CN102549153A - 代谢综合征的预防剂和/或治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供表现出内脏脂肪型肥胖和脂质代谢异常的代谢综合征的治疗用物质的筛选方法、所述综合征的预防和/或治疗用组合物。所述筛选方法包括下述工序：(1)提取工序，由以规定的量按规定的期间给予被测物质的构成被测物质给药组的非人哺乳动物、和未给予所述被测物质的构成被测物质非给药组的非人哺乳动物分别采集骨骼肌，由骨骼肌提取总RNA级分；(2)定量工序，利用规定的方法，对所述提取工序中提取的各总RNA级分中所含的、编码糖转运蛋白基因的mRNA的表达量进行定量；和(3)判定工序，对于分别构成所述被测物质给药组和被测物质非给药组的所述非人哺乳动物在所述规定期间中的摄食量、体重增加量和编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量，在组间进行比较分析，从而判定针对所述代谢综合征的效果。

Description

代谢综合征的预防剂和/或治疗剂
技术领域
本发明涉及以蜜柑区柑橘类提取物作为有效成分的代谢综合征的预防和/或治疗剂、含有上述提取物的用于代谢综合征的预防和/或治疗的药物制剂、以及用于代谢综合征的预防的功能性食品和健康食品。
背景技术
由肥胖引起的高血糖、高血压、脂质异常等症状的增加是世界各国共通的社会问题。将除了由内藏脂肪组织的肥大化引起并导致体重增加的内脏脂肪型肥胖以外，还兼具高血糖、高血压、脂质异常中的两种以上的状态称为“代谢综合征(内脏脂肪综合征)”，美国国家胆固醇教育计划(NCEP)已经公布了该病状的诊断基准。
将高血糖作为指标进行判定的糖尿病大致分为I型和II型。I型的病状主要为由于遗传的因素而完全丧失了本应正常保持血糖值的激素胰岛素的分泌，其占日本人糖尿病患者的5～10％。II型的病状主要为后天丧失了胰岛素的感受性(成为胰岛素抵抗性)，在日本人中也发现了伴随胰岛素分泌降低的病例。占糖尿病患者的90～95％、由代谢综合征诱发的糖尿病属于2型糖尿病。
已知患糖尿病的原因之一为过量饮食等生活习惯对肾脏等脏器造成负担，根据最近的研究可知，作为肥胖原因的脂肪细胞的肥大化会引起脂肪组织内的基因水平的变化，通过血中的细胞因子或其他信号因子的浓度变化而对包含肝脏和骨骼肌在内的全身造成影响，促使糖尿病的发病。在糖尿病治疗中，吡格列酮作为非常有效的降血糖剂得到利用，但存在副作用的问题(日本特开2003-119148、以下称为专利文献1)。
另外，脂肪细胞的肥大化与脂质异常有关。作为脂质异常的指标，一直以来使用了血中的总胆固醇(以下，称为“T-CHO”)值或中性脂肪(血中甘油三酯，以下称为“TG”)的值，目前，代替T-CHO而将血中LDL胆固醇值作为指标之一。并且已知若患LDL胆固醇血症、高甘油三酯血症，则罹患动脉硬化等心血管疾病的风险会变高。在这种脂质异常的治疗中使用了司他汀(statin)、贝特类(fibrates)药物。
另一方面，有报道指出在柑橘类中含有对上述那样的糖尿病、脂质异常有效的物质。此处，柑橘类的分类详细记载于田中的分类法(Tanaka，T.，Misunderstanding withregards Citrus classification and nomenclature.Bull.Univ.Osaka Pref.Ser.B，21，139-145(1969)，以下称为非专利文献1)中。需要说明的是，针对柑橘类中所含的聚甲氧基黄酮的种类和量已有研究，并报道称在与基于田中的分类法的分类之间发现了关联(非专利文献2)。
WO 1999/056768A2(以下称为专利文献2)中，已知一种将在脂肪组织或脂肪细胞中表达的基因的表达量变化作为指标而对物质的作用进行评价的方法。报道了例如GDF-8抑制剂促进培养脂肪细胞内的GLUT4的表达、以及该物质对于糖尿病的处置有用的内容。
另外，关于聚甲氧基黄酮(以下称为PMF)的效果，报道了下述例子。据WO2007/024982A2(以下称为专利文献3)中报道，与接受高脂饮食的小鼠相比，在接受添加有由甜橙(Citrus sinensis)提取的包含PMF的成分的高脂饮食的小鼠中，体重的增加量和平均脂肪重量降低。
据日本特开2001-240539(以下称为专利文献4)中报道，若对自然患糖尿病的小鼠经口给予作为PMF之一的蜜桔黄素或扁平橘(Citrus depressa)浓缩果汁，则与未给予这些物质的小鼠相比，具有显著的抑制血糖上升的效果。
据WO 2002/087567A2(以下称为专利文献5)中报道，对仓鼠仅提供果糖时、以及提供添加有食用橘皮素或柑橘类PMF组合物的果糖时，血中总胆固醇浓度降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-119148
专利文献2：国际公开公报WO 1999/056768A2
专利文献3：国际公开公报WO 2007/024982A2
专利文献4：日本特开2001-240539
专利文献5：国际公开公报WO 2002/087567A2
非专利文献
非专利文献1：Tanaka，T.，Misunderstanding with regards Citrus classification andnomenclature.Bull.Univ.Osaka Pref.Ser.B，21，139-145(1969)
非专利文献2：Nogata，Y.，Sakamoto，K.，Shiratsuchi，H.，Ishii，T.，Yano M.，andOhta，H.，Flavonoid Composition of Fruit Tissues of Citrus Species，Biosci.Biotechnol.Biochem.，70，178-192(2006)
发明内容
如上所述，代谢综合征是由内脏脂肪型肥胖所诱发的，因此为了提高治疗效果，必须改善肥胖度、即缩小脂肪组织。但是，目前尚未发现有效的抗肥胖药，而且尚未得到认可，因此将饮食疗法和运动疗法合用。
上述吡格列酮存在促进脂肪细胞的成长的矛盾点，若长期服用则存在体重和体脂肪增加、降血糖作用减弱的问题。另外，司他汀类、贝特类的药物存在横纹肌溶解和由肝脏分泌的脂肪酸增多的问题。
代谢综合征的治疗中饮食的限制和适度的运动是重要的。其目的在于切断下述不好的流动：摄入到肌肉中但未被消耗的血中的糖分被储存在脂肪组织中，肥大化的脂肪细胞会分泌引起循环系统的并发症的中性脂肪。即，为了提高治疗效果，抑制糖分的供给源的过量摄取、将所摄取的糖分消耗尽是必要的。此处，抑制糖分的供给源(即摄食量)必须小心进行，以免引起低血糖或骨质疏松症等。另外，若所摄取的糖分在肌肉中的血糖摄入和代谢得到促进，则会促进血糖的消耗，因而摄入到肥大化的脂肪组织中的血糖减少，脂肪细胞的肥大化得到抑制，中性脂肪等的分泌也得到抑制。
此外，如上所述，代谢综合征合并了多种病状，因此在针对各病状进行给药的对症疗法中存在极限。因此，社会强烈要求对下述物质进行筛选：(A)改善肥胖和高血糖、且不妨碍脂质异常的改善的物质；或(B)改善肥胖和脂质异常、且不妨碍高血糖的改善的物质。
另外，为了进行上述代谢综合征的预防和/或治疗，最希望发现可同时改善内脏脂肪型肥胖、高血糖、脂质异常这三种病状；且无高血压和其他副作用或者副作用小的物质，将该物质作为药物糖提供。但是，即使无法同时改善上述三种病状，若能在改善内脏脂肪型肥胖的病状的同时改善高血糖或脂质异常的任一种病状，则只要另一种病状不恶化则也没有问题。
此外，若这种物质的安全性高，则不仅可以以药物制剂的形式提供，还可以以功能性食品或健康食品的形式提供，可以期待预防代谢综合征患者的发生的效果。
因此，社会高度要求提供这种物质。
本发明是鉴于上述情况而完成的。即，本发明的发明人立足于与内脏脂肪型肥胖、高血糖、脂质异常相关的复杂机理，并且注意了安全性和副作用，开发了对代谢综合征的治疗有效的成分的筛选方法。结果发现：通过对骨骼肌组织或骨骼肌细胞中的糖转运蛋白基因的mRNA表达量进行测定，能够筛选出对代谢综合征的治疗有效的组合物，通过进行该筛选，发现由针对糖转运蛋白基因的效果而赋予了特征的柑橘类提取物的成分具有以往未知的显著作用，由此完成了本发明。
本发明的第1方式为代谢综合征的治疗用物质的筛选方法，所述代谢综合征表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常，该筛选方法包括下述的工序(1)～(3)。(1)提取工序，由以规定的量按规定的期间给予被测物质的构成被测物质给药组的非人哺乳动物、和未以所述规定的量按所述规定的期间给予所述被测物质的构成被测物质非给药组的非人哺乳动物分别采集骨骼肌，由骨骼肌提取总RNA级分；(2)定量工序，利用规定的方法，对所述提取工序中提取的各总RNA级分中所含的、编码糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行定量；和(3)判定工序，对于分别构成所述被测物质给药组和被测物质非给药组的所述非人哺乳动物在所述规定期间中的体重增加量、摄食量和编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量，在组间进行比较分析，从而判定针对所述代谢综合征的效果。上述工序(2)中定量的所述糖转运蛋白基因优选为小鼠GLUT4及其同源物。
上述筛选方法中，更优选所述规定的方法包括以下工序：使用逆转录酶由编码所述糖转运蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；使用所述转运蛋白基因特异性引物，以所述cDNA为模板进行扩增的工序；使用选自由荧光标记核酸、同位素标记核酸和核酸染色剂组成的组中的试剂，利用与所述试剂对应的检测法对扩增产物进行定量的工序；和对编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行确定的工序。
另外，代替利用规定的方法对编码糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行定量的工序，还可以为利用规定的方法对所述基因所编码的糖转运蛋白的蛋白质表达量进行定量的工序。该情况下，在所述比较分析中，代替所述RNA的表达量而优选在组间对所述蛋白质的表达量进行比较分析。
用于对所述蛋白质的表达量进行定量的规定的方法优选包括以下工序：利用选自由蛋白质印迹法、ELISA和免疫染色法组成的组中的任一种方法测定糖转运蛋白的蛋白质表达量的工序；以及确定该表达量的工序。另外，还可以合用依据所述RNA的表达量的方法和依据所述蛋白质的表达量的方法，均可以用于所述比较分析中。另外，所述被测物质中含有化合物和组合物。
本发明的第2方式为用于实施上述筛选方法的试剂盒。上述试剂盒优选包含逆转录酶、以cDNA为模板对DNA进行扩增的酶和糖转运蛋白基因特异性引物。上述试剂盒优选还具备核酸染色剂。
本发明的第3方式为一种代谢综合征的治疗用组合物，所述代谢综合征是糖尿病发病前的表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常的代谢综合征，其中，所述组合物含有在干燥重量中含70～100重量％的蜜桔黄素的蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类的果皮提取级分，以所述果皮提取级分的干燥重量换算，以每天5～200mg/kg的用量经口给药，所述组合物具有下述作用或特征(1)～(4)。(1)抑制体重增加量的上升而不影响摄食量的作用；(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的蛋白质表达的作用；(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；(4)降低血中葡萄糖浓度而不影响血中甘油三酯浓度的作用。
上述组合物中，所述蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类优选为扁平橘：Citrusdepressa，所述蜜桔黄素优选在干燥重量中为95～100重量％，所述用量优选为每天10～100mg/kg，另外，作为所述作用或特征，优选还具有：(5)促进内脏周边白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用；(6)改善糖耐量的作用。
本发明的第4方式为一种代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，所述代谢综合征表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常，其中，所述组合物含有在干燥重量中含45～55重量％的蜜桔黄素和45～55重量％的橘皮素的蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类果皮提取级分，以所述果皮提取级分的干燥重量换算，每人每天经口摄取0.5～8.0g，所述组合物具有下述作用或特征(1)～(4)。(1)抑制体重增加量的增加而不影响摄食量的作用；(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的mRNA或蛋白质表达的作用；(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；(4)降低血中甘油三酯浓度而不影响血中葡萄糖浓度的作用。
上述组合物中，所述蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类优选为扁平橘：Citrusdepressa，所述用量优选为1.0～6.0g/人/天，另外，作为所述作用或特征，优选还具有：(5)促进内脏周边白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用；(6)改善瘦素抵抗性的作用。
另外，本发明的第5方式为一种含有上述代谢综合征的治疗用组合物的功能性食品。本发明的第6方式为一种含有上述代谢综合征的治疗用组合物的健康食品。另外，本发明的第7方式为一种含有上述代谢综合征的治疗用组合物的药物制剂。
根据本发明的筛选方法，能够选择出具有以下作用或特征的物质、或者含有所述物质的组合物：(1)抑制体重增加量的增加而不影响摄食量的作用；(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的以小鼠GLUT4为首的糖转运蛋白基因表达的作用。
利用本发明的所述含有蜜桔黄素的组合物，能够提供一种代谢综合征的预防和/或治疗用药物制剂、功能性食品或健康食品，其特征在于，其具有抗肥胖效果，具有高血糖治疗等效果，且不妨碍脂质异常的改善。利用本发明的所述含有蜜桔黄素和橘皮素的组合物，能够提供一种代谢综合征的预防和/或治疗用药物制剂、功能性食品或健康食品，其特征在于，其具有抗肥胖效果，具有脂质异常治疗等效果，且不妨碍高血糖的改善。
通过利用规定的方法给予本发明的药物制剂，能够预防和/或治疗代谢综合征。另外，通过摄取本发明的功能性食品和健康食品，能够促进代谢综合征的预防和/或治疗。
附图说明
图1A是表示扁平橘果皮提取物的HPLC分析的结果的曲线图。曲线图的纵轴以检测电压(mV)表示UV检测器的电位变化。
图1B是表示温州蜜柑果皮提取物的HPLC分析的结果的曲线图。曲线图的纵轴以检测电压(mV)表示UV检测器的电位变化。
图2A是表示实施例3中提供低脂饮食(LFD)、高脂饮食(HFD)、添加扁平橘提取物的高脂饮食(HFD+1SPE)和添加高浓度扁平橘提取物的高脂饮食(HFD+1.5SPE)后小鼠的体重增加量的曲线图。
图2B是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1.5SPE后小鼠的摄食量的重量的曲线图。
图2C是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1.5SPE后小鼠的肝脏、肾脏和白色脂肪组织的重量的曲线图。
图3A是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1.5SPE后小鼠的中性脂肪(甘油三酯)、总胆固醇、葡萄糖的血中浓度的曲线图。
图3B是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1.5SPE后小鼠的瘦素的血中浓度的曲线图。
图3C是表示实施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1.5SPE后小鼠的白色脂肪组织的脂质生物合成相关基因群的相对表达量(设LFD＝1时)的曲线图。
图4A是观察实施例3中提供LFD后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图4B是观察实施例3中提供HFD后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图4C是观察实施例3中提供HFD+1SPE后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图4D是观察实施例3中提供HFD+1.5SPE后小鼠的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图5A是表示对糖尿病模型小鼠提供仅溶剂(Vehicle)、蜜桔黄素(No200)和吡格列酮(P30)时葡萄糖的血中浓度的曲线图。
图5B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时针对糖耐量的经口葡萄糖耐量试验(OGTT)的结果的曲线图。
图6A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时白色脂肪组织中的糖转运蛋白GLUT4基因的mRNA表达量的曲线图。
图6B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时上述GLUT4的蛋白质表达量的电泳图像照片及表示其表达量的曲线图。
图6C是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时骨骼肌中的糖转运蛋白GLUT4的蛋白质表达量的电泳图像照片及表示表达量的曲线图。
图7A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时肝脏组织中的糖异生相关基因PEPCK的mRNA表达量的曲线图。
图7B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时肝脏组织中的糖异生相关基因G6Pase的mRNA表达量的曲线图。
图8A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂联素的血中浓度的曲线图。
图8B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂联素基因的mRNA表达量的曲线图。
图9A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞因子基因TNF-α的mRNA表达量的曲线图。
图9B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞因子基因MCP-1的mRNA表达量的曲线图。
图9C是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞因子基因IL-6的mRNA表达量的曲线图。
图10A是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂肪细胞特异性转录因子基因PPARγ的mRNA表达量的曲线图。
图10B是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂质生物合成相关基因aP2的mRNA表达量的曲线图。
图10C是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂质蓄积控制相关基因LPL的mRNA表达量的曲线图。
图10D是表示对糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30时脂质蓄积控制相关基因Perilipin的mRNA表达量的曲线图。
图11A是表示实施例6中进行低脂饮食喂食+溶剂给药的LFD摄取组(LFD，无肥胖诱导的比较例)、以及利用高脂饮食(HFD)进行肥胖诱导后进行高脂饮食喂食+溶剂给药的HFD摄取组(HFD)和进行高脂饮食喂食+橘皮素给药的T200给药组(HFD+T200)的白色脂肪组织中的脂肪细胞特异性转录因子PPARγ基因和糖转运蛋白GLUT4基因的mRNA表达量的电泳图像照片及表示表达量的曲线图。
图11B是表示实施例6中上述肥胖诱导后的LFD、HFD、HFD+T200的骨骼肌中的糖转运蛋白GLUT4基因的mRNA表达量的电泳图像照片和表示表达量的曲线图。
图12A是表示实施例6和7中利用高脂饮食(HFD)进行肥胖诱导和给予蜜桔黄素或橘皮素的时间表。
图12B是表示实施例7中进行低脂饮食喂食+溶剂给药的LFD摄取组(LFD，无肥胖诱导的比较例)、以及利用高脂饮食(HFD)进行肥胖诱导后进行高脂饮食喂食+溶剂给药的HFD摄取组(HFD)、进行高脂饮食喂食+蜜桔黄素给药的10No给药组(HFD+10No)和进行高脂饮食+高浓度蜜桔黄素给药的10No给药组(HFD+100No)的5周的体重总增加量的曲线图。
图12C是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+10No、HFD+100No的5周的平均摄食量的曲线图。
图13A是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+10No、HFD+100No的肝脏、肾脏和白色脂肪组织的重量的曲线图。
图13B是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+10No、HFD+100No的中性脂肪(甘油三酯)、总胆固醇、葡萄糖的各血中浓度的曲线图。
图14A是实施例7中通过经口葡萄糖耐量试验(OGTT)表示LFD、HFD、HFD+10No、HFD+100No的糖耐量的曲线图。
图14B是表示实施例7中LFD、HFD、HFD+10No、HFD+100No的前期OGTT的血中葡萄糖浓度曲线的时间积分值的曲线图。
图15A是观察实施例7中LFD的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图15B是观察实施例7中HFD的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图15C是观察实施例7中HFD+10No的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
图15D是观察实施例7中HFD+100No的白色脂肪组织的脂肪细胞的照片。
具体实施方式
以下，对本发明进行更详细的说明。
本说明书中，只要没有特别声明，则代谢综合征是指表现出内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常状态的代谢综合征。另外，本申请发明中，抗肥胖效果包括使肥大化的内藏脂肪组织缩小的效果。
作为被测物质，可以使用任意的物质。被测物质优选混合到食物中、或是溶解或悬浮于适当的溶剂中，然后经口给药到被测对象动物中。另外，被测物质为脂溶性物质时，也可以经皮给药到被测对象动物中。
本发明的筛选方法中作为被测对象的非人哺乳动物优选为啮齿目(Rodentia)，更优选为实验用小鼠(小家鼠；Mus musculus；以下称为小鼠)。优选小鼠构成以规定的量按规定的期间给予被检物质的被检物质给药组、和未以所述规定的量按所述规定的期间给予所述被检物质的被检物质非给药组这两组，或者除此之外构成改变给药量、食物条件等规定条件的多个组。
本发明的筛选方法中，作为肥胖的指标，优选测定体重。进而优选通过解剖取出内藏白色脂肪组织，测定其重量，并测定内脏脂肪型肥胖的程度。进而优选对脂肪组织进行显微镜观察，测定脂肪细胞的肥大化的程度。另外，作为不伴有解剖的方法，还可以利用测定被测对象动物的电阻值的方法、或测定比重的方法来测定体脂肪率。作为本发明的摄食量的测定方法，在笼内使小鼠摄食并测定所提供的食物的减少量的方法因简便而优选。
作为本发明的用于所述筛选的糖转运蛋白相关基因，优选GLUT4、GLUT1、GLUT2、AMPK等。若代谢综合征的治疗用物质在骨骼肌控制这些基因的表达，则通过控制血糖在骨骼肌组织中的摄入效率，能够改善胰岛素抵抗性、糖耐受不良或高血糖。此外，通过减少葡萄糖在脂肪细胞中的摄入量，可抑制脂肪细胞和脂肪组织的肥大化，另外，对于已经肥大化的脂肪细胞和脂肪组织可以促进缩小。通过使由这样缩小后的脂肪细胞和脂肪组织的脂质分泌正常化，能够改善脂质异常。进而若代谢综合征的治疗用物质可促进骨骼肌内的GLUT4、AMPK等糖转运蛋白相关基因的表达，则对于需要运动疗法的代谢综合征患者而言，可以期待其辅助效果。另外，在高血糖中，这些基因的表达的促进具有通过胰岛素抵抗性改善而防止向更严重的糖尿病转移的效果。这些筛选用基因中，从所述物质具有改善高血糖以及脂质异常症状的作用的可能性高的方面考虑，特别优选骨骼肌的GLUT4。
本发明的基因表达的测定可以通过测定mRNA或蛋白质的表达量来进行。这些测定可以利用公知的方法进行。mRNA的测定优选包括以下工序。
(1)由骨骼肌组织片、或骨骼肌细胞提取含有mRNA的级分的工序；
(2)使用逆转录酶，由编码所述糖转运蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；
(3)使用所述转运蛋白基因特异性引物，对所述cDNA进行扩增的工序；
(4)使用规定的试剂，利用与该试剂对应的检测法对扩增产物进行定量的工序；和
(5)对编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行确定的工序。
所述规定的试剂优选为选自由荧光标记核酸、同位素标记核酸和核酸染色剂组成的组中的任一种试剂，从筛选效率的观点出发，进一步优选为核酸染色剂。作为所述核酸染色剂，从检测效率的观点出发，优选为SYBR(注册商标)Green。作为所述检测法，从测定值的准确性的观点出发，优选为实时PCR法。作为确定所述表达量的方法，优选将甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)作为标准使用的比较Ct法。
另外，蛋白质的表达量的测定优选包括以下工序：由骨骼肌组织片或骨骼肌细胞提取全部蛋白质级分的工序；利用蛋白质印迹法法、ELISA法、其他公知的方法测定所述蛋白质级分中的糖转运蛋白的蛋白质表达量的工序；确定该表达量的工序。另外，蛋白质的表达量也可以利用骨骼肌组织或骨骼肌细胞的免疫染色来测定。
本发明的被测物质针对代谢综合征的效果的判定优选根据以下条件进行。
即，优选为以下条件：在所述规定的条件下，与所述被测物质非给药组相比，(条件1)抑制所述被测物质给药组的体重的增加、或体重增加量的上升；(条件2)不伴有摄食量的明显增加、减少；(条件3)促进所述糖转运蛋白基因的mRNA或蛋白质的表达。利用所述(条件1)选择具有肥胖抑制效果的物质，利用(条件2)排除伴有作为副作用指标的摄食量的抑制的物质、和与肥胖的亢进相关的增加摄食量的物质。另外，利用(条件3)选择促进如上所述可期待对高血糖或脂质异常有改善效果的、骨骼肌中的糖转运蛋白基因的表达的物质。
关于本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物的提取，从提取效率的观点出发，优选从蜜柑区柑橘类的果皮提取。在蜜柑区柑橘类中，从组合物的含量的方面考虑，进一步优选花良治(Keraji；Citrus Keraji；以下相同)、椪柑(Ponkan；C.reticulata)、丹西橘(Dancy tangerine；C.tangerine)、天台蜜橘(Jimikan；C.succosa)、四会柑(Shikaikan；C.suhuiensis)、立花橘(Tachibana；C.tachibana)、小红蜜柑(Kobenimikan；C.erythrosa)、纪州蜜柑(Kishumikan；C.kinokuni)、扁平橘(Shiikuwasha；C.depressa)、柑子(Koji；C.leiocarpa)等。
从由果实得到果皮时的作业效率和所述组合物的提取效率的方面考虑，进一步优选由扁平橘(Shiikuwasha；C.depressa)的果皮提取。所述果皮可以通过阳光或机械干燥机进行干燥，但通过阳光干燥可以降低干燥所消耗的能量、防止成分变性，因而优选。
作为本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，可以优选使用由所述蜜柑区柑橘类的干燥果皮进行甲醇提取等而得到的提取物。所述提取物以规定的比例含有下述式(I)表示的蜜桔黄素和/或式(II)表示的橘皮素。另外，所述蜜桔黄素和橘皮素的骨架部分是共通的，通常将其甲氧基的数量和部位不同的化合物组称为聚甲氧基黄酮(PMF)，本说明书中也使用该名称。
以下示出由上述植物材料提取含有PMF的级分并对该级分进行粗精制从而得到以规定的量含有蜜桔黄素和橘皮素的级分的方法、以及精制蜜桔黄素或橘皮素的方法的一个例子。
利用阳光将由柑橘类的果实得到的果皮自然干燥3天，制成干燥果皮。在规定量的干燥果皮中加入其5倍容积的溶剂，以规定的期间、规定的温度进行浸渍提取，得到提取液。这里，作为提取溶剂，例如可以举出甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、各种混合比的水-甲醇混合液、水-乙醇混合液等。
对所得到的粗提取液进行过滤以除去固体成分，对全部量的滤液进行浓缩，得到浓缩液。向该浓缩液中适量加入适合的水相/有机相的混合液，进行液-液分配萃取。改变混合液的组成，进行多次分配萃取。将由分配萃取得到的有机相浓缩，供于空心柱中，利用阶段性提高溶剂浓度的分级梯度法进行洗脱，将所期望的级分用作果皮提取物(以下称为“SPE”)。
接下来，将该级分的一部分浓缩，调整溶质浓度，进行分离柱色谱以进行粗精制。将SPE进一步供于柱色谱，对该提取物中所含的蜜桔黄素和/或橘皮素的量进行定量。将含有所期望的含量的蜜桔黄素、或蜜桔黄素和橘皮素两者的级分用作后述的治疗用组合物。
具体地说，在扁平橘、温州蜜柑(Satsuma；C.unshiu)等蜜柑区柑橘类的干燥果皮6～10kg中加入30～50L的甲醇，在2～6℃提取7～21天，得到提取液。过滤该提取液以除去固体成分，使用闪蒸器浓缩全部量的滤液。接下来，加入4L水/乙酸乙酯(1/1)进行分配萃取。向所得到的乙酸乙酯相中加入4L 90％甲醇/正己烷(1/1)，再次进行液-液分配萃取。
接着，将90％甲醇相的一部分浓缩，例如，加样到ODS硅胶柱(Cosmosil75C18-OPN，
Figure BDA0000132369620000131
)中，进行分级梯度洗脱(甲醇浓度每次提高20％)，得到60％～100％甲醇的级分。利用大型旋转蒸发器干燥这些级分，作为SPE用于本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物中。
接下来，例如，在上述级分中将80％甲醇级分的一部分浓缩，加入甲醇将溶质浓度调整为900mg/ml，供于分离柱色谱。在例如以下条件下进行分级而得到所期望的级分后，对各级分中的蜜桔黄素和/或橘皮素的含量进行定量。
分离条件：柱5C18-AR-II柱(NACALAI TESQUE，INC.)
洗脱溶剂：70％甲醇/水
溶质浓度：900mg/ml
进样体积：3ml
级分体积：10ml
流速：5ml/分钟
检测波长：UV215nm
范围：20mV
利用色谱分析蜜桔黄素和橘皮素的标准品的保留时间(Retention Time)和所得到的各级分中的峰的保留时间，对蜜桔黄素和橘皮素进行定量。为了制成本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，利用蒸发器等干燥后使用。热干燥法由于可能会引起成分变性，因而不优选。
需要说明的是，本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物中使用的含有蜜桔黄素和/或橘皮素的组合物可以利用公知的方法或以其为基准的方法获得，也可以购入市售品。
另外，本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物优选控制代谢综合征相关基因。所述代谢综合征相关基因是指选自由脂质生物合成相关基因、糖转运蛋白相关基因、糖异生相关基因、脂肪细胞因子相关基因、脂肪细胞特异性转录因子和脂质蓄积控制相关基因组成的组中的至少一种以上的基因。这里，关于所述代谢综合征相关基因，本说明书中，“控制”是指提高所述基因表达的情况、降低所述基因表达的情况和维持所述基因表达的情况。
作为脂质生物合成相关基因，可以举出aP2、SREBP1c、SCD1、FAS、ACC1、FATP、DGAT1、AGPAT、GPAT等。其中，控制选自由aP2、SREBP1c、SCD1、FAS、ACC1、FATP、DGAT1组成的组中的基因的表达可通过抑制脂质生物合成而抑制脂肪细胞的肥大化，其结果，抑制了脂肪组织的肥大化，使胰岛素抵抗性、糖耐受不良、高血糖或血中脂质异常得到了改善，因而优选。
本发明的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物控制所述脂肪组织内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的表达，这样可以控制血糖在组织中的摄入效率，适当地控制脂肪组织和血糖值或血中中性脂肪的状态，因而进一步优选。
作为所述糖异生相关基因，可以举出PEPCK、G6Pase、果糖-1，6-二磷酸酯酶和丙酮酸羧化酶等，抑制肝脏内的PEPCK或G6Pase的表达的物质可抑制糖异生活性，从而改善肝脏的胰岛素抵抗性，因而优选。
作为所述脂肪细胞因子相关基因，可以举出TNFα、MCP-1、IL-6、PAI-1、RBP4、Resistin和Adipsin等所谓的有害脂肪细胞因子相关基因。其中，通过抑制选自由TNFα、MCP-1、IL-6和PAI-1组成的组中的至少一种基因的表达，可抑制有害脂肪细胞因子的产生，由此抑制这些有害脂肪细胞因子的分泌，结果能够改善肝脏的胰岛素抵抗性。
作为上述脂肪细胞特异性转录因子基因，可以举出PPARγ和PDE3B等。其中，若PPARγ的表达被促进，则可实现PPARγ的功能的提高，其结果，脂联素基因的表达得到促进。其结果，促进了脂联素的产生和分泌。
另外，此时若基于PPARγ的所述脂质生物合成相关基因的表达被选择性地抑制，则抑制脂肪细胞的肥大化、改善胰岛素抵抗性的效果会变高。
作为上述脂质蓄积控制相关基因，可以举出LPL、Perilipin和PPARσ等。其中，优选LPL或Perilipin的表达得到促进。由此，脂质的蓄积受到抑制，脂肪细胞的肥大化受到抑制，其结果，抑制了脂肪组织的肥大化。并且，胰岛素抵抗性、糖耐受不良、高血糖或血中脂质异常得到了改善。
基于下述理由，本发明的第3方式的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物优选为相对于上述精制物的干燥重量含有70～100重量％的蜜桔黄素的上述组合物，其每天的用量换算成蜜桔黄素优选为经口5～200mg/kg体重。上述预防和/或治疗用组合物中的蜜桔黄素含量进一步优选为95～100重量％，每天的用量换算成蜜桔黄素进一步优选为10～150mg/kg体重，进一步优选为100mg/kg体重。
这是因为，在上述范围内含有蜜桔黄素的组合物具有以下作用：(1)抑制体重增加量的上升而不影响摄食量的作用；(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的蛋白质的表达的作用；(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；(4)降低血中葡萄糖浓度而不影响血中甘油三酯浓度的作用；(5)促进内脏周边白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用；(6)改善糖耐量的作用。
本发明的第4方式的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物优选为相对于组合物的干燥重量含有40～60重量％的蜜桔黄素和40～60％的橘皮素的上述SPE，进一步优选为含有45～55重量％的蜜桔黄素和45～55％的橘皮素的上述SPE。
本发明的第4方式的对人的给药量优选如下。通常认为适合于小鼠的给药量的约50倍的值是适合于人的给药量，因此所述组合物每天对成人的用量优选为经口1～4g/人，进一步优选为2.0～3.4g/人，特别优选为3.2～3.4g/人。另外，优选根据患者的体重以所述的1/2～2倍程度调整用量。
这是因为，上述SPE组成的组合物具有以下作用：(1)抑制体重增加量的增加而不影响摄食量的作用；(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的mRNA或蛋白质表达的作用；(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；(4)降低血中甘油三酯浓度而不影响血中葡萄糖浓度的作用；(5)促进内脏周边白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用；(6)改善瘦素抵抗性的作用。
关于在上述范围内含有蜜桔黄素和橘皮素的SPE，在上述的蜜桔黄素所具有的作用中，不具有降低血中葡萄糖浓度的效果，但具有降低血中甘油三酯的效果，并且不改善糖耐量而改善瘦素抵抗性，在这些方面是不同的。
通过所述方法得到的含有上述式(I)～(II)表示的化合物的所述组合物、或所述组合物中所含的化合物的生理学上可接受的盐、其生理学上可接受的水合物、或由其生理学上可接受的水合物组成的组合物可以如下制成药物制剂。将蜜桔黄素单独制成药物制剂、或蜜桔黄素与橘皮素的混合物单独制成药物制剂时，根据常规方法对如上得到的结晶进行处理，然后与后述的赋形剂等混合即可。作为以这些药物组合物作为有效成分的药物制剂，可以举出注射剂、栓剂、气溶胶剂、经皮吸收剂、软膏剂、硬膏剂、喷雾剂和其他非经口剂；片剂、散剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、糖锭剂、液剂和其他经口剂等。
这里，上述片剂包含糖衣片、包衣片、口含片，胶囊剂包含硬胶囊剂、软胶囊剂这两者。另外颗粒剂还包含包衣的颗粒剂。另外，上述液剂包含悬浮剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等，糖浆剂还包含干糖浆。需要说明的是，上述各制剂不仅包含未经缓释化的制剂，还包含缓释化的制剂。这种制剂可以根据公知的制剂学的制法，利用制剂的制法中药理学上可接受的日本药典中记载的基剂、载体、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂等来制造。作为这样的载体和赋形剂，例如可以举出乳糖、葡萄糖、白糖、甘露糖醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、结晶纤维素、甘草末、龙胆末等。
作为所述结合剂，例如，可以举出淀粉、黄蓍胶、明胶、糖浆、聚乙烯醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素等。作为所述崩解剂，例如，可以举出淀粉、琼脂、明胶末、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、结晶纤维素、碳酸钙、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素等。作为所述润滑剂，例如，可以举出滑石、硬脂酸镁等。作为所述着色剂，只要是允许在药物品中添加的物质则均可以使用，没有特别限定。另外，除此之外，根据需要还可以适当使用矫味剂、矫臭剂等。
制成片剂或颗粒剂的情况下，根据需要，可以利用白糖、明胶、精制虫胶、甘油、山梨糖醇、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸聚合物等进行包衣，也可以进行多层包衣。此外，还可以将颗粒剂或粉剂填装到乙基纤维素或明胶之类的胶囊中，制成胶囊剂。利用上述组合物、或由其中所含的化合物的生理学上可接受的盐、或者水合物组成的组合物制备注射剂的情况下，根据需要，还可以添加pH调节剂、缓冲剂、稳定化剂、增溶剂等。
对患者给予上述那样的代谢综合征的预防和/或治疗剂时，给药量根据患者的症状的严重程度、年龄、体重、血糖值、血压和健康状态等各种条件而异。通常以上述用量和用法每天给药1次或2次以上的次数即可，可以根据以上各种条件适当增减给药的次数和量。
将上述提取物单独、或与化合物组合作为有效成分包含在制剂中时，该组合物中这些物质的含量与上述相同。作为有效成分的蜜桔黄素、橘皮素、或它们的混合物的含量低于下限值时，无法充分发挥代谢综合征的改善作用，相反地即使超过上限值进行添加，也无法发挥与添加量相应的效果。另外，若超过上限值，则给药时可能会发挥细胞毒性，有可能引起生物体所不希望产生的副作用。此外，通过根据需要适当添加上述化合物、其衍生物、生理学上可接受的盐、生理学上可接受的它们的水合物，能够提供具有脂肪细胞的增殖分化促进效果的功能性食品或者健康商品。
将上述组合物、由该组合物中所含的所述化合物的衍生物、生理学上可接受的它们的盐、或生理学上可接受的它们的水合物组成的组合物添加到例如面包、曲奇和饼干、米饭添加用麦和粗粮、乌冬面、荞麦面、意大利面、其他面类；干酪、酸奶、其他乳制品：果酱、蛋黄酱、黄酱、酱油、其他大豆制品；茶、咖啡和可可、清凉饮料、果实饮料、其他非醇类饮料；药用酒、其他醇类饮料；糖果、巧克力、其他小吃点心；口香糖、脆饼、羊羹、其他以大豆为原料的点心等中，可以制成功能性食品。或者添加到动物用食物中，可以制成功能性混合饲料。需要说明的是，在添加到上述酸奶、酱油、饮料等中时，为了使本发明的化合物在这些物质中不结晶化而沉淀，还可以适当加入溶解助剂、稳定化剂。
另外，通过根据常规方法将本发明的化合物单独(或2种以上混合)制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂，可以制成健康食品。这里，为了使本发明的化合物形成粉末，将生成过程中得到的提取物浓缩，利用冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥等方法使其干燥，并利用样品磨、搅拌机、混合器等将干燥固体粉碎即可。另外，根据需要，可以添加玉米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、牡蛎壳粉末等。
另外，在如上得到的粉末中适当加入上述结合剂并压片，也可以制成片剂。制成片剂后，可以利用上述白糖或明胶等包衣剂制成糖衣片，还可以利用其它包衣剂制成肠溶剂等。此外，还可以根据常规方法将如上得到的粉末制成颗粒，制造颗粒剂。另外，也可以将上述粉末或颗粒适量填充到上述胶囊中，从而制成胶囊剂。需要说明的是，本发明中，上述功能性食品和健康食品中不包含其自身天然含有上述组合物的柑橘类和其他植物果实等。但是，通过在上述柑橘类等中添加上述组合物而制造的上述食品等包括在本发明中。
实施例1
1.被测物质等的制备
(1-1)来自蜜柑区柑橘类果皮的提取物的提取方法
扁平橘的果实由冲绳县大宜味购入。将由扁平橘果实得到的果皮在阳光下干燥3天，得到扁平橘干燥果皮。温州蜜柑购入的是爱媛县产的果实。另外将由温州蜜柑得到的果皮同样地在阳光下干燥3天，得到温州蜜柑干燥果皮。
在这些干燥果皮8kg中加入40L的甲醇进行浸渍，于4℃提取14天。进行过滤，得到粗提取液，使用蒸发器将全部量的该粗提取液浓缩。将该浓缩液在4L的水/乙酸乙酯(1/1)中利用液-液分配进行萃取，接下来，再次将乙酸乙酯相在4L的90％甲醇-水/己烷(1/1)中利用液-液分配进行萃取。
将所得到的90％甲醇相添加到ODS硅胶空心柱(Cosmosil 75C18-OPN)中，利用蒸发器进行浓缩，将水-甲醇作为流动相，通过分级梯度法(其中甲醇浓度每次提高20％)进行洗脱。通过该洗脱，得到60％甲醇/80％甲醇/100％甲醇的3个级分。将此处得到的80％甲醇级分作为来自蜜柑区柑橘类果皮的提取物。
(1-2)来自蜜柑区柑橘类果皮的提取物的组成
利用公知的方法对如上得到的提取物进行HPLC分析。HPLC的条件如下。
HPLC装置：UV-8011HPLC(TOSOH社制造)
检测器：UV检测器
柱：Cholester Waters内径4.6mm×250mm(Waters社制造)
洗脱溶剂：75％MeOH/水
溶质浓度：0.1mg/mL
进样体积：0.005ml
流速：1.0mL/分钟
检测波长：UV 215nm
范围：1000mV
如图1所示，检测到蜜桔黄素和橘皮素。由图1A和图1B的比较可知，扁平橘与温州蜜柑相比以更高的浓度提取到蜜桔黄素和橘皮素。在由上述扁平橘的提取物中，蜜桔黄素和橘皮素的组成比为50％/50％。
以下，作为扁平橘果皮提取物(Shiikuwasha Peel Extract；SPE)，使用通过上述方法由扁平橘果皮得到的、由50％蜜桔黄素(Nobiletin)和50％橘皮素(Tangeretin)的组成构成的提取物。
实施例2
2.被测动物的饲料以及基因表达量的测定法
(2-1)被测动物的饲料
通常的小鼠用饲料(标准食)购入CRF-1(Oriental Yeast Co.，ltd.制造)。作为用于制备低脂饮食和高脂饮食的添加物，购入酪蛋白、牛脂、β-玉米淀粉、α-玉米淀粉、食物纤维、矿物质和维生素，按照以下的量(w/w％)添加并使用(均为Oriental Yeast Co.，ltd.制造)。另外，购入蔗糖、L-胱氨酸、酒石酸氢胆碱、叔丁基氢醌，按照下表所示的量(w/w％)添加到CRF-1中进行喂食(均为和光纯药工业株式会社制造)。
表1是低脂饮食、高脂饮食以及实施例3中的添加SPE的食物的食物组成。各值表示重量％(w/w％)。记为*1的成分由和光纯药工业株式会社(Wako Pure ChemicalIndustries)购入。蔗糖、L-胱氨酸、酒石酸氢胆碱、叔丁基氢醌以外由Oriental Yeast Co.，ltd.购入。
[表1]
Figure BDA0000132369620000191
(2-2)基因表达量的测定法
如下基于实时PCR法测定mRNA表达量。
根据ISOGEN(NIPPON GENE CO.，LTD.)的说明书，由白色脂肪组织、肝脏和骨骼肌提取RNA。接着使用逆转录系统试剂盒(Promega，USA)由1μg的RNA制备cDNA。接着，根据FastStart universal SYBR(注册商标)Green Master PCR试剂盒试剂(RocheDiagnostics，Germany)的说明书，对于下述实验中作为对象的各基因，制作合适的引物。测定中使用实时PCR系统7700HT(Applied Biosytems，USA)，以所述cDNA为模板，进行实时PCR。各反应条件依据所述PCR试剂盒试剂。关于RNA量的定量分析，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)作为标准，通过比较Ct法进行。
实施例3
3.高脂饮食摄取时SPE针对肥胖的效果的测定
对以下实施例中使用的动物提供低脂饮食(low fat diet；脂肪含量4％)或高脂饮食(high fat diet；脂肪含量40％)。作为高脂饮食，制备SPE无添加、1％SPE添加、1.5％SPE添加的3种。以下在实施例3中，摄取低脂饮食的组表示为LFD摄取组，摄取SPE无添加高脂饮食的组表示为HFD摄取组，摄取1％SPE添加高脂饮食的组表示为HFD+1SPE摄取组，摄取1.5％SPE添加的组表示为HFD+1.5SPE摄取组。另外，在以下的表中，分别表示为LFD、HFD、HFD+1SPE和HFD+1.5SPE。
关于使用动物，由CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN，INC.购入出生后7周龄的C57BL/6小鼠，用标准食物驯化饲育1周后，分成4组(n＝9、3只/笼)，供于5周的实验。维持恒温(23±5℃)、12/12小时的明暗循环，在自由摄食的条件下饲育。
蜜桔黄素标准品和橘皮素标准品、苏木精、曙红及羧甲基纤维素均由和光纯药工业株式会社购入。经口糖耐量试验用的葡萄糖由Sigma-Aldrich公司购入，吡格列酮由武田药品工业株式会社购入。
(3-1)高脂饮食摄取时的SPE摄取与体重变化以及摄食量的变化
小鼠的体重每周测定一次，摄食量每周测定2次。各组小鼠的摄食量每周测定2次。关于摄食量，对于所有组，设为24小时以内的摄食量/3只/笼，以5周的平均值进行计算。将SPE摄取和各组小鼠的体重变化以及摄食量的变化示于表2、图2A以及图2B。在以下各表中，相对于LFD摄取组的显著性差异用*表示，相对于HFD摄取组的显著性差异用#表示。
[表2]
Figure BDA0000132369620000201
**：p＜0.01  ***：p＜0.005  #：p＜0.05。
5周后，HED摄取组相对于LFD摄取组显示出显著高的体重增加量(p＜0.05)，但在HFD+1SPE摄取组和HFD摄取组之间没有发现显著性差异。HFD+1.5SPE摄取组相对于HFD摄取组显示出显著低的值(p＜0.01)。
HFD摄取组的摄食量与LFD摄取组相比显著低(p＜0.01)。另一方面，若与HFD摄取组对比，在HFD+1SPE摄取组和HFD+1.5SPE摄取组中，摄食量的变化均没有发现显著性差异。
以上内容表明，即使在饲料中添加1.0～1.5％的SPE，高脂饮食组中摄食量也没得到抑制，通过添加1.5％SPE，小鼠的体重增加被显著抑制。由于摄食量无变化，因此认为体重增加的抑制不是由于卡路里摄取的减少所导致的(参照图2B)。
(3-2)高脂饮食摄取时的SPE摄取对各组织重量所产生的影响
实验结束后，将整组小鼠解剖，测定下述表3和图2C所示的组织和脏器的各重量(平均值±标准误差，n＝9)。
[表3]
Figure BDA0000132369620000211
*：p＜0.05，**：p＜0.01  #：p＜0.05。
关于5周后的肝重量，在HFD摄取组和LFD摄取组之间无显著性差异，另外，在HFD+1SPE摄取组以及HFD+1.5SPE摄取组与HFD之间也没有发现显著性差异。以上内容表明，即使在饲料中添加1.0～1.5％的SPE，肝重量也没有影响。
HFD摄取组相对于LFD摄取组显示出显著低的肾脏重量(p＜0.01)。另一方面，相对于HFD摄取组，HFD+1SPE摄取组和HFD+1.5SPE摄取组中肾脏重量均没有发现显著的增减。
以上内容表明，肾脏重量的降低依赖于HFD的摄取，并不依赖于1.0～1.5％的SPE的添加。
另外，关于由生殖器和肾脏周边取下的白色脂肪组织的重量，HFD摄取组相对于LFD摄取组显示出显著高的值(p＜0.05)。在HFD+1SPE摄取组与HFD摄取组之间没有发现显著性差异，但HFD+1.5SPE摄取组相对于HFD摄取组显示出显著低的值(p＜0.01)。以上内容表明，SPE抑制高脂饮食投食时白色脂肪组织重量的增加。
(3-3)SPE摄取所导致的中性脂肪等在血中浓度的变化
实验结束后，进行下述表4所示项目的测定。实验结束日(摄取开始5周后)，使全部小鼠断食16小时，其后由各小鼠的尾静脉分别采血1mL。以3000×g、4℃的条件对所得到的血液离心15分钟，得到血浆。作为血浆中的脂质，测定血中中性脂肪(TG)和血中总胆固醇(T-CHO)的浓度(n＝9)。
TG用甘油三酯E-Test WAKO测定，T-CHO用胆固醇E-Test WAKO测定，另外，血中葡萄糖(Glucose)用葡萄糖CII Test WAKO(均为和光纯药工业株式会社制造)测定。结果示于表4以及图3A和图3B中。
[表4]
adipo：脂联素  *：p＜0.05  #：p＜0.05。
HFD摄取组相对于LFD摄取组，TG、T-CHO和葡萄糖的各浓度均显示出显著高的值(p＜0.05)。另外，在HFD摄取组与HFD+1SPE摄取组之间，TG浓度没有发现显著性差异，但HFD+1.5SPE摄取组相对于HFD摄取组显示出显著低的值(p＜0.05)。另一方面，关于T-CHO浓度和葡萄糖浓度，在HFD摄取组与HFD+1SPE摄取组或HFD+1.5SPE摄取组之间没有发现显著性差异。
以上内容表明，1.0～1.5％SPE的添加可抑制高脂饮食给药组的血中甘油三酯浓度的增加，但不影响血中总胆固醇浓度和葡萄糖浓度。
血中脂联素浓度使用基于酶免疫测定法的Quantikine Mouse Adiponectin/Acrp30(R&D Systems，USA)进行测定。在HFD与LFD之间，血中脂联素浓度没有发现显著性差异，在HFD摄取组与HFD+1SPE摄取组或HFD+1.5SPE摄取组之间也没有发现显著性差异。
以上内容表明，1.0～1.5％SPE的添加没有对高脂饮食投食时脂联素的血浆中浓度产生影响。需要说明的是，如实施例5所示，在糖尿病模型小鼠中，通过蜜桔黄素的给药，脂联素的血浆中浓度上升至LFD摄取组那样的健康小鼠的2～3倍的水平。
血中瘦素浓度使用基于酶免疫测定法的Quantikine Mouse leptin(R&D Systems，USA)进行测定。HFD摄取组相对于LFD摄取组显示出显著高的血中瘦素浓度(p＜0.05)。另外，HFD+1SPE摄取组的血中瘦素浓度显示出HFD摄取组的约一半的值，但两组之间没有发现显著性差异。另一方面，HFD+1.5SPE摄取组相对于HFD显示出显著低的值(p＜0.05)。
以上内容表明，1.0～1.5％SPE的添加可抑制高脂饮食投食时瘦素抵抗性。这表明，即使瘦素的浓度降低，也可以正常地进行食欲的控制。
(3-4)SPE摄取对白色脂肪组织中的脂肪细胞的影响
实验结束后，由各组小鼠取下附睾的脂肪组织，制作切片，并利用苏木精和曙红染色。将这些切片以200倍进行显微镜观察，计算每单位面积的细胞数(个)并进行比较(n＝9)。结果示于表5和图4中。
[表5]
*：p＜0.05  #：p＜0.05。
HFD给药组中，与LFD摄取组相比，脂肪细胞的大小显著变大(p＜0.05)(图4A和图4B)。另一方面，在HFD摄取组与HFD+1SPE摄取组中，脂肪细胞的大小没有发现显著性差异(图4C)，但在HFD+1.5SPE摄取组中脂肪细胞的大小显著变小(p＜0.05)(图4D)。由此表明，SPE在高脂饮食摄取时具有抑制脂肪细胞肥大化的作用。另外，该结果暗示了SPE具有使肥大化白色脂肪组织和白色脂肪组织中的脂肪细胞缩小的效果。在后述实施例5的糖尿病模型小鼠中没有观察到该效果。即，通过200mg/ml的蜜桔黄素的给药，没能使在糖尿病发病状态中肥大化的白色脂肪组织的脂肪细胞缩小，但是对于高脂饮食摄取所引起的肥胖状态、即糖尿病发病前，通过相对于食物量摄取1.5％的SPE，显示出使白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的效果。
认为这些观察结果表明，SPE促进脂肪细胞的分化诱导，使肥大化的脂肪细胞分裂，或者通过将肥大化的脂肪细胞替换成新分化的脂肪细胞，从而促进白色脂肪组织中的脂肪细胞的小型化，改善了糖尿病发病前阶段的胰岛素抵抗性。
(3-5)SPE摄取对白色脂肪组织内的基因表达的影响
测定各组小鼠的与脂质生物合成相关的aP2、SREBP1c、SCD1、FAS、ACC1、FATP、DGAT1的各基因的mRNA表达量(n＝9)。结果示于表6和图3C中。
[表6]
Figure BDA0000132369620000241
*：p＜0.05  #：p＜0.05
HFD摄取组相对于LFD摄取组，实验结束后的aP2、FAS、FATP、DGAT1的mRNA表达量显著上升(均为p＜0.05)。另外，SREBP1c、SCD1和ACC1的mRNA表达量没有发现显著性差异，但确认到表达量的增加倾向。
另外，关于aP2、SCD1、ACC1、FATP和DGAT1的mRNA表达量，在HFD给药组与HFD+1SPE给药组之间没有发现显著性差异，但在与HFD+1.5SPE摄取组之间发现了表达量的显著降低(p＜0.05)。在HFD+1SPE摄取组和HFD+1.5SPE摄取组中，均发现了ACC1的mRNA表达量的显著降低(p＜0.05)。需要说明的是，在HFD+1SPE给药组和HFD+1.5SPE给药组中，观察到SREBP1c和FAS的mRNA表达量的降低倾向，但没有显著性差异。
由此表明，SPE对因高脂饮食摄取而上升的脂质生物合成相关基因群的表达具有抑制作用。
实施例4
(1)试剂等
蜜桔黄素标准品和橘皮素标准品、苏木精、曙红和羧甲基纤维素均由和光纯药工业株式会社购入。经口糖耐量试验用的葡萄糖由Sigma-Aldrich社购入，吡格列酮由武田药品工业株式会社购入。
(2)由SPE精制蜜桔黄素和橘皮素
将实施例2中得到的80％甲醇级分的一部分浓缩，用100％甲醇将溶质浓度调整为900mg/ml。接下来，以下述条件进行分离柱色谱，得到7个级分。
分离柱：5C18-AR-II柱(NACALAI TESQUE，INC.制造)
洗脱溶剂：70％甲醇
溶质浓度：900mg/mL
进样体积：3ml
级分体积：10ml
流速：5mL/分钟
检测波长：UV215nm
范围：20mV
使用蜜桔黄素和橘皮素标准品作为内标(浓度＝100μg/ml)，对各级分的峰的保留时间(RT：retention time(分钟))与标准品的峰的保留时间进行比较，鉴定蜜桔黄素和橘皮素，并求出含量。其后，利用大型旋转蒸发器使各精制级分干燥，精制出约165mg(55％)的蜜桔黄素和135mg(45％)的橘皮素。
实施例5
5.蜜桔黄素对于II型糖尿病模型小鼠(ob/ob)的效果
糖尿病模型小鼠和实验体系如下所述。作为糖尿病模型小鼠，由CHARLESRIVER LABORATORIES JAPAN，INC.购入7周龄的雄性C57BL/6J-ob/ob(以下有时称为“ob/ob”)，以1组10只的方式使用。预备饲育和实验中的饲育条件与实施例3相同，饲料使用所述CRF-1。
对于阴性对照组(图5～图10中表示为Vehicle。另外，以下称为“溶剂给药组”)，以0.01ml/g体重的分量、5周连续每天仅强制经口给予0.3％CMC水溶液。对于阳性对照组(图5～图10中和下文中称为“P30给药组”)，为了能够以0.01ml/g体重的分量给药，将吡格列酮3mg悬浮于0.3％CMC水溶液中，5周连续每天强制经口给药(给药量：30mg/kg体重/天)。
对于试样给药组(图5～图10中和下文中称为“No200给药组”)，为了能够以0.01ml/g体重的分量给药，将上述(1)中精制的蜜桔黄素20mg悬浮于0.3％的羧甲基纤维素(CMC)水溶液中，5周连续每天强制经口给药(给药量：200mg/kg/天)。
(5-1)糖尿病模型小鼠的蜜桔黄素摄取对体重等的影响
(5-1-1)蜜桔黄素摄取对体重等的影响
关于各组小鼠的体重、摄食量、白色脂肪组织重量、肝脏重量的测定，以及血中TG、血中T-CHO、血中脂联素的各浓度的测定，与上述实施例3同样进行，其结果示于表7中(n＝10)。另外，特别是关于脂联素的结果，示于图8A中。
另外，血中胰岛素浓度如下测定。在实验结束日，由各组小鼠的尾静脉分别采血1mL。以4℃、3000×g的条件将所得到的血液离心分离15分钟，得到血浆。血中胰岛素浓度使用基于酶免疫测定法的Lbis Insulin-Mouse(U型)(Shibayagi Co.，Ltd.制)进行测定。
[表7]
Figure BDA0000132369620000261
*：p＜0.05  ***：p＜0.005
在所有组中，体重增加量、摄食量、白色脂肪组织重量和肝重量均没有发现显著性差异，表明上述浓度的蜜桔黄素的摄取不会对糖尿病模型小鼠的体重增加、摄食量、白色脂肪细胞重量和肝重量造成影响。
关于血中TG浓度，相对于溶剂给药组，No200给药组和P30给药组均降低，但没有发现显著性差异。由此表明，通过以一定期间摄取200mg/kg的蜜桔黄素，糖尿病模型小鼠的血中TG浓度改善为与摄取吡格列酮时同等的程度。
关于血中T-CHO浓度，相对于溶剂给药组，在P30给药组中显著降低(p＜0.05)，但在溶剂给药组与No200给药组之间没有发现显著性差异。由此表明，上述浓度的蜜桔黄素摄取不会对血中T-CHO浓度造成影响。
关于血中胰岛素浓度，相对于溶剂给药组，在No200给药组和P30给药组中确认到了降低倾向，但没有发现显著性差异。另一方面，关于血中脂联素浓度，P30给药组高至溶剂给药组的2.5倍以上，但No200给药组中没有发现如此大的上升。
由此表明，若以一定期间摄取上述浓度的蜜桔黄素，则具有血中胰岛素浓度改善为与摄取吡格列酮时同等程度的倾向，但血中脂联素浓度没有如吡格列酮那样上升。
(5-1-2)蜜桔黄素摄取对空腹时的血糖值的影响
给药开始2周后和5周后，测定空腹时血糖值(n＝10)。血中葡萄糖浓度的测定如上述实施例1那样进行。结果示于表8和图5A中。
[表8]
Figure BDA0000132369620000271
*：p＜0.05
给药开始2周后和5周后，No200给药组相对于溶剂给药组均显示出显著低的值(p＜0.05)，这表明蜜桔黄素具有使糖尿病模型小鼠的空腹时血糖值降低的作用。
(5-1-3)蜜桔黄素摄取对糖耐量的影响
对于给予了蜜桔黄素等的糖尿病模型小鼠(ob/ob)进行经口糖耐量试验(OGTT)，研究对糖耐量的影响。
在给药开始第4周，使各给药组的小鼠断食16小时，其后，以2g/kg体重强制经口给予葡萄糖。给予葡萄糖后，在0分钟、30分钟、60分钟和120分钟的时刻，由各小鼠的尾静脉分别采血1mL。以4℃、3000×g的条件将所得到的血液离心分离15分钟，得到血浆(n＝10)。与上述实施例1同样地测定血中葡萄糖浓度。结果示于表9和图5B中。
[表9]
Figure BDA0000132369620000272
*：p＜0.05  **：p＜0.01。
刚给予葡萄糖后，相对于溶剂给药组，No200给药组和P30给药组均显示出显著低的血糖值(p＜0.05)。即使在给药30分钟后也同样(p＜0.05和p＜0.005)。由此表明，蜜桔黄素具有改善糖尿病模型小鼠的糖耐量的作用。
(5-2)蜜桔黄素摄取与白色脂肪组织和肝脏内的基因的表达量
针对蜜桔黄素的摄取对白色脂肪组织和肝脏内的基因的mRNA表达量造成什么样的影响进行测定(n＝10)。结果示于表10、以及图6A、图7A、B、图8B、图9A～C和图10A～D中。
[表10]
Figure BDA0000132369620000281
表中[W]表示白色脂肪组织，[L]表示肝脏。
*：p＜0.05、**：p＜0.01、***：p＜0.005。
5周的给药期间结束后，利用实时RT-PCR法测定表10所示的各基因的mRNA表达量。关于实时RT-PCR，根据ISOGEN(NIPPON GENE CO.，LTD.制造)的说明书，由白色脂肪组织和肝脏提取RNA。接着，使用逆转录系统试剂盒(Promega社制造，USA)由1μg的RNA制备cDNA。接着，根据FastStart universal SYBR(注册商标)GreenMaster PCR试剂盒试剂(Roche Diagnostics社制造，Germany)的说明书，对于上述各基因制作合适的引物。
测定中使用实时PCR系统7700HT(Applied Biosytems社制造，USA)，以所述cDNA为模板，进行实时PCR。依据所述PCR试剂盒试剂设定各反应条件。关于RNA量的定量分析，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)作为标准，通过比较Ct法进行。
相对于溶剂给药组，在No200给药组中，GLUT4和脂联素的表达量显著增高(p＜0.01)。在溶剂给药组与P30给药组之间没有发现显著性差异。由此表明，蜜桔黄素在糖尿病模型小鼠中表现出利用现有的胰岛素抵抗性改善药吡格列酮所未发现的、促进白色脂肪组织内的GLUT4基因表达的作用。另外表明，通过促进脂联素基因的表达，具有促进脂联素分泌的作用。
关于糖异生基因PEPCK的表达量，相对于溶剂给药组，No200给药组和P30给药组均显示出显著低的值(p＜0.05)。另外，G6Pase的表达量也同样(p＜0.005)。由此表明，蜜桔黄素在糖尿病模型小鼠中具有抑制糖异生相关基因群表达的作用。
相对于溶剂给药组，在No200给药组中，TNF-α基因的表达量显著降低(p＜0.005)，但在P30给药组中观察到略微的上升。另外，关于MCP-1和IL-6基因的表达量，相对于溶剂给药组，No200给药组和P30给药组均显著降低(p＜0.005)。
以上内容表明，蜜桔黄素在糖尿病模型小鼠中具有抑制TNF-α、MCP-1、IL-6等有害脂肪细胞因子基因群的表达的作用。
关于PPARγ的表达量，在溶剂给药组与P30给药组之间没有发现显著性差异，但在No200给药组中显著上升(p＜0.005)。关于aP2的表达量，相对于溶剂给药组，在P30给药组中观察到显著的上升(p＜0.005)，但No200给药组相对于P30给药组显示出显著低的值(p＜0.05)。另一方面，关于LPL的表达量，在No200给药组中观察到上升，在P30给药组中观察到降低，但均没有发现显著性差异。另外，关于Perilipin的表达量，在No200给药组中，相对于溶剂给药组观察到显著的上升，但在P30给药组与溶剂给药组之间没有发现显著性差异。
以上内容表明，蜜桔黄素在糖尿病模型小鼠中具有促进PPARγ的表达、并介由脂肪细胞的作用而适当地控制血中脂质量的特征性作用。另外表明，SPE可抑制脂质蓄积控制相关基因，降低血中中性脂肪浓度。另外表明，蜜桔黄素促进PPARγ的表达，由此促进脂联素的表达，从而促进脂联素的分泌。
以上内容表明，蜜桔黄素与噻唑烷系降血糖剂不同，虽然促进PPARγ的功能，但难以产生脂质生物合成亢进的副作用。
(5-3)蜜桔黄素摄取与GLUT4蛋白表达量
实验结束后，如上述实施例1那样取下白色脂肪组织和骨骼肌，通过蛋白质印迹法检测GLUT4蛋白的表达量。以Na+/K+ATPaseα-1蛋白作为内标，对GLUT4蛋白的表达量进行定量。结果示于表11、以及图6B和图6C中。
[表11]
Figure BDA0000132369620000301
相对于溶剂给药组，No200给药组中表达量增大至约1.7倍，另外P30给药组中表达量增大至约2.2倍。由此表明，蜜桔黄素在糖尿病模型小鼠中具有促进白色脂肪组织内的GLUT4蛋白质表达的作用。
另外，如上所述，表明：蜜桔黄素摄取时在白色脂肪组织中GLUT4高度表达，即使与葡萄糖的摄入增加相伴的脂质合成活跃，也不会产生中性脂肪或总胆固醇的血中浓度增加、白色脂肪组织的重量增加、胰岛素的血中浓度变化、肝脏重量的增加、体重的增加和摄食量的变化等副作用。
相对于溶剂给药组，No200给药组中表达量增大至约6倍，P30给药组中表达量增大至约3倍。由此表明，蜜桔黄素具有促进糖尿病模型小鼠的骨骼肌内的GLUT4蛋白表达的特别优异的作用。
实施例6
6.橘皮素对利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的小鼠的效果
将6周龄的雄性C57BL/6小鼠预备饲育1周(-9～-8周)，然后分成3组。对1组提供LFD8周、其他2组提供HFD8周(-8～+5周)。第8周(15周龄)以后至第13周，对各组5周连续每天强制经口给予下述药剂(以下，在实施例6中称为LFD摄取组和HFD摄取组)。LFD、HFD的组成与实施例3相同。
以0.01ml/g体重的分量对LFD摄取组(n＝8)和HFD摄取组(n＝11)提供0.3％CMC水溶液。另外，除了HFD摄取之外，为了能够以0.01ml/g体重的分量给药，将橘皮素悬浮于0.3％的CMC溶液中，并以200mg/kg/天的分量给药，将该组(n＝11)表示为“T200给药组；简写符号HFD+T200”。图12A中示意性示出上述3组的摄食和药剂给药的时间表。
(6-1)橘皮素摄取对体重、摄食量的影响
结果示于表12中。关于实验结束后的体重增加量，HFD摄取组相对于LFD摄取组显示出显著高的值(p＜0.005)。另外，在HFD摄取组与T200给药组之间没有发现显著性差异。
每周测定两次各组小鼠的摄食量。关于1次测定，设为24小时内的摄食量/3只/笼，求出5周的平均值。HFD摄取组与LFD摄取组相比，摄食量显著降低(p＜0.005)。另外，在HFD摄取组与T200给药组之间，摄食量的变化没有发现显著性差异。
[表12]
Figure BDA0000132369620000311
***：p＜0.005。
由此表明，即使在高脂饮食中以200mg/kg添加橘皮素，也不会对体重增加造成影响，另外不会对摄食量造成影响。由于摄食量无变化，因而暗示仅利用橘皮素时对食物行为和代谢所造成的影响极小。
(6-2)橘皮素摄取对组织重量的影响
实验结束后将各组小鼠解剖，取出脏器等，分别测定重量。从腹膜后腔和附睾的周边取下白色脂肪组织。结果示于表13中。
[表13]
Figure BDA0000132369620000312
*：p＜0.05，***：p＜0.005。
实验结束后的HFD摄取组的白色脂肪组织重量与LFD摄取组相比显示出显著高的值(p＜0.005)。另外，在HFD摄取组与T200给药组之间，腹膜后腔白色脂肪组织、附睾白色脂肪组织的重量均没有发现显著的变化，所述白色脂肪组织的重量的合计值也没有发现显著的变化。
在HFD摄取组的肝重量与LFD摄取组的肝重量之间没有发现显著性差异，在HFD摄取组与HFD+T200给药组之间也同样。另一方面，HFD摄取组的肾脏重量相对于LFD为显著高的值(p＜0.05)，但在HFD摄取组与T200给药组中，肾脏重量没有观察到显著的变化。
以上内容表明，在摄取高脂饮食时即使以200mg/kg在饲料中添加橘皮素，也不会对白色脂肪组织重量和肝重量造成影响。另外表明，因高脂饮食的摄取而增加的肾脏重量不会进一步增大。
(6-3)橘皮素摄取对中性脂肪等的血中浓度的影响
实验结束后，在给药开始时、给药开始2周后和5周后的时刻，测定空腹时的血中中性脂肪浓度等。结果示于表14和表15中。
血中中性脂肪(TG)浓度的测定与实施例1同样进行。结果示于表14中。结果表明，在所有时刻，相对于LFD摄取组，HFD摄取组均显示出显著高的值(p＜0.005)，但在HFD摄取组与T200给药组之间没有发现显著性差异。
[表14]
Figure BDA0000132369620000321
*：p＜0.05。
血中总胆固醇(T-CHO)浓度的测定与实施例1同样进行。结果示于表15中。结果表明，在所有时刻，相对于LFD摄取组，HFD摄取组均显示出显著高的值(p＜0.005)，但在HFD摄取组与T200给药组之间没有发现显著性差异。
以上内容表明，即使以200mg/kg在食物中添加橘皮素，也不会对高脂饮食摄取时的血中TG浓度和血中总胆固醇浓度造成影响。
[表15]
Figure BDA0000132369620000322
***：p＜0.005。
(6-4)橘皮素摄取对空腹时的血糖值的影响
葡萄糖的血中浓度的测定与实施例1同样进行。以下所述的实验结果示于表16中。表16表示橘皮素对于高脂饮食摄取时血中葡萄糖浓度(mg/dl)的效果。结果表明，在所有时刻，相对于LFD摄取组，HFD摄取组均显示出显著高的值(p＜0.005)。另外，相对于HFD摄取组，T200给药组在给药期间开始5周后没有发现显著的变化，但在给药期间开始2周后显示出显著低的值(p＜0.005)。由此表明，橘皮素对由高脂饮食摄取所引起的空腹时血糖值上升具有抑制作用。
[表16]
Figure BDA0000132369620000331
**：p＜0.005  #：p＜0.05
(6-5)橘皮素的摄取对糖耐量的影响
经口糖耐量试验(OGTT)与实施例1同样进行。结果示于表17中。结果表明，在所有时刻，相对于LFD摄取组，HFD给药组均显示出显著高的血糖值(p＜0.005～0.005)，但在HFD摄取组与T200给药组之间没有发现显著性差异。由此表明，即使以200mg/kg在食物中添加橘皮素，也不会对高脂饮食摄取时的糖耐量造成影响。
[表17]
Figure BDA0000132369620000332
*：p＜0.05，**：p＜0.01  ***：p＜0.005
(6-6)橘皮素对糖转运蛋白和/或转录因子的表达的影响
与实施例1同样地，在实验结束后取出白色脂肪组织，利用实时RT-PCR法测定GLUT4基因和PPARγ基因的mRNA表达量。表18以及图11A和图11B中示出了将HFD设为1时的表达量之比。
对白色脂肪组织内的GLUT4和PPARγ的mRNA表达量进行比较发现，HFD摄取组相对于LFD摄取组和T200给药组更高。另一方面，关于骨骼肌内的GLUT4的mRNA的表达量，HFD摄取组比LFD摄取组更低，但T200给药组升高。
由此表明，橘皮素对因高脂饮食摄取而上升的白色脂肪组织内的GLUT4基因和PPARγ基因的表达具有抑制作用，并且对因高脂饮食摄取而降低的骨骼肌内的GLUT基因的表达具有恢复作用。
[表18]
Figure BDA0000132369620000341
W：白色脂肪组织  M：骨骼肌
由此暗示，橘皮素在高脂饮食摄取时促进骨骼肌中血糖的摄入，而使血糖值降低，另外，通过抑制白色脂肪组织中血糖的摄入，从而抑制脂肪细胞的肥大化。
由以上内容可以认为，白色脂肪组织以及骨骼肌中的GLUT4基因的表达量对于所给予的胰岛素抵抗性改善剂、或者糖尿病或生活习惯病的预防和/或治疗剂的筛选是有效的指标。
实施例7
7.蜜桔黄素对利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的小鼠的效果
将6周龄的雄性C57BL/6小鼠预备饲育1周(-9～-8周)，然后分成4组(各组的n＝9)。对1组提供LFD 8周、对其他3组提供HFD 8周(-8～+5周)。第8周(15周龄)以后至第13周，对各组5周连续每天强制经口给予下述药剂。以下，在实施例7中将摄取上述LFD的组称为LFD摄取组，将摄取上述HFD且不给予蜜桔黄素的组称为HFD摄取组。LFD、HFD的组成与实施例3相同。
以0.01ml/g体重的分量对LFD摄取组和HFD摄取组提供0.3％CMC水溶液。另外，在以下实施例7中，除了HFD摄取之外，为了能够以0.01ml/g体重的分量给药，将蜜桔黄素悬浮于0.3％的CMC溶液中，并以10mg/kg/天的分量给药，将该组表示为“No10给药组；简写符号HFD+No10”，另外同样地，将以100mg/kg/天的分量给药的组表示为“No100给药组；简写符号HFD+No100”。图12A中示意性示出上述4组的摄食和药剂给药的时间表。
(7-1)蜜桔黄素对肥胖诱导后的小鼠的体重和摄食量的影响
各组的体重增加量示于表19和图12B中。表中，[最终增加]表示第0～+5周的增加量。利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后，HFD摄取组相对于LFD摄取组显示出显著高的体重(p＜0.005)，体重增加量也同样。另外，相对于HFD摄取组，No10给药组中体重增加量没有发现显著的变化，但No100给药组中为显著低的值(p＜0.05)。由此表明，蜜桔黄素对利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的体重增加具有抑制作用。
[表19]
Figure BDA0000132369620000351
*：p＜0.05  ***：p＜0.005  #：p＜0.05。
实验期间中的摄食量的变化示于表20和图12C中。关于各组小鼠的摄食量，从药剂给药开始时计算，每天进行测定，直至第1～8天(第0周)。对于各组，分笼测定24小时以内的摄食量，求出每一只小鼠的摄食量的平均值(g)。第0天的值表示给药开始前一天的值。给药开始第2周以后，每周测定2次。[最终平均]表示5周的平均值。
关于HFD摄取组，第0周的摄食量相对于LFD摄取组显示出显著低的值(p＜0.005)，最终平均也是HFD摄取组相对于LFD摄取组显示出显著低的值(p＜0.005)。
[表20]
Figure BDA0000132369620000352
***：p＜0.005  #：p＜0.05。
另外，相对于HFD摄取组，No100给药组的第4天的摄食量显示出显著低的值(p＜0.05)，但在其他时刻，No10给药组与No100给药组之间没有发现显著性差异。此外，以最终平均来看，在HFD摄取组、No10给药组、No100给药组之间没有发现显著性差异。
以上内容表明，在以100mg/kg对利用高脂饮食进行了肥胖诱导的小鼠经口给予蜜桔黄素时，虽然给药初期会抑制摄食，但并没有影响整个给药期间的摄食量。由此暗示，体重增加量的减少并不是主要起因于摄食量的减少(参见图12B和图12C)。
(7-2)利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的蜜桔黄素摄取对各组织重量的影响
实验结束后，将小鼠解剖，摘除表21所示的脏器等，分别测定重量。结果示于表21和图13A中。
肝重量和肾脏重量在所有的组之间均没有发现显著性差异，但关于脂肪组织的重量，HFD摄取组相对于LFD摄取组显著高(p＜0.005)，No100给药组相对于HFD摄取组显示出显著低的值(p＜0.05)。
以上内容表明，即使以10～100mg/kg在食物中添加蜜桔黄素，也不会对肝脏和肾脏的重量造成影响，但以100mg/kg给药时，则可抑制白色脂肪的增加。
[表21]
Figure BDA0000132369620000361
***：p＜0005  #：p＜0.05。
(7-3)利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的蜜桔黄素摄取对血中脂质浓度的影响
上述实验结束后，与实施例1同样地测定空腹时的血中的中性脂肪、总胆固醇、葡萄糖、脂联素的各浓度；以及满腹时的血中中性脂肪、血中总胆固醇、葡萄糖的各浓度。表22中，脂联素的相对浓度表示血中脂联素相对于白色脂肪组织的总重量的比浓度。
结果示于表22中。另外，血中中性脂肪(甘油三酯)、血中总胆固醇、血中葡萄糖的结果示于图13B中。LFD摄取组和HFD摄取组的中性脂肪和总胆固醇的血中浓度与实施例3的(3-3)相比为明显较小的值，但认为这是小鼠周龄以及利用HFD的肥胖诱导期间的不同所引起的。
[表22]
Figure BDA0000132369620000371
除*1以外单位为mg/dl，*1脂联素单位为μg/ml，*2脂联素的相对浓度单位为μg/ml/g，***：p＜0.005  #：p＜0.05。
HFD摄取组的空腹时血中葡萄糖浓度相对于LFD摄取组为显著高的值(p＜0.005)。在HFD摄取组与No10给药组之间没有发现显著性差异，但在与No100给药组之间显示出显著低的值(p＜0.005)。需要说明的是，满腹时血中葡萄糖浓度在各组之间没有发现显著性差异。
关于空腹时的血中TG浓度，相对于LFD摄取组，HFD摄取组显示出显著高的值(p＜0.005)，但在与No10给药组和No100给药组之间没有发现显著性差异。需要说明的是，满腹时的血中TG浓度在各组之间没有发现显著性差异。
关于血中T-CHO浓度，相对于LFD摄取组，HFD摄取组在空腹时和满腹时均显示出显著高的值(p＜0.005)。另外，在HFD摄取组与No10给药组和No100给药组之间，空腹时和满腹时的血中T-CHO浓度没有发现显著性差异。
以上内容表明，0～100mg/kg的蜜桔黄素的给药可对利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的空腹时血糖值的上升进行抑制，但在通过摄食而使血糖值上升时则不产生影响。这表明，蜜桔黄素通过抑制消化系统内的淀粉和多糖类向葡萄糖的消化过程、或者葡萄糖的吸收过程，其结果并非抑制血糖值水平，而是促进葡萄糖向白色脂肪组织、肝脏、肾脏以外的任意器官中吸收，从而使血糖值水平降低。另外表明，对利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的血中TG和T-CHO浓度不造成影响。
相对于LFD摄取组，HFD摄取组中，利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的血中脂联素浓度显示出上升的倾向，但没有发现显著性差异。另外，在HFD摄取组与No10给药组或No100给药组之间均没有发现显著性差异。
以血中脂联素相对于白色脂肪组织的总重量的比浓度的形式，由上述测定值求出脂联素的相对浓度。相对于LFD摄取组，HFD摄取组中，血中脂联素的比浓度显著降低。另外，相对于HFD摄取组，在No10给药组中没有发现显著性差异，但在No100给药组中显示出显著高的值。
利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的血中脂联素的浓度没有观察到变化，但血中脂联素的比浓度上升，由此表明，每单位重量的白色脂肪组织的脂联素的产生量通过10～100mg/kg的蜜桔黄素的给药而增加。
以上内容表明，若利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导，则会引起与胰岛素抵抗性的发生相伴的脂肪细胞的肥大化，这会使单位重量的白色脂肪组织的脂联素产生量降低，另外表明，蜜桔黄素具有使降低的脂联素产生量恢复的作用。另外表明，如专利文献3和实施例5所示那样，蜜桔黄素所致的血中脂联素的表达上升至通常时的2～3倍的现象限定于糖尿病的发病时。
(7-4)利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的蜜桔黄素摄取对糖耐量的影响
糖耐量实验与上述实施例2同样进行(n＝9)。结果示于表23以及图14A和图14B中。
[表23]
Figure BDA0000132369620000381
***：p＜0.005  #：p＜0.05
AUC：设HFD为100时以百分率(％)表示0～120分钟的血中葡萄糖浓度曲线的积分值。
在刚给予葡萄糖后、15分钟后、30分钟后、60分钟后、120分钟后的各时刻，相对于LFD摄取组，HFD摄取组中血中葡萄糖浓度显著上升(均为p＜0.05)。在HFD摄取组与No10给药组之间，任意时刻均没有发现显著性差异。另一方面，在HFD摄取组与No100给药组之间，在15分钟后、60分钟后的时刻血中葡萄糖浓度分别显著降低(均为p＜0.05)。
另外，若以血中浓度曲线下面积(AUC)进行比较，相对于+LFD摄取组，HFD摄取组中观察到显著的上升(p＜0.005)。在HFD摄取组与No10给药组之间没有发现显著性差异，但在与No100给药组之间发现了显著性差异(p＜0.05)。
以上内容表明，10～100mg/kg的蜜桔黄素给药可改善利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的小鼠的糖耐量。
(7-5)利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的蜜桔黄素摄取对脂肪细胞的大小的影响
实验结束后，取下小鼠附睾的脂肪组织，制成切片，利用苏木精和曙红进行染色(n＝9)。以200倍对其进行显微镜观察，比较显微镜拍摄视野范围内所看见的细胞的大小。结果示于图15A～图15D中。
HFD摄取组(图15B)与LFD摄取组(图15A)相比，实验结束后的脂肪细胞的大小变大。另外，在HFD摄取组与No10给药组(图15C)之间没有发现较大差异，但No100给药组(图15D)的脂肪细胞变小。
以上内容表明，在利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后蜜桔黄素具有使白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的作用。在实施例2的糖尿病模型小鼠中没有发现该效果。即，通过200mg/ml的蜜桔黄素的给药，在糖尿病发病状态下不至于使肥大化的白色脂肪组织的脂肪细胞缩小，但是若对于高脂饮食摄取所引起的肥胖状态、即糖尿病发病前，则通过10～100mg/kg的蜜桔黄素的给药，显示出具有使白色脂肪组织的脂肪细胞缩小的效果。
认为这些观察结果表明，蜜桔黄素促进脂肪细胞的分化诱导，使肥大化的脂肪细胞分裂，或者通过将肥大化的脂肪细胞替换成新分化的脂肪细胞，从而促进白色脂肪组织中的脂肪细胞的小型化，改善了糖尿病发病前阶段的胰岛素抵抗性。
(7-6)利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的蜜桔黄素摄取与白色脂肪组织中的基因表达
以mRNA的量对下述表24所示的利用高脂饮食摄取进行肥胖诱导后的小鼠脂质生物合成相关基因及其他基因的表达进行测定，研究蜜桔黄素对这些基因表达的效果(n＝9)。各基因的表达量以将HFD设为1时的表达量之比表示。结果示于表24中。
[表24]
Figure BDA0000132369620000401
*：p＜0.05  ***：p＜0.005  #：p＜0.05  ##：p＜0.01  ###：p＜0.005。
相对于LFD摄取组，HFD摄取组的SCD1、FAS、ACC1、Glut4的mRNA表达量显示出显著低的值(SCD1和Glut4中p＜0.05，FAS和ACC1中p＜0.005)。另外，HFD摄取组与LFD摄取组相比，脂联素、TNF-α、MCP-1和PPARγ的mRNA表达量显示出显著高的值(脂联素、TNF-α和PPARγ中p＜0.05，MCP-1中p＜0.005)。
另外，相对于HFD摄取组，HFD+No10和No100给药组中SCD1、FAS、ACC1、DAGT1、PPARγ和SREBP1-c的mRNA表达量显示出显著高的值(DAGT1和PPARγ中p＜0.01，SCD1、FAS、ACC1、SREBP1-c)。在HFD摄取组与No10给药组之间，TNF-α的mRNA的表达量没有发现显著性差异，但No100给药组显示出显著低的值。
由以上内容可知，蜜桔黄素对白色脂肪组织的基因表达有影响。
橘皮素具有降低空腹时血糖值(血中葡萄糖浓度)的效果，但对于糖耐受不良未必观察得到效果。蜜桔黄素对空腹时血糖值和糖耐受不良这两者均具有效果。可知由50重量％的蜜桔黄素和50重量％的橘皮素组成的组合物能够抑制所述脂质异常。
工业实用性
本发明在药物制剂、功能性食品、健康食品等的制造和开发领域中有用。

Claims (10)

1.一种代谢综合征的治疗用物质的筛选方法，所述代谢综合征表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常，该筛选方法包括下述工序(1)～(3)：
(1)提取工序，由以规定的量按规定的期间给予被测物质的构成被测物质给药组的非人哺乳动物、和未以所述规定的量按所述规定的期间给予所述被测物质的构成被测物质非给药组的非人哺乳动物分别采集骨骼肌，由骨骼肌提取总RNA级分；
(2)定量工序，利用规定的方法，对所述提取工序中提取的各总RNA级分中所含的、编码糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行定量；和
(3)判定工序，对于分别构成所述被测物质给药组和被测物质非给药组的所述非人哺乳动物在所述规定期间中的体重增加量、摄食量和编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量，在组间进行比较分析，从而判定针对所述代谢综合征的效果。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其中，所述糖转运蛋白基因为小鼠GLUT4及其同源物。
3.如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述规定的方法包括以下工序：
使用逆转录酶由编码所述糖转运蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；
使用所述转运蛋白基因特异性引物，对所述cDNA进行扩增的工序；
使用选自由荧光标记核酸、同位素标记核酸和核酸染色剂组成的组中的试剂，利用与所述试剂对应的检测法对扩增产物进行定量的工序；和
对编码所述糖转运蛋白基因的RNA的表达量进行确定的工序。
4.一种代谢综合征的治疗用组合物，所述代谢综合征是糖尿病发病前的表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常的代谢综合征，其中，
所述组合物含有在干燥重量中含70重量％～100重量％的蜜桔黄素的蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类的果皮提取级分，以所述果皮提取级分的干燥重量换算，以每天5mg/kg～200mg/kg的用量经口给药，所述组合物具有下述作用(1)～(4)：
(1)抑制体重增加量的上升而不影响摄食量的作用；
(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的蛋白质表达的作用；
(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；和
(4)降低血中葡萄糖浓度而不影响血中甘油三酯浓度的作用。
5.如权利要求4所述的代谢综合征的治疗用组合物，其中，所述蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类为扁平橘(Shiikuwasha；C.depressa)，所述果皮提取级分中的蜜桔黄素含量在干燥重量中为95重量％～100重量％，所述用量为每天10mg/kg～100mg/kg。
6.一种代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，所述代谢综合征表现为内脏脂肪型肥胖、高血糖和脂质异常，其中，
所述组合物含有在干燥重量中含45重量％～55重量％的蜜桔黄素和45重量％～55重量％的橘皮素的蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类果皮提取级分，以所述果皮提取级分的干燥重量换算，以0.5g/人/天～8.0g/人/天的用量经口摄取，所述组合物具有下述作用或特征(1)～(4)：
(1)抑制体重增加量的增加而不影响摄食量的作用；
(2)促进骨骼肌组织内或骨骼肌细胞内的小鼠GLUT4及作为其同源物的糖转运蛋白基因的mRNA或蛋白质表达的作用；
(3)促进肥大化内脏周边白色脂肪组织缩小的作用；和
(4)降低血中甘油三酯浓度而不影响血中葡萄糖浓度的作用。
7.如权利要求6所述的代谢综合征的预防和/或治疗用组合物，其中，所述蜜柑区(Acrumen(VII)section)柑橘类为扁平橘Citrus depressa，所述用量为1.0g/人/天～6.0g/人/天。
8.一种功能性食品，其含有权利要求4～7所述的代谢综合征的治疗用组合物。
9.一种健康食品，其含有权利要求4～7所述的代谢综合征的治疗用组合物。
10.一种药物制剂，其含有权利要求4～7所述的代谢综合征的治疗用组合物。
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