KR101735061B1 - 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 α-글루코시다제(glucosidase) 및 α-아밀라아제(amylase)의 저해 활성을 촉진하고, 세포 독성이 없으며, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 우수한 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물은 비만 동물모델에서 간 독성을 일으키지 않으며, 체중 및 부위별 지방무게를 감소시키고, 혈중 HDL-콜레스테롤의 농도를 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition containing Artemisia annua extract, artemisinin or dihydroartemisinin for preventing or treating obesity}

본 발명은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 있었다. 특히, 바쁜 현대인들의 경우 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 체중 과다 및 비만이 증가하고 있다. 체중 과다는 체질량 지수 (BMI, 체중을 키의 제곱으로 나눈 비만 척도)가 25 이상 30 미만을 의미하며, 비만은 체질량 지수가 30 이상일 때를 의미한다.

미국 성인의 3분의 2는 체중 과다이거나 비만이며, 체중 과다는 혈압과 콜레스테롤 수치를 높여 심장 질환 등의 각종 성인병의 발병률을 증가시킨다. 비만이 여러 가지 질병에 미치는 영향은 매우 심각하여 전 세계 당뇨병 환자의 80 %, 심장질환의 21 %가 비만이 원인인 것으로 알려져 있다. 이 외에도 자궁암, 신장암, 유방암 등 각종 암 또한 비만과 직, 간접적으로 연관되어 있으며, 비만이나 과체중의 경우 수면무호흡증, 골 관절염, 담석증 등의 발병률도 정상인보다 높다 (Stein CJ, Colditz GA. The epidemic of obesity. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 2522-2525. ; Kopelman PG. Obesity as a medical problem. Nature 2000 Apr 6; 404(6778): 635-43.).

비만은 한 가지 원인으로 발생하는 질병이 아니라 유전적, 환경-사회적, 정신적 등 여러 가지 요인들이 복합적으로 작용하여 발생하기 때문에 어느 한 가지 방법으로 치료하기는 어렵다. 현재 비만을 치료하기 위한 방법은 식사요법, 운동요법, 행동요법 등 생활 습관을 교정하는 방법과 약물치료 및 수술적 치료로 나눌 수 있다. 약물이나 수술적 치료에 앞서 생활습관을 교정하기 위한 적극적인 노력이 선행되어야 하지만, 생활습관을 교정하는 일이 쉽지 않을 뿐 아니라 생활습관 교정만으로 감소시킬 수 있는 체중은 한계가 있다. 따라서 많은 경우에 생활습관 교정과 함께 약물치료가 필요하다.

이러한 비만의 약물 치료를 위해 매년 많은 항비만 제제들이 개발되고 있지만 현재 사용 가능한 비만 치료 약물은 많지 않으며, 대부분 소화나 식욕을 억제시키는 제제에 국한되어 있다. 소화나 식욕을 조절하는 제제의 경우, 습관성 때문에 향정신성 약물로 분류되며, 소화억제제는 설사, 변비 등의 부작용을 나타낸다. 2010년까지 미국 FDA가 장기사용을 승인한 대표적 비만치료 약물은 노르에피네프린 (norepinephrine)과, 세로토닌 (serotonin)의 재흡수를 억제하는 작용을 가진 시부트라민 (sibutramine; Reductil)과, 췌장 및 소화기계에서 분비되는 리파제 (lipase)를 억제하여 효과를 나타내는 오르리스타트 (orlistat; Xenical)가 있었다 (Yanovski SZ, Yanovski JA. Obesity. N Engl J Med 2002; 346: 591-602.).

그러나 시부트라민은 혈압상승, 불면증, 구강건조, 어지러움 등의 부작용이 흔하고, 심근경색과 뇌졸중 등 심혈관계 증상이 나타날 위험이 있어 2010년 10월 미국 및 국내에서 퇴출되었다. 또한 오르리스타트는 설사, 지방변, 분실금 등의 부작용이 흔하고 한국인과 같이 서양인에 비해 지방섭취가 적은 경우에는 약물의 효과가 뚜렷하지 않아 사용이 제한되고 있다 (김상만. Orlistat에 대한 연구. 대한비만학회지 1998; 7(4): 287-92.).

따라서, 아직까지 비만 억제 효과가 좋고 장기 복용의 안전성이 확인된 비만 치료 약물이 아직은 존재하지 않기 때문에 이를 대체할 만한 비만 예방 및 치료제가 요구되는 실정이다.

한편, 개똥쑥은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 한해살이 풀로 잔잎쑥, 개땅쑥이라고도 한다. 풀 전체에 털이 없고 특이한 냄새가 난다. 줄기는 녹색으로 가지가 많이 갈라진다. 잎은 어긋나고 2～3회 가늘게 깃꼴로 깊게 갈라진다. 길이 4～7 cm로 모양은 바소꼴이고 겉에 잔털과 선점이 있다. 꽃은 6～9월에 녹황색으로 피며, 작은 두상화가 이삭처럼 달려서 전체가 원추꽃차례를 이룬다. 두상화는 공 모양이고 지름 1.5 cm이다. 총포 조각은 털이 없고 2～3줄로 배열하며, 외포 조각은 긴 타원형으로 녹색이다. 열매는 수과로 길이 약 0.7 mm이다. 한방에서는 발열 감기, 학질, 소아경기, 소화불량, 이질 등의 치료에 사용한다. 또한, 개똥쑥은 항말라리아제인 아르테미시닌(artemisinin)의 공급원으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 개똥쑥 추출물의 항비만 효과에 관해서는 보고된 바가 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상황이다.

이에 본 발명자들은 기존의 비만 치료를 위해 개발된 약물들의 한계점을 극복하고, 비만 억제 효과가 높으며, 부작용이 적은 새로운 약물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 개똥쑥 추출물 및 이로부터 분리한 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌이 우수한 항 비만 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 α-글루코시다제(glucosidase) 및 α-아밀라아제(amylase)의 저해 활성을 촉진하고, 세포 독성이 없으며, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 우수한 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물은 비만 동물모델에서 간 독성을 일으키지 않으며, 체중 및 부위별 지방무게를 감소시키고, 혈중 HDL-콜레스테롤의 농도를 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 개똥쑥 추출물이 α-글루코시다제의 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 개똥쑥 추출물이 α-아밀라아제의 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 개똥쑥 추출물, 및 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌의 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌이 지방 세포 내 TG 축적에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌이 지방세포에서 C/EBPα의 발현 및 핵 내 이동에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌이 지방세포에서 PPARγ의 발현 및 핵 내 이동에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 개똥쑥 추출물이 비만 동물 모델의 체중에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9는 개똥쑥 추출물이 비만 동물 모델의 사료 섭취량에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 개똥쑥 추출물이 비만 동물 모델의 부위별 지방 무게에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 11은 개똥쑥 추출물이 비만 동물 모델의 혈중 HDL-콜레스테롤 농도에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 12는 개똥쑥 추출물이 비만 동물 모델의 혈중 AST 수치에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 13은 개똥쑥 추출물이 비만 동물 모델의 혈중 ALT 수치에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

본 발명은 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 개똥쑥 추출물은 통상적인 추출 방법에 의해 수득할 수 있으며, 본 발명에서는 하기와 같은 방법으로 수득하였다.

먼저, 개똥쑥을 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조한다. 개똥쑥은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 개똥쑥에 적당한 양의 용매를 가하여 완전히 침지되도록 하여 개똥쑥 추출물을 수득한다. 추출 방법은 실온에서 함침하거나 가온할 수 있으며, 추출 용매의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 추출 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이다. 개똥쑥 추출물을 여과한 후, 용매를 증발시켜 농축하여, 최종 개똥쑥 추출물을 수득한다.

또한, 본 발명의 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌은 하기와 같은 방법으로 수득하였다.

상기 개똥쑥 추출물을 여과 및 농축하여 조추출물을 수득한다. 수득한 조추출물을 증류수에 현탁하고 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(n-butanol)로 순차 분획한다. 이들 분획물을 크로마토그래피하여 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌을 수득한다.

본 발명에 따른 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 α-글루코시다제(glucosidase) 및 α-아밀라아제(amylase)의 저해 활성을 촉진하고, 세포 독성이 없으며, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 우수한 효과를 가지고 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 항비만 효과가 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물은 비만 동물모델에서 간 독성을 일으키지 않으며, 체중 및 부위별 지방무게를 감소시키고, 혈중 HDL-콜레스테롤의 농도를 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌과 함께 비만 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 개똥쑥 추출물은 1일 0.1 내지 10000 mg/kg(체중)의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 비만의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 건강기능식품이란 질병의 예방 및 치료, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 비만의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 개똥쑥 추출물의 제조

개똥쑥을 깨끗이 물로 세척하여 이물질을 제거한 후, 상온에서 건조하고 분쇄하였다. 분쇄된 개똥쑥 분말을 에탄올에 침지시켜 밤새 추출하였다. 상기 개똥쑥 추출물을 여과한 후, 용매를 증발시켜 농축하여, 최종 개똥쑥 추출물을 수득하였다.

실시예 2. 개똥쑥 추출물로부터 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌의 분리

상기 실시예 1에서 제조한 개똥쑥 추출물을 여과 및 농축하여 조추출물을 수득하였다. 수득한 조추출물을 증류수에 현탁하고 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(n-butanol)로 순차 분획하였다. 이들 분획물을 크로마토그래피하여 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌을 수득하였다.

이하 실험에서는, 상기 과정을 통해 분리하여 수득하거나, Sigma aldrich사에서 구입한 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌을 이용하였다.

실험예 1. 대사 관련 효소 활성에 미치는 영향 검증

상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물이 대사 관련 효소 활성에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1-1. α-글루코시다제의 저해 활성 평가

ρ-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside가 α-글루코시다제에 의해 ρ-니트로페놀(Nitrophenol)과 글루코오스(glucose)로 분해되어 유출된 ρ-니트로페놀의 함량을 측정하여 α-글루코시다제의 활성 정도를 평가하였다. 보다 구체적으로, 생리식염수에 용해된 intestinal acetone powder 50 μL와 상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물 10 μL를 첨가하고 405 nm에서 흡광도를 측정한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 여기에 기질을 50 μL 첨가하고 실온에서 10분간 반응시킨 후, 405 nm에서 한번 더 흡광도를 측정하였다. 저해율은 아래의 계산식을 사용하여 계산하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 개똥쑥 추출물은 농도 의존적으로 α-글루코시다제의 저해 활성을 촉진함을 확인하였다.

1-2. α-아밀라아제의 저해 활성 평가

α-아밀라아제의 저해 활성은 분해되어 유출된 ρ-니트로페놀의 함량을 측정하여 평가하였다. α-아밀라아제는 인산완충액(0.1M phosphate, 0.2% BSA, 0.02%NaN₃, pH6.9)에 100U/mL의 농도로 용해시켜 사용하였다. α-아밀라아제50 μL에 상기 실시예 1에서 수득한 추출물을 10 μL씩 첨가한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 실온에서 5분간 반응시킨 후, 기질을 50 μL 첨가하고, 20분간 실온에서 반응시킨 후, 405nm에서 한번 더 흡광도를 측정하였다. 저해율은 아래의 계산식을 사용하여 계산하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 개똥쑥 추출물은 농도 의존적으로 α-아밀라아제의 저해 활성을 촉진함을 확인하였다.

실험예 2. 세포 독성 검증

상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물 및, 상기 실시예 2에서 수득한 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌의 세포 독성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 미분화된 3T3-L1 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁴ 개의 농도로 분주하고, 24시간 뒤에 상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물, 또는 상기 실시예 2에서 수득한 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 농도별로 처리하였다. 8일 후 50 μL/웰씩 1 mg/mL농도의 MTT를 처리하고 2시간 동안 반응시킨 뒤. 배양액을 제거하였다. 각 웰에 DMSO 150 μL를 처리한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률은 아래의 계산식을 사용하여 계산하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

Cell viability(%) = Abs solvent/Abs sample ×100

도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 세포 독성이 없음을 확인하였다.

실험예 3. 지방전구세포의 지방세포로의 분화에 미치는 영향 검증

상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물 및, 상기 실시예 2에서 수득한 아테미시닌 및 디히드로아테미시닌이 지방전구세포의 지방세포로의 분화에 미치는 영향 을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

3-1. TG 축적 억제 효능 측정

3T3-L1 세포를 48 웰 플레이트에 웰 당 2×10⁴개의 농도로 분주한 뒤 24시간 뒤에 세포가 충분히 찼는지 확인하고 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 분화 유도 배지는 DMEM(10% FBS, 0.1% Antibiotics, 0.1% insulin, 1 μM Dexamethasone, 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methyl xanthine)을 이용하였으며, 총 7일간 실시하였다. 이때, 배지에 상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물(0.1, 1, 10 μg/mL), 또는 상기 실시예 2에서 수득한 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌(0.1, 0.2, 0.3 μM)을 농도별로 처리하였다. 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 3.7% 포르말린(PBS에 용해)에 2분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 2회 세척하고 Oil red O 용액을 첨가한 후, 1시간동안 방치하였다. 이를 PBS로 2번 세척한 뒤, 현미경으로 TG 가 염색된 것을 관찰하였으며, 염색된 세포를 건조시킨 뒤 4% Nonidet P-40을 200 μL첨가하여 Oil red O 용액을 녹여낸 뒤, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥 추출물 및 아테미시닌은 농도의존적으로 세포 내 중성지질의 축적을 감소시켰으며, 디히드로아테미시닌은 저농도에서 세포 내 중성지질의 축적을 감소시키는 것을 확인하였다.

3-2. C/EBPα와 PPARγ 발현 측정

3T3-L1 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 농도로 분주한 뒤, 24 시간 뒤에 세포가 90%이상 찼는지 확인하고 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 분화 유도 배지는 DMEM(10%FBS, 0.1% antibiotics, 0.1% insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methyl xanthine)을 이용하였으며, 총 8일간 실시하였다. 이때, 배지에 상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물(0.1, 1, 10 μg/mL), 또는 상기 실시예 2에서 수득한 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌(0.1, 0.2, 0.3 μM)을 농도별로 처리하였다. 8일 뒤 세포를 수집한 후, Protein assay kit(Bio-rad, CA, USA)를 이용하여 세포 내 단백질을 정량하였다. 50 μg의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gell electrophoresis)로 분리한 다음, PVDF 멤브레인(Polyvinylidene fluoridel pore size 0.45μm, Millipore)으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 1% BSA를 함유한 TBS/T(tris buffered saline-Tween; 200 nM Tris, 1.37 M NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween20)로 1시간동안 블락킹하였다. 그 후 C/EBPα와 PPARγ에 대한 1차 항체와 함께 밤새 반응시킨 후, 2차 항체인 항-래빗 IgG를 이용하여 4시간 동안 반응시켰다. 각 반응 사이에 TBS/T(tris-buffered saline)로 20분씩 3회 세척하였다. 각 항체에 대한 단백질 밴드는 HRP(horse radish peroxidase) 활성에 의하여 형광을 나타내는 supersignal west pico chemiluminescent substrate(Pierce, Pockford, IL, USA)를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 지방세포로의 분화를 촉진하는 역할을 한다고 알려진 세포 내 C/EBPα와 PPARγ의 단백질 발현을 감소시키며, PPARγ의 핵 내 이동을 저해시킴을 확인하였다.

실험예 4. 비만 동물모델에서의 항비만 효과 검증

상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물의 비만 동물모델에서 항비만 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 4주령된 C57BL/6J 수컷 마우스를 Z 배열법에 따라 군간 체중을 고르게 분리하였다. 정상군(Control)은 일반식이를 급여하였으며, 고지방식이군(HFD)은 고지방식이를 14주간 급여하였다. 실험군에는 고지방식이와 함께 상기 실시예 1에서 수득한 개똥쑥 추출물을 10g/kg 또는 30g/kg의 농도로 매일 투여하였다.

4-1. 체중 및 사료 섭취량 측정

14주동안 매주 1회 체중과 사료섭취량을 측정하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥 추출물을 투여한 군에서는 고지방식이군에 비해 고지방식이 급여에 의한 체중 증가가 억제되었으며, 사료 섭취량에는 큰 영향이 없음을 확인하였다.

4-2. 부위별 지방 무게 측정

실험 종료 후, 각 마우스를 희생시킨 후, 견갑골지방, 피하지방, 신장주변지방, 부고환주변지방, 신장후복부지방, 장간막지방을 적출하여 무게를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥 추출물을 투여한 군에서는 고지방식이군에 비해 피하지방과 신장후복부지방이 감소하였으며, 특히, 개똥쑥 추출물을 30g/kg diet로 투여한 군에서는 견갑골지방, 피하지방, 신장주변지방, 부고환주변지방, 신장후복부지방 및 장간막지방의 무게가 정상군과 유사한 수준으로 낮아지는 것을 확인하였다.

4-3. 혈중 HDL-콜레스테롤 측정

실험 종료 후, 각 마우스의 혈액을 수집하고, 원심분리를 통해 혈청을 분리하였다. 혈청 내 혈중 HDL-콜레스테롤을 측정하기 위하여, 아산세트 HDL-CHO (아산제약주식회사, 경기도, Korea)를 사용하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥 추출물을 투여한 군에서는 고지방식이군에 비해 혈중 HDL-콜레스테롤이 증가함을 확인하였다.

4-4. 혈중 간 손상 지표 측정

혈중 간 손상 정도를 측정하기 위하여, 혈청 transaminase 측정용 시약 (아산제약주식회사, 경기도, Korea)을 사용하여, 혈중 AST(aspartate transaminase) 및 ALT(alanine transaminase)를 측정하였다. 이 때 시료 사용량은 1/10로 줄여 수행하였다. 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥 추출물을 투여한 군에서는 고지방식이군에 비해 혈중 AST 및 ALT 수치가 감소함을 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

2. 정제의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

3. 캡슐제의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

4. 주사제의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO42H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

5. 액제의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 제제의 제조

1. 건강식품의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

개똥쑥 추출물, 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌은 개똥쑥 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 삭제
6. 아테미시닌 또는 디히드로아테미시닌을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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