JPWO2010134373A1 - メタボリックシンドロームの予防剤及び／又は治療剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、内臓脂肪型肥満及び脂質代謝異常を呈するメタボリックシンドロームの治療用物質のスクリーニング方法、前記シンドロームの予防及び／又は治療用組成物の提供を目的とする。前記スクリーニング方法は、（１）被検物質を所定の量で所定の期間投与した被検物質投与群を構成する非ヒト哺乳動物、及び前記被検物質を投与していない被検物質非投与群を構成する非ヒト哺乳動物から、各々採取した骨格筋より、全ＲＮＡ画分を抽出する抽出工程；（２）前記抽出工程で抽出した各全ＲＮＡ画分中に含まれる、糖輸送体遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現量を所定の方法で定量する定量工程；及び（３）前記被検物質投与群及び被検物質非投与群をそれぞれ構成する前記非ヒト哺乳動物の前記所定期間中における摂食量、体重増加量、及び前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を、群間で比較解析し、前記メタボリック症候群に対する効果を判定する工程を備える。

Description

本発明は、ミカン区柑橘類抽出物を有効成分とするメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療剤、上記抽出物を含むメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療のための医薬製剤、及びメタボリックシンドロームの予防のための機能性食品及び健康食品に関する。

肥満によって引き起こされる、高血糖、高血圧、脂質異常等の症状の増加は世界各国の共通の社会問題である。内蔵脂肪組織の肥大化によって引き起こされ、体重の増加を招く内臓脂肪型肥満に加えて、高血糖、高血圧、脂質異常のうち２つ以上を合わせ持った状態を「メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）」といい、National Cholesterol Education Program (NCEP)がこの病態の診断基準を公表している。
高血糖を指標として判定される糖尿病は、大まかに１型と２型に分けられる。１型は、主として遺伝的な要因により血糖値を正常に保つはずのホルモンであるインスリンの分泌が完全に失われている病態で、日本人の糖尿病患者の５〜１０％を占めている。２型は、主として後天的にインスリンの感受性が失われている病態（インスリン抵抗性）であり、日本人にはインスリンの分泌低下を伴う症例も見られる。糖尿病患者の９０〜９５％を占めており、メタボリックシンドロームによって誘発される糖尿病は２型に該当する。

過食等の生活習慣が、腎臓等の臓器に負担をかけることが糖尿病の発症の一因であることは知られているが、最近の研究によれば、肥満の原因である脂肪細胞の肥大化が、脂肪組織内の遺伝子レベルでの変化を惹起し、血中のサイトカインやその他のシグナル因子の濃度変化を通じて肝臓や骨格筋を含む全身に影響を及ぼし、糖尿病の発症を促すことが分かってきた。糖尿病治療にはピオグリタゾンが、非常に有効な血糖降下剤として利用されているが、副作用の問題がある（特開2003-119148、以下、特許文献１という。）。
また、脂肪細胞の肥大化は脂質異常に関連がある。脂質異常の指標として、血中の総コレステロール（以下、「T-CHO」という。）値や中性脂肪（血中トリグリセリド、以下「TG」という。）の値が用いられてきたが、現在では、T-CHOに代えて血中LDLコレステロール値が指標の１つとされている。そして、LDLコレステロール血症や高トリグリセリド血症を発症すると、動脈硬化等の心血管疾患に罹患するリスクが高まることが知られている。こうした脂質異常の治療には、スタチンやフィブラート系薬剤が使用されている。

一方で、上記のような糖尿病や脂質異常に対して効果のある物質が柑橘類に含まれることが報告されている。ここで、柑橘類の分類は田中の分類法（Tanaka, T., Misunderstanding with regards Citrus classification and nomenclature. Bull. Univ. Osaka Pref. Ser. B, 21, 139-145 (1969)、以下、非特許文献１という）に詳しく記載されている。なお、柑橘類に含まれるポリメトキシフラボノイドの種類と量について調べられており、田中の分類法に基づく分類との間に相関が見られることが報告されている（非特許文献２）。
WO 1999/056768 A2（以下、特許文献２という。）では、脂肪組織や脂肪細胞において発現する遺伝子の発現量変化を指標として、物質の作用を評価する方法が知られている。例えば、GDF-8インヒビターが培養脂肪細胞内のGLUT4の発現を促進すること、及び当該物質は糖尿病の処置に有用であることが報告されている。

また、ポリメトキシフラボノイド（以下、PMFと言う。）の効果については下記のような例が報告されている。WO 2007/024982 A2（以下、特許文献３という）には、高脂肪食を与えられたマウスに比べ、オレンジ（Citrus sinensis）から抽出されたPMFを含む分画を添加された高脂肪食を与えられたマウスで、体重の増加量及び平均脂肪重量が低下したことが報告されている。
特開2001-240539（以下、特許文献４という）では、糖尿病を自然発症するマウスに、PMFの一つであるノビレチン又はシークワーシャー（シークワーサー）濃縮果汁を経口投与すると、これらを投与していないマウス比べて、有意な血糖上昇の抑制効果があることが報告されている。
WO 2002/087567 A2（以下、特許文献５という。）では、ハムスターに果糖のみを与えた場合と、食用タンゲリチン又は柑橘類PMF組成物を添加された果糖を与えた場合に、血中総コレステロール濃度が低下したことが報告されている。

特開2003-119148 国際公開公報WO 1999/056768 A2 国際公開公報WO 2007/024982 A2 特開2001-240539 国際公開公報WO 2002/087567 A2

Tanaka, T., Misunderstanding with regards Citrus classification and nomenclature. Bull. Univ. Osaka Pref. Ser. B, 21, 139-145 (1969) Nogata, Y., Sakamoto, K., Shiratsuchi, H., Ishii, T., Yano M., and Ohta, H., Flavonoid Composition of Fruit Tissues of Citrus Species, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, 178-192 (2006)

上記のように、メタボリックシンドロームは内臓脂肪型肥満により誘発されるものであるから、治療効果を上げるためには、肥満度の改善、すなわち脂肪組織の縮小が必須である。しかし、現在のところ、有効な抗肥満薬が見つかっておらず、また認可もされていないため、食事療法と運動療法とが併用されている。
上述したピオグリタゾンは、脂肪細胞の成長促進という矛盾点を内包しており、長期間服用すると体重や体脂肪が増加する、血糖降下作用が減弱するといった問題がある。また、スタチン系やフィブラート系の薬剤には、横紋筋融解や肝臓からの脂肪酸分泌が増えるといった問題がある。

メタボリックシンドロームの治療には、食事の制限と適度な運動が重要である。これは、筋肉に取り込まれて消費されなかった血中の糖分は、脂肪組織に蓄えられ、肥大化した脂肪細胞が、循環器系の合併症を惹起する中性脂肪を分泌するという悪い流れを断ち切るために行われる。すなわち、糖分の供給源の過剰摂取を抑制し、摂取した糖分を消費しきることが、治療効果を上げるためには必要である。ここで、糖分の供給源、すなわち、摂食量を抑制することは、低血糖や骨粗鬆症等を惹起しないように、注意深く行う必要がある。また、摂取した糖分の筋への血糖の取込と代謝とが促進されれば、血糖の消費が促進されることから、肥大化した脂肪組織に取り込まれる血糖は減少し、脂肪細胞の肥大化が抑制され中性脂肪等の分泌も抑制されることになる。
さらに、メタボリックシンドロームは、上述したように、複数の病態が合併しているため、病態ごとに薬剤を投与する対症療法には限界がある。このため、（Ａ）肥満と高血糖とを改善し、かつ脂質異常の改善を妨げない物質、又は、（Ｂ）肥満と脂質異常とを改善し、かつ高血糖の改善を妨げない物質をスクリーニングすることに対する、強い社会的要請がある。

また、上記メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療のためには、内臓脂肪型肥満、高血糖、脂質異常という３つの病態を同時に改善しつつ、高血圧その他の副作用がないか、小さい物質が発見され、それらが薬剤糖として提供されることが最も望ましい。しかし、上記３つの病態を同時に改善できなくとも、内臓脂肪型肥満という病態を改善するとともに、高血糖又は脂質異常のいずれかの病態改善することができれば、他方の１つの病態が悪化しない限り問題はない。
さらに、こうした物質が安全性の高いものであれば、医薬製剤として提供できるだけでなく、機能性食品又は健康食品としても提供することが可能となり、メタボリックシンドローム患者の発生を予防するという効果が期待できる。
したがって、こうした物質を提供することに対して、高い社会的要請があった。

本発明は、上記のような状況の下で完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、内臓脂肪型肥満、高血糖、脂質異常を関連付ける複雑なメカニズムを踏まえつつ、安全性と副作用とに留意しながら、メタボリックシンドロームの治療に効果のある成分のスクリーニング方法の開発を進めた。その結果、骨格筋組織または骨格筋細胞中の糖輸送体遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することで、メタボリックシンドロームの治療に効果のある組成物のスクリーニングができることを見出し、このスクリーニングを行うことによって、糖輸送体遺伝子に対する効果より特徴付けられる柑橘類抽出物の分画に、従来知られていなかった顕著な作用があることを発見し、本発明を完成したものである。

本発明の第１の態様は、下記の工程（１）〜（３）を備える、内臓脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈するメタボリックシンドロームの治療用物質のスクリーニング方法である。（１）被検物質を所定の量で所定の期間投与した被検物質投与群を構成する非ヒト哺乳動物、及び前記被検物質を前記所定の量で前記所定の期間投与していない被検物質非投与群を構成する非ヒト哺乳動物から、それぞれ採取した骨格筋より、全ＲＮＡ画分を抽出する抽出工程と、（２）前記抽出工程で抽出したそれぞれの全ＲＮＡ画分中に含まれる、糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を所定の方法で定量する定量工程と、（３）前記被検物質投与群及び被検物質非投与群をそれぞれ構成する前記非ヒト哺乳動物の前記所定期間中の体重増加量、摂食量、及び前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を、群間で比較解析することにより、前記メタボリックシンドロームに対する効果を判定する工程。上記工程（２）で定量する前記糖輸送体遺伝子は、マウスＧＬＵＴ４及びそのホモログであることが好ましい。

上記スクリーニング方法中、前記所定の方法は、逆転写酵素を用いて前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、前記輸送体遺伝子特異的プライマーを用いて前記ｃＤＮＡを鋳型として増幅する工程と、蛍光標識核酸、同位体標識核酸、及び核酸染色剤からなる群から選ばれる試薬を用いて、前記試薬に応じた検出法で増幅産物を定量する工程と、前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を決定する工程と、を備えることがさらに好ましい。
また、糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を所定の方法で定量する工程にかえて、前記遺伝子のコードする糖輸送体タンパク質の発現量を所定の方法で定量する工程とすることもできる。そのような場合には前記比較解析において、前記ＲＮＡの発現量にかえて、前記タンパク質の発現量を、群間で比較解析することが好ましい。

前記タンパク質の発現量を定量するための所定の方法は、糖輸送体タンパク質の発現量をウェスタンブロッティング、ELISA、及び免疫染色法からなる群から選ばれるいずれかの方法で測定する工程、及びその発現量を決定する工程を備えることが好ましい。また、前記ＲＮＡの発現量に依拠する方法と前記タンパク質の発現量に依拠する方法とは、併用することもでき、ともに前記比較解析に利用することができる。また、前記被験物質には化合物及び組成物が含まれるものとする。
本発明の第２の態様は、上記スクリーニング方法を実施するための試薬キットである。上記試薬キットは、逆転写酵素、ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅する酵素、及び糖輸送体遺伝子特異的プライマーからなることが好ましい。上記試薬キットはさらに核酸染色薬を備えることが好ましい。

本発明の第３の態様は、糖尿病発症前の、内蔵脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈するメタボリックシンドロームの治療用組成物であって、乾燥重量中７０〜１００重量％のノビレチンを含有するミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類の果皮抽出画分を含み、前記果皮抽出画分の乾燥重量換算で、１日当たり５〜２００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与し、下記の作用又は特徴（１）〜（４）を備える組成物である。（１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の上昇を抑制する作用；（２）骨格筋組織内又は骨格筋細胞内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子のタンパク質の発現を促進する作用；（３）肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進する作用；（４）血中トリグリセリド濃度に影響を与えることなく、血中ブドウ糖濃度を低下させる作用。
上記組成物において、前記ミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類はシークワーサー：Citrus depressaであることが好ましく、前記ノビレチンは乾燥重量中９５〜１００重量％であることが好ましく、前記用量は１日あたり１０〜１００ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、また、前記作用又は特徴としてさらに（５）内臓周辺白色脂肪組織の脂肪細胞の縮小を促進する作用；（６）耐糖能を改善する作用を備えることが好ましい。

本発明の第４の態様は、内蔵脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈するメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物であって、乾燥重量中４５〜５５重量％のノビレチンと４５〜５５重量％のタンゲリチンとを含有するミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類果皮抽出画分を含み、前記果皮抽出画分の乾燥重量換算で、０．５〜８．０ｇ/body/日を経口的に摂取し、下記の作用又は特徴（１）〜（４）を備える組成物である。（１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の増加を抑制する作用；（２）骨格筋組織内の又は骨格筋細胞内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を促進する作用；（３）肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進する作用；（４）血中ブドウ糖濃度に影響を与えることなく、血中トリグリセリド濃度を低下させる作用。
上記組成物において、前記ミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類はシークワーサー：Citrus depressaであることが好ましく、前記用量は、１．０〜６．０ｇ/body/日であることが好ましく、また、前記作用又は特徴としてさらに（５）内臓周辺白色脂肪組織の脂肪細胞の縮小を促進する作用；（６）レプチン抵抗性を改善する作用を備えることが好ましい。

また、本発明の第５の態様は、上記メタボリックシンドロームの治療用組成物を含有する機能性食品である。本発明の第６の態様は、上記メタボリックシンドロームの治療用組成物を含有する健康食品である。又は本発明の第７の態様は、上記メタボリックシンドロームの治療用組成物を含有する医薬製剤である。

本発明のスクリーニング方法によれば、以下の作用又は特徴を有する物質、又は前記物質を含有する組成物を選択することができる；（１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の増加を抑制する作用；（２）骨格筋組織内又は骨格筋細胞内の、マウスＧＬＵＴ４を始めとする糖輸送体遺伝子の発現を促進する作用。
本発明の前記ノビレチンを含有する組成物によれば、抗肥満効果があり、高血糖治療等効果があり、かつ脂質異常の改善を妨げないことを特徴とする、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用医薬製剤、機能性食品、又は健康食品を提供できる。本発明の前記ノビレチン及びタンゲリチンを含有する組成物によれば、抗肥満効果があり、脂質異常治療等効果があり、かつ高血糖の改善を妨げないことを特徴とする、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用医薬製剤、機能性食品、又は健康食品を提供できる。
本発明の医薬製剤を所定の方法で投与する方法により、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療ができる。また、本発明の機能性食品及び健康食品を、摂取することでメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療促進ができる。

シークワーサー果皮抽出物のHPLC分析の結果を表わすグラフである。グラフの縦軸はUV検出器の電位変化を検出電圧（mV）として表したものである。 ウンシュウミカン果皮抽出物のHPLC分析の結果を表わすグラフである。グラフの縦軸はUV検出器の電位変化を検出電圧（mV）として表したものである。 実施例３において、低脂肪食（ＬＦＤ）、高脂肪食（ＨＦＤ）、シークワーサー抽出物添加高脂肪食（ＨＦＤ＋１ＳＰＥ）、及び高濃度シークワーサー抽出物添加高脂肪食（ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥ）を与えた後のマウスの体重増加量を表すグラフである。 実施例３において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１ＳＰＥ、ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥを与えた後のマウスの、摂食量の重量を表すグラフである。 実施例３において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１ＳＰＥ、ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥを与えた後のマウスの肝臓、腎臓、及び白色脂肪組織の重量を表すグラフである。 実施例３において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１ＳＰＥ、ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥを与えた後のマウスの中性脂肪（トリグリセリド）、総コレステロール、ブドウ糖の血中濃度を表すグラフである。 実施例３において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１ＳＰＥ、ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥを与えた後のマウスのレプチンの血中濃度を表すグラフである。 実施例３において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１ＳＰＥ、ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥを与えた後のマウスの白色脂肪組織の脂質生合成関連遺伝子群の相対発現量（ＬＦＤ＝１としたとき）を表すグラフである。

実施例３において、ＬＦＤを与えた後のマウスの白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 実施例３において、ＨＦＤを与えた後のマウスの白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 実施例３において、ＨＦＤ＋１ＳＰＥを与えた後のマウスの白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 実施例３において、ＨＦＤ＋１．５ＳＰＥを与えた後のマウスの白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 糖尿病モデルマウスに対し溶媒のみ（Vehicle）、ノビレチン（Ｎｏ２００）、及びピオグリタゾン（Ｐ３０）を与えた場合のブドウ糖の血中濃度を表したグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の耐糖能を経口的ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の結果を表したグラフである。

糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の白色脂肪組織中の糖輸送体ＧＬＵＴ４遺伝子のｍＲＮＡ発現量を表したグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の上記ＧＬＵＴ４のタンパク質発現量を示す電気泳動像写真及びその発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の骨格筋中の糖輸送体ＧＬＵＴ４のタンパク質発現量を示す電気泳動像写真及び発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の肝臓組織中の糖新生関連遺伝子ＰＥＰＣＫのｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の肝臓組織中の糖新生関連遺伝子Ｇ６ＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。

糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合のアディポネクチンの血中濃度を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合のＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合のアディポカイン遺伝子ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合のアディポカイン遺伝子ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合のアディポカイン遺伝子ＩＬ−６のｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。

糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の脂肪細胞特異的転写因子遺伝子ＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の脂質生合成関連遺伝子ａＰ２のｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の脂質蓄積制御関連遺伝子ＬＰＬのｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。 糖尿病モデルマウスに対しVehicle、Ｎｏ２００、及びＰ３０を与えた場合の脂質蓄積制御関連遺伝子ＰｅｒｉｌｉｐｉｎのｍＲＮＡ発現量を表すグラフである。

実施例６において、低脂肪食給餌＋溶媒投与を行ったＬＦＤ摂取群（ＬＦＤ；肥満誘導なしの比較例）、並びに高脂肪食（ＨＦＤ）による肥満誘導後の、高脂肪食給餌＋溶媒投与を行ったＨＦＤ摂取群（ＨＦＤ）、及び高脂肪食給餌＋タンゲリチン投与を行ったＴ２００投与群（ＨＦＤ＋Ｔ２００）の、白色脂肪組織中の脂肪細胞特異的転写因子ＰＰＡＲγ遺伝子、及び糖輸送体ＧＬＵＴ４遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す電気泳動像写真及び発現量を表すグラフである。 実施例６において、上記肥満誘導後のＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋Ｔ２００の、骨格筋中の糖輸送体ＧＬＵＴ４遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す電気泳動像写真及び発現量を表すグラフである。 実施例６及び７において、高脂肪食（ＨＦＤ）による肥満誘導とノビレチン又はタンゲリチン投与のスケジュールを表したものである。 実施例７において、低脂肪食給餌＋溶媒投与を行ったＬＦＤ摂取群（ＬＦＤ；肥満誘導なしの比較例）、並びに高脂肪食（ＨＦＤ）による肥満誘導後の、高脂肪食給餌＋溶媒投与を行ったＨＦＤ摂取群（ＨＦＤ）、高脂肪食給餌＋ノビレチン投与を行った１０Ｎｏ投与群（ＨＦＤ＋１０Ｎｏ）、及び高脂肪食＋高濃度ノビレチン投与を行った１０Ｎｏ投与群（ＨＦＤ＋１００Ｎｏ）の、５週間の体重総増加量を表すグラフである。 実施例７において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１０Ｎｏ、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、５週間の平均摂食量を表すグラフである。

実施例７において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１０Ｎｏ、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、肝臓、腎臓、及び白色脂肪組織の重量を表すグラフである。 実施例７において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１０Ｎｏ、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、中性脂肪（トリグリセリド）、総コレステロール、ブドウ糖の各血中濃度を表すグラフである。 実施例７において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１０Ｎｏ、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、耐糖能を経口的ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）により表したグラフである。 実施例７において、ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋１０Ｎｏ、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、前期ＯＧＴＴの血中ブドウ糖濃度曲線の時間積分値を表したグラフである。

実施例７において、ＬＦＤの、白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 実施例７において、ＨＦＤの、白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 実施例７において、ＨＦＤ＋１０Ｎｏの、白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。 実施例７において、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。

以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本明細書において、特に断りのない限り、メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常状態を呈するメタボリックシンドロームのことを指すものとする。また本願発明においては抗肥満効果に、肥大化した内蔵脂肪組織を縮小する効果が含まれるものとする。
被験物質としては任意のものが使用できる。被験物質は食餌に混合するか、適当な溶媒に溶解又は懸濁して被験対象動物に経口投与することが好ましい。また、被験物質が脂溶性のものである場合には、被験対象動物に経皮投与することもできる。

本発明のスクリーニング方法で被験対象となる非ヒト哺乳動物は、げっ歯目（Rodentia）が好ましく、より好ましくは実験用マウス（ハツカネズミ；Mus musculus；以下、マウスという。）が好ましい。マウスは被検物質を所定の量で所定の期間投与した被検物質投与群、及び前記被検物質を前記所定の量で前記所定の期間投与していない被検物質非投与群の２群、もしくは、それに加えて投与量、食餌条件などの所定の条件を変えた複数群を構成することが望ましい。
本発明のスクリーニング方法においては、肥満の指標として体重を測定することが好ましい。さらに解剖によって内蔵白色脂肪組織を取り出し、その重量を測定し、内臓脂肪型肥満の度合いを測定することが好ましい。さらに脂肪組織を顕微鏡観察して脂肪細胞の肥大化の度合いを測定することが好ましい。また、解剖を伴わない方法として、被験対象動物の電気抵抗値を測定する方法、又は比重を測定する方法によって体脂肪率を測定してもよい。本発明の摂食量の測定方法としては、マウスにケージ内で摂食させて、与えた餌の減少量を測定することが簡便で好ましい。

本発明の、前記スクリーニングに用いる糖輸送体関連遺伝子としては、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＡＭＰＫ等が好ましい。メタボリックシンドロームの治療用物質がこうした遺伝子の発現を骨格筋で制御するものであると、骨格筋組織への血糖の取り込み効率を制御することにより、インスリン抵抗性、耐糖能不全、又は高血糖を改善することができる。さらに、脂肪細胞へのブドウ糖の取り込み量が減少することで、脂肪細胞及び脂肪組織の肥大化を抑制し、また、すでに肥大化した脂肪細胞及び脂肪組織に対しては縮小を促進する。このように縮小した脂肪細胞及び脂肪組織からの脂質分泌を正常化することで脂質異常を改善することができる。さらにメタボリックシンドロームの治療用物質が、骨格筋内のＧＬＵＴ４，ＡＭＰＫ等の糖輸送体関連遺伝子の発現の促進するものであると、運動療法を必要とするメタボリックシンドローム患者にとって、その補助効果が期待できる。また、高血糖においては、これらの遺伝子の発現の促進は、インスリン抵抗性改善により深刻な糖尿病への移行を防ぐ効果を有する。これらのスクリーニング用遺伝子の中でも、骨格筋のＧＬＵＴ４は、前記物質が高血糖並びに脂質異常の症状を改善する作用を有する可能性が高い点で、特に好ましい。

本発明の、遺伝子発現の測定はｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量の測定により行うことができる。これらの測定は公知の手法で行うことができる。ｍＲＮＡの測定は以下の工程を含むものであることが好ましい。
（１）骨格筋組織片、又は骨格筋細胞よりｍＲＮＡを含む画分を抽出する工程；
（２）逆転写酵素を用いて前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程；
（３）前記輸送体遺伝子特異的プライマーを用いて前記ｃＤＮＡを増幅する工程；
（４）所定の試薬を用い、その試薬に応じた検出法で増幅産物を定量する工程，及び
（５）前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を決定する工程
前記所定の試薬は蛍光標識核酸、同位体標識核酸、及び核酸染色剤からなる群から選ばれるいずれかの試薬であることが好ましく、スクリーニング効率の観点から核酸染色剤がさらに好ましい。前記核酸染色剤としては検出効率の観点から、SYBR (登録商標) Greenが好ましい。前記検出法としては、測定値の正確性の観点からリアルタイムPCR法が好ましい。前記発現量を決定する方法としては、グリセアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）を標準として用いる、比較Ｃｔ法が好ましい。
また、タンパク質の発現量の測定は、骨格筋組織片、又は骨格筋細胞より全タンパク質画分を抽出する工程と；前記タンパク質画分中の糖輸送体タンパク質の発現量をウェスタンブロッティング法、ELISA法、その他の公知の方法で測定する工程と；その発現量を決定する工程とを備えることが好ましい。また、タンパク質の発現量は、骨格筋組織又は骨格筋細胞の免疫染色によって測定してもよい。

本発明の、被験物質のメタボリックシンドロームに対する効果の判定は、以下の条件に基づいて行われることが好ましい。
すなわち、前記所定の条件下で、前記被験物質非投与群に比べ、前記被験物質投与群の、（条件１）体重の増加、又は体重増加量の上昇を抑制し；（条件２）摂食量の著しい増加、減少が伴わず；（条件３）前記糖輸送体遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を促進することを条件とするのが好ましい。前記（条件１）で肥満抑制効果を有するものを選択し、（条件２）で、副作用の指標となる摂食量の抑制を伴うもの、及び肥満の亢進に繋がる摂食量を増加させるものを除外する。そして、（条件３）で、上記の通り高血糖又は脂質異常の改善に効果が期待できる骨格筋中の糖輸送体遺伝子の発現を促進するものを選択する。

本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物の抽出には、抽出効率の観点から、ミカン区柑橘類の果皮から抽出するのが好ましい。ミカン区柑橘類の中でも、ケラジ（Keraji；Citrus Keraji；以下同様とする。）、ポンカン（Ponkan；C. reticulata）、ダンシータンジェリン（Dancy tangerine；C. tangerine）、ジミカン（Jimikan；C. succosa）、シカイカン（Shikaikan；C. suhuiensis）、タチバナ（Tachibana；C. tachibana）、コベニミカン（Kobenimikan；C. erythrosa）、キシュウミカン（Kishumikan；C. kinokuni）、シークワーサー（Shiikuwasha；C. depressa）コウジ（Koji；C. leiocarpa）等が組成物の含量の点からさらに好ましい。
果実から果皮を得る際の作業効率、及び前記組成物の抽出効率の点から、シークワーサー（Shiikuwasha；C. depressa）の果皮から抽出することがさらに好ましい。上記果皮は天日又は機械乾燥機により乾燥させることができるが、天日で乾燥させることが、乾燥にかかるエネルギーの低減と、成分変性の防止のために好ましい。

本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物として、上記のミカン区柑橘類の乾燥果皮からメタノール抽出等をすることによって得られる抽出物を、好適に使用することができる。前記抽出物は、下記式（I）で表されるノビレチン及び／又は式（II）で表されるタンゲリチンを所定の割合で含有する。また、上記ノビレチン及びタンゲリチンと骨格部分が共通し、そのメトキシ基の数及び部位の異なる化合物群を、一般にポリメトキシフラボノイド（ＰＭＦ）と称するので、本明細書においてもこの名称を使用する。

以下に、上述した植物材料から、PMFを含む画分を抽出し、この画分を粗精製してノビレチンとタンゲリチンとを所定の量で含む画分を得る方法、及びノビレチン又はタンゲリチンを精製する方法の一例を示す。
柑橘類の果実から得た果皮を、天日で３日間自然乾燥させ、乾燥果皮とする。所定量の乾燥果皮に、この５倍容の溶媒を加え、所定の期間、所定の温度で浸漬抽出を行い、抽出液を得る。ここで、抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、各種の混合比の水−メタノール混合液、水−エタノール混合液等を挙げることができる。
得られた粗抽出液を濾過して固形分を除き、濾液全量を濃縮し、濃縮液を得る。この濃縮液に、適当な水相／有機相の混合液を適当量加えて、液−液分配抽出を行う。分配抽出は、混合液の組成を変えて複数回行う。分配抽出によって得られた有機相を濃縮し、オープンカラムに供して、段階的に溶媒濃度を上げるステップグラジエント法による溶出を行い、所望の画分を果皮抽出物（以下、「SPE」という。）として使用する。

次いで、この画分の一部を濃縮し、溶質濃度を調整して、分取カラムクロマトグラフィーを行って粗精製を行う。SPEを、さらにカラムクロマトグラフィーに供し、この抽出物に含まれるノビレチン及び／又はタンゲリチンの量を定量する。所望の含量のノビレチン、又はノビレチン及びタンゲリチンの双方を含む画分を、後述する治療用組成物として使用する。
具体的には、シークワーサー、ウンシュウミカン（Satsuma；C. unshiu）等のミカン区柑橘類の乾燥果皮６〜10kgに、30〜50Ｌのメタノールを加えて、２〜６℃で７〜21日間抽出し、抽出液を得る。この抽出液を濾過して固形分を除き、フラッシュエバポレータを用いて、濾液全量を濃縮する。次いで、水／酢酸エチル（１／１）を４Ｌ加えて分配抽出をおこなう。得られた酢酸エチル相に、90％メタノール／ｎ−ヘキサン（１／１）を４Ｌ加えて、再度、液−液分配抽出を行う。

引き続き、90％メタノール相の一部を濃縮し、例えば、ODSシリカゲルカラム（Cosmosil 75C₁₈-OPN、50 mmφ×500 mm）にアプライして、20％ずつメタノール濃度を上げるステップグラジエント溶出を行い、60％〜100％メタノールの画分を得る。これらの画分を、大型ロータリーエバポレータにて乾燥させ、SPEとして本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物に使用する。
次いで、例えば、上記の画分のうち、80％メタノール画分の一部を濃縮し、メタノールを加えて溶質濃度を900mg/mlに調整し、分取カラムクロマトグラフィーに供する。例えば、以下の条件で分画を行って所望の画分を得た後に、各画分中のノビレチン及び／又はタンゲリチンの含有量を定量する。

分取条件：カラム５C₁₈-AR-IIカラム（ナカライテスク（株））
溶出溶媒：７０％メタノール／水
溶質濃度：９００ｍｇ／ｍｌ
Injection volume：３ｍｌ
Fraction volume：１０ｍｌ
Flow rate：５ｍｌ／分
検出波長：ＵＶ２１５ｎｍ
レンジ：２０ｍＶ
ノビレチン及びタンゲレチンの標準品の保持時間（Retention Time）と、得られた各画分中のピークの保持時間とをクロマトグラムから分析し、ノビレチン及びタンゲレチンを定量する。本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物とするにはエバポレーター等で乾燥させて使用する。熱乾燥法は成分変性を起こす恐れがあるので好ましくない。
なお、本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物において使用する、ノビレチン及び／又はタンゲリチンを含有する組成物は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって、入手してもよく、市販品を購入してもよい。

また、本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物は、メタボリックシンドローム関連遺伝子を制御するものであることが好ましい。前記メタボリックシンドローム関連遺伝子とは、脂質生合成関連遺伝子、糖輸送体関連遺伝子、糖新生関連遺伝子、アディポカイン関連遺伝子、脂肪細胞特異的転写因子、及び脂質蓄積制御関連遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子を言う。ここで、前記メタボリックシンドローム関連遺伝子は、本明細書においては、「制御」とは、上記遺伝子の発現を上昇させる場合、低下させる場合、及び維持する場合をいうものとする。
脂質生合成関連遺伝子としては、ａＰ２、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＳＣＤ１、ＦＡＳ、ＡＣＣ１、ＦＡＴＰ、ＤＧＡＴ１、ＡＧＰＡＴ、ＧＰＡＴ 等を挙げることができる。これらのうち、ａＰ２、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＳＣＤ１、ＦＡＳ、ＡＣＣ１、ＦＡＴＰ、ＤＧＡＴ１からなる群から選ばれる遺伝子の発現を制御することが、脂質生合成の抑制を介して脂肪細胞の肥大化を抑制し、その結果、脂肪組織の肥大化が抑制されてインスリン抵抗性、耐糖能不全、高血糖、又は血中脂質異常が改善されるために好ましい。

本発明のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物は、前記脂肪組織内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子の発現を制御するものであることが、組織への血糖の取り込み効率を制御して、脂肪組織、及び血糖値又は血中中性脂肪の状態を適切にコントロールするためにさらに好ましい。

前記糖新生関連遺伝子としては、ＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐａｓｅ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ、及びピルビン酸カルボキシラーゼ等を挙げることができ、肝臓内のＰＥＰＣＫ又はＧ６Ｐａｓｅの発現を抑制するものであることが、糖新生活性を抑制することによって、肝臓のインスリン抵抗性を改善するために好ましい。
前記アディポカイン関連遺伝子としては、ＴＮＦα，ＭＣＰ−１，ＩＬ−６，ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、Ｒｅｓｉｓｔｉｎ、及びＡｄｉｐｓｉｎ等の、いわゆる悪玉アディポカイン関連遺伝子を挙げることができる。これらうち、ＴＮＦα，ＭＣＰ−１，ＩＬ−６及びＰＡＩ−１からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現を抑制することで、悪玉アディポカインの産生を抑制し、これによって、これら悪玉アディポカインの分泌を抑制し、結果として肝臓のインスリン抵抗性を改善することができるからである。

上記脂肪細胞特異的転写因子遺伝子としては、ＰＰＡＲγ及びＰＤＥ３Ｂ等を挙げることができる。これらのうち、ＰＰＡＲγの発現が促進されると、ＰＰＡＲγの機能の向上が図られ、その結果、アディポネクチン遺伝子の発現が促進される。その結果、アディポネクチンの産生と分泌とが促進されることによる。
またこのとき、ＰＰＡＲγによる前記脂質生合成関連遺伝子の発現が選択的に抑制されると、脂肪細胞の肥大化が抑制され、インスリン抵抗性が改善されるという効果が高い。
上記脂質蓄積制御関連遺伝子としては、ＬＰＬ、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ、及びＰＰＡＲσ等を挙げることができる。これらのうち、ＬＰＬ又はＰｅｒｉｌｉｐｉｎの発現が促進されることが好ましい。それによって、脂質の蓄積が抑制され、脂肪細胞の肥大化が抑制される結果として、脂肪組織の肥大化が抑制される。そして、インスリン抵抗性、耐糖能不全、高血糖、又は血中脂質異常が改善されるからである。

本発明の第３の態様のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物は、好ましくは、上記精製物の乾燥重量に対して70〜100重量％のノビレチンを含有する上記組成物であり、その１日当たりの用量は、ノビレチンに換算して、経口で５〜200 mg/kg体重であることが以下の理由から好ましい。上記治療及び／又は組成物中のノビレチン含量は95〜100重量％であり、１日当たりの用量は、ノビレチンに換算して、10〜150 mg/kg体重であることがさらに好ましく、100 mg/kg体重とすることがさらに好ましい。
以上はノビレチンを上記の範囲で含有する組成物が、（１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の上昇を抑制する作用；（２）骨格筋組織内又は骨格筋細胞内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子のタンパク質の発現を促進する作用；（３）肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進する作用；（４）血中トリグリセリド濃度に影響を与えることなく、血中ブドウ糖濃度を低下させる作用；（５）内臓周辺白色脂肪組織の脂肪細胞の縮小を促進する作用；（６）耐糖能を改善する作用を備えることによる。

本発明の第４の態様のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物は、組成物の乾燥重量に対して40〜60重量％のノビレチンと40〜60％のタンゲリチンとを含有する上記SPEであることが好ましく、45〜55重量％のノビレチンと45〜55％のタンゲリチンとを含有する上記SPEであることがさらに好ましい。
本発明の第４の態様の人に対する投与量は以下の通りとするのが好ましい。一般にマウスに適する投与量の約50倍の値がヒトに適する投与量であると考えられるため、前記組成物の１日当たりの成人に対する用量は、経口で１〜４ g/bodyであることが好ましく、2.0〜3.4 g/bodyであることがさらに好ましく、3.2〜3.4 g/bodyであることが特に好ましい。また、患者の体重に合わせて前記の1/2〜2倍程度で用量を調整することが好ましい。
以上は上記SPEからなる組成物が、（１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の増加を抑制する作用；（２）骨格筋組織内の又は骨格筋細胞内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を促進する作用；（３）肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進する作用；（４）血中ブドウ糖濃度に影響を与えることなく、血中トリグリセリド濃度を低下させる作用；（５）内臓周辺白色脂肪組織の脂肪細胞の縮小を促進する作用；（６）レプチン抵抗性を改善する作用を備えることによる。
ノビレチンとタンゲリチンとを上記の範囲で含有するSPEは、上述したノビレチンが有する作用のうち、血中ブドウ糖濃度を低下させる効果はないが、血中トリグリセリドを低下させる効果を有する点と、耐糖能ではなくレプチン抵抗性を改善する点で相違がある。

前記の方法により得られた上記式（Ｉ）〜（ＩＩ）で表される化合物を含む前記組成物、又は前記組成物に含まれる化合物の生理学的に許容される塩、これの生理学的に許容される水和物、又はこれの生理学的に許容される水和物からなる組成物は、以下のようにして医薬製剤とすることができる。ノビレチン単独、又はノビレチンとタンゲリチンとの混合物を単独で医薬製剤とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合すればよい。これらの医薬組成物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤、軟膏剤、硬膏剤、スプレー剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。

ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル剤が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また顆粒剤にはコーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。なお、上述した各製剤には、徐放化されてないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製法に際して薬理学的に許容できる日本薬局方に記載の基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。

前記結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース等を挙げることができる。前記崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース等を挙げることができる。前記滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。前記着色剤としては、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。

錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。さらに顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。上記の組成物、又はこれに含まれる化合物の生理学的に許容される塩、若しくは水和物からなる組成物を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝材、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。
上述したようなメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、血糖値、血圧及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、上述した用量及び用法で、１日１回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよく、以上のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。

上述した抽出物を単独で、または化合物と組み合わせて、有効成分として製剤中に含まれるときは、当該組成物中のこれらの含有量は上記と同様である。有効成分であるノビレチンや、タンゲリチン、又はこれらの混合物の含有量が下限値未満ではメタボリックシンドロームの改善作用が十分に発揮されず、逆に上限値を超えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を超えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。さらに、上述した化合物、その誘導体、生理学的に許容される塩、生理学的に許容されるそれらの水和物を必要に応じて適宜添加することにより、脂肪細胞の増殖分化促進効果を有する機能性食品若しくは健康商品を提供することができる。

上述した組成物、その組成物中に含まれる前記化合物の誘導体、生理学的に許容されるそれらの塩、又は生理学的に許容されるそれらの水和物からなる組成物を、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタ、その他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒、その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して機能性食品とすることができる。あるいは動物用餌に添加して機能性配合飼料とすることができる。なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の化合物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。

また、本発明の化合物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。ここで、本発明の化合物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。

また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。さらに上述したようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。なお、本発明において上記機能性食品及び健康食品には、それ自体が天然に上記組成物を含有する、柑橘類その他の植物果実等は含まないものとする。ただし、上記柑橘類等に上記組成物を添加することで製造される上記食品等は、本発明から除外しないものとする。

１．被検物質等の調製
（１−１）ミカン区柑橘類果皮からの抽出物の抽出方法
シークワーサーの果実は、沖縄県大宜味より購入した。シークワーサー果実から得た果皮を天日で３日間乾燥させ、シークワーサー乾燥果皮を得た。ウンシュウミカンの果実は、愛媛県産を購入した。またウンシュウミカンから得た果皮を同様に、天日で３日間乾燥させ、ウンシュウミカン乾燥果皮を得た。
これらの乾燥果皮８ｋｇに、40Ｌのメタノールを加えて浸漬し、14日間、４℃にて抽出した。濾過を行って粗抽出液を得、エバポレーターを用いてこの粗抽出液を全量濃縮した。この濃縮液を、４Ｌの水／酢酸エチル（１／１）で液−液分配による抽出を行い、次いで、酢酸エチル相を４Ｌの90％メタノール−水／ヘキサン（１／１）で再度、液−液分配による抽出を行った。

得られた90％メタノール相を、ODSシリカゲルオープンカラム（Cosmosil 75C₁₈-OPN)にかけ、エバポレーターで濃縮し、水−メタノールを移動相として２０％ずつメタノール濃度を増加させるステップグラジエント法で溶出した。この溶出により、60％メタノール／80％メタノール／100％メタノールの３画分を得た。ここで得られた80％メタノール画分を、ミカン区柑橘類果皮からの抽出物とした。

（１−２）ミカン区柑橘類果皮からの抽出物の組成
上記の通り得られた抽出物を公知の方法でHPLC分析した。HPLCの条件は以下の通りである。
HPLC装置 ：UV-8011 HPLC（TOSOH社製）
検出器 ：UV Detector
カラム ：Cholester Waters 内径4.6ｍｍ×250ｍｍ（Waters社製）
溶出溶媒 ：75% MeOH／水
溶質濃度 ：0.1 mg/mL
Injection volume ：0.005 ｍｌ
Flow rate ：1.0 ｍＬ／分
検出波長 ：UV 215 nm
レンジ ：1000 mV
図１に示されるとおりノビレチンとタンゲリチンが検出された。図１Ａ及び図１Ｂの比較から分かるとおり、シークワーサーからはウンシュウミカンよりも高濃度でノビレチン及びタンゲリチンが抽出された。上記シークワーサーからの抽出物中、ノビレチンとタンゲリチンの組成比は５０％／５０％であった。
以下、シークワーサー果皮から上記方法で得られ、ノビレチン（Nobiletin）５０％、及びタンゲリチン（Tangeretin）５０％の組成からなる抽出物、を、シークワーサー果皮抽出物（Shiikuwasha Peel Extract；SPE）として使用する。

２．被験動物の飼料並びに遺伝子発現量の測定法
（２−１）被験動物の飼料
通常のマウス用飼料（標準食）は、CRF-1（オリエンタル酵母工業（株）製）を購入した。低脂肪食及び高脂肪食の調製用添加物として、カゼイン、牛脂、β−コーンスターチ、α−コーンスターチ、食物繊維、ミネラル及びビタミンを購入し、以下の量（w/w％）で添加して使用した（いずれもオリエンタル酵母工業（株）製）。また、スクロース、Ｌ−シスチン、重酒石酸コリン、ｔ−ブチルヒドロキノンを購入し、以下表に示す量（w/w％）でCRF-1に添加して給餌した（いずれも、和光純薬工業（株）製）。
表１は低脂肪食、高脂肪食ならびに実施例３におけるSPE添加食の食餌組成である。各値は重量％（w/w%）を示す。*1を記した成分は和光純薬工業（株）（Wako Pure Chemical Industries）から購入した。スークロース、L-シスチン、重酒石酸 コリン、第3ブチルヒドロキノ以外はオリエンタル酵母から購入した。

（２−２）遺伝子発現量の測定法
リアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現量の測定は以下の通り行った。
ISOGEN (株式会社ニッポンジーン) の説明書に従い、白色脂肪組織、肝臓、及び骨格筋からＲＮＡを抽出した。次に１μｇのRNAから、Reverse Transcription System キット（Promega, USA)を用いて、cDNAを調製した。次に、FastStart universal SYBR (登録商標) Green Master PCR キット 試薬 (Roche Diagnostics, Germany）の説明書に従い、下記実験にて対象とした各遺伝子について適切なプライマーを作成した。測定にはリアルタイムPCRシステム7700HT（Applied Biosytems, USA）を用い、前記cDNAを鋳型としてリアルタイムPCRを行った。各反応条件は前記PCRキット試薬に従った。RNA量の定量分析は、グリセアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）を標準として用い、比較Ｃｔ法により行った。

３．高脂肪食餌摂取時の肥満に対するSPEの効果の測定
以下の実施例で使用する動物には、低脂肪食（low fat diet；脂肪含量４％）又は高脂肪食（high fat diet；脂肪含量40％）を与えた。高脂肪食として、SPE無添加、1％SPE添加、1.5％SPE添加の３種類を調製した。以下実施例３において、低脂肪食を摂取した群をLFD摂取群、SPE無添加高脂肪食摂取した群をHFD摂取群、1％SPE添加高脂肪食を摂取した群をHFD+1SPE摂取群、1.5％SPE添加を摂取した群をHFD+1.5SPE摂取群と表わす。また、以下の表中では、それぞれ、LFD、HFD、HFD+1SPE、及びHFD+1.5 SPEと表わす。
使用動物は、生後７週齢のC57BL/6マウスを日本チャールス・リバー（株）より購入し、標準食で１週間、馴化飼育を行った後に、４群（ｎ＝９、３匹／ケージ）に分けて５週間の実験に供した。恒温（23±５℃）、12／12時間の明暗サイクルを維持して、自由に摂食させながら飼育した。

ノビレチン標準品及びタンゲリチン標準品、ヘマトキシリン、エオシン及びカルボキシメチルセルロースは、いずれも和光純薬工業（株）から購入した。経口糖負荷試験用のブドウ糖は、シグマ アルドリッチ社から購入し、ピオグリタゾンは武田薬品工業（株）から購入した。

（３−１）高脂肪食餌摂取時の、SPE摂取と体重変化及び摂食量の変化
マウスの体重は、週に１回測定し、摂食量は週２回測定した。各群のマウスの摂食量は１週間に２回測定した。摂食量は、すべての群について、24時間以内の摂食量／３匹／ケージとし、５週間の平均で計算した。SPE摂取と各群のマウスの体重変化及び摂食量の変化を、表２及び図２Ａ及び図２Ｂに示す。以下の各表において、LFD摂取群に対する有意差を^*で、HFD摂取群に対する有意差を^#でそれぞれ示す。

^**：p<0.01 ^***：p<0.005 ^＃：p<0.05。

５週間後、HFD摂取群は、LFD摂取群に対し、有意に高い体重増加量を示したが（ｐ＜0.05）、HFD+1SPE摂取群とHFD摂取群との間では有意差は見られなかった。HFD+1.5SPE摂取群は、HFD摂取群に対し、有意に低い値を示した（ｐ＜0.01）。
HFD摂取群の摂食量はLFD摂取群に比べて、有意に低くなっていた（ｐ＜0.01）。一方、HFD摂取群と対比すると、HFD+1SPE摂取群及びHFD+1.5SPE摂取群では、いずれも摂食量の変化に有意差は見られなかった。
以上より、1.0〜1.5％のSPEを飼料に添加しても、高脂肪食群では摂食量は抑制されないこと、1.5％SPE添加により、マウスの体重増加が有意に抑制されることが示された。摂食量に変化がないため、体重増加の抑制はカロリー摂取の減少によるものではないと考えられた（図２Ｂ参照）。

（３−２）高脂肪食餌摂取時の、SPE摂取が各組織重量に与える影響
実験終了後に、全群のマウスを解剖し、下記表３及び図２Ｃに示す組織及び臓器の各重量を測定した（平均値±標準誤差、ｎ＝９）。

^*：p<0.05，^**：p<0.01 ^＃：p<0.05。

５週間後の肝重量は、HFD摂取群とLFD摂取群との間に有意差はなく、また、HFD+1SPE摂取群及びHFD+1.5SPE摂取群とHFDとの間にも有意差は見られなかった。以上より、1.0〜1.5％のSPEを飼料に添加しても、肝重量には影響がないことが示された。
HFD摂取群は、LFD摂取群に対して、有意に低い腎臓重量を示した（ｐ＜0.01）。一方、HFD摂取群に対し、HFD+1SPE摂取群及びHFD+1.5SPE摂取群では、いずれも腎臓重量に有意な増減は見られなかった。
以上より、腎臓重量の低下はHFDの摂取によるものであり、1.0〜1.5％のSPEの添加によるものではないことが示された。
また、生殖器及び腎臓周辺から摘出した白色脂肪組織の重量は、HFD摂取群がLFD摂取群に対して有意に高い値を示した（ｐ＜0.05）。HFD+1SPE摂取群とHFD摂取群との間では有意差は見られなかったが、HFD+1.5SPE摂取群はHFD摂取群に対して、有意に低い値を示した（ｐ＜0.01）。以上より、SPEが高脂肪食投与時の白色脂肪組織重量の増加を抑制することが示された。

（３−３）SPE摂取による中性脂肪等の血中濃度の変化
実験終了後に、下記表４に示す項目の測定を行った。実験終了日（摂取開始５週間後）に、全マウスを16時間絶食させ、その後各マウスの尾静脈より、１ｍＬずつ採血した。得られた血液を、3,000×ｇ、４℃にて15分間遠心し血漿を得た。血漿中の脂質として、血中中性脂肪（TG）及び血中総コレステロール（T-CHO）の濃度を測定した（ｎ＝９）。
TGはトリグリセライドＥ−テストワコーで、T-CHOはコレステロールＥ−テストワコーで、また、血中ブドウ糖（Glucose）は、グルコースＣIIテストワコー（いずれも、和光純薬工業（株）製）で、それぞれ測定した。結果を表４及び図３Ａ及び図３Ｂに示す。

adipo：アディポネクチン ^*：p<0.05 ^＃：p<0.05。

HFD摂取群は、LFD摂取群に対して、TG、T-CHO及びブドウ糖の各濃度が、いずれも有意に高い値を示した（ｐ＜0.05）。また、HFD摂取群とHFD+1SPE摂取群との間ではTG濃度には有意差が見られなかったが、HFD+1.5SPE摂取群は、HFD摂取群に対して有意に低い値を示した（ｐ＜0.05）。一方、T-CHO濃度及びブドウ糖濃度は、HFD摂取群と、HFD+1SPE摂取群又はHFD+1.5SPE摂取群との間で、有意差は見られなかった。
以上より、1.0〜1.5％SPEの添加は、高脂肪食投与群の血中トリグリセリド濃度の増加を抑制するが、血中総コレステロール濃度及びブドウ糖濃度には影響しないことが示された。

血中アディポネクチン濃度は、酵素免疫測定法によるQuantikine Mouse Adiponectin/Acrp30（R&D Systems, USA）を用いて測定した。HFDとLFDとの間では、血中アディポネクチン濃度に有意差は見られず、HFD摂取群と、HFD+1SPE摂取群又はHFD+1.5SPE摂取群との間でも有意差は見られなかった。
以上より、1.0〜1.5％SPEの添加は、高脂肪食投与時のアディポネクチンの血漿中濃度に影響を及ぼさないことが示された。なお、実施例５に示すとおり、糖尿病モデルマウスにおいては、ノビレチンの投与により、アディポネクチンの血漿中濃度が、LFD摂取群のような健康なマウスの２〜３倍のレベルまで上昇した。

血中レプチン濃度は、酵素免疫測定法によるQuantikine Mouse leptin（R&D Systems, USA）を用いて測定した。HFD摂取群は、LFD摂取群に対して有意に高い血中レプチン濃度を示した（ｐ＜0.05）。また、HFD+1SPE摂取群の血中レプチン濃度はHFD摂取群の約半分の値を示したが、両群の間に有意差は見られなかった。一方、HFD+1.5SPE摂取群は、HFDに対して有意に低い値を示した（ｐ＜0.05）。
以上より、1.0〜1.5％SPEの添加は、高脂肪食投与時のレプチン抵抗性を抑制することが示された。このことは、レプチンの濃度が低下しても食欲のコントロールが正常に行われることを示す。

（３−４）SPE摂取が白色脂肪組織中の脂肪細胞に与える影響
実験終了後、各群のマウスから精巣上体の脂肪組織を摘出して切片を作成し、ヘマトキシリン及びエオシンにて染色した。これらの切片を200倍で顕微鏡観察し、単位面積当たりの細胞数（個）を数えて比較した（ｎ＝９）。結果を表５及び図４に示す。

^*：p<0.05 ^＃：p<0.05。

HFD投与群では、LFD摂取群に比べて、脂肪細胞の大きさが有意に大きくなっていた（ｐ＜0.05）（図４Ａ及び図４Ｂ）。一方、HFD摂取群とHFD+1SPE摂取群では脂肪細胞の大きさに有意差は見られなかったが（図４Ｃ）、HFD+1.5SPE摂取群では脂肪細胞の大きさが有意に小さくなっていた（ｐ＜0.05）（図４Ｄ）。このことから、SPEが高脂肪食摂取時に脂肪細胞の肥大化を抑制する作用を有することが示された。また、この結果はSPEが肥大化した白色脂肪組織、及び白色脂肪組織中の脂肪細胞を縮小する効果を示唆するものである。このような効果は後述実施例５の糖尿病モデルマウスでは見られないものである。すなわち、200mg/mlのノビレチンの投与では、糖尿病発症状態において肥大化した白色脂肪組織の脂肪細胞を縮小させることには至らないものの、高脂肪食餌摂取による肥満状態、すなわち糖尿病発症前においては、食餌量に対し１．５％のSPEを摂取することで白色脂肪組織の脂肪細胞を縮小させる効果があることを示すものである。
これらの観察結果は、SPEが脂肪細胞の分化誘導を促進し、肥大化した脂肪細胞を分裂させるか、あるいは肥大化した脂肪細胞を、新たに分化した脂肪細胞と置き換えることで、白色脂肪組織中の脂肪細胞の小型化を促し、糖尿病発症前段階のインシュリン抵抗性を改善したことを表すと考えられる。

（３−５）SPE摂取が白色脂肪組織内の遺伝子の発現に与える影響
各群のマウスの脂質生合成に関与するaP2、SREBP1c、SCD1、FAS、ACC1、FATP、DGAT1の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した（ｎ＝９）。結果を表６及び図３Ｃに示す。

^*：p<0.05 ^＃：p<0.05

HFD摂取群は、LFD摂取群に対し、実験終了後のaP2、FAS、FATP、DGAT1のmRNA発現量が有意に上昇していた（いずれもｐ＜0.05）。また、SREBP1c、SCD1、及びACC1のmRNA発現量には有意差は見られないが、発現量の増加傾向が認められた。
また、aP2、SCD1、ACC1、FATP及びDGAT1のmRNA発現量は、HFD投与群とHFD+1SPE投与群との間では有意差は見られなかったが、HFD+1.5SPE摂取群との間では発現量の有意な低下が見られた（ｐ＜0.05）。HFD+1SPE摂取群及びHFD+1.5SPE摂取群では、いずれもACC1のmRNA発現量の有意な低下が見られた（ｐ＜0.05）。なお、HFD+1SPE投与群及びHFD+1.5SPE投与群では、SREBP1c及びFASのmRNA発現量は低下傾向が見られたが、有意差はなかった。
このことから、SPEは高脂肪食摂取によって上昇した脂質生合成関連遺伝子群の発現を抑制する作用を有することが示された。

（１）試薬等
ノビレチン標準品及びタンゲレチン標準品、ヘマトキシリン、エオシン及びカルボキシメチルセルロースは、いずれも和光純薬工業（株）から購入した。経口糖負荷試験用のブドウ糖は、シグマ アルドリッチ社から購入し、ピオグリタゾンは武田薬品工業（株）から購入した。
（２）SPEからのノビレチン及びタンゲリチンの精製
実施例２で得られた80％メタノール画分の一部を濃縮し、100％メタノールで溶質濃度を900mg/mlに調整した。次いで、分取カラムクロマトグラフィーを下記の条件で行い、７つの画分を得た。

分取カラム：５C₁₈-AR-IIカラム（ナカライテスク社製）
溶出溶媒 ：70％メタノール
溶質濃度 ：900mg/mL
Injection volume：３ｍｌ
Fraction volume：１０ｍｌ
Flow rate：５ｍＬ／分
検出波長 ：UV215nm
レンジ ：20mV
内部標準として、ノビレチン及びタンゲレチン標準品を用い（濃度＝100 μg/ml）、各画分のピークの保持時間（RT:retention time (min)）と標準品のそれとを比較して、ノビレチン及びタンゲレチンを同定し、含有量を求めた。その後、各精製画分を大型ロータリーエバポレータにて乾燥させ、約165 mg（５５％）のノビレチンと135 mg（４５％）のタンゲレチンを精製した。

５．II型糖尿病モデルマウス（ob/ob）に対するノビレチンの効果
糖尿病モデルマウス及び実験系は下記の通りである。糖尿病モデルマウスとして、７週齢の雄性C57BL/6J‐ob/ob(以下、「ob/ob」ということがある)を日本チャールズリバー（株）から購入し、１群10匹で使用した。予備飼育及び実験中の飼育条件は実施例３と同様であり、飼料は前記CRF-1を使用した。
陰性対照群（図５〜図１０中、Vehicleと表す。また、以下「溶媒投与群」という。）には、0.3％CMC水溶液のみを0.01ml/g体重の分量で、５週間、連日、強制経口した。陽性対照群（図５〜図１０中、及び以下「P30投与群」という。）には、ピオグリタゾン３mgを、0.01ml/g体重の分量で投与できるよう、0.3％CMC水溶液に懸濁し、５週間、連日、強制経口投与した（投与量：30mg/kg体重/日）。
試料投与群（図５〜図１０中、及び以下、「No200投与群」という。）には、上記（１）で精製したノビレチン20 mgを、0.01ml/g体重の分量で投与できるよう、0.3％のカルボキシメチルセルロース（CMC）水溶液に懸濁し、５週間、連日、強制経口投与した（投与量：200mg/kg/日）。

（５−１）糖尿病モデルマウスのノビレチン摂取が体重等に与える影響
（５−１−１）ノビレチン摂取が体重等に与える影響
各群のマウスの体重、摂食量、白色脂肪組織重量、肝臓重量の測定、及び血中TG、血中T-CHO、血中アディポネクチンの各濃度測定は、上記実施例３と同様に行い、その結果を表７に示す（ｎ＝10）。また、特にアディポネクチンの結果について図８Ａに表す。
また、血中インスリン濃度は、以下のように測定した。実験終了日に、各群のマウスの尾静脈より１ｍLずつ採血を行った。得られた血液を、４℃にて、3,000×ｇで15分間遠心分離し、血漿を得た。血中インスリン濃度は、酵素免疫測定法によるレビスインスリン−マウス（Ｕタイプ）（（株）シバヤギ製）を用いて測定した。

^*：p<0.05 ***：p<0.005

いずれの群においても、体重増加量、摂食量、白色脂肪組織重量、及び肝重量に有意差は見られず、上記濃度のノビレチンの摂取は、糖尿病モデルマウスの体重増加、摂食量、白色脂肪細胞重量、及び肝重量には影響を与えないことが示された。
血中TG濃度は、溶媒投与群に対し、No200投与群及びP30投与群のいずれにおいても低下していたが、有意差は見られなかった。このことから、200mg/kgのノビレチンを一定期間摂取することにより、糖尿病モデルマウスの血中TG濃度は、ピオグリタゾンを摂取したときと同等程度に改善されることが示された。

血中T-CHO濃度は、溶媒投与群に対し、P30投与群では有意に低下していた（ｐ＜0.05）が、溶媒投与群とNo200投与群との間には有意差は見られなかった。このことから、上記濃度のノビレチン摂取は、血中T-CHO濃度に影響しないことが示された。
血中インスリン濃度は、溶媒投与群に対し、No200投与群及びP30投与群では低下傾向が認められたが、有意差は見られなかった。一方、血中アディポネクチン濃度は、P30投与群は溶媒投与群の2.5倍以上高くなっていたが、No200投与群はそれほど大きな上昇は見られなかった。
このことから、上記濃度のノビレチンを一定期間摂取すると、血中インスリン濃度は、ピオグリタゾンを摂取時と同等程度に改善される傾向があるが、血中アディポネクチン濃度はピオグリタゾンほど上昇させないことが示された。

（５−１−２）ノビレチン摂取が空腹時の血糖値に与える影響
投与開始２週間後及び５週間後に、空腹時血糖値を測定した（ｎ＝10）。血中ブドウ糖濃度の測定は上記実施例１のように行った。結果を表８及び図５Ａに示す。

^*：p<0.05

投与開始２週後及び５週後ともに、No200投与群は溶媒投与群に対して有意に低い値を示し（ｐ＜0.05）、ノビレチンが糖尿病モデルマウスの空腹時血糖値を低下させる作用を有することが示された。
（５−１−３）ノビレチン摂取が耐糖能に与える影響
ノビレチン等を投与した糖尿病モデルマウス(ob/ob)に対する経口糖負荷試験（OGTT）を行い、耐糖能に与える影響を検討した。
投与開始４週目に、各投与群のマウスを16時間絶食させ、その後、ブドウ糖を２g/kg体重で強制経口投与した。ブドウ糖投与後、０分、30分、60分及び120分の時点で、各マウスの尾静脈より１mLずつ採血を行った。得られた血液を、４℃にて、3,000×ｇで15分間遠心分離し血漿を得た（ｎ＝10）。血中ブドウ糖濃度は、上記実施例１と同様に測定した。結果を表９及び図５Ｂに示す。

^*：p<0.05 ^**：p<0.01。

ブドウ糖投与直後では、溶媒投与群に対して、No200投与群及びP30投与群のいずれにおいても有意に低い血糖値を示した（ｐ＜0.05）。投与30分後でも、同様であった（ｐ＜0.05及びｐ＜0.005）。このことから、ノビレチンは、糖尿病モデルマウスの耐糖能を改善する作用を有することが示された。
（５−２）ノビレチン摂取と白色脂肪組織及び肝臓内の遺伝子の発現量
ノビレチンの摂取が、白色脂肪組織及び肝臓内の遺伝子のmRNA発現量に、どのような影響を与えるかを測定した（ｎ＝10）。結果を表10、並びに図６Ａ、図７Ａ，Ｂ、図８Ｂ、図９Ａ〜Ｃ、及び図１０Ａ〜Ｄに示す。

表中［Ｗ］は白色脂肪組織を、［Ｌ］は肝臓を表す。
^*：p<0.05、^**：p<0.01、^***：p<0.005。

５週間の投与期間終了後、リアルタイムRT-PCR法により、表10に示す各遺伝子のmRNA発現量を測定した。リアルタイムRT-PCRは、ISOGEN（（株）ニッポンジーン製）の説明書に従い、白色脂肪組織及び肝臓からRNAを抽出した。次に１μｇのRNAから、Reverse Transcription System キット（Promega社製, USA)を用いて、cDNAを調製した。ついで、FastStart universal SYBR (登録商標) Green Master PCR キット 試薬 (Roche Diagnostics社製, Germany）の説明書に従い、上記各遺伝子について適切なプライマーを作成した。
測定にはリアルタイムPCRシステム7700HT（Applied Biosytems社製, USA）を用い、前記cDNAを鋳型としてリアルタイムPCRを行った。前記PCRキット試薬に従って各反応条件を設定した。RNA量の定量分析は、グリセアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）を標準として用い、比較Ｃｔ法により行った。

溶媒投与群に対して、No200投与群では、GLUT4及びアディポネクチンの発現量が有意に高くなっていた（ｐ＜0.01）。溶媒投与群とP30投与群との間には、有意差は見られなかった。このことから、既知のインスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンでは見られない白色脂肪組織内のGLUT4遺伝子の発現を促進する作用を、ノビレチンが糖尿病モデルマウスで示すことが示された。また、Adiponectin遺伝子の発現促進を介して、アディポネクチンの分泌を促進する作用を有することが示された。
糖新生遺伝子であるPEPCKの発現量は、溶媒投与群に対し、No200投与群及びP30投与群のいずれもが有意に低い値を示した（ｐ＜0.05）。また、G6Paseの発現量も同様であった（ｐ＜0.005）。このことから、ノビレチンは糖尿病モデルマウスにおいて糖新生関連遺伝子群の発現を抑制する作用を有することが示された。

溶媒投与群に対し、No200投与群では、TNF-α遺伝子の発現量が有意に低下した（ｐ＜0.005）が、P30投与群では若干の上昇が見られた。また、MCP-1及びIL-6遺伝子の発現量は、溶媒投与群に対して、No200投与群及びP30投与群のいずれも有意に低下していた（ｐ＜0.005）。
以上より、ノビレチンは、糖尿病モデルマウスにおいてTNF-α、MCP-1、IL-6等の悪玉アディポカイン遺伝子群の発現を抑制する作用を有することが示された。

PPARγの発現量は、溶媒投与群とP30投与群との間では有意差は見られなかったが、No200投与群では顕著に上昇していた（ｐ＜0.005）。aP2の発現量は、溶媒投与群に対して、P30投与群で顕著な上昇が見られたが（ｐ＜0.005）、No200投与群は、P30投与群に対して有意に低い値を示した（ｐ＜0.05）。一方、LPLの発現量は、No200投与群で上昇が見られ、P30投与群で低下が見られたが、いずれも有意差は見られなかった。また、Perilipinの発現量は、No200投与群で、溶媒投与群に対して有意な上昇が見られたが、P30投与群と溶媒投与群との間には有意差は見られなかった。
以上より、ノビレチンは、糖尿病モデルマウスにおいてPPARγの発現を促進し、脂肪細胞の働きを介して血中脂質量を適切に制御する特徴的な作用を有することが示された。また、SPEは脂質蓄積制御関連遺伝子を抑制し、血中中性脂肪濃度を低下させることが示された。また、ノビレチンはPPARγの発現を促進し、これによってAdiponectinの発現を促進することによって、アディポネクチンの分泌を促進することが示された。

以上より、ノビレチンはチアゾリジン系血糖降下剤と異なり、PPARγの機能を促進するが、脂質生合成亢進という副作用は起こりにくいことが示された。
（５−３）ノビレチン摂取とGLUT4タンパク発現量
実験終了後、上記実施例１の通りに白色脂肪組織及び骨格筋を摘出し、ウェスタンブロッティング法によりGLUT４タンパクの発現量を検出した。GLUT4タンパクの発現量は、Na+／K+ ATPase α-1タンパクを内部標準として定量した。結果を、表11、並びに図６Ｂ及び図６Ｃに示す。

溶媒投与群に対し、No200投与群では約1.7倍に、また、P30投与群では約2.2倍に発現量が増大していた。このことから、ノビレチンは、糖尿病モデルマウスにおいて白色脂肪組織内のGLUT4たんぱく質の発現を促進する作用を有することが示された。
また、上述した通り、ノビレチン摂取時に白色脂肪組織中でGLUT4が高発現し、ブドウ糖の取り込み増加に伴う脂質合成が活発化したとしても、中性脂肪や総コレステロールの血中濃度増加、白色脂肪組織の重量増加、インスリンの血中濃度変化、肝臓重量の増加、体重の増加及び摂食量の変化などの副作用は生じないことが示された。
溶媒投与群に対し、No200投与群では約６倍、P30投与群では約３倍に発現量が増大していた。このことから、ノビレチンは、糖尿病モデルマウスの骨格筋内のGLUT4タンパクの発現を促進する、特に優れた作用を有することが示された。

６．高脂肪食摂取による肥満誘導後のマウスに対するタンゲリチンの効果
６周齢の雄性C57BL/6マウスを１週間予備飼育し（−９〜−８週）、その後、３群に分けた。１群にはLFDを、他の２群にはHFDを８週間与えた（−８〜＋５週）。８週目（15週齢）以降13週目まで、各群に以下の薬剤を５週間にわたって連日強制経口投与した（以下、実施例６においてLFD摂取群及びHFD摂取群）という。）。LFD、HFDの組成は実施例３と同等である。
LFD摂取群（ｎ＝８）及びHFD摂取群（ｎ＝11）には、0.01ml/g体重の分量で、0.3％CMC水溶液を与えた。また、HFD摂取に加えて、0.01ml/g体重の分量で投与できるよう0.3％のCMC溶液に懸濁したタンゲリチンを、200mg/kg/日の分量で投与した群（ｎ＝11）を「T200投与群；略号HFD+T200」と表わす。上記３群の摂食及び薬剤投与のスケジュールを図１２Ａに模式的に表す。

（６−１）タンゲリチン摂取が体重、摂食量に与える影響
結果を表12に示す。実験終了後の体重増加量は、HFD摂取群がLFD摂取群に対して有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）。また、HFD摂取群とT200投与群との間には、有意差は見られなかった。
各群のマウスの摂食量は１週間に２回測定した。１回の測定は、24時間以内の摂食量／３匹／ケージとし、５週間の平均を求めた。HFD摂取群は、LFD摂取群に比べて、摂食量が有意に低くなっていた（ｐ＜0.005）。また、HFD摂取群とT200投与群との間では、摂食量の変化に有意差は見られなかった。

^***：p<0.005。

このことから、高脂肪食に200mg/kgでタンゲリチンを添加しても、体重増加には影響を及ぼさないこと、及び摂食量に影響を与えないことが示された。摂食量に変化がなかったことから、タンゲリチンのみでは食餌行動や代謝に与える影響は極めて小さいことが示唆された。

（６−２）タンゲリチン摂取が組織重量に与える影響
実験終了後に各群のマウスを解剖して臓器等を取り出し、それぞれの重量を測定した。白色脂肪組織は、後腹膜及び精巣上体の周辺から摘出した。結果を表13に示す。

^*：p<0.05，^***：p<0.005。

実験終了後のHFD摂取群の白色脂肪組織重量は、LFD摂取群と比べて有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）。また、HFD摂取群とT200投与群との間には、後腹膜白色脂肪組織、精巣上体白色脂肪組織のいずれも重量に有意な変化は見られず、前記白色脂肪組織の重量の合計値にも有意な変化は見られなかった。
HFD摂取群の肝重量と、LFD摂取群の肝重量との間には、有意差は見られず、HFD摂取群とHFD+T200投与群との間でも同様であった。一方、HFD摂取群の腎臓重量は、LFDに対して有意に高い値となっていた（ｐ＜0.05）が、HFD摂取群とT200投与群では、腎臓重量に有意な変化は見られなかった。
以上より、高脂肪食摂取時に200mg/kgでタンゲリチンを飼料に添加しても、白色脂肪組織重量及び肝重量には影響を及ぼさないことが示された。また、高脂肪食の摂取によって増加した腎臓重量がさらに増大することはないことが示された。

（６−３）タンゲリチン摂取が中性脂肪等の血中濃度に与える影響
実験終了後に空腹時の血中中性脂肪濃度等を、投与開始時、投与開始２週間後、及び５週間後の時点で測定した。結果を表14及び表15に示す。
血中中性脂肪（ＴＧ）濃度の測定は、実施例１と同様に行った。結果を表14に示す。いずれの時点においてもLFD摂取群に対し、HFD摂取群は有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）が、HFD摂取群とT200投与群との間には有意差は見られなかった。

^*：p<0.05。

血中総コレステロール（T-CHO）濃度の測定は、実施例１と同様に行った。結果を表15に示す。いずれの時点においてもLFD摂取群に対し、HFD摂取群は有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）が、HFD摂取群とT200投与群との間には有意差は見られなかった。
以上から、200mg/kgでタンゲリチンを食餌に添加しても、高脂肪食餌摂取時の血中TG濃度、及び血中総コレステロール濃度に影響を及ぼさないことが示された。

^***：p<0.005。

（６−４）タンゲリチン摂取が空腹時の血糖値に与える影響
ブドウ糖の血中濃度の測定は、実施例１と同様に行った。以下に記述する実験の結果は、表16に示す。表16は高脂肪食餌摂取時の血中ブドウ糖濃度(mg/dl)に対するタンゲリチンの効果を表す。いずれの時点においても、LFD摂取群に対し、HFD摂取群は有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）。また、HFD摂取群に対し、T200投与群は、投与期間開始５週間後では有意な変化は見られなかったが、投与期間開始２週間後では有意に低い値を示していた（ｐ＜0.005）。このことから、タンゲリチンは、高脂肪食餌摂取による空腹時血糖値の上昇を抑制する作用を有することが示された。

^***：p<0.005 ^＃：p<0.05

（６−５）タンゲリチンの摂取が耐糖能に与える影響
経口糖負荷試験（OGTT）を実施例１と同様に行った。結果を表17に示す。いずれの時点においても、LFD摂取群に対し、HFD投与群が有意に高い血糖値を示した（ｐ＜0.005〜0.005）が、HFD摂取群とT200投与群との間には有意差は見られなかった。このことから、200mg/kgでタンゲリチンを食餌に添加しても、高脂肪食餌摂取時の耐糖能に影響を及ぼさないことが示された。

^*：p<0.05，^**：p<0.01 ^***：p<0.005

（６−６）タンゲリチンが糖輸送体及び／又は転写因子の発現に与える影響
実施例１と同様に、実験終了後に白色脂肪組織を取り出し、リアルタイムRT-PCR法によりGLUT4遺伝子及びPPARγ遺伝子のmRNA発現量を測定した。HFDを１としたときの発現量の比を、表18及び図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。
白色脂肪組織内のGLUT４及びPPARγのmRNA発現量を比較すると、HFD摂取群は、LFD摂取群及びT200投与群に対して高くなっていた。一方、骨格筋内のGLUT4のmRNAの発現量は、HFD摂取群がLFD摂取群よりも低くなっていたが、T200投与群は高くなっていた。
このことから、タンゲリチンは高脂肪食摂取によって上昇した白色脂肪組織内のGLUT4遺伝子及びPPARγ遺伝子の発現を抑制する作用を有すること、及び高脂肪食摂取によって低下した骨格筋内のGLUT遺伝子の発現を回復する作用を有することが示された。

W：白色脂肪組織 M：骨格筋

このことは、タンゲリチンは高脂肪食摂取時に骨格筋への血糖の取り込みを促して血糖値を低下させ、また、白色脂肪組織への血糖の取り込みを抑制することによって脂肪細胞の肥大化を抑制することを示唆する。
以上より、白色脂肪組織ならびに骨格筋中のGLUT4遺伝子の発現量は、投与されたインスリン抵抗性改善剤、または糖尿病または生活習慣病の予防及び／又は治療剤のスクリーニングにとって有効な指標であること考えられる。

７．高脂肪食摂取による肥満誘導後のマウスに対するノビレチンの効果
６周齢の雄性C57BL/6マウスを１週間予備飼育し（−９〜−８週）、その後、４群に分けた（各群のｎ＝９）。１群にはLFDを、他の３群にはHFDを８週間与えた（−８〜＋５週）。８週目（15週齢）以降13週目まで、各群に以下の薬剤を５週間にわたって連日強制経口投与した。以下、実施例７において上記LFDを摂取した群をLFD摂取群といい、上記HFDを摂取しノビレチンを投与しなかった群をHFD摂取群という。LFD、HFDの組成は実施例３と同等である。
LFD摂取群及びHFD摂取群には、0.01ml/g体重の分量で、0.3％CMC水溶液を与えた。また、以下実施例７において、HFD摂取に加えて、0.01ml/g体重の分量で投与できるよう0.3％のCMC溶液に懸濁したノビレチンを、10mg/kg/日の分量で投与した群を、「No10投与群；略号HFD+No10」と表わし、また同様にして、100mg/kg/日の分量で投与した群を「No100投与群；略号HFD+No100」と表わす。上記４群の摂食及び薬剤投与のスケジュールを図１２Ａに模式的に表す。

（７−１）肥満誘導後のマウスの体重及び摂食量に対するノビレチンの影響
各群の体重増加量を表19及び図１２Ｂに示す。表中、[最終増加]は０〜＋５周目の増加量を示す。高脂肪食摂取による肥満誘導後、HFD摂取群はLFD摂取群に対し、有意に高い体重を示し（ｐ＜0.005）、体重増加量も同様であった。また、HFD摂取群に対し、No10投与群では体重増加量に有意な変化は見られなかったが、No100投与群では有意に低い値となっていた（ｐ＜0.05）。このことから、ノビレチンには高脂肪食摂取による肥満誘導後の体重増加を抑制する作用を有することが示された。

^*：p<0.05 ^***：p<0.005 ^＃：p<0.05。

実験期間中の摂食量の変化を表20及び図１２Ｃに示す。各群のマウスの摂食量は、薬剤の投与開始時から数えて１〜８日目（０週目）まで毎日測定した。24時間以内の摂食量を各群のケージごとに測定し、マウス１匹当たりの摂食量の平均値（ｇ）を求めた。０日目の値は投与開始前日の値を示す。投与開始２週目以降は、１週間に２回測定した。[最終平均]は５週間の平均値を表わす。
HFD摂取群は、０週目の摂食量がLFD摂取群に対して有意に低い値を示し（ｐ＜0.005）、最終平均もHFD摂取群はLFD摂取群に対して有意に低い値を示した（ｐ＜0.005）。

^***：p<0.005 ^＃：p<0.05。

また、HFD摂取群に対して、No100投与群の４日目の摂食量が有意に低い値を示した（ｐ＜0.05）が、その他の時点では、No10投与群とNo100投与群との間には有意差は見られなかった。さらに、最終平均で見ると、HFD摂取群、No10投与群、No100投与群との間には、有意差は見られなかった。
以上より、高脂肪食による肥満誘導マウスに100mg/kgでノビレチンを経口投与した場合、投与初期には摂食を抑制するが、投与期間全体の摂食量に影響を与えるものではないことが示された。このことは、体重増加量の減少が、主として摂食量の減少に起因するものではないことを示唆する（図１２Ｂ及び図１２Ｃ参照）。

（７−２）高脂肪食摂取による肥満誘導後のノビレチン摂取が各組織重量に与える影響
実験終了後、マウスを解剖して表21に示す臓器等を摘出し、重量をそれぞれ測定した。結果を表21及び図１３Ａに示す。
肝重量及び腎臓重量は、いずれの群の間でも有意差は見られなかったが、脂肪組織の重量は、HFD摂取群がLFD摂取群に対して有意に高くなっていたが（ｐ＜0.005）、No100投与群はHFD摂取群に対し有意に低い値を示した（ｐ＜0.05）。
以上より、10〜100mg/kgでノビレチンを食餌に添加しても、肝臓及び腎臓の重量には影響を及ぼさないが、100mg/kgで投与すると白色脂肪の増加が抑制されることが示された。

^***：p<0.005 ^＃：p<0.05。

（７−３）高脂肪食摂取による肥満誘導後のノビレチン摂取が血中脂質濃度に与える影響
上記の実験終了後、空腹時の血中の中性脂肪、総コレステロール、ブドウ糖、アディポネクチンの各濃度、及び満腹時の血中中性脂肪、血中総コレステロール、ブドウ糖の各濃度を、実施例１と同様に測定した。表22中、Adiponectinの相対濃度は、白色脂肪組織の総重量に対する血中アディポネクチンの比濃度を表す。
結果を表22に示す。また血中中性脂肪（トリグリセリド）、血中総コレステロール、血中ブドウ糖の結果を図１３Ｂに示す。LFD摂取群とHFD摂取群の中性脂肪と総コレステロールの血中濃度が、実施例３の（３−３）と比べ著しく小さい値となっているが、これはマウス週齢及びHFDによる肥満誘導期間の違いによるものと思われる。

*1を除き単位はmg/dl，*1 Adiponectin 単位はμg/ml，*2 Adiponectinの相対濃度 単位はμg/ml/g，^***：p<0.005 ^＃：p<0.05。

HFD摂取群の空腹時血中ブドウ糖濃度は、LFD摂取群に対し、有意に高い値となっていた（ｐ＜0.005）。HFD摂取群とNo10投与群との間には有意差は見られなかったが、No100投与群との間は有意に低い値を示した（ｐ＜0.005）。なお、満腹時血中ブドウ糖濃度は、各群の間で有意差は見られなかった。
空腹時の血中TG濃度は、LFD摂取群に対し、HFD摂取群が有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）が、No10投与群及びNo100投与群との間には有意差は見られなかった。なお、満腹時の血中TG濃度は、各群の間で有意差は見られなかった。
血中T-CHO濃度は、空腹時及び満腹時ともに、LFD摂取群に対し、HFD摂取群が有意に高い値を示した（ｐ＜0.005）。また、HFD摂取群と、No10投与群及びNo100投与群との間には、空腹時及び満腹時の血中T-CHO濃度に有意差は見られなかった。

以上より、0〜100mg/kgのノビレチンの投与は、高脂肪食摂取による肥満誘導後の空腹時血糖値の上昇を抑制するが、摂食によって血糖値が上昇したときには影響を与えないことが示された。このことは、ノビレチンが、消化器系内のデンプンや多糖類のブドウ糖への消化過程、またはブドウ糖の吸収過程を抑制することで、結果として血糖値レベルを抑制するのではなく、白色脂肪組織、肝臓、腎臓以外のいずれかの器官へのブドウ糖の吸収を促進することで、血糖値レベルを低下させていることを示す。また、高脂肪食摂取による肥満誘導後の、血中TG及びT-CHO濃度には影響を与えないことが示された。

HFD摂取群では、LFD摂取群に対し、高脂肪食摂取による肥満誘導後の血中アディポネクチン濃度は上昇する傾向を示したが、有意差は見られなかった。また、HFD摂取群と、No10投与群又はNo100投与群との間でも、いずれも有意差は見られなかった。
上記の測定値より、アディポネクチンの相対濃度を、白色脂肪組織の総重量に対する血中アディポネクチンの比濃度として求めた。HFD摂取群では、LFD摂取群に対して、血中アディポネクチンの比濃度が有意に低下していた。また、HFD摂取群に対して、No10投与群では有意差は見られなかったが、No100投与群では有意に高い値を示した。
高脂肪食摂取による肥満誘導後の血中アディポネクチンの濃度には変化は見られないが、血中アディポネクチンの比濃度が上昇したことから、白色脂肪組織の単位重量当たりのアディポネクチンの産生量は、10〜100mg/kgのノビレチン投与によって増加したことが示された。
以上から、高脂肪食摂取による肥満誘導を行うと、インスリン抵抗性の惹起を伴う脂肪細胞の肥大化を招き、これが白色脂肪組織重量あたりのアディポネクチン産生量を低下させること、ノビレチンは、低下したアディポネクチン産生量を回復させる作用を有することが示された。また、特許文献３及び実施例５に示されるような、ノビレチンによる血中アディポネクチンの発現が、通常時の２〜３倍に上昇する現象は、糖尿病の発病時に限定されることが示された。

（７−４）高脂肪食摂取による肥満誘導後のノビレチン摂取が耐糖能に与える影響
糖負荷実験は、上記実施例２と同様に行った（ｎ＝９）。結果を表23及び図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。

^***：p<0.005 ^#：p<0.05
AUC：0〜120分までの血中ブドウ糖濃度曲線の積分値を、HFDを100としたときの百分率（％）で表す。

ブドウ糖投与直後、15分後、30分後、60分後、120分後のそれぞれの時点で、LFD摂取群に対し、HFD摂取群では有意に血中ブドウ糖濃度が上昇していた（いずれもｐ＜0.05）。HFD摂取群とNo10投与群との間では、いずれの時点でも有意差は見られなかった。一方、HFD摂取群とNo100投与群との間では、15分後、60分後の時点でそれぞれ、血中ブドウ糖濃度が有意に低くなっていた（いずれもｐ＜0.05）。
また、血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）で比較すると、＋LFD摂取群に対してHFD摂取群で有意な上昇が見られた（ｐ＜0.005）。HFD摂取群とNo10投与群との間では有意差は見られなかったが、No100投与群との間では有意差が見られた（ｐ＜0.05）。
以上より、10〜100mg/kgのノビレチン投与は、高脂肪食摂取による肥満誘導後のマウスの耐糖能を改善することが示された。

（７−５）高脂肪食摂取による肥満誘導後のノビレチン摂取が脂肪細胞の大きさに与える影響
実験験終了後、マウス精巣上体の脂肪組織を摘出して切片を作成し、ヘマトキシリン及びエオシンにて染色した（ｎ＝９）。これを、200倍で顕微鏡観察し、顕微鏡撮影視野範囲内に見える細胞の大きさを比較した。結果を図１５Ａ〜図１５Ｄに示す。

HFD摂取群（図１５Ｂ）は、LFD摂取群（図１５Ａ）と比較して、実験終了後の脂肪細胞の大きさが大きくなっていた。また、HFD摂取群とNo10投与群（図１５Ｃ）との間では大きな差は見られなかったが、No100投与群（図１５Ｄ）は脂肪細胞が小さくなっていた。
以上より、ノビレチンは高脂肪食餌摂取による肥満誘導後において白色脂肪組織の脂肪細胞を縮小する作用を有することが示された。この効果は、実施例２の糖尿病モデルマウスでは見られなかった。すなわち、200mg/kgのノビレチンの投与では、糖尿病発症状態のときに肥大化した白色脂肪組織の脂肪細胞を縮小させることには至らないが、高脂肪食摂取による肥満状態、すなわち糖尿病発症前であれば、10〜100mg/kgのノビレチンの投与で白色脂肪組織の脂肪細胞を縮小させる効果のあることが示された。
これらの観察結果は、ノビレチンが脂肪細胞の分化誘導を促進し、肥大化した脂肪細胞を分裂させるか、あるいは肥大化した脂肪細胞を、新たに分化した脂肪細胞と置き換えることで、白色脂肪組織中の脂肪細胞の小型化を促し、糖尿病発症前段階のインスリン抵抗性を改善したことを表すと考えられる。

（７−６）高脂肪食摂取による肥満誘導後のノビレチン摂取と白色脂肪組織中の遺伝子発現
下記表24に示す高脂肪食餌摂取による肥満誘導後の、マウス脂質生合成関連遺伝子、及びその他の遺伝子の発現をmRNAの量で測定し、これらの遺伝子の発現に対するノビレチンの効果を検討した（ｎ＝９）。各遺伝子の発現量は、HFDを１とした時の発現量の比で表した。結果を表24に示す。

^*：p<0.05 ^***：p<0.005 ^#：p<0.05 ^##：p<0.01 ^###：p<0.005。

LFD摂取群に対し、HFD摂取群は、SCD1、FAS、ACC1、Glut4のmRNA発現量が有意に低い値を示した（SCD1及びGlut4ではｐ＜0.05，FAS及びACC1ではｐ＜0.005）。また、HFD摂取群は、LFD摂取群に比べて、Adiponectin、TNF-α、MCP-1及びPPARγのmRNA発現量が有意に高い値を示した（Adiponectin、TNF-α及びPPARγでは＜0.05、MCP-1ではｐ＜0.005）。
また、HFD摂取群に対し、HFD+No10及びNo100投与群では、SCD1、FAS、ACC1、DAGT1、PPARγ、及びSREBP1-cのmRNA発現量が有意に高い値を示した（DAGT1及びPPARγではｐ＜0.01、SCD1、FAS、ACC1、SREBP1-c）。HFD摂取群とNo10投与群との間にはTNF-αのmRNAの発現量に有意差は見られなかったが、No100投与群は有意に低い値を示した。
以上より、ノビレチンは白色脂肪組織の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが分かった。

タンゲリチンには空腹時血糖値（血中ブドウ糖濃度）を下げる効果があるが、耐糖能不全に対しては必ずしも効果が見られるわけではない。ノビレチンには空腹時血糖値及び耐糖能不全の双方に対して効果がある。５０重量％のノビレチン及び５０重量％のタンゲリチンからなる組成物は前記脂質異常を抑制できることが分かる。

本発明は、医薬製剤、機能性食品、健康食品等の製造及び開発の分野で有用である。

【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は、ミカン区柑橘類抽出物を有効成分とするメタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤、上記抽出物を含むメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療のための医薬製剤、及びメタボリックシンドロームの予防のための機能性食品及び健康食品に関する。
背景技術
［０００２］
肥満によって引き起こされる、高血糖、高血圧、脂質異常等の症状の増加は世界各国の共通の社会問題である。内臓脂肪組織の肥大化によって引き起こされ、体重の増加を招く内蔵脂肪型肥満に加えて、高血糖、高血圧、脂質異常のうち２つ以上を合わせ持った状態を「メタボリックシンドローム（内蔵脂肪症候群）」といい、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）がこの病態の診断基準を公表している。
高血糖を指標として判定される糖尿病は、大まかに１型と２型に分けられる。１型は、主として遺伝的な要因により血糖値を正常に保つはずのホルモンであるインスリンの分泌が完全に失われている病態で、日本人の糖尿病患者の５〜１０％を占めている。２型は、主として後天的にインスリンの感受性が失われている病態（インスリン抵抗性）であり、日本人にはインスリンの分泌低下を伴う症例も見られる。糖尿病患者の９０〜９５％を占めており、メタボリックシンドロームによって誘発される糖尿病は２型に該当する。
［００１１］
過食等の生活習慣が、腎臓等の臓器に負担をかけることが糖尿病の発症の一因であることは知られているが、最近の研究によれば、肥満の原因である脂肪細胞の肥大化が、脂肪組織内の遺伝子レベルでの変化を惹起し、血中のサイトカインやその他のシグナル因子の濃度変化を通じて肝臓や骨格筋を含む全身に影響を及ぼし、糖尿病の発症を促すことが分かってきた。糖尿病治

【０００５】
さらに、こうした物質が安全性の高いものであれば、医薬製剤として提供できるだけでなく、機能性食品又は健康食品としても提供することが可能となり、メタボリックシンドローム患者の発生を予防するという効果が期待できる。
したがって、こうした物質を提供することに対して、高い社会的要請があった。
課題を解決するための手段
［００１１］
本発明は、上記のような状況の下で完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、内臓脂肪型肥満、高血糖、脂質異常を関連付ける複雑なメカニズムを踏まえつつ、安全性と副作用とに留意しながら、メタボリックシンドロームの治療に効果のある成分のスクリーニング方法の開発を進めた。その結果、骨格筋組織または骨格筋細胞中の糖輸送体遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することで、メタボリックシンドロームの治療に効果のある組成物のスクリーニングができることを見出し、このスクリーニングを行うことによって、糖輸送体遺伝子に対する効果より特徴付けられる柑橘類抽出物の分画に、従来知られていなかった顕著な作用があることを発見し、本発明を完成したものである。
［００１２］
本発明の第１の態様は、糖尿病発症前であるが、内蔵脂肪型肥満、高血糖及び脂質異常を呈している患者に対して投与する、内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物であって、（１）前記組成物の乾燥重量に対して７０〜１００重量％のノビレチンを含有するミカン区（Ａｃｒｕｍｅｎ（ＶＩＩ）ｓｅｃｔｉｏｎ）柑橘類の果皮抽出画分を有効成分として含み、（２）５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する、内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物である。
ここで、前記ミカン区（Ａｃｒｕｍｅｎ（ＶＩＩ）ｓｅｃｔｉｏｎ）柑橘類は、シークワーサー（Ｓｈｉｉｋｕｗａｓｈａ；Ｃ．ｄｅｐｒｅｓｓａ）であり、前記果皮抽出画分中のノビレチン含量は、前記組成物の乾燥重量に対して９５〜１００重量％であることが好ましく、前記果皮抽出画分は、その乾燥重量換算で、１日当たり１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与することが好ましい。

【０００６】
以上の組成とすることによって、上記内蔵周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物は、骨格筋組織又は骨格筋細胞内の糖輸送体遺伝子のタンパク質の発現量増加作用と、血中ブドウ糖濃度低下作用と、耐糖能改善作用と、を奏することができる。
［００１３］
本発明の第２の態様は、上記医薬組成物を有効成分として含有し、前記有効成分の摂取量が５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である、機能性食品である。また、本発明の第３の態様は、上記の医薬組成物を、有効成分として含有し、前記有効成分の摂取量は５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である、健康食品である。本発明の第４の態様は、上述した医薬組成物を含有し、前記有効成分の摂取量が５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日である、メタボリックシンドローム医薬医薬製剤である。
［００１４］
本発明の第５の態様は、内蔵脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈する患者に対して投与する、肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物であって、（１）前記組成物の乾燥重量に対して４５〜５５重量％のノビレチンと４５〜５５重量％のタンゲリチンとを含有するミカン区（Ａｃｒｕｍｅｎ（ＶＩＩ）ｓｅｃｔｉｏｎ）柑橘類果皮抽出画分を含み、（２）１．０〜６．０ｇ／ｂｏｄｙ／日の容量で投与する、内蔵周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物である。
ここで、前記ミカン区（Ａｃｒｕｍｅｎ（ＶＩＩ）ｓｅｃｔｉｏｎ）柑橘類は、シークワーサー（Ｓｈｉｉｋｕｗａｓｈａ；Ｃ．ｄｅｐｒｅｓｓａ）であり、前記果皮抽出画分は、その乾燥重量換算で、１．０〜６．０ｇ／ｂｏｄｙ／日の用量で経口的に摂取することが好ましい。
以上の組成とすることによって、上記内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物は、血中トリグリセリド濃度低下作用と、体重抑制作用と、骨格筋組織又は骨格筋細胞内の糖輸送体遺伝子のタンパク質又はｍＲＮＡの発現量増大作用と、レプチン抵抗性改善作用と、を奏することができる。
［００１５］
本発明の第６の態様は、上述した医薬組成物を有効成分として含有し、前記有効成分の摂取量は０．５〜８．０ｇ／ｂｏｄｙ／日である、機能性食品である

【０００７】
。また、本発明の第７の態様は、上述した医薬組成物を有効成分として含有し、前記有効成分の摂取量は０．５〜８．０ｇ／ｂｏｄｙ／日である、健康食品である。本発明の第８の態様はまた、上述した医薬組成物を含有し、前記有効成分の摂取量は０．５〜８．０ｇ／ｂｏｄｙ／日である、メタボリックシンドローム治療用医薬製剤である。
［００１６］
本発明の第９の態様は、下記の工程（１）〜（４）を備える、内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用物質のスクリーニング方法である。
（１）高脂肪食摂取による肥満を誘導した非ヒト哺乳動物に、所定量の被験物質を所定期間投与した後に骨格筋を採取し、得られた骨格筋から全ＲＮＡ画分を抽出する全ＲＮＡ抽出工程と、（２）前記全ＲＮＡ抽出工程で抽出したそれぞれの全ＲＮＡ画分を用いて、糖輸送体遺伝子をコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅させるｃＤＮＡ増幅工程と、（３）前記ｃＤＮＡ増幅工程で得られた増幅産物を、蛍光標識核酸、同位体標識核酸、及び核酸染色剤からなる群から選ばれるいずれかの試薬を用いて定量する増幅産物定量工程と、（４）前記非ヒト哺乳動物の前記所定期間中における体重増加量、摂食量、前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量に基づいて、内臓周辺白色脂肪組織の縮小量を判定する判定工程である。
ここで、前記糖輸送体遺伝子はマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログであることが、好ましい。
［００１７］
また、前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を定量する工程を、前記遺伝子のコードする糖輸送体タンパク質の発現量を定量する工程とすることもできる。前記タンパク質の発現量を定量する工程では、糖輸送体タンパク質の発現量をウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及び免疫染色法からなる群から選ばれるいずれかの方法で測定し、その発現量を決定することが好ましい。また、前記ＲＮＡの発現量に依拠する方法と前記タンパク質の発現量に依拠する方法とは併用することもでき、ともに前記比較解析に利用することができる。また、前記被験物質には化合物及び組成物が含まれるものとする。

【０００８】
また、本発明のさらに別の態様は、上記スクリーニング方法を実施するための試薬キットである。上記試薬キットは、逆転写酵素、ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅する酵素、及び糖輸送体遺伝子特異的プライマーからなることが好ましい。上記試薬キットはさらに核酸染色薬を備えることが好ましい。
発明の効果
［００１８］
本発明のノビレチンを含有する組成物によれば、抗肥満効果と高血糖治療等効果とがあり、かつ脂質異常の改善を妨げないことを特徴とする、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療に有用な内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物、その組成物を有効成分とする医薬製剤、機能性食品、又は健康食品を提供できる。本発明のノビレチン及びタンゲリチンを含有する組成物によれば、抗肥満効果と脂質異常治療等効果とがあり、かつ高血糖の改善を妨げないことを特徴とする、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療に有用な内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組成物、その組成物を有効成分とする医薬製剤、機能性食品、又は健康食品を提供できる。
本発明のスクリーニング方法によれば、摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の増加を抑制する作用と、骨格筋組織内又は骨格筋細胞内の、マウスＧＬＵＴ４を始めとする糖輸送体遺伝子の発現を促進する作用とを有するに有用な内臓周辺白色脂肪組織の縮小促進用医薬組医物質、又は前記物質を含有する組成物を選択することができる。
本発明の医薬製剤を所定の方法で投与することにより、内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進させ、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療を行うことができる。また、本発明の機能性食品及び健康食品を、摂取することでメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療促進ができる。
図面の簡単な説明
［００１９］
［図１Ａ］シークワーサー果皮抽出物のＨＰＬＣ分析の結果を表わすグラフである。

【００１３】
［図１５Ｃ］実施例７において、ＨＦＤ＋１０Ｎｏの、白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。
［図１５Ｄ］実施例７において、ＨＦＤ＋１００Ｎｏの、白色脂肪組織の脂肪細胞を観察した写真である。
発明を実施するための形態
［００２７］
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本明細書において、特に断りのない限り、メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常状態を呈するメタボリックシンドロームのことを指すものとする。また本願発明においては抗肥満効果に、肥大化した内臓脂肪組織を縮小する効果が含まれるものとする。
被験物質としては任意のものが使用できる。被験物質は食餌に混合するか、適当な溶媒に溶解又は懸濁して被験対象動物に経口投与することが好ましい。また、被験物質が脂溶性のものである場合には、被験対象動物に経皮投与することもできる。
［００２８］
本発明のスクリーニング方法で被験対象となる非ヒト哺乳動物は、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）が好ましく、より好ましくは実験用マウス（ハツカネズミ；Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；以下、マウスという。）が好ましい。マウスは被験物質を所定の量で所定の期間投与した被験物質投与群、及び前記被験物質を前記所定の量で前記所定の期間投与していない被験物質非投与群の２群、もしくは、それに加えて投与量、食餌餌条件などの所定の条件を変えた複数群を構成することが望ましい。
本発明のスクリーニング方法においては、肥満の指標として体重を測定することが好ましい。さらに解剖によって内臓白色脂肪組織を取り出し、その重量を測定し、内臓脂肪型肥満の度合いを測定することが好ましい。さらに脂肪組織を顕微鏡観察して脂肪細胞の肥大化の度合いを測定することが好ましい。また、解剖を伴わない方法として、被験対象動物の電気抵抗値を測定する方法、又は比重を測定する方法によって体脂肪率を測定してもよい。本発明の摂食量の測定方法としては、マウスにケージ内で摂食させて、与えた

Claims (10)

1. 下記の工程（１）〜（３）を備える、内臓脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈するメタボリックシンドロームの治療用物質のスクリーニング方法：
   （１）被検物質を所定の量で所定の期間投与した被検物質投与群を構成する非ヒト哺乳動物、及び前記被検物質を前記所定の量で前記所定の期間投与していない被検物質非投与群を構成する非ヒト哺乳動物から、それぞれ採取した骨格筋より、全ＲＮＡ画分を抽出する抽出工程と、
   （２）前記抽出工程で抽出したそれぞれの全ＲＮＡ画分中に含まれる、糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を所定の方法で定量する定量工程と、
   （３）前記被検物質投与群及び被検物質非投与群をそれぞれ構成する前記非ヒト哺乳動物の前記所定期間中の体重増加量、摂食量、及び前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を、群間で比較解析することにより、前記メタボリックシンドロームに対する効果を判定する工程。
2. 前記糖輸送体遺伝子はマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. 前記所定の方法は、
   逆転写酵素を用いて前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、前記輸送体遺伝子特異的プライマーを用いて前記ｃＤＮＡを増幅する工程と、
   蛍光標識核酸、同位体標識核酸、及び核酸染色剤からなる群から選ばれる試薬を用いて、前記試薬に応じた検出法で増幅産物を定量する工程と、
   前記糖輸送体遺伝子をコードするＲＮＡの発現量を決定する工程と、を備えることを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
4. 糖尿病発症前の、内蔵脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈するメタボリックシンドロームの治療用組成物であって、乾燥重量中７０〜１００重量％のノビレチンを含有するミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類の果皮抽出画分を含み、前記果皮抽出画分の乾燥重量換算で１日当たり５〜２００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与し、下記の作用（１）〜（４）を備える組成物：
   （１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の上昇を抑制する作用；
   （２）骨格筋組織内又は骨格筋細胞内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子のタンパク質の発現を促進する作用；
   （３）肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進する作用；
   （４）血中トリグリセリド濃度に影響を与えることなく、血中ブドウ糖濃度を低下させる作用。
5. 前記ミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類は、シークワーサー（Shiikuwasha；C. depressa）であり、前記果皮抽出画分中のノビレチン含量は乾燥重量中９５〜１００重量％であり、前記用量は１日あたり１０〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項４に記載のメタボリックシンドロームの治療用組成物。
6. 内蔵脂肪型肥満、高血糖、及び脂質異常を呈するメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用組成物であって、乾燥重量中４５〜５５重量％のノビレチンと４５〜５５重量％のタンゲリチンとを含有する、ミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類果皮抽出画分を含み、前記果皮抽出画分の乾燥重量換算で、０．５〜８．０ｇ/body/日の用量で経口的に摂取し、下記の作用又は特徴（１）〜（４）を備える組成物：
   （１）摂食量に影響を与えることなく体重の増加量の増加を抑制する作用；
   （２）骨格筋組織内又は骨格筋細胞内のマウスＧＬＵＴ４及びそのホモログである糖輸送体遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を促進する作用；
   （３）肥大化した内臓周辺白色脂肪組織の縮小を促進する作用；
   （４）血中ブドウ糖濃度に影響を与えることなく、血中トリグリセリド濃度を低下させる作用。
7. 前記ミカン区（Acrumen (VII) section）柑橘類はシークワーサー：Citrus depressaであり、前記用量は１．０〜６．０ｇ/body/日である請求項６に記載のメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療に用いられる組成物。
8. 請求項４〜７に記載のメタボリックシンドロームの治療用組成物を含有する、機能性食品。
9. 請求項４〜７に記載のメタボリックシンドロームの治療用組成物を含有する、健康食品。
10. 請求項４〜７に記載のメタボリックシンドロームの治療用組成物を含有する、医薬製剤。