JP2015513557A

JP2015513557A - 疼痛の治療に対するアダプター関連キナーゼ１の阻害

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Publication number: JP2015513557A
Application number: JP2014561064A
Authority: JP
Inventors: トーマスハーバートランソーン; カテリーナサヴェリエヴァ; ブライアンザンブロウィッツ
Original assignee: レクシコンファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2015-05-14
Also published as: ES2657061T3; EP3235499A2; PT2822555T; DK2822555T3; CA2866145A1; HUE036040T2; US20190134037A1; US20140080834A1; CN104220071A; WO2013134336A2; EP3235499A3; AU2013230066A1; EP2822555A2; WO2013134336A3; NO2935475T3; US20160206619A1; US20150164899A1; EP2822555B1; HK1199814A1; PL2822555T3

Abstract

本発明は、アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）を阻害することによる疼痛の治療に関する。多数のＡＡＫ１阻害剤を開示する。【選択図】図１

Description

１．発明の分野
本発明は、アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）を阻害することにより疼痛を治療する方法に関する。

本願は、２０１２年３月９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／６０８，８４９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に対する優先権を主張している。

２．発明の背景
疼痛は概して急性、炎症性及び神経因性の３つの異なるタイプに分けることができる。急性疼痛はまさにその性質上、概して短期間であり、極めて強い。一方、炎症性疼痛ははるかに長時間持続し得、その強さはより段階的である。炎症は組織損傷、自己免疫応答及び病原体侵入を含む様々な理由で起こり得る。３種類目の疼痛は神経因性であり、数年続く慢性疼痛を引き起こし得る病理的な「感作」状態を生じる神経タンパク質及び神経回路の再構成をもたらす神経損傷を伴うとみなされている。このタイプの疼痛は既存の治療法による治療が特に困難である。

疼痛、特に神経因性及び難治性の疼痛には満たされていない大きな医学上の要求がある。何百万もの人々が、現在の治療法では十分にコントロールされない激しい疼痛に苦しんでいる。疼痛の治療に使用される現在の薬物としては、ＮＳＡＩＤＳ、ＣＯＸ２阻害剤、オピオイド、三環系抗鬱剤及び抗痙攣剤が挙げられる。神経因性疼痛は、オピオイドに対して高用量に達するまで良好に反応しないため特に治療が困難であった。ガバペンチンは現在、神経因性疼痛の治療に有利な治療剤であるが、６０％の患者にしか奏功せず、僅かな有効性しか示さない。

アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）は、セリン／トレオニンキナーゼのＡｒｋ１／Ｐｒｋ１ファミリーの成員である。ＡＡＫ１ｍＲＮＡはショート及びロングと呼ばれる２種のスプライシング型で存在する。ロング型は脳及び心臓において優勢であり、強く発現する（非特許文献１）。ＡＡＫ１はシナプトソーム調製物に豊富に含まれ、培養細胞においてエンドサイトーシス構造と共局在化する。ＡＡＫ１は、シナプス小胞の再利用及び受容体媒介性のエンドサイトーシスに重要なプロセスであるクラスリン被覆エンドサイトーシスを調節する。ＡＡＫ１が、受容体のカーゴとクラスリン被覆とを連結するヘテロ四量体であるＡＰ２複合体に結び付く。クラスリンとＡＡＫ１との結合がＡＡＫ１キナーゼ活性を刺激する（非特許文献２、非特許文献３）。ＡＡＫ１は、ＡＰ−２のｍｕ−２サブユニットをリン酸化し、それによりｍｕ−２とカーゴ受容体上のチロシンを含むソーティングモチーフとの結合を促す（非特許文献４、非特許文献５）。Ｍｕ２のリン酸化は受容体の取込みに必要ではないが、リン酸化は内在化の効率を高める（非特許文献６）。

ＡＡＫ１はＰＣ１２細胞におけるニューレグリン−１／ＥｒｂＢ４シグナル伝達の阻害剤として特定されている。ＲＮＡ干渉媒介性の遺伝子サイレンシング又は（ＡＡＫ１キナーゼ活性を阻害する）キナーゼ阻害剤Ｋ２５２ａでの処理によるＡＡＫ１発現の喪失がニューレグリン−１誘導性の神経突起伸長の増強をもたらす。これらの処理により、細胞膜又はその付近でのＥｒｂＢ４の発現の増大及びＥｒｂＢ４の集積が起こる（非特許文献７）。ＮＲＧ１及びＥｒｂＢ４は推定統合失調症感受性遺伝子である（非特許文献８）。両遺伝子のＳＮＰが複合的な統合失調症の中間形質に関連している（非特許文献９）。ニューレグリン１及びＥｒｂＢ４ＫＯマウスモデルは統合失調症関連の形態変化及び行動的表現型を示した（非特許文献１０、非特許文献１１）。加えて、ＡＡＫ１遺伝子のイントロンでの一塩基多型はパーキンソン病の発症年齢に関連していた（非特許文献１２）。

Henderson and Conner, Mol. Biol. Cell. 2007, 18, 2698-2706 Conner et. al., Traffic 2003, 4, 885-890 Jackson et. al., J. Cell. Biol. 2003, 163, 231-236 Ricotta et. al., J. Cell Bio. 2002, 156, 791-795 Conner and Schmid, J. Cell Bio. 2002, 156, 921-929 Motely et. al., Mol. Biol. Cell. 2006, 17, 5298-5308 Kuai et. al., Chemistry and Biology 2011, 18, 891-906 Buonanno, Brain Res. Bull. 2010, 83, 122-131 Greenwood et. al., Am. J. Psychiatry 2011, 168, 930-946 Jaaro-Peled et. al., Schizophrenia Bulletin 2010, 36, 301-313 Wen et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107, 1211-1216 Latourelle et. al., BMC Med. Genet. 2009, 10, 98

３．発明の概要
本発明は、ＡＡＫ１の阻害が疼痛を軽減する可能性があるという出願人らの独創的な発見及びそれに続く複数種のＡＡＫ１阻害剤の発見に基づく。

本発明自体が、疼痛を治療又は管理する方法であって、それを必要とする患者においてＡＡＫ１活性を阻害することを含む、方法を包含する。具体的な疼痛は、線維筋痛又は末梢神経障害（例えば糖尿病性神経障害）等の神経因性疼痛である。
４．図面の簡単な説明

本発明の態様を説明するものであり、ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）ノックアウトマウスとその野生型（＋／＋）同腹子とを用いたホルマリン疼痛モデルから得られた結果を示す図である。ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）ノックアウトマウスは、その野生型（＋／＋）同腹子と比較して急性及び持続性の（tonic）疼痛応答の両方において明らかな低減を示している。

５．発明の詳細な説明
本発明は、ＡＡＫ１ノックアウトマウスが疼痛に高い耐性を示すという発見に一部基づくものである。この発見は、最終的に疼痛の治療及び管理に使用することができる広範なＡＡＫ１阻害剤の発見につながる研究を促した。要するに、本発明は、疼痛を治療又は管理することができる全く新たな機構及びそれに有用な化合物を提供する。
５．１．定義
特に明示のない限り、「本発明の化合物」、「本開示の化合物」等の語句は、本明細書中で開示される化合物を指す。

特に明示のない限り、「ヒドロカルビル」という用語は、全炭素主鎖（all-carbon backbone）を有し、炭素原子と水素原子とからなる脂肪族部分又は脂環式部分を意味する。ヒドロカルビル基の例としては、１個〜２０個、１個〜１２個、１個〜６個及び１個〜４個の炭素原子を有するもの（それぞれＣ_１〜２０ヒドロカルビル、Ｃ_１〜１２ヒドロカルビル、Ｃ_１〜６ヒドロカルビル及びＣ_１〜４ヒドロカルビルと称される）が挙げられる。具体例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ベンジル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、ナフチル、フェニル及びフェニルエチルが挙げられる。

アルキル部分の例としては、１個〜２０個、１個〜１２個、１個〜６個、１個〜４個及び１個〜３個の炭素原子を有する直鎖部分及び分岐部分（それぞれＣ_１〜２０アルキル、Ｃ_１〜１２アルキル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルキル及びＣ_１〜３アルキルと称される）が挙げられる。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソへキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシルが挙げられる。

アルケニル部分の例としては、直鎖及び分岐Ｃ_２〜２０、Ｃ_２〜１２及びＣ_２〜６アルケニルが挙げられる。具体例としては、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、３−オクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、１−デセニル、２−デセニル及び３−デセニルが挙げられる。

アルキニル部分の例としては、直鎖及び分岐Ｃ_２〜２０、Ｃ_２〜１２及びＣ_２〜６アルキニルが挙げられる。具体例としては、エチニル及び２−プロピニル（プロパルギル）が挙げられる。

アリール部分の例としては、アントラセニル、アズレニル、フルオレニル、インダン、インデニル、ナフチル、フェニル及びフェナントレニルが挙げられる。

シクロアルキル部分の例としては、Ｃ_３〜１２、Ｃ_３〜７、Ｃ_４〜６及びＣ_６シクロアルキルが挙げられる。具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びアダマンチルが挙げられる。

特に明示のない限り、「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含する。

特に明示のない限り、「ヘテロカルビル」という用語は、１つ又は複数の炭素原子と１つ又は複数のヘテロ原子とから構成される主鎖を有する部分を指す。具体的なヘテロ原子は窒素、酸素及び硫黄である。ヘテロカルビル部分は、少なくとも１つの炭素原子、ＣＨ基、ＣＨ_２基又はＣＨ_３基が、１つ又は複数のヘテロ原子と原子価を満たすのに必要な数の水素原子とで置き換えられたヒドロカルビル部分と考えることができる。ヘテロカルビルの例としては、２員〜２０員、２員〜１２員、２員〜８員、２員〜６員及び２員〜４員のヘテロカルビル部分が挙げられ、この数の範囲はこの部分の炭素原子、窒素原子、酸素原子及び／又は硫黄原子の合計を指す。したがって、「２員〜１２員のヘテロカルビル」という用語は、合計で２個〜１２個の炭素原子、窒素原子、酸素原子及び／又は硫黄原子を有するヘテロカルビル部分を指す。具体的なヘテロカルビル部分としては、直鎖及び分岐ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル及びヘテロアルキニル、並びに複素環及びヘテロアリールが挙げられる。

ヘテロアルキル部分の例としては、２員〜８員、２員〜６員及び２員〜４員のヘテロアルキル部分が挙げられる。具体例としては、アルコキシル、アシル（例えばホルミル、アセチル、ベンゾイル）、アルキルアミノ（例えばジ−（Ｃ_１〜３−アルキル）アミノ）、アリールアミノ、アリールオキシム、カルバメート、カルバミド、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルキルスルファニル、アリールスルファニル、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニルアミノ及びアリールスルホニルアミノが挙げられる。

特に明示のない限り、「複素環」という用語は、芳香族、部分芳香族又は非芳香族であり得る環式（単環式又は多環式）のヘテロカルビル部分を指す。複素環はヘテロアリールを含む。例としては、４員〜１０員、４員〜７員、６員及び５員の複素環が挙げられる。具体例としては、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシニル、シンノリニル、フラニル、ヒダントイニル、モルホリニル、オキセタニル、オキシラニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル及びバレロラクタミルが挙げられる。「複素環」という用語は環を指すため、単独ではオキサゾリジノン及びイミダゾリジノン等の部分を包含しない。かかる部分は、置換された複素環、すなわちオキソで置換された複素環とみなされる。

ヘテロアリール部分の例としては、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾキナゾリニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、フリル、イミダゾリル、インドリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、フタラジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、テトラゾリル、チアゾリル及びトリアジニルが挙げられる。

特に明示のない限り、「挙げられる（含む）（include）」という用語は、「挙げられる（含む）が、これらに限定されない」と同じ意味を有し、「挙げられる（含む）（includes）」という用語は、「挙げられる（含む）が、これらに限定されない」と同じ意味を有する。同様に、「等の（のような）（such as）」という用語は、「等の（のような）（ただし、これらに限定されない）」という用語と同じ意味を有する。

特に明示のない限り、「管理する（manage）」、「管理すること（managing）」及び「管理（management）」という用語は、特定の疾患若しくは障害に既に罹患した患者において疾患若しくは障害の再発を予防すること、及び／又は疾患若しくは障害に罹患している患者が寛解期にある時間を延長させることを包含する。この用語は、疾患若しくは障害の閾値、発症及び／又は継続期間を調節すること、又は患者の疾患若しくは障害に対する応答の仕方を変えることを包含する。

特に明示のない限り、化合物の「治療的に有効な量」は、疾患若しくは病態の治療若しくは管理において治療的利点をもたらすのに、又は疾患若しくは病態に関連した１つ若しくは複数の症状を遅延させる若しくは最小限に抑えるのに十分な量である。化合物の「治療的に有効な量」は、疾患又は病態の治療又は管理に治療的利点をもたらす、単独の又は他の治療法と組み合わせた治療剤の量を意味する。「治療的に有効な量」という用語は、治療法を全体的に改善するか、疾患若しくは病態の症状若しくは原因を低減させる若しくは回避するか、又は別の治療剤の治療的な有効性を高める量を包含し得る。

特に明示のない限り、「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」及び「治療（treatment）」という用語は、疾患若しくは障害の重症度を低減させるか、又は疾患若しくは障害の進行を遅延若しくは減速させる、患者が特定の疾患又は障害に罹患している間に行う処置を意図する。

特に明示のない限り、一連の名詞の直前にくる１つ又は複数の形容詞は、それぞれの名詞を修飾するものとして解釈される。例えば、「任意に置換されるアルキル、アリール又はヘテロアリール」という語句は、「任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアリール、又は任意に置換されるヘテロアリール」と同じ意味を有する。
５．２．化合物
ＡＡＫ１の阻害に使用することができる化合物は、米国仮特許出願第６１／６０８，７５８号、同第６１／６０８，７６５号及び同第６１／６０８，７３７号（全て２０１２年３月９日付けで出願）、並びに米国特許出願公開第１３／７７７，１４４号（２０１３年２月２６日付けで出願）、同第１３／７８５，２７１号（２０１３年３月５日付けで出願）及び同第１３／７８５，３５５号（同様に２０１３年３月５日付けで出願）に開示されている。

本発明の化合物は１つ又は複数の不斉中心を有することができる。特に指示のない限り、本発明はこの化合物のあらゆる立体異性体とそれらの混合物とを包含する。化合物の個々の立体異性体を、キラル中心を含有する市販の出発材料から、又は鏡像異性生成物の混合物を調製した後、ジアステレオマー混合物への変換後の分離若しくは再結晶化、クロマトグラフ法、又はキラルクロマトグラフカラム上での鏡像異性体の直接分離等の分離によって合成的に調製することができる。特定の立体化学の出発化合物は市販されているか、又は当該技術分野で既知の技法によって作製及び分割することができる。

本開示の或る特定の化合物は、分離可能な異なる安定した立体配座型でも存在し得る。非対称の単結合についての束縛回転に起因する、例えば立体障害又は環の変形（ring strain）による捻れ非対称（Torsional asymmetry）によって、異なる配座異性体の分離が可能となり得る。本開示はこれらの化合物の各立体配座異性体とそれらの混合物とを含む。

本開示は本発明の化合物で生じる原子の全ての同位体を含むことが意図される。同位体には、原子数が同じであるが、質量数が異なる複数の原子が含まれる。一般例であり限定するものではないが、水素の同位体にはデューテリウムとトリチウムとが含まれる。炭素の同位体には^１３Ｃと^１４Ｃとが含まれる。本発明の同位体的に標識された化合物は一般的に、当業者に既知の従来技法によって、又は他で用いられている非標識試薬の代わりに適切な同位体的に標識された試薬を用いる本明細書に記載のものに類似するプロセスによって、調製することができる。かかる化合物には多様な潜在用途、例えば生物活性を特定する際の標準及び試薬としての用途があり得る。安定した同位体の場合、かかる化合物には生物学的、薬理学的又は薬物動態的な特性を有利に変更する可能性があり得る。

本開示の化合物は薬学的に許容可能な塩として存在することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な塩」という用語は、正しい医学的判断の範囲内において過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は妥当なベネフィット／リスク比に相応する他の問題若しくは合併症を伴わずに、患者の組織に接触させて使用するのに適しており、その使用目的に対して効果的である、水又は油に可溶性又は分散性の本開示の化合物の塩又は両性イオン体を指す。塩は化合物の最終単離及び精製中に、又は好適な窒素原子と好適な酸とを反応させることにより別々に調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩；ジグルコン酸塩、二臭化水素酸塩、二塩酸塩、二ヨウ化水素酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（pectinate）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩（propionate）、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。薬学的に許容可能な付加塩を形成するのに用いることができる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸等の無機酸とシュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸等の有機酸とが挙げられる。

塩基付加塩は、カルボキシ基を、金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩等の好適な塩基、又はアンモニア若しくは有機の第一級アミン、第二級アミン若しくは第三級アミンと反応させることにより、化合物の最終単離及び精製中に調製することができる。薬学的に許容可能な塩の陽イオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びアルミニウムと、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等の非毒性の第四級アミンの陽イオンとが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン及びピペラジンが挙げられる。

特定の化合物は、下記の実施例に記載されるＰ８１フィルタープレートアッセイにおいて測定されるように０．１μＭ、０．０１μＭ又は０．００１μＭ未満のＩＣ_５０でＡＡＫ１を阻害する。特定の化合物は、下記の実施例に記載されるＨＥＫ２８１細胞ベースアッセイにおいて測定されるように０．１μＭ、０．０１μＭ又は０．００１μＭ未満のＩＣ_５０でＡＡＫ１を阻害する。
５．２．１．イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン系阻害剤
本発明の実施形態に使用することができる化合物の１種が、「イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン系化合物、それを含む組成物、及びそれらを使用する方法（Imidazo[1,2-b]pyridazine-based Compounds, Compositions Comprising Them, and Methods of Their Use）」という表題の２０１３年３月５日付けで出願された米国特許出願公開第１３／７８５，２７１号に開示されている。この出願は、下記式の化合物：

（式中、Ｒ_１はＲ_１Ａ又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_１Ａによるものであり、各Ｒ_１Ａは独立して、−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、シアノ、ハロ、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_１Ｂによるものであり、各Ｒ_１Ｂは独立して、−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、シアノ又はハロであり、各Ｒ_１Ｃは独立して、水素、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のシアノ、ハロ又はヒドロキシルによるものであり、Ｒ_２は−ＮＲ_２ＡＲ_２Ｂであり、ここでＲ_２Ａは水素であり、Ｒ_２Ｂは任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ若しくは複数のＲ_２Ｃによるものであり、又はＲ_２ＡとＲ_２Ｂとがともに１つ若しくは複数のＲ_２Ｃで任意に置換された４員〜７員の複素環を形成し、各Ｒ_２Ｃは独立して、−ＯＲ_２Ｄ、−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、シアノ、ハロ、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_２Ｄによるものであり、各Ｒ_２Ｄは独立して、水素、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のシアノ、ハロ、又はヒドロキシルによるものであり、Ｒ_３は水素、又は１つ若しくは複数のシアノ、ハロ若しくはヒドロキシルで任意に置換されたＣ_１〜６アルキルである）及びその薬学的に許容可能な塩を包含する。

特定の化合物では、Ｒ_１がＲ_１Ａである。特定の化合物では、Ｒ_１が、任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビルである。特定の化合物では、Ｒ_１が、任意に置換されたフェニルである。特定の化合物では、Ｒ_１が、任意に置換された２員〜１２員のヘテロカルビル（例えば２員〜８員のヘテロカルビル、２員〜６員のヘテロカルビル、２員〜６員のヘテロカルビル）である。特定の化合物では、Ｒ_１が、任意に置換されたピリジニル、チオフェン又はイミダゾールである。

特定の化合物では、Ｒ_１Ａがハロである。幾つかの化合物では、Ｒ_１Ａが−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２である。幾つかの化合物では、Ｒ_１Ａが−ＯＲ_１Ｃである。幾つかの化合物では、Ｒ_１Ｂが−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−ＯＲ_１Ｃ、ハロである。

特定の化合物では、Ｒ_２ＡとＲ_２Ｂとがともに、１つ又は複数のＲ_２Ｃで任意に置換された４員〜７員の複素環を形成する。

特定の化合物では、Ｒ_１Ｃが水素である。幾つかの化合物では、Ｒ_１ＣがＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばメチル、エチル、プロピル等のＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｃが−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、又は−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄである。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｄが水素である。幾つかの化合物では、Ｒ_２ＤがＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばメチル、エチル、プロピル等のＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。

特定の化合物では、Ｒ_３が水素である。

本発明の一実施形態は、下記式の化合物：

（式中、Ａは環状Ｃ_１〜１２ヒドロカルビル又は４員〜７員の複素環であり、Ｄは４員〜７員の複素環であり、各Ｒ_１Ａは独立して、−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、シアノ、ハロ、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_１Ｂによるものであり、各Ｒ_１Ｂは独立して、−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、シアノ又はハロであり、各Ｒ_１Ｃは独立して、水素、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のシアノ、ハロ又はヒドロキシルによるものであり、各Ｒ_２Ｃは独立して、−ＯＲ_２Ｄ、−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、シアノ、ハロ、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_２Ｄによるものであり、各Ｒ_２Ｄは独立して、水素、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のシアノ、ハロ、又はヒドロキシルによるものであり、ｎは１〜３であり、ｍは０〜３である）及びその薬学的に許容可能な塩を包含する。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｃはヒドロキシル又は任意に置換されたフェニル若しくはピリジニルではない。

特定の化合物では、Ｄがジアゼピンであり、かつＡがピリジニルである場合、Ｒ_２Ｃは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルではない。

特定の化合物では、Ｄがピペラジンであり、Ａがフェニルであり、かつＲ_１Ａがクロロである場合、Ｒ_２Ｃは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルではない。

特定の化合物では、Ｄがピペリジニルであり、Ａがピリジニルであり、かつＲ_１Ａがクロロである場合、Ｒ_２Ｃは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルではない。

特定の化合物では、Ｄがピペリジニルであり、Ａがピリジニルであり、かつＲ_１Ａが−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２である場合、Ｒ_２ＣはＮＨ_２ではない。

本発明の一実施形態は、下記式の化合物：

本実施形態に包含される特定の化合物では、１）Ｒ_２Ｃはヒドロキシル、又は任意に置換されたフェニル若しくはピリジニルではなく、２）Ｄがジアゼピンであり、かつＡがピリジニルである場合、Ｒ_２Ｃは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルではなく、３）Ｄがピペラジンであり、Ａがフェニルであり、かつＲ_１Ａがクロロである場合、Ｒ_２Ｃは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルではなく、４）Ｄがピペリジニルであり、Ａがピリジニルであり、かつＲ_１Ａがクロロである場合、Ｒ_２Ｃは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルではなく、５）Ｄがピペリジニルであり、Ａがピリジニルであり、かつＲ_１Ａが−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２である場合、Ｒ_２ＣはＮＨ_２ではない。

特定の化合物では、Ｄがピペラジン又はピロリジンである。

特定の化合物では、ｎが１である。

特定の化合物では、ｍが１である。

特定の化合物では、Ａがピリジニル、チオフェン又はイミダゾールである。

本発明の特定の化合物は、下記式の化合物：

（式中、ＸがＣＨ又はＮである）である。

本発明の一実施形態は、下記式の化合物：

（式中、ＸがＣＨ又はＮであり、各Ｒ_１Ａが独立して、−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、シアノ、ハロ、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_１Ｂによるものであり、各Ｒ_１Ｂが独立して、−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、シアノ又はハロであり、各Ｒ_１Ｃが独立して、水素、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のシアノ、ハロ又はヒドロキシルによるものであり、各Ｒ_２Ｃが独立して、−ＯＲ_２Ｄ、−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、シアノ、ハロ、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のＲ_２Ｄによるものであり、各Ｒ_２Ｄは独立して、水素、又は任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル若しくは２員〜１２員のヘテロカルビルであり、任意の置換は１つ又は複数のシアノ、ハロ又はヒドロキシルによるものであり、ｍは０〜３である）及びその薬学的に許容可能な塩を包含する。

本実施形態の幾つかの化合物では、Ｒ_２Ｃが、任意に置換されたフェニル又はピリジニルではない。

本発明の特定の化合物は下記式の化合物：

である。

本発明の特定の化合物は下記式の化合物：

である。

本発明の特定の化合物は下記式の化合物：

である。

本発明の一実施形態は、下記式の化合物：

本実施形態の幾つかの化合物では、ＸがＣＨであり、ｍが１であり、かつＲ_１Ａがクロロである場合、Ｒ_２Ｃはｔ−ブチルではない。

本実施形態の幾つかの化合物では、Ｒ_２Ｃが任意に置換されたフェニル又はピリジニルではない。

本発明の特定の化合物は下記式の化合物：

である。

本発明の特定の化合物は下記式の化合物：

である。

特定の化合物では、Ｒ_１Ａが−ＯＲ_１Ｃである。

特定の化合物では、Ｒ_１Ｃが、任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。

特定の化合物では、各Ｒ_２Ｄが独立して、水素、又はＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。
５．２．２．ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン系阻害剤
本発明の実施形態に使用することができる別の種類の化合物が、「ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン系化合物、それを含む組成物、及びそれらを使用する方法（Pyrazolo[1,5-b]pyrimidine-based Compounds, Compositions Comprising Them, and Methods of Their Use）」という表題の２０１３年３月５日付けで出願された米国特許出願公開第１３／７８５，３５５号に開示されている。この出願は、下記式の化合物：

特定の化合物では、Ｒ_１がＲ_１Ａである。幾つかの化合物では、Ｒ_１が、任意に置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビルである。幾つかの化合物では、Ｒ_１が、任意に置換されたフェニルである。幾つかの化合物では、Ｒ_１が、任意に置換された２員〜１２員のヘテロカルビル（例えば２員〜８員のヘテロカルビル、２員〜６員のヘテロカルビル、２員〜６員のヘテロカルビル）である。幾つかの化合物では、Ｒ_１が、任意に置換されたピリジニル、チオフェン又はイミダゾールである。

特定の化合物では、Ｒ_１Ａがハロである。幾つかの化合物では、Ｒ_１Ａが−ＯＲ_１Ｃ、−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_１Ｃ、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２である。幾つかの化合物では、Ｒ_１Ａが−ＯＲ_１Ｃである。

特定の化合物では、Ｒ_１Ｂが−Ｎ（Ｒ_１Ｃ）_２、−ＯＲ_１Ｃ、ハロである。

特定の化合物では、Ｒ_１Ｃが水素である。幾つかの化合物では、Ｒ_１ＣがＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばメチル、エチル、プロピル等のＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。幾つかの化合物では、Ｒ_２Ｃが−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２、又は−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２Ｄである。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｄが水素である。

特定の化合物では、Ｒ_２ＤがＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばメチル、エチル、プロピル等のＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。

特定の化合物では、Ｒ_３が水素である。

本発明の一実施形態は、下記式の化合物：

特定の化合物では、Ｄはピペリジニルではない。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｃは−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２ではない。

特定の化合物では、Ａはフェニルではない。

特定の化合物では、ｍは１である。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｄはエチルではない。

特定の化合物では、Ｄがピペリジニルであり、Ａがフェニルであり、かつＲ_２Ｃが−Ｎ（Ｒ_２Ｄ）_２である場合、Ｒ_２Ｄはエチルではない。

特定の化合物では、ｎが１である。

特定の化合物では、ｍは１である。

特定の化合物は、下記式の化合物：

（式中、ＸがＣＨ又はＮである）である。

本発明の別の実施形態は、下記式の化合物：

特定の化合物では、Ｒ_２Ｃが、任意に置換されたフェニル又はピリジニルではない。

特定の化合物は下記式の化合物：

である。

特定の化合物は下記式の化合物：

である。

特定の化合物は下記式の化合物：

である。

本発明の別の実施形態は、下記式の化合物：

特定の化合物は下記式の化合物：

である。

特定の化合物は下記式の化合物：

である。

特定の化合物では、Ｒ_１Ａは−ＯＲ_１Ｃである。

特定の化合物では、Ｒ_２Ｄは独立して水素又はＣ_１〜１２ヒドロカルビル（例えばＣ_１〜６ヒドロカルビル、Ｃ_１〜４ヒドロカルビル）である。
５．２．３．アリールエーテル系阻害剤
本発明の実施形態に使用することができる別の種類の化合物が、「アリールエーテル系キナーゼ阻害剤（Aryl Ether-Base Kinase Inhibitors）」という表題の２０１３年２月２６日付けで出願された米国特許出願公開第１３／７７７，１４４号に開示されている。この出願は、下記式の化合物：

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立して水素、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル及びＣ_１〜Ｃ_３アルキルから選択され、ここでＣ_１〜Ｃ_３アルキルはＣ_１〜Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキルアミノ、アミノ、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_３ジアルキルアミノ、ハロ及びヒドロキシから独立して選択される１つ、２つ若しくは３つの基で任意に置換されるか、又はＲ^１及びＲ^２はともにオキソであり、Ｒ^３はＣ_１〜Ｃ_３アルキル−Ｙ又はＣ_２〜Ｃ_８アルキルであり、ここでＣ_２〜Ｃ_８アルキルはＣ_１〜Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキルアミノ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルコキシＣ_２〜Ｃ_３アルキルアミノ、アミノ、アリール、ハロ、Ｃ_１〜Ｃ_３ハロアルキルアミノ、Ｃ_１〜Ｃ_３ハロアルキルカルボニルアミノ、ヒドロキシ、−ＮＲ^ｘＲ^ｙ及びＣ_３〜Ｃ_８シクロアルキルから独立して選択される１つ、２つ又は３つの基で任意に置換され、ここでシクロアルキルは更にＣ_１〜Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキルアミノ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルコキシＣ_２〜Ｃ_３アルキルアミノ、アミノ、アリール、アリールＣ_１〜Ｃ_３アルキル、ハロ、Ｃ_１〜Ｃ_３ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_３ハロアルキルアミノ及びヒドロキシから独立して選択される１つ、２つ又は３つの基で任意に置換され、Ｒ^４は水素、Ｃ_１〜Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキルアミノ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキルカルボニルアミノ、アミノ、アリールアミノ、アリールカルボニルアミノ、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキルアミノ、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキルカルボニルアミノ、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキルオキシ、ハロ、Ｃ_１〜Ｃ_３ハロアルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_３ハロアルキルアミノ、Ｃ_２〜Ｃ_３ハロアルキルカルボニルアミノ及びヒドロキシから選択され、Ｒ^５は水素、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、シアノ、Ｃ_３シクロアルキル及びハロから選択され、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙはそれらが結合する窒素原子とともに３員〜６員の環を形成し、Ｙは

（式中、Ｒ^６は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル及びＣ_１〜Ｃ_６アルキルカルボニルから選択され、ｎは０、１、２又は３であり、Ｒ^７は各々独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アリール、アリールＣ_１〜Ｃ_３アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ及びＣ_１〜Ｃ_３ハロアルキルから選択され、Ｒ^８は各々独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_３アルコキシ及びヒドロキシから選択される）から選択される）及びその薬学的に許容可能な塩を包含するものである。

特定の化合物では、Ｒ^１及びＲ^２は各々水素である。幾つかの化合物では、Ｒ^１及びＲ^２の一方が水素であり、他方がＣ_１〜Ｃ_３アルキルである。幾つかの化合物では、Ｒ^１及びＲ^２の一方が水素であり、他方がＣ_３〜Ｃ_６シクロアルキルである。幾つかの化合物では、Ｒ^１及びＲ^２がともにオキソである。

特定の化合物では、Ｒ^３はアミノ基で任意に置換されたＣ_２〜Ｃ_８アルキルである。幾つかの化合物では、Ｒ^３はアミノ基及びアリール基で任意に置換されたＣ_２〜Ｃ_８アルキルであり、ここでアリールはフェニルである。

特定の化合物では、Ｒ^４は水素である。幾つかの化合物では、Ｒ^４はアミノである。幾つかの化合物では、Ｒ^４はＣ_１〜Ｃ_３アルキルカルボニルアミノである。

特定の化合物では、Ｒ^５は水素である。幾つかの化合物では、Ｒ^５はハロである。
５．３．使用方法
本発明は、遺伝子突然変異の結果としての、またＡＡＫ１阻害剤の投与によるアダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）の阻害が疼痛を緩和する可能性があるという独創的な発見に基づく。

したがって、本発明の一実施形態は、疼痛を治療又は管理する方法であって、それを必要とする患者においてＡＡＫ１を阻害することを含む、方法を包含する。具体的な疼痛のタイプとしては、慢性疼痛、急性疼痛及び神経因性疼痛が挙げられる。具体的な神経因性疼痛のタイプとしては、線維筋痛及び末梢神経障害（例えば糖尿病性神経障害）が挙げられる。特定の実施形態では、阻害は患者に治療的に有効な量のＡＡＫ１阻害剤を投与することによって達成される。

５．４．実施例
本発明の或る特定の態様は下記実施例から理解することができる。
５．４．１．ＡＡＫ１ノックアウトマウス
ＡＡＫ１遺伝子の破壊に関するホモ接合型（−／−）マウスを遺伝子トラップ法及び相同組換えという２つの方法によって準備した。

遺伝子トラップ法は、突然変異原としてレポーター又は選択可能なマーカー遺伝子をコードするＤＮＡのフラグメントを使用するランダム挿入突然変異の方法である。遺伝子トラップベクターは、細胞スプライシング機構によって、ベクターでコードされたエクソンが細胞ｍＲＮＡへとスプライシングするようにイントロン又は遺伝子に組み込まれるように設計されている。一般的に遺伝子トラップベクターは、強いスプライスアクセプター配列が先行しプロモーターは先行していない、選択可能なマーカー配列を含有する。このため、かかるベクターが遺伝子に組み込まれると、細胞スプライシング機構によって、エクソンはトラップされた遺伝子から選択可能なマーカー配列の５’末端上へとスプライシングする。典型的に、かかる選択可能なマーカー遺伝子は、遺伝子をコードするベクターがイントロンに組み込まれている場合にのみ発現することができる。次いで得られる遺伝子トラップ事象は選択的培養物を生存させることができる細胞を選択することによって特定される。

胚性幹細胞（マウス派生株Ａ１２９由来のＬｅｘ−１細胞）は、遺伝子操作されたベクター配列の少なくとも一部を対象の遺伝子に挿入させることを含むプロセスによって突然変異させて、突然変異された胚性幹細胞を胚盤胞に微量注入して、次いでそれを偽妊娠雌性宿主に導入して、確立された方法を用いて出産させた。例えば、"Mouse Mutagenesis", 1998, Zambrowicz et al., eds., Lexicon Press, The Woodlands, TXを参照されたい。その後、得られるキメラ動物を繁殖させ、対象の遺伝子に遺伝子操作による突然変異を含有する対立遺伝子の生殖細胞系伝達が可能な子孫を産生した。

ＡＡＫ１遺伝子が破壊されたマウスは相同組換えによっても作製された。この場合、マウスＡＡＫ１遺伝子の第２のコーディングエクソン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７７７６２を参照されたい）を当該技術分野で既知の方法によって除去した。例えば、米国特許第５，４８７，９９２号、同第５，６２７，０５９号及び同第５，７８９，２１５号を参照されたい。

ＡＡＫ１遺伝子の破壊に関するホモ接合型（−／−）マウスを、ＡＡＫ１遺伝子の破壊に関するヘテロ接合型（＋／−）マウス及び野生型（＋／＋）同腹子とともに研究した。この分析の間、マウスに対して、哺乳動物の被験体において主な器官系の機能を評価するように設計された一連の統合医療診断法を用いる医学的精密検査を行った。ホモ接合型（−／−）「ノックアウト」マウスをそのヘテロ接合型（＋／−）及び野生型（＋／＋）の同腹子とともに研究した。ＡＡＫ１遺伝子の破壊をサザン分析によって確認した。ＡＡＫ１のマウスホモログの発現をマウスの脳、脊髄、眼、胸腺、脾臓、肺、腎臓、肝臓、骨格筋、骨、胃、小腸及び結腸、心臓、脂肪、喘息肺、ＬＰＳ肝臓、血液、輪状化した心臓、大動脈（aortic tree）、前立腺及び乳腺（５週齢の未交尾（virgin）、成体の未交尾、１２ＤＰＣ、産後３日目（授乳）、離乳後３日目（初期乳腺退縮）、及び離乳後７日目（後期乳腺退縮））においてＲＴ−ＰＣＲによって検出した。

ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）及びその野生型（＋／＋）同腹子を、急性及び持続性の侵害受容反応を評価するためにホルマリン脚試験を用いて試験した。これらの試験には、ＡｕｔｏｍａｔｉｃＮｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎＡｎａｌｙｚｅｒ（カリフォルニア大学サンディエゴ校のOzaki labから購入）を使用した。試験の３０分前に金属バンドを各マウスの左後肢に巻いた。３０分の馴化期間の後、２０μｌの５％ホルマリンを左後肢の背面に皮下注射する。マウスを個々に４５分間、円筒型のチャンバに収容した。コンピューターによって、電磁場による１分当たりのフリンチ回数（flinches）、第１相（最初の８分である急性期）の総フリンチ回数、及び第２相（２０分〜４０分の間の期間である持続期）の総フリンチ回数を記録した。Yaksh TL, Ozaki G, McCumber D, Rathbun M, Svensson C, Malkmus S, Yaksh MC. An automated flinch detecting system for use in the formalin nociceptive bioassay. J Appl Physiol., 2001; 90:2386-402を参照されたい。

図１に示されるように、第１相及び第２相のデータは、ホモ接合型（−／−）雌性マウス（ｎ＝１６）、野生型雌性マウス（ｎ＝１５）、ホモ接合型（−／−）雄性マウス（ｎ＝９）、及び野生型雄性マウス（ｎ＝１８）を用いて入手した。全ての群及び両相において、ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）マウスは、その野生型（＋／＋）同腹子よりも記録された脚フリンチが大幅に少なかった。
５．４．２．Ｃａｌｉｐｅｒアッセイ
アッセイはＵ底３８４ウェルプレートで行った。最終アッセイ容量は、アッセイバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び１．０ｍＭＤＴＴ）中の酵素及び基質（蛍光標識ペプチド（５−ＦＡＭ）−Ａｈａ−ＫＥＥＱＳＱＩＴＳＱＶＴＧＱＩＧＷＲ−ＮＨ２（配列番号１）及びＡＴＰ）及び試験化合物の１５μｌの添加によって調製した３０μｌとした。細菌で発現されたＧＳＴ−Ｘａ−ｈＡＡＫ１と基質及び試験化合物とを合わせることによって反応を開始した。反応物を室温で３時間インキュベートし、６０μｌの３５ｍＭＥＤＴＡバッファーを各サンプルに添加することによって反応を終了した。反応を蛍光基質及びリン酸化生成物の電気泳動分離によってＣａｌｉｐｅｒＬａｂＣｈｉｐ３０００（Caliper、マサチューセッツ州ホプキントン）で分析した。阻害データを１００％阻害のＥＤＴＡクエンチ対照反応と０％阻害のビヒクル単独反応との比較によって算出した。アッセイにおける試薬の最終濃度は、ＡＴＰが２２μＭ、（５−ＦＡＭ）−Ａｈａ−ＫＥＥＱＳＱＩＴＳＱＶＴＧＱＩＧＷＲ−ＮＨ２（配列番号１）が１．５μＭ、ＧＳＴ−Ｘａ−ｈＡＡＫ１が３．５ｎＭ、ＤＭＳＯが１．６％とした。用量反応曲線を作成し、キナーゼ活性の５０％阻害に必要な濃度（ＩＣ_５０）を決定した。化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１０ｍＭで溶解し、１１の濃度で評価した。ＩＣ_５０値を非線形回帰分析から導いた。
５．４．３．Ｐ８１フィルタープレートアッセイ
化合物を、最大化合物濃度が９６μＭとなるようにＭｕｔｉｐｒｏｂｅ（PerkinElmer）及びＢｉｏｍｅｋＦＸ（Beckman Coulter）を用いてＬａｂｃｙｔｅＬＤＶプレート（Labcyte、カタログ番号ＬＰ−０２００）へと段階希釈させた。次いで化合物を、ＥＣＨＯ５５０ＬｉｑｕｉｄＨａｎｄｌｅｒ（Labcyte）を用いてＧｒｅｉｎｅｒ３８４ウェル反応プレート（Greiner、番号７８１０７６）に分注した（pinged）（１ウェル当たり７５ｎＬ）。その後、合計１２μｌの反応バッファー（Molecular Devices製のＴｗｅｅｎとＤＴＴとを含有するＩＭＡＰバッファー）を陰性対照用のカラム１及びカラム１３の各ウェルに添加して、１２μｌの２×ＡＡＫ１（０．２ｎＭの完全長ヒトタンパク質、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５５７２６．２）を残りのウェルに添加した。次に酵素を化合物と室温で１０分間プレインキュベートした。反応は、２×Ｍｕ２（０．２μＭ、完全長ヒトタンパク質）、２×低温ＡＴＰ（２μＭ）、及び１．３μＣｉの高温^３３Ｐ−ＡＴＰを含有する１２μｌの基質ミックスをＭｉｎｉｔｒａｋ（PerkinElmer）によって添加することで開始した。反応は室温で１時間進行させた。一方で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ３８４ウェルＰ８１フィルタープレート（Millipore、カタログ番号ＭＺＰＨＮ０Ｗ１０）をプレートウォッシャー（plate washer）（ＺｏｏｍＺＷ、Titertek製）に載せ、５０μｌの１％リン酸で予め湿潤させた。次いでキナーゼ反応は２４μｌの２％リン酸を各ウェルに添加することで停止した後、Ｍｉｎｉｔｒａｋを使用して、４０μｌを各ウェルから予め湿潤させたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ３８４ウェルＰ８１フィルタープレートに移した。反応混合物をＰ８１プレートにおいて室温で１０分間インキュベートし、その後Ｚｏｏｍフィルターウォッシャー（filter washer）を用いて１００μｌ／ウェルの１％リン酸で５回洗浄した。各フィルタープレートの下部に封をした後、各ウェルに２０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ４０を添加して、プレートの上部にＦｌａｓｈｐｌａｔｅカバーで封をした後、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（PerkinElmer）による読み取りまで１時間置いた。
５．４．４．ＨＥＫ２８１細胞ベースアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＤＭＥＭ（Gibco、カタログ番号１１９６５）、１０％ＦＢＳ（SAFC Biosciences、カタログ番号１２１０３Ｃ）、１×ＧＰＳ（グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン）を含む培地中で培養した。細胞がトランスフェクション時に約８０％コンフルエントとなるように、１日目に細胞を１０ｃｍ径の皿の上でプレーティングした。およそ１２００万の細胞がトランスフェクション時の１０ｃｍ径の皿に存在していた。２日目、各皿を４８ｕｇのＤＮＡ及び１４４ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen、カタログ番号１１６６８−０１９）でトランスフェクトした。ＤＮＡは、３ｕｇのＡＡＫ１／ＨＡ／ｐＩＲＥＳ（完全長ヒト、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５５７２６．２）、４５μｇのＦｌａｇ／ＡＰ２ＭＩ／ｐｃＤＮＡ（完全長ヒト）、及び１．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを含む混合物（１０ｃｍ径の皿１つ当たり）で構成されていた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は、１４４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００及び１．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを含む混合物（１０ｃｍ径の皿１つ当たり）で構成されていた。各混合物を個々の１５ｍｌ容のチューブに移し、室温で５分間インキュベートした後、２つの混合物を組み合わせて、室温で２０分間インキュベートした。次いで成長培地を各１０ｃｍ径のプレートから吸引して、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ＧＰＳなし）と交換した。最後に、３ｍｌのＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅミックスを各１０ｃｍ径の皿に添加し、穏やかに混合した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で一晩、インキュベートした。

３日目、化合物を１０００倍の最終濃度で１００％ＤＭＳＯで希釈した後、合計５つの試験濃度となるように３倍の段階希釈を行った。１０ｃｍ径の皿１つ当たり４つの化合物を試験した。次いで１ｕｌの各化合物希釈液をディープウェルの９６ウェルプレートへとピペッティングした後、各化合物が２倍の最終濃度となるように５００μｌのＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳを各ウェルに添加した。細胞を１０ｃｍ径の皿において単純なピペッティングによって再懸濁させ（この時点でＨＥＫ２９３細胞がプレートから容易に剥がれ落ちる）、次いで５０ｍｌ容の円錐チューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化した。次いで細胞ペレットを１０ｃｍ径の皿１つ当たり２．７５ｍｌのＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳで再懸濁させ、１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルＴＣプレートの各ウェルに移した。次いで最後に、ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳで希釈した１００μｌの２×化合物を１倍の最終濃度となるように細胞懸濁液の入ったウェルに添加した。その後プレートを３７℃及び５％ＣＯ_２で３時間インキュベートした後、細胞懸濁液を各ウェルから１２チューブＰＣＲストリップへと移した。ＰＣＲストリップをチップラック内において１０００ｒｐｍで５分間スピンさせ、細胞をペレット化し、培地をピペッティングによって細胞ペレットを破壊することなく取り除いた。

ウェスタンブロット分析の準備のために、細胞ペレットを４０ｕｌの１×ＬＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Invitrogen、カタログ番号ＮＰ０００８）＋２×Ｈａｌｔリン酸及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific、カタログ番号１８６１２８４）で再懸濁させた後、それぞれを５に設定されたマイクロチップソニケーターを用いて８秒〜１０秒超音波処理した。５ｕｌの１０×ＮｕＰａｇｅＳａｍｐｌｅＲｅｄｕｃｉｎｇＡｇｅｎｔ（５０ｍＭＤＴＴを含む）を各サンプルに添加した後、ＰＣＲ機器において７０℃で１０分間熱変性させた。リン−ｍｕ２ブロットについては、１サンプル当たり合計１０μｌを４％〜２０％Ｔｒｉｓ−ＧｌｙｃｉｎｅＣｒｉｔｅｒｉｏｎ２６ウェルゲル（Biorad、カタログ番号３４５−００３４）の各レーンに、及びｍｕ２ブロットについては１レーン当たり１０μｌを４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（＋ＭＥＳバッファー）ＮｕＰＡＧＥ２６ウェルゲル（Invitrogen、カタログ番号ＷＧ１４０３ＢＸ１０）に充填した。対照については、２ｎｇのリン−ｍｕ２又は２０ｎｇのｍｕ２／Ｆｌａｇタンパク質を各ゲルの最後のウェルに充填した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、各ゲル上のサンプルを、ｉＢｌｏｔを用いてＰＶＤＦ膜へと移し、膜はＴＢＳＴ＋５％ミルクで１時間ブロッキングした後、５〜１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルを、ＴＢＳＴ＋５％ＢＳＡ中のウサギ抗リン−ｍｕ２（１：５０００、New England Peptideにより作製され、Lexiconでアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体）を用いてプローブした一方で、ＮｕＰＡＧＥゲルは、ＴＢＳＴ＋５％ミルク中のマウス抗Ｆｌａｇ（１：５００、Sigma、カタログ番号Ｆ１８０４）を用いてプローブして、これらの一次抗体はロッカーにおいて４℃で一晩インキュベートした。

４日目、ウェスタンブロット膜を５〜１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄して、ＴＢＳＴ＋５％ミルク中の抗ウサギ−ＨＲＰ（１：２０００、BioRad、カタログ番号１７０−６５１５）又は抗マウス−ＨＲＰ（１：２０００、Biorad、カタログ番号１７０−６５１６）を用いて室温で１時間プローブして、１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄して、ＶｅｒｓａｄｏｃにおいてＥＣＬ試薬（GE Healthcare、カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を用いて展開させた。最後に、１０分間３０秒毎に撮影するようにカメラを設定して、各ブロットについて飽和シグナルのない最良の画像を保存した（シグナルが飽和すると、バンドが赤色に強調表示される）。各バンドの容量分析を行い、密度値を得た。各サンプルについてのパーセント阻害を、初めに総Ｍｕ２発現レベルに正規化した後、０％対照及び１００％対照と比較することによって算出した。次いでＩＣ_５０値を、エクセルのフィッティングソフトウェアを用いて算出した。
５．４．５．イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン系阻害剤のｉｎｖｉｔｒｏデータ
様々な本発明の化合物で得られたｉｎｖｉｔｒｏデータを下記表１に提示する。表１において、「ＭＷ」は分子量を意味し、「Ｐ８１アッセイ」は上記のＰ８１フィルタープレートアッセイを表し、「ＣＢＡ」は上記のＨＥＫ２８１細胞ベースアッセイを表し、「−−」は所与のアッセイの結果が得られなかったことを意味し、「^＊」は１．０μＭ以下の値を意味し、「^＊＊」は０．１μＭ以下の値を意味し、「^＊＊＊」は０．０１μＭ以下の値を意味する。

５．４．６．ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン系阻害剤のｉｎｖｉｔｒｏデータ
様々な本発明の化合物で得られたｉｎｖｉｔｒｏデータを下記表１に提示する。表１において、「ＭＷ」は分子量を意味し、「Ｐ８１アッセイ」は上記のＰ８１フィルタープレートアッセイを表し、「ＣＢＡ」は上記のＨＥＫ２８１細胞ベースアッセイを表し、「−−」は所与のアッセイの結果が得られなかったことを意味し、「^＊」は１．０μＭ以下の値を意味し、「^＊＊」は０．１μＭ以下の値を意味し、「^＊＊＊」は０．０１μＭ以下の値を意味する。

５．４．７．アリールエーテル系阻害剤のｉｎｖｉｔｒｏデータ
上記のＣａｌｉｐｅｒアッセイ及びＨＥＫ２８１アッセイを用いて、下記の様々なアリールエーテル系化合物についてのｉｎｖｉｔｒｏデータを得た。

５．４．８．薬理効果
ＡＡＫ１ノックアウトマウスの研究によって、ＡＡＫ１遺伝子の破壊がホルマリン脚試験を用いて測定される疼痛応答に影響を及ぼすことが示された。上記の実施例５．４．１を参照されたい。同じ試験を用いて、ＡＡＫ１阻害剤の投与も疼痛応答に影響を与え得ることが確認された。

マウスを、ＡｕｔｏｍａｔｉｃＮｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎＡｎａｌｙｚｅｒ（カリフォルニア大学サンディエゴ校のOzaki labから購入）を用いて侵害受容について試験した。試験の３０分前に金属バンドを強力瞬間接着剤で各マウスの左後肢に巻いた。３０分の馴化期間の後、２０μｌの５％ホルマリンを左後肢の背面に皮下注射した。マウスを個々に４５分間、円筒型のチャンバに収容した。新たな５％ホルマリン溶液を、ホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅ−ｆｒｅｓｈ２０％、Fisher Scientific、ニュージャージー州フェアローン）を蒸留水で希釈することによって調製した。調査対象の化合物をホルマリン注射の３０分前に投与した。

コンピューターソフトウェアによって、電磁場による１分当たりのフリンチ回数、第１相（最初の８分である急性期）の総フリンチ回数、及び第２相（２０分〜４０分の間の持続期）の総フリンチ回数を記録した。Yaksh TL, Ozaki G, McCumber D, Rathbun M, Svensson C, Malkmus S, Yaksh MC. An automated flinch detecting system for use in the formalin nociceptive bioassay. J Appl Physiol., 2001; 90:2386-402を参照されたい。

様々な本発明の化合物を様々な用量で試験した。ガバペンチン及びプレガバリンを陽性対照として使用した。結果を下記表２に示す。表２において、「^＊」は２００ｍｐｋでのガバペンチンの効果の５０パーセント以上の効果を意味し、「^＊＊」は２００ｍｐｋでのガバペンチンの効果の１００パーセント以上の効果を意味し、「ｓｃ」は皮下投与を意味し、「ｉｐ」は腹腔内投与を意味し、「ｐｏ」は経口投与を意味する。

これらの結果から、ＡＡＫ１阻害剤を使用して、疼痛を治療することができることが明らかとなる。

上記に挙げられた全ての公報（例えば特許及び特許出願）はその全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。

Claims

疼痛を治療又は管理する方法であって、それを必要とする患者においてアダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）活性を阻害することを含む、方法。
前記疼痛が神経因性疼痛である、請求項１に記載の方法。
前記神経因性疼痛が線維筋痛又は末梢神経障害である、請求項２に記載の方法。
前記末梢神経障害が糖尿病性神経障害である、請求項３に記載の方法。