)에 의하여 6-7 주령의 마우스에서 부고환(epididymal), 사타구니(inguinal) 및 BAT의 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction)을 분리하였다. 간략하게, 지방 조직을 절개하여 다진 후 행크스 밸런스 염 용액(Hank’s balanced salts solution, Sigma) 내 0.2 %의 콜라게나아제 A(Roche)로 37℃에서 45분 동안 일정하게 흔들어 분해하였다. 4℃에서 10분 동안 800 x g에서 원심분리하여 세포 펠렛으로부터 성숙 지방세포(adipocyte) 및 결합 조직을 분리하였다. 이후, RBC 용해 완충액(RBC lysis buffer, Sigma)으로 상기 세포 펠렛을 현탁하고, 40-μm 메쉬 필터(BD bioscience)를 통하여 여과하였다. 상기 펠렛화된 기질 혈관 세포(SVCs)를 10% FBS를 포함하는 DMEM에 재현탁하고, 지방세포 분화를 위하여 6-웰 플레이트에 접종하였다.
오일 레드 오(Oil Red O) 염색
전분화 후(day 8), 3T3-L1 지방세포를 PBS 내 3.7%(w/v) 포름알데하이드로 상온에서 15분 동안 고정하고 PBS로 3회 세척하였다. 이후, 상기 세포를 여과된 오일 레드 오 용액(1.5 mg/mL 60%(v/v) 이소프로파놀)으로 30분 동안 염색하고 증류수로 2회 세척하였다. 오일 레드 오 염색양의 정량을 위하여, 상기 세포를 100% 이소프로판올에 10분 동안 녹인 후 VersaMax 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, 미국)을 이용하여 520 nm에서 추출물의 흡광도를 측정하였다.
대사 분석
대사율을 측정하기 위하여, 상기 마우스를 각각 8-챔버, 열린 서킷 Oxymax/CLAMS(Columbus Instruments Comprehensive Lab Animal Monitoring System) 시스템에 이전 기술된 바와 같이 수용하였다33. 이들의 대사율을 결정하기 위하여 먹이를 공급한 상태에서 각 마우스를 72시간 동안 평가하였다. microPET R4 스캐너(Concorde Microsystems, Siemens)를 이용하여 이전에 기술된 바와 같이 PET 이미징을 수행하였다34.
글루코오스 저항성 시험 및 인슐린 저항성 시험
글루코오스 저항성 시험을 위하여, 오버나잇 금식 후 PBS 내 2 g/kg D-글루코스를 상기 마우스에 투여하였다. 인슐린 저항성 시험을 위하여, 4시간 금식 후 인슐린(0.75 U/kg)을 복강 내 주입하였다. 주입 후 0, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분에 꼬리 정맥으로부터 획득한 혈액 시료 내의 혈액 글루코오스 레벨을 Gluco DR Plus glucometer(Allmedicus)를 이용하여 측정하였다.
혈액 화학 분석
0.1 M 과염소산 내 0.02% 아스코르브산을 포함하는 추출 완충액에서 균질화에 의하여 조직 세로토닌을 추출한 후 원심분리하였다. 액체 크로마토그래피-질량 분석기 방법(liquid chromatography-mass spectrometry method)을 통하여 상등액 내 상기 세로토닌 레벨을 측정하였다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 이용하여 혈청 렙틴(Enzo Life Science, 미국), LDL-콜레스테롤(Waco) 및 FFA(Biovision, 미국)을 측정하였다.
cAMP 분석
1 μM 온단세트론, 100 nM m-CPBG 또는 1 μM CL-316243을 분화된 IBAs에 15분 동안 처리하였다. 1 μM CL-316243을 양성 대조군으로 사용하였다. 제조사의 안내에 따라 cAMP 경쟁적 ELISA(Promega)를 수행하였다. 간략하게, 세포에 0.5% 트리톤 X-100을 포함한 0.1 M HCl을 첨가하여 cAMP를 추출하였다. 10분 동안 600g에서 원심분리한 후, 상등액을 cAMP 경쟁적 ELISA에 의한 cAMP 레벨 결정에 이용하였다.
OCR 분석
Seahorse XF 분석기(Seahorse Bioscience, 미국)를 이용하여 세포의 OCRs을 측정 하였다. XF-24 플레이트에 IBAs를 접종한 후, 상기 세포를 인큐베이션하고 상술한 프로토콜을 이용하여 분화시켰다. 전분화 IBAs를 PBS 및 온단세트론으로 30분 동안 전처리하였다. 이후, β3 아고니스트(CL-316243) 및 미토콘드리아 억제제 올리고마이신(oligomycin) 및 로테논/안티마이신(rotenone/antimycin)을 상기 IBAs에 처리하였다. 센서 카트리지 및 Seahorse XF-24 소프트웨어로 OCRs을 계산하고 기록하였다.
실시간 PCR(Real-time PCR) 분석
제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 마우스 조직 또는 세포주로부터 총 RNA를 추출하였다. TURBO DNase(Invitrogen) 처리 후, 총 RNA의 2 μg을 슈퍼스크립트 Ⅲ 역전사 효소(Superscript Ⅲ reverse transcriptase, Invitrogen)로 상보적 DNA를 생성하는데 사용하였다. 유전자 발현을 분석하기 위하여, ViiA 7 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems) 및 Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)로 실시간 PCR을 수행하였다. 상대적 정량은 ddCt 방법을 기초로 하였고, ActB를 내인성 대조군(내부 대조군)＇＇으로 이용하였다. 프라이머 서열은 표 1과 같다.
Target Primer Sequence SEQ ID number
Acaca Forward Primer (5´-3´) CAGTAACCTGGTGAAGCTGGA SEQ ID NO: 1
Acaca Reverse Primer (5´-3´) GCCAGACATGCTGGATCTCAT SEQ ID NO: 2
Acly Forward Primer (5´-3´) CCCTCTTCAGCCGACATACC SEQ ID NO: 3
Acly Reverse Primer (5´-3´) CTGCTTGTGATCCCCAGTGA SEQ ID NO: 4
Actb Forward Primer (5´-3´) CAGCTTCTTTGCAGCTCCTT SEQ ID NO: 5
Actb Reverse Primer (5´-3´) CTTCTCCATGTCGTCCCAGT SEQ ID NO: 6
Adipog Forward Primer (5´-3´) CTCCACCCAAGGGAACTTGT SEQ ID NO: 7
Adipog Reverse Primer (5´-3´) GGACCAAGAAGACCTGCATC SEQ ID NO: 8
Cidea Forward Primer (5´-3´) GCCGTGTTAAGGAATCTGCTG SEQ ID NO: 9
Cidea Reverse Primer (5´-3´) TGCTCTTCTGTATCGCCCAGT SEQ ID NO: 10
Cox8b Forward Primer (5´-3´) GAACCATGAAGCCAACGACT SEQ ID NO: 11
Cox8b Reverse Primer (5´-3´) GCGAAGTTCACAGTGGTTCC SEQ ID NO: 12
Cptla Forward Primer (5´-3´) AGCTCGCACATTACAAGGACA SEQ ID NO: 13
Cptla Reverse Primer (5´-3´) CCAGCACAAAGTTGCAGGAC SEQ ID NO: 14
Cycs Forward Primer (5´-3´) GCAAGCATAAGACTGGACCAAA SEQ ID NO: 15
Cycs Reverse Primer (5´-3´) TTGTTGGCATCTGTGTAAGAGAATC SEQ ID NO: 16
Dgat1 Forward Primer (5´-3´) GGATCTGAGGTGCCATCGTC SEQ ID NO: 17
Dgat1 Reverse Primer (5´-3´) ATCAGCATCACCACACACCA SEQ ID NO: 18
Dgat2 Forward Primer (5´-3´) CATCATCGTGGTGGGAGGTG SEQ ID NO: 19
Dgat2 Reverse Primer (5´-3´) TGGGAACCAGATCAGCTCCAT SEQ ID NO: 20
Dio2 Forward Primer (5´-3´) TTGGGGTAGGGAATGTTGGC SEQ ID NO: 21
Dio2 Reverse Primer (5´-3´) TCCGTTTCCTCTTTCCGGTG SEQ ID NO: 22
Fabp4 Forward Primer (5´-3´) AACACCGAGATTTCCTTCAA SEQ ID NO: 23
Fabp4 Reverse Primer (5´-3´) TCACGCCTTTCATAACACAT SEQ ID NO: 24
Fasn Forward Primer (5´-3´) AAGCGGTCTGGAAAGCTGAA SEQ ID NO: 25
Fasn Reverse Primer (5´-3´) AGGCTGGGTTGATACCTCCA SEQ ID NO: 26
Gpam Forward Primer (5´-3´) CCACAGAGCTGGGAAAGGTT SEQ ID NO: 27
Gpam Reverse Primer (5´-3´) GTGCCTTGTGTGCGTTTCAT SEQ ID NO: 28
Hsl Forward Primer (5´-3´) AACGAGACAGGCCTCAGTGT SEQ ID NO: 29
Hsl Reverse Primer (5´-3´) GAATCGGCCACCGGTAAAGA SEQ ID NO: 30
Htrla Forward Primer (5´-3´) TCAGCTACCAAGTGATCACCTCT SEQ ID NO: 31
Htrla Reverse Primer (5´-3´) GTCCACTTGTTGAGCACCTG SEQ ID NO: 32
Htrlb Forward Primer (5´-3´) TGCTCCTCATCGCCCTCTATG SEQ ID NO: 33
Htrlb Reverse Primer (5´-3´) CTAGCGGCCATGAGTTTCTTCTT SEQ ID NO: 34
Htrld Forward Primer (5´-3´) CCTCCAACAGATCCCTGAATG SEQ ID NO: 35
Htrld Reverse Primer (5´-3´) CAGAGCAATGACACAGAGATGCA SEQ ID NO: 36
Htrlf Forward Primer (5´-3´) TGTGAGAGAGAGCTGGATTATGG SEQ ID NO: 37
Htrlf Reverse Primer (5´-3´) TAGTTCCTTGGTGCCTCCAGAA SEQ ID NO: 38
Htr2a Forward Primer (5´-3´) AGCTGCAGAATGCCACCAACTAT SEQ ID NO: 39
Htr2a Reverse Primer (5´-3´) GGGATTGGCATGGATATACCTAC SEQ ID NO: 40
Htr2b Forward Primer (5´-3´) AAATAAGCCACCTCAACGCCT SEQ ID NO: 41
Htr2b Reverse Primer (5´-3´) TCCCGAAATGTCTTATTGAAGAG SEQ ID NO: 42
Htr2c Forward Primer (5´-3´) TTCTTAATGTCCCTAGCCATTGC SEQ ID NO: 43
Htr2c Reverse Primer (5´-3´) GCAATCTTCATGATGGCCTTAGT SEQ ID NO: 44
Htr3a Forward Primer (5´-3´) AAATCAGGGCGAGTGGGAGCTG SEQ ID NO: 45
Htr3a Reverse Primer (5´-3´) GACACGATGATGAGGAAGACTG SEQ ID NO: 46
Htr3b Forward Primer (5´-3´) CGTGTGGTACCGAGAGGTTT SEQ ID NO: 47
Htr3b Reverse Primer (5´-3´) GGATGGGCTTGTGGTTTCTA SEQ ID NO: 48
Htr4 Forward Primer (5´-3´) ATGGACAAACTTGATGCTAATGTGA SEQ ID NO: 49
Htr4 Reverse Primer (5´-3´) TCACCAGCACCGAAACCAGCA SEQ ID NO: 50
Htr5a Forward Primer (5´-3´) GATTGACTTCAGTGGGCTCG SEQ ID NO: 51
Htr5a Reverse Primer (5´-3´) AAAGTCAGGACTAGCACTCG SEQ ID NO: 52
Htr7 Forward Primer (5´-3´) CTCGGTGTGCTTTGTCAAGA SEQ ID NO: 53.
Htr7 Reverse Primer (5´-3´) TTGGCCATACATTTCCCATT SEQ ID NO: 54
Lep Forward Primer (5´-3´) ACACACGCAGTCGGTATCC SEQ ID NO: 55
Lep Reverse Primer (5´-3´) GCAGCACATTTTGGGAAGGC SEQ ID NO: 56
Lpin1 Forward Primer (5´-3´) CATACAAAGGCAGCCACACG SEQ ID NO: 57
Lpin1 Reverse Primer (5´-3´) CATACAAAGGCAGCCACACG SEQ ID NO: 58
Maoa Forward Primer (5´-3´) GCGGTACAAGGGTCTGTTCC SEQ ID NO: 59
Maoa Reverse Primer (5´-3´) CAGCCAATCCTGAGATGCCG SEQ ID NO: 60
Maob Forward Primer (5´-3´) GGGCGGCATCTCAGGTATGG SEQ ID NO: 61
Maob Reverse Primer (5´-3´) AAGTCCTGCCTCCTACACGG SEQ ID NO: 62
Me1 Forward Primer (5´-3´) GACCCGCATCTCAACAAGGA SEQ ID NO: 63
Me1 Reverse Primer (5´-3´) CAGGAGATACCTGTCGAAGTCA SEQ ID NO: 64
Nrf1 Forward Primer (5´-3´) CAGCAACCCTGATGGCACCGTGTCG SEQ ID NO: 65
Nrf1 Reverse Primer (5´-3´) GGCCTCTGATGCTTGCGTCGTCTGG SEQ ID NO: 66
Plin1 Forward Primer (5´-3´) GGTGTTACAGCGTGGAGAGTA SEQ ID NO: 67
Plin1 Reverse Primer (5´-3´) TCTGGAAGCACTCACAGGTC SEQ ID NO: 68
Pparg Forward Primer (5´-3´) GGTGTGATCTTAACTGCCGGA SEQ ID NO: 69
Pparg Reverse Primer (5´-3´) GCCCAAACCTGATGGCATTG SEQ ID NO: 70
Ppargc1a Forward Primer (5´-3´) GCCCAGGTACGACAGCTATG SEQ ID NO: 71
Ppargc1a Reverse Primer (5´-3´) ACGGCGCTCTTCAATTGCTT SEQ ID NO: 72
Prdm16 Forward Primer (5´-3´) AGCCCTCGCCCACAACTTGC SEQ ID NO: 73
Prdm16 Reverse Primer (5´-3´) TGACCCCCGGCTTCCGTTCA SEQ ID NO: 74
Scd1 Forward Primer (5´-3´) AGAGTCAGGAGGGCAGGTTT SEQ ID NO: 75
Scd1 Reverse Primer (5´-3´) GAACTGGAGATCTCTTGGAGCA SEQ ID NO: 76
Slc6a4 Forward Primer (5´-3´) CGCAGTTCCCAGTACAAGC SEQ ID NO: 77
Slc6a4 Reverse Primer (5´-3´) CGTGAAGGAGGAGATGAGG SEQ ID NO: 78
Srebf1 Forward Primer (5´-3´) GTGGGCCTAGTCCGAAGC SEQ ID NO: 79
Srebf1 Reverse Primer (5´-3´) CTGGAGCATGTCTTCGATGT SEQ ID NO: 80
Tfam Forward Primer (5´-3´) AGTTCCCACGCTGGTAGTGT SEQ ID NO: 81
Tfam Reverse Primer (5´-3´) GCGCACATCTCGACCC SEQ ID NO: 82
Tmem26 Forward Primer (5´-3´) ACCCTGTCATCCCACAGAG SEQ ID NO: 83
Tmem26 Reverse Primer (5´-3´) TGTTTGGTGGAGTCCTAAGGTC SEQ ID NO: 84
Tph1 Forward Primer (5´-3´) ACCATGATTGAAGACAACAAGGAG SEQ ID NO: 85
Tph1 Reverse Primer (5´-3´) TCAACTGTTCTCGGCTGAT SEQ ID NO: 86
Tph2 Forward Primer (5´-3´) GCCATGCAGCCCGCAATGATGATG SEQ ID NO: 87
Tph2 Reverse Primer (5´-3´) CAACTGCTGTCTTGCTGCTC SEQ ID NO: 88
Ucp1 Forward Primer (5´-3´) CTTTGCCTCACTCAGGATTGG SEQ ID NO: 89
Ucp1 Reverse Primer (5´-3´) CTTTGCCTCACTCAGGATTGG SEQ ID NO: 90
Ucp2 Forward Primer (5´-3´) GTGGTCGGAGATACCAGAGC SEQ ID NO: 91
Ucp2 Reverse Primer (5´-3´) GAGGTTGGCTTTCAGGAGAG SEQ ID NO: 92
조직학적 분석
사타구니, 부고환 및 견갑간 지방 조직을 수획하고, PBS 내 4 %(w/v) 파라포름알데히드로 고정하고 파라핀에 내장하였다. 이후, 5 μm 두께의 조직 구획을 탈파라핀화 및 재수화하고, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(H & E) 염색, 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 면역형광(immunofluorescence)에 사용하였다. 항원 회수를 위하여, 슬라이드를 10 mM의 시트르산 나트륨(pH 6.0)에 침수시키고 95℃까지 20분 동안 가열하였다. VECTASTAIN ABC 키트(PK-4001, Vector Laboratories, 미국)를 이용하여 제조사의 안내에 따라 Ucp1과 Plin1의 시각화를 수행하였다. 간략하게, 상기 슬라이드를 BLOXALL 블록킹 용액(SP-6000, Vector Laboratories)에 인큐베이션 한 후 비특이적 결합을 봉쇄하기 위하여 상온에서 30분 동안 2% 정상 염소 혈청에 인큐베이션하였다. 구획을 Ucp1(ab10983, Abcam) 또는 Plin1(ab3526, Abcam)에 대한 일차 항체와 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후 종-특이적 비오틴화 2차 항체와 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 슬라이드를 30분 동안 Vectastain ABC-AP 시약과 인큐베이션한 후 시각화를 위하여 알칼리 포스파타아제 기질(alkaline phosphatase substrate, DAB, SK-4100, Vector Laboratories)와 인큐베이션 하였다. 면역형광 염색에 사용된 염료 및 항체는 BODIPY(BODIPY®493/503, Invitrogen), 항-5HT(ab10385, Abcam) 및 DAPI(D9542, Sigma)를 포함한다.
이전 기술된 바와 같이35 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, Tecnai Spirit TEM)에 의하여 BAT의 전자 현미경 이미지를 획득하였다. 간략하게, BAT를 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처음 고정시키고, 추가 고정한 후, 초박형 구획을 절단하고, 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하고 시트르산을 리드한 후, 전자 현미경으로 검사하였다.
웨스턴 블롯 분석
프로테아제 억제제(Roche)를 추가한 RIPA 완충액(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% SDS)에서 인큐베이션한 세포에 의하여 전세포 용해물을 추출하였다. 간단한 원심분리로 상등액을 수집하고, BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 상기 상등액 내 단백질 농도를 측정하였다. 이후, 상기 세포 용해물을 동일 부피의 2x Laemmli 완충액(4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루 및 120 mM의 Tris-HCl, pH 6.8)와 혼합하고 95℃에서 5분 동안 끓였다. 그 다음, 단백질 시료를 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막(Millipore)으로 옮겼다. 5% 스킴 밀크 용액(Sigma)에서 블로킹한 후, 상기 막을 특이적 1차 항체, 즉 항-포스포 Hsl 항체(ser660), 항-포스포-(Ser/Thr) PKA 기질 항체 및 항-Act 항체와 인큐베이션하였다. 이후, 상기 막을 1x TBST로 세척하고 항-토끼 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다아제-연결 항체 또는 항-마우스 IgG 항체와 인큐베이션하였다. 각 단백질의 검출은 Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)를 이용하여 제조사의 안내에 따라 수행하였다. 신호는 ChemiDoc MP 시스템(Bio-Rad)에 의해 수집하였다.
글리세롤 방출 분석
유리 글리세롤 시약(Sigma)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 글리세롤 방출율을 측정하였다. 간략하게, 24-웰 플레이트에서 전분화된 3T3-L1 지방세포를 4% 지방산-프리 우혈청 알부민(Sigma)을 포함하는 Krebs Ringer 인산 완충액(136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 10 mM NaPO4, 0.9 mM MgSO4 및 0.9 mM CaCl2) 내 5-HT 또는 DOI와 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로 이소프로테레놀(isoproterenol)을 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포 배양 상등액 10 μL를 유리 글리세롤 시약 0.8 mL과 혼합하고, 이후 상기 혼합물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 분광 광도계(DU730 Life Science UV/Vis, Beckman Coulter, 미국)를 이용하여 540 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다. 세포 단백질 함량에 대한 방출된 글리세롤의 양을 표시하였다.
데이터 분석 및 통계
모든 값은 평균 및 평균의 표준 오차(SEMs)로 표시하였다. 군(groups) 간의 비교는 스튜던트 t 테스트 또는 일방향 ANOVA에 의해 수행하였다. f-테스트에 의하여 정규 분포를 시험하였다. P-값<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험 결과
5-HT는 WAT(흰색 지방 조직)와 BAT(갈색 지방 조직)에 존재하고 3T3-L1 지방전구세포(preadipocytes)에서 지방 생성(adipogenesis)을 촉진하는 것으로 알려져있다15-17. 실제로, 5-HT는 지방 조직에서 검출되었으며, Tph2를 제외한 세로토닌 작동성 유전자가 이들 조직에서 발현되었다(도 1a 및 도 1i). 흥미롭게도, HFD의 투여는 eWAT(부고환 흰색 지방 조직)과 iWAT(사타구니 흰색 지방 조직)의 5-HT 레벨 및 Tph1 mRNA 레벨을 증가시켰고(도 1a 및 b), 이는 식이-유발 비만의 발달에서의 5-HT의 잠재적 역할을 시사한다. 에너지 항상성에서의 말초 5-HT의 역할을 탐구하기 위하여, 10주 동안 HFD를 먹이고 복강 내 주입에 의하여 PCPA(p-chlorophenylalanine)를 주입하였다. 5-HT 합성의 전신적 억제 결과, HFD 섭식 PCPA-처리 마우스는 체중 증가가 감소하였고 HFD 섭식 WT 대조군과 비교하여 eWAT 질량이 감소하였다(도 1c 및 d). 따라서, PCPA는 HFD 섭식 마우스에서 글루코스 저항성 및 인슐린 민감성을 향상시켰다(도 1e, f). 저밀도 지질 단백질(LDL: low density lipoprotein) 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA: free fatty acid) 및 렙틴(leptin)의 혈중 레벨은 PCPA-처리 마우스에서 eWAT의 감소에 따라 낮아졌다(도 1j). PCPA의 항-비만 효과는 혈액-뇌 관문(blood-brain barrier)을 통과하지 못하는 말초 Tph 억제제 LP-533401을 처리한 마우스에서도 관찰되었다(도 1k)18.
PCPA 처리에 따라 관찰된 eWAT 질량의 감소는 에너지 소비의 증가 또는 에너지 저장의 감소가 5-HT 합성의 억제에 의하여 일어날 수 있음을 시사한다. 이 문제에 접근하기 위하여, 본 발명자들은 HFD 섭식 6주 후 간접 열량측정법(calorimetry)을 이용하여 마우스의 에너지 소비율을 분석하였다. PCPA-처리 마우스는 음식 섭취 또는 신체 활동의 변화에 기인 할 수 없는 에너지 소비 및 열 생산의 증가 보였다(도 1g, 1h 및 1l). 그러나, PCPA 처리는 표준 식단 식이(SCD: standard chow diet)를 한 마우스의 대사율에 영향을 미치지 않았고(도 1m), 이는 에너지 소비에 대한 PCPA의 긍정적 효과를 위하여 대사성 스트레스의 필요성을 시사한다. 본 발명의 결과와는 대조적으로, 뇌실 내 PCPA 주입은 식욕을 감소시키고 체중을 증가시킴이 보고되어 있다19. 장-특이적 Tph1 KO 연구는 장-유래 5-HT가 HFD-유도 비만과 연관되어 있지 않음을 밝혔다14. 이러한 점에서, 본 발명의 데이터는 PCPA의 항-비만 효과가 지방 조직에서 중앙의 5-HT 결핍 또는 PCPA의 간접적 영향이 아닌 국부적 5-HT 결핍에서 기인함을 시사한다.
지방 조직에서 5-HT의 세포 유형-특이적 효과를 탐구하기 위하여, 본 발명자들은 eWAT, iWAT 및 BAT를 분석 하였다. eWAT에서, PCPA 투여는 정상 세포 구조가 아닌 지방세포의 크기 감소를 야기하였다(도 2a, 2b 및 2j). eWAT의 실시간 RT-PCR 분석은 대조군 마우스와 비교하여 PCPA-처리 마우스에서 HFD 소비에 관계 없이 트리글리세리드(triglyceride) 저장에 관여하는 대부분의 유전자 발현이 억제됨을 보여준다(도 2c 및 2k). PCPA-처리 마우스의 iWAT에서는, 지방세포의 크기가 감소하고 Ucp1을 발현하는 갈색 지방세포-유사 다방성 세포가 관찰되었는데 이는 iWAT의 갈변을 나타낸다(도 2d, e 및 2l)20. Ucp1 면역염색 결과와 일치하게, Ucp1 및 Dio2 mRNA 레벨이 PCPA 처리에 따라 iWAT에서 증가하였다(도 2f 및 2m-2o). 이러한 결과는 세로토닌이 지질 생성과 WAT 유지에 역할을 함을 시사한다.
HFD의 섭취는 BAT의 역동적 변화를 가져오는데, 이는 단방성 지질 방울의 확대 및 미토콘드리아 함량의 감소를 포함한다21. 본 발명에서, 대조군 마우스의 BAT도 HFD 섭식 후 갈색 지방세포에서 단방성 지질 방울 형성을 보였으나, PCPA-처리 마우스의 BAT는 지질 방울 크기가 감소하고 다방성 지방세포의 증가를 보였다(도 2g). 실시간 RT-PCR 분석은 PCPA 처리가 BAT에서 열 발생 유전자(thermogenic gene) 발현을 증가시킴을 보였고, Dio2 mRNA 레벨에서 가장 높은 증가가 관찰되었다(도 2h 및 2p-2r). 열 발생을 위하여 갈색 지방세포가 지질 뿐만 아니라 글루코오스를 사용하고 있기 때문에, 양전자 방출 단층 촬영-컴퓨터 단층 촬영(PET-CT)을 이용한 18플루오로디옥시글루코오스(18F-FDG: 18fluorodeoxyglucose) 흡수 평가에 의하여 BAT의 대사 활성을 측정하였다22. BAT로의 글루코오스 흡수는 HFD 소비 후 감소된다; 그러나, PCPA에 의한 5-HT 합성 억제는 BAT로의 글루코오스 흡수를 현저하게 증가시켰다(도 2i 및 2s). 또한, 미토콘드리아 수와 크기 및 크리스테(cristae)의 밀도는 PCPA-처리 마우스 BAT에서 증가되었다(도 2t).
BAT에서 PCPA의 항-비만 효과가 적응 열발생의 강화에서 기인하였기 때문에, 본 발명자들은 BAT의 활성화를 담당하는 수용체의 동정을 시도하였다. BAT 내 5-HT 수용체(Htr) 중에서, 본 발명자들은 기능적 세로토닌-게이트 양이온 채널로 역할을 하는 Htr3a 및 Htr3b의 헤테로펜타머인 Htr3에 초점을 맞추었다23,24. 췌장도(pancreatic islets)에서, Htr3 활성화는 β-세포막을 탈분극시키고, 따라서 글루코오스-자극 인슐린 분비를 증가시킨다25. β3-아드레날린 작용성 자극에 대응한 BAT 활성이 막 전위의 일시적 과분극을 포함하기 때문에26, 본 발명자들은 Htr3의 억제가 막 과분극을 유도할 수 있고, BAT 활성에 부가적 효과를 가질 수 있다고 가정하였다. 이러한 점에서, 본 발명자들은 BAT-적응 열발생에서의 Htr3의 역할을 평가하기 위하여 Htr3a KO 마우스를 분석하였다. Htr3a KO 마우스는 HFD-유도 비만에 저항성을 가지고(도 3a), eWAT 질량이 감소되었다(도 3q). 이러한 결과는 혈장 렙틴, LDL 콜레스테롤 및 FFA 레벨에 의하여 확증되었다(도 3r). PCPA-처리 마우스와 달리 Htr3a KO 마우스는 eWAT 질량의 상당량을 유지하였고(고 1j, 3q), eWAT 및 iWAT에서 WT 리터메이트와 비교하여 조직학적 차이가 관찰되지 않았다(도 3s). WT 리터메이트의 BAT에서 HFD-유발 확대된 단방성 지질 방울을 관찰하였지만, HFD-섭식 Htr3a KO 마우스는 BAT에서 지방세포 크기가 감소하고 세포 수가 증가하였다(도 3b). 더불어, Htr3a KO 마우스의 BAT 내 미토콘드리아의 수 및 크기가 증가하였고(도 3t), 열 발생 및 미토콘드리아 생물발생(biogenesis)과 관련된 유전자 전사도 증가되었다(도 3c 및 3u). PCPA-처리 마우스와 유사하게, Htr3a KO 마우스는 이들의 WT 리터메이트에 비해 에너지 소비 및 열 생산 증가를 보였다(도 3d, e 및 3v). 그러나, 인슐린 민감성 향상에도 불구하고 Htr3a KO 마우스의 글루코오스 저항성은 향상되지 않았다(도 3f, g). Htr3a KO 마우스의 인슐린 분비 결손은 글루코어스 저항성 및 인슐린 민감성 사이의 불일치를 설명 할 수 있다25. 이러한 데이터는 BAT에서 관찰된 미토콘드리아 생물발생 및 에너지 소비 증가가 Htr3 신호전달의 봉쇄에서 기인함을 시사한다.
중추 신경계에서의 Htr3의 영향을 배제하기 위하여, 본 발명자들은 불멸화 갈색 지방세포(IBAs: immortalized brown adipocytes)를 이용하여 BAT에서의 Htr3의 직접적 작용을 탐구하였다. Htr3 안타고니스트 온단세트론으로 전처리된 IBA는 β3-아드레날린 작용성 수용체 아고니스트의 존재 하에서 cAMP 레벨, 호르몬-민감성 리파아제(HSL: hormone-sensitive lipase) 및 PKA 기질의 인산화 증가를 보였다(도 3h, i). 온단세트론 역시 IBA에서, Ucp1와 Ppargc1a과 같은 열 발생 유전자의 mRNA 발현을 증가시켰다(도 3j). 역으로, Htr3 아고니스트, 1-(m-클로로페닐)-비구아니드(m-CPBG: 1-(m-chlorophenyl)-biguanide)는 IBA에서 Ucp1의 mRNA 뿐만 아니라, HSL 및 PKA 기질의 인산화를 감소시켰다(도 3i, k). 본 발명자들은 이후 IBA의 산소 소비율(OCR: oxygen consumption rate)을 측정하였다. 온단세트론은 β3-아드레날린 작동성 수용체 아고니스트에 상승적으로(synergistically) OCR을 증가시켰고(도 3l), 이는 Htr3를 통하여 국부 5-HT가 BAT에서의 열 생성을 직접적으로 조절할 수 있음을 나타낸다.
Htr3a KO 마우스는 eWAT 질량의 감소를 보였으나, 이러한 감소는 PCPA-처리 마우스와 같이 심각하지 않았다(도 1j, 3q). 이러한 결과는 Htr3 억제 효과가 BAT에서 더 선택적임을 시사한다. PCPA 투여에 따른 eWAT의 심각한 손실을 설명할 수 있는 추가적인 메카니즘을 밝히기 위하여, 본 발명자들은 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 인 비트로 분석을 수행하였는데, 이는 Tph1를 발현하고, 이의 발현은 지방세포가 분화하는 동안 서서히 증가한다16. 분화하는 동안, 4일 후 5-HT를 검출하였고(도 3w), 흥미롭게도 Gq-결합 Htr2a의 발현이 8일 후 서서히 증가하였다(도 3m). 지방전구세포가 8일 후 성숙 지방세포로 전분화된 점을 고려할 때, 이러한 결과는 Htr2a가 성숙 지방세포에서 지질 생성에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 따라서 본 발명자들은 Htr2a 억제가 3T3-L1 지방세포에서 지질 생성에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 실제로, Htr2a 아고니스트 2,5-디메톡시-4-아이오도암페타민(DOI: 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine)이 성숙 지방세포에서의 지질 생성 유전자의 mRNA 레벨을 증가시켰다(도 3n). 한편, Htr2a 안타고니스트 케탄 세린은 성숙 지방세포에서의 지질생성을 감소시켰다(도 3o). 글리세롤 방출 분석에서, 5-HT 및 Htr2a 아고니스트는 성숙 지방세포에서 지방분해(lipolysis)을 억제하였고(도 3p), 이는 5-HT가 Htr2a를 통하여 성숙 지방세포에서 지질 생성을 양성적으로 조절함을 나타낸다.
지방조직에서 5-HT의 세포 자율 기능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 지방세포-특이적 Tph1 KO(Adipoq-Cre+/-/Tph1floxlflox, Tph1 FKO) 마우스를 발생시켰다. Tph1 FKO 마우스는 지극히 정상적으로 보이고, 이들의 지방조직에서 조직학적 차이가 관찰되지 않았다(Supplementary 도 20, 21). 그러나, Tph1 FKO 마우스는 HFD-유발 비만에 저항성을 보였고 PCPA-처리 마우스에서와 같이 WAT 및 BAT 모두에서 유사한 조직학적 변화를 나타냈다(도 4a, b). Ucp1 발현은 Tph1-부족 iWAT의 다방성 세포에서 상당히 증가하였고(도 4c), Tph1 FKO 마우스에서 글루코오스 저항성이 향상되었다(도 4d). 이후, 본 발명자들은 Tph1 FKO BAT에서 기질 혈관 분획(SVF: stromal vascular fraction)을 분리하고 갈색 지방세포로의 분화 가능성을 시험하였다. 분화 배지에서 8일 동안의 전분화 후, Tph1 무표지 세포(Tph1 null cells)에서의 Ucp1 mRNA 발현은 상향조절되었고, 이는 5-HT 처리에 의하여 없어졌다(도 4e). 더불어, β3 아드레날린 작용성 자극은 Tph1 FKO BAT의 SVF에서의 Ucp1 mRNA 발현을 현저하게 증가시켰다(도 4e). 이러한 데이터는 갈색 지방세포의 능력이 Tph1 FKO 마우스에서 더 큼을 시사한다29. 성숙 지방세포에서의 5-HT 역할을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 유도 Tph1 FKO(aP2-CreERT2+/-/Tph1floxlflox, Tph1 AFKO) 마우스의 표현형을 추가적으로 분석하였다. HFD-섭식 Tph1 AFKO 마우스도 중량 증가가 감소하고 글루코오스 저항성 및 인슐린 민감성이 증가됨을 보였으며(도 4f, g, h), 이들은 PCPA-처리 마우스와 같이 지방 조직에서 유사한 조직학적 변화를 보였다(도 4i, 4j, 4k 및 4p). 이러한 결과는 지방 조직에서 5-HT의 세포 자율 역할을 입증한다.
본 발명에서, 본 발명자들은 다른 지방 조직에서의 에너지 대사 조절을 위한 복합적 모델을 제공한다(도 4l). 과잉-섭식 상태에서, WAT 내 5-HT 레벨이 증가하였고, Htr2a를 통하여 지질 생성의 증가를 가져왔다. 기저 5-HT 레벨 역시 Htr3a을 통하여 BAT 내 열 발생을 억제하였다. 5-HT 신호전달이 봉쇄된 경우, WAT 내 지방분해가 증가하였고, iWAT 및 BAT 모두에서 열 발생이 증가하였다(도 4m). 세로토닌-Htr3 신호전달의 봉쇄로 유발된 제약없는 열 발생과 결합한 HFD에 의하여 자극된 β3 아드레날린 작용성 신호전달은 iWAT 및 BAT 모두에서 에너지 소비의 증가를 가져왔다. 따라서, 지방 조직에서의 5-HT 생성의 억제는 항-비만 치료에 대한 신규한 전략을 제시할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<400> 7 ctccacccaa gggaacttgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Adipoq <400> 8 ggaccaagaa gacctgcatc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Cidea <400> 9 gccgtgttaa ggaatctgct g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Cidea <400> 10 tgctcttctg tatcgcccag t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Cox8b <400> 11 gaaccatgaa gccaacgact 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Cox8b <400> 12 gcgaagttca cagtggttcc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Cptla <400> 13 agctcgcaca ttacaaggac a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Cptla <400> 14 ccagcacaaa gttgcaggac 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Cycs <400> 15 gcaagcataa gactggacca aa 22 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Cycs <400> 16 ttgttggcat ctgtgtaaga gaatc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Dgat1 <400> 17 ggatctgagg tgccatcgtc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Dgat1 <400> 18 atcagcatca ccacacacca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Dgat2 <400> 19 catcatcgtg gtgggaggtg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Dgat2 <400> 20 tgggaaccag atcagctcca t 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Dio2 <400> 21 ttggggtagg gaatgttggc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Dio2 <400> 22 tccgtttcct ctttccggtg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Fabp4 <400> 23 aacaccgaga tttccttcaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Fabp4 <400> 24 tcacgccttt cataacacat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Fasn <400> 25 aagcggtctg gaaagctgaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Fasn <400> 26 aggctgggtt gatacctcca 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Gpam <400> 27 ccacagagct gggaaaggtt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Gpam <400> 28 gtgccttgtg tgcgtttcat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Hsl <400> 29 aacgagacag gcctcagtgt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Hsl <400> 30 gaatcggcca ccggtaaaga 20 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1a <400> 31 tcagctacca agtgatcacc tct 23 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1a <400> 32 gtccacttgt tgagcacctg 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1b <400> 33 tgctcctcat cgccctctat g 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1b <400> 34 ctagcggcca tgagtttctt ctt 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1d <400> 35 cctccaacag atccctgaat g 21 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1d <400> 36 cagagcaatg acacagagat gca 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr1f <400> 37 tgtgagagag agctggatta tgg 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr1f <400> 38 tagttccttg gtgcctccag aa 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr2a <400> 39 agctgcagaa tgccaccaac tat 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr2a <400> 40 gggattggca tggatatacc tac 23 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr2b <400> 41 aaataagcca cctcaacgcc t 21 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr2b <400> 42 tcccgaaatg tcttattgaa gag 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr2c <400> 43 ttcttaatgt ccctagccat tgc 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr2c <400> 44 gcaatcttca tgatggcctt agt 23 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr3a <400> 45 aaatcagggc gagtgggagc tg 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr3a <400> 46 gacacgatga tgaggaagac tg 22 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr3b <400> 47 cgtgtggtac cgagaggttt 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr3b <400> 48 ggatgggctt gtggtttcta 20 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr4 <400> 49 atggacaaac ttgatgctaa tgtga 25 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr4 <400> 50 tcaccagcac cgaaaccagc a 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr5a <400> 51 gattgacttc agtgggctcg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr5a <400> 52 aaagtcagga ctagcactcg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Htr7 <400> 53 ctcggtgtgc tttgtcaaga 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Htr7 <400> 54 ttggccatac atttcccatt 20 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Lep <400> 55 acacacgcag tcggtatcc 19 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Lep <400> 56 gcagcacatt ttgggaaggc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Lpin1 <400> 57 catacaaagg cagccacacg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Lpin1 <400> 58 catacaaagg cagccacacg 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Maoa <400> 59 gcggtacaag ggtctgttcc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Maoa <400> 60 cagccaatcc tgagatgccg 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Maob <400> 61 gggcggcatc tcaggtatgg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Maob <400> 62 aagtcctgcc tcctacacgg 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Me1 <400> 63 gacccgcatc tcaacaagga 20 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Me1 <400> 64 caggagatac ctgtcgaagt ca 22 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nrf1 <400> 65 cagcaaccct gatggcaccg tgtcg 25 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nrf1 <400> 66 ggcctctgat gcttgcgtcg tctgg 25 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Plin1 <400> 67 ggtgttacag cgtggagagt a 21 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Plin1 <400> 68 tctggaagca ctcacaggtc 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Pparg <400> 69 ggtgtgatct taactgccgg a 21 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Pparg <400> 70 gcccaaacct gatggcattg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Ppargc1a <400> 71 gcccaggtac gacagctatg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Ppargc1a <400> 72 acggcgctct tcaattgctt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Prdm16 <400> 73 agccctcgcc cacaacttgc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Prdm16 <400> 74 tgacccccgg cttccgttca 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Scd1 <400> 75 agagtcagga gggcaggttt 20 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Scd1 <400> 76 gaactggaga tctcttggag ca 22 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Slc6a4 <400> 77 cgcagttccc agtacaagc 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Slc6a4 <400> 78 cgtgaaggag gagatgagg 19 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Srebf1 <400> 79 gtgggcctag tccgaagc 18 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Srebf1 <400> 80 ctggagcatg tcttcgatgt 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tfam <400> 81 agttcccacg ctggtagtgt 20 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tfam <400> 82 gcgcacatct cgaccc 16 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tmem26 <400> 83 accctgtcat cccacagag 19 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tmem26 <400> 84 tgtttggtgg agtcctaagg tc 22 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tph1 <400> 85 accatgattg aagacaacaa ggag 24 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tph1 <400> 86 tcaactgttc tcggctgatg 20 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Tph2 <400> 87 gccatgcagc ccgcaatgat gatg 24 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Tph2 <400> 88 caactgctgt cttgctgctc 20 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Ucp1 <400> 89 ctttgcctca ctcaggattg g 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Ucp1 <400> 90 ctttgcctca ctcaggattg g 21 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Ucp2 <400> 91 gtggtcggag ataccagagc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Ucp2 <400> 92 gaggttggct ttcaggagag 20

Claims (16)

  1. HTR3(5-hydroxytryptamine 3 receptor) 억제제를 유효성분으로 포함하고, 상기 HTR3 억제제는 상기 HTR3의 발현 억제제 또는 안타고니스트(antagonist)이며, 상기 HTR3의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA이고, 상기 HTR3의 안타고니스트(antagonist)는 온단세트론(ondansetron), 그라니세트론(granisetron), 트로피세트론(tropisetron), 돌라세트론(dolasetron), 팔로노세트론(palonosetron), 라모세트론(ramosetron), 알로세트론(alosetron), 반타노프리드(batanopride), 렌자프리드(renzapride) 또는 자코프리드(zacopride)인 것을 특징으로 하는 고지방 식이 유도 비만, 고지혈증 및 고콜레스테롤증으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 β3-아드레날린성 수용체의 활성화제를 추가적으로 포함하고, 상기 β3-아드레날린성 수용체의 활성화제는 5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-클로로페닐)-2-하이드록시에틸]아미노]프로필]-1,3-벤조디옥솔-2,2-다이카르복실산[5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-Chlorophenyl)- 2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3-benzodioxole-2,2-dicarboxylic acid]; 아미베그론(amibegron); 미라베그론(mirabegron); 솔라베그론(solabegron); N-[4-[2-[[(2S)-2-하이드록시-3-(4-하이드록시페녹시)프로필]아미노]에틸]페닐]-4-요오도벤젠설폰아미드[N-[4-[2-[[(2S)-2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenoxy)propyl] amino]ethyl]phenyl]-4-iodobenzenesulfonamide]; 또는 (R)-N -[4-[2-[[2-하이드록시-2-(3-피리디닐)에틸]아미노]에틸]-페닐]-4-[4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]티아졸-2-일]-벤젠설폰아미드][(R)-N-[4-[2-[[2-hydroxy-2-(3-pyridinyl)ethyl]amino]ethyl]-phenyl]-4-[4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]thiazol-2-yl]-benzenesulfonamide]]인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 HTR3은 갈색 지방조직(BAT)에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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