KR102043056B1 - 상지 추출물을 함유하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상지 에탄올 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물 에 관한 것이다.

Description

상지 추출물을 함유하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물{Food Composition for Preventing or Improving Obesity Including Extracts from Ramulus mori}

본 발명은 상지 추출물을 함유하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지 소비와 섭취의 불균형으로 인해 다량의 지방이 축적되는 것이다. 비만은 단순히 체중 증가뿐 아니라 당뇨, 뇌졸증, 관절염과 같은 대사질환의 원인이 되기도 한다. 전세계적으로 과체중 혹은 비만 인구는 급속도로 증가하고 있으며 이에 따라 다이어트 제품의 공급과 수요가 증가하고있다. 다이어트 약 중에서 orlistat와 sibutramine은 FDA에서 승인 받은 제품으로 지방분해요소를 억제하거나 세로토닌의 재흡수를 억제하여 다이어트 효과를 갖는다. 그러나 이러한 약들을 장기간 복용하였을 시, 위장장애, 설사, 불면증과 같은 부작용이 수반되며 이러한 한계점 극복을 위해 부작용과 의존성이 적은 천연원료를 기반으로 한 항비만보조제의 필요성이 증가하고있다.

비만은 몇 가지 기작에 의해 발생한다. 지방이 축적되는 과정은 크게 지방세포 분화과정(adipogenesis)과 지방 합성과정(lipogenesis)으로 구분된다. 지방세포는 초과된 에너지를 TG (triglyceride)형태로 저장할 수 있는 세포로 이 세포의 분화율은 비만과 매우 밀접한 관련이 있다. 이 과정에 직접적으로 관여하는 전사인자는 PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein alpha)과 SREBP-1 (sterol regulatory element-binding protein1)이다. 특히 SREBP-1은 지방세포 분화뿐 아니라, FAS (fatty acid synthase), ACC (acetyl-CoA carboxylase), SCD-1 (stearoyl-CoA desaturase1)와 같은 지방합성에 관여하는 인자들의 발현을 조절함으로써 지방산과 중성지방의 합성에도 관여한다.

지방세포분화와 지방합성은 지방전구세포의 증식과 분화, 지방산 합성과정 사이에서 상호적으로 발생한다. 지방축적률은 지방합성과 지방분해과정 (lipolysis) 사이의 균형에 의해 결정된다. ATGL (adipose tissue triglyceride lipase)와 HSL (hormone sensitive lipase) 같은 효소는 TG를 지방산과 글리세롤로 분해하는 중요한 효소이다. ATGL과 달리 HSL은 Ser-563자리가 인산화되며 활성을 나타내게 된다.

식물추출물은 안전함과 개발비용상의 유리함으로 인해 최근 건강기능성식품 원료로 각광받고 있다. 주로 동아시아에서 서식하는 뽕나무는 예로부터 식재료 혹은 민간요법으로 사용되던 재료이다. 뽕나무를 원료로 진행된 대다수의 실험들은 열매와 잎을 기반으로 진행되었다.

이에 본 발명자들은 뽕나무의 가지(상지)를 대상으로 연구를 계속하여 비만 개선 또는 예방에 효과가 있는 최적의 함량을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제1837477호

본 발명의 목적은 1일 유효량의 상지 에탄올 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상지 에탄올 추출물을 이용한 식품 조성물 제조방법에 대한 것이다.

본 발명은 상지 에탄올 추출물 8 내지 32 mg/kg을 1일 기준 유효량으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

"상지(Ramulus mori)"는 뽕나무 가지를 말하며, 식품 원료로 등재된 물질로서 장기간 또는 다량으로 사용하여도 부작용(예: 간독성)이 없으며, 본 발명의 상지 에탄올 추출물을 함유하는 조성물은, 경구로 섭취하더라도 지방 축적 억제 또는 지방세포 분화 억제 효과를 충분히 달성할 수 있고, 지방 분해 효과도 있다.

특히, 본 발명의 식품 조성물은 상지 에탄올 추출물을 1일 기준 유효량으로 8 내지 32 mg/kg을 포함하는데, 이는 매우 저농도의 함유량이다. 따라서 본 발명의 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물은 경제성도 가지고 있다.

상기 1일 기준 유효량은, 하기 실시예에 기재된 것과 같은 동물 실험 및 임상 시험을 통해 도출된 최적의 함유량이다. 하기 실시예를 보면, 동물 실험 시 50 mg/kg/day와 100 mg/kg/day 섭취군에서 매우 우수한 효과가 나타났다. 그리고 이를 인체에 적용하는 경우, 이 기술분야에 알려진 계산식에 따라, 8 내지 32 mg/kg, 바람직하게는 8 내지 25 mg/kg. 더욱 바람직하게는 8 내지 20 mg/kg, 더더욱 바람직하게는 8 내지 16 mg/kg의 유효량을 가질 수 있다.

상기 1일 기준 유효량이 8 mg/kg 미만인 경우에는 체중 감소 효과가 미미하며, 32 mg/kg을 초과하는 경우에는 식품 조성물 제조의 경제성이 떨어지는 문제점이 발생할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 조성물이 지방세포 분화 및 지방 합성을 억제하고, 그리고 지방 분해를 촉진하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 상지 에탄올 추출물은 상기 추출물 전체 중량 대비 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol, OXY)을 2 내지 20 중량% 함유할 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 체중 감소 또는 체중 증가 억제 효과가 잘 나타나지 않을 수도 있다.

뽕나무 가지 추출물에 함유되어 있는 유효 물질 중 하나인 옥시레스베라트롤은 하기 화학식 I로 표시되며, 식물이 외부의 스트레스에 반응해 분비하는 물질로 4개의 수산기를 갖고 있다.

[화학식 I]

본 발명에서는 옥시레스베라트롤을 유효 물질로 갖는 상지(뽕나무 가지) 에탄올 추출물 (ethanol extract of R. mori, ERMO)이 지방세포 분화를 억제하고 지방합성을 억제하고 또는 지방분해를 촉진하는 것을 동물 실험을 통해 확인하였다.

일 구체예에서, 상기 조성물이 음료, 환, 과립, 정제 및 캡슐로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 경구용 식품 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서, 상기 식품 조성물은 본 발명의 상지 에탄올 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다.

다른 측면에서 본 발명은, 상지 에탄올 추출물 100 내지 2000 mg을 식용 원료와 혼합하는 단계를 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제조 방법을 제공한다.

상기 상지 에탄올 추출물 100 내지 200O mg은 앞서 언급한 1일 기준 유효량을 포함하여 식품으로 제조하기 적합한 양을 의미한다. 상기 범위를 벗어나는 경우 체중 감소 효과가 미미하거나 식품 제조의 경제성이 떨어지는 단점이 있다.

상기 식품 조성물에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100중량부당 0.01 ~ 0.04중량부, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03중량부의 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.

상기 이 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100중량부당 0.01 ~ 0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

다른 측면에서 본 발명은 상지 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물로, 상기 상지 에탄올 추출물이 1회당 480 내지 2000 mg의 양으로 섭취되는 것일 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 비만 개선 및/또는 비만 예방 효과를 나타내는 상지 에탄올 추출물의 1일 기준 유효량은 8 내지 32 mg/kg이고, 이를 일반 성인의 섭취량으로 환산하는 경우, 1회당 480 내지 2000 mg/kg 범위 내에서 섭취하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 1회당 480 내지 960mg/kg, 더더욱 바람직하게는 1회당 560 내지 1120 mg/kg일 수 있다.

본 발명에 따른 상지 에탄올 추출물 1일 기준 유효량을 포함하는 식품 조성물은 비만 개선 및/또는 비만 예방 효과를 제공한다. 또한 저농도의 상지 에탄올 추출물을 포함하므로 고가의 비용을 지불하지 않고도 항비만 조성물을 제조할 수 있다.

도 1은 상지 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 상지 에탄올 추출물의 세포독성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상지 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방세포의 mRNA 발현에 미치는 영향을 qPCR (quantitative real-time PCR)로 분석한 그래프이다.
도 4는 고지방 식이(high fat diet, HFD)로 비만이 유도된 마우스 사진이다: (a) 음성 대조군; (b) HFD 단독; (c) HFD 및ERMO20; (d) HFD 및 ERMO50; (e) HFD 및 ERMO100; (f) HFD 및 orlistat.
도 5는 상지 에탄올 추출물이 부고환지방 무게 및 간 무게에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 각 그룹의 WAT (white adipose tissue)와 간 모양을 나타낸 것이다. (a) 양성 대조군; (b) HFD 단독; (c) HFD 및 ERMO20; (d) HFD 및 ERMO50; (e) HFD 및 ERMO100; (f) HFD 및 orlistat. (B, C)는 간과 지방 조직의 무게를 나타낸 것이다.
도 6은 상지 에탄올 추출물이 고지방 식이로 비만이 유도된 마우스의 간 조직에서 지방 축적 억제 효과가 있음을 보여주는 것이다. (A)는 오일 레드 O 염색으로 관찰된 간 지방 방울이다 (200Х 배율). (B)는 염색된 지방 방울의 세기를 측정하여 지방 축적을 정량화한 그래프이다. (a) 양성 대조군; (b) HFD 단독; (c) HFD 및 ERMO20; (d) HFD 및 ERMO50; (e) HFD 및 ERMO100; (f) HFD 및 orlistat.
도 7은 상지 에탄올 추출물이 고지방 식이로 비만이 유도된 마우스의 mRNA 발현에 미치는 영향을 qPCR (quantitative real-time PCR)로 분석한 그래프이다.
도 8은 상지 에탄올 추출물이 비만 유도 마우스의 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다(A). 상지 에탄올 추출물은 지방세포분화 단백질((B) PPARγ, (C) C/EBPα, (D) SREBP-1) 의 발현을 억제하였다.
도 9는 상지 에탄올 추출물이 비만 유도 마우스의 지방합성 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다(A). 상지 에탄올 추출물은 p-ACC/ACC (B)를 증가시키고, 지방합성 관련 단백질 ((C)FAS, (D) SCD-1) 을 억제하였다.
도 10은 상지 에탄올 추출물이 비만 유도 마우스의 지방분해 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다(A). 상지 에탄올 추출물은 지방분해 관련 단백질((B) ATGL, (C) HSL) 발현을 증가시켰다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1: 재료

세포배양을 위해 HyClone사에서 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 icillin/streptomycin (P/S)를 구입하여 사용하였다. Bovine calf serum(BCS)는 Welgene에서 구입하였으며, Insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), orlistat는 sigma에서, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)시약은 Ameresco에서 구입하였다.

1-2: 세포배양 및 세포 분화

3T3-L1 지방전구세포는(CL-173)는 ATCC에서 구입하였다. 세포는 10% BCS, 1% P/S가 포함된 배지에서 배양되었으며 배양환경은 37℃, 5%의 이산화탄소가 유지되었다.

세포의 컨플루언시(confluency)가 꽉 차고 이틀 후 (Day0), 5μg/ml insulin, 1

dexamethasone, 0.5mM IBMX, 10% FBS가 포함된 분화 유도 배지로 교체되었다. Day2부터는 5 μg/ml insulin, 10% FBS만이 포함된 배지로 교체되었으며 이틀에 한번 새 배지로 교체하며 8일간 배양하였다. 8일 후, 분화된 세포에 세 가지 농도의 ERMO를 이틀간 처리하였으며 ERMO는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 사용하였다. 세포에 처리되는 DMSO의 최종 농도는 약 0.05%이다.

1-3: 상지 에탄올 추출물 준비

충남 광천에서 수확한 뽕나무 가지 (상지)는 55°C 에서 3일간 건조되었다. 건조된 샘플 1 kg은 잘게 잘라 씻어준 후 8L의 70% 에탄올에서 60°C에서 12시간 추출되었다. 추출된 샘플은 필터를 통해 걸려지고 회전감압기를 이용하여 500 ml로 농축되었다. 농축된 추출물은 -80°C에서 동결된 후 동결건조기를 이용하여 건조되었고, 최종적으로 30g의 상지 에탄올 추출물(ERMO)을 얻었다.

1-4: HPLC 분석

ERMO의 옥시레스베라트롤은 HPLC를 이용하여 측정되었다. 상지주정 추출액 내의 옥시레스베라트롤은 HPLC(YL9100 HPLC system, 영린기기)를 이용하여 분석하였다(표 1). 분석 조건으로 컬럼은 Luna C₁₈ (5 μm, 4.6×250 mm, Phenomenex, USA), 컬럼 온도는 35℃, 자외선 검출 파장은 325 nm, 유속은 0.7 mL/min, 샘플 주입량은 100 μL로 30분 동안 분석하였다. 이동상은 CH₃CN(A):10 mM H3PO4(B) 10:90(v/v)을 시작으로 하여 10분까지 A:B=25:75(v/v), 30분까지 A:B=50:50(v/v)의 기울기 조건으로 수행하였다.

[표 1]

표준물질 용액은 다음과 같이 제조하였다. 옥시레스베라트롤의 직선성, 검출한계, 정량한계를 확인하기 위하여 10 mg 옥시레스베라트롤을 CH₃CN:10 mM H3PO4=35:65 (v/v) 용매 100 mL에 녹여 100 μg/mL 농도로 제조하였다. 제조된 표준용액을 2배씩 희석하여 1.56-50 μg/mL의 옥시레스베라트롤 용액을 만들었다. 그 후 0.2 μm PTFE syringe filter (Chromafil O-20/15 MS, Macherey-Nagel, USA)로 여과하여 HPLC를 수행하였다.

HPLC에 의한 상지의 옥시레스베라트롤 함량 분석은 다음과 같이 수행하였다. 상지주정 추출액은 HPLC 분석은 CH₃CN:10 mM H₃PO₄=35:65 (v/v) 용매로 10배 희석한 후 수행하였다. 즉, 상지주정 추출액 1 mL에 상기용매 9 mL 첨가하여 10배 희석한 후, 0.2 μm PTFE syringe filter (Chromafil O-20/15 MS, Macherey-Nagel, USA)로 여과 후 HPLC를 수행하였다. 상지내의 옥시레스베라트롤 함량은 다음 식에 의해 계산하였다.

그 결과, 약 14.5 중량%의 옥시레스베라트롤이 포함됨을 확인하였다(도 1).

1-5: 세포 생존능 테스트

ERMO가 3T3-L1 지방전구세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하지 위해 MTT 분석을 수행하였다. 3T3-L1 지방전구세포는 1Х10⁵ cells/ml의 농도로 96웰 플레이트에 시딩되었다. 그 후 분화 유도를 통해 분화된 세포에 10-40 μg/ml농도의 ERMO와 음성대조군으로 0.05%의 DMSO를 처리 후 2일 간 배양하였다. 2일 후, FBS가 포함되지 않고 0.5mg/ml의 MTT 시약이 포함된 배지로 교체한 후 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지는 버리고 생성된 포르마잔(formazan)을 녹이기 위해 DMSO 100 μl를 분주하여 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 음성대조군 대비 퍼센트로 표기하였다.

1-6: 정량 리얼타임 PCR

mRNA분석을 위해 지방전구세포는 1Х10⁵ cells/ml의 농도로 6웰 플레이트에 시딩되었다. 음성대조군을 제외하고 모든 세포들은 분화가 유도되었다. 분화가 유도된 세포에는 세가지 농도의 ERMO 혹은 0.05%의 DMSO가 양성대조군으로 2일 간 처리되었다 이 샘플에서 RNA는 AccuZol ^™ Total RNA Extraction Reagent 을 이용하여 추출되었다. 추출된 RNA는 NanoDrop을 이용하여 정량한 후, 각 샘플들의 양을 동일하게 맞춰주었다. cDNA conversion은 총 1000ng의 RNA를 이용하여 진행하였으며 RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit를 사용하였다. PCR분석에 사용된 프라이머는 Bioneer에서 구입하였으며 서열은 밑에 첨부한 표와 같다 (표 2). qPCR은 StepOnePlus^™ Real-Time PCR 시스템을 사용하여 진행하였다. 분석 방법은 다음과 같다: 95 ℃로 10분 간 예열 후 95℃에서 15초, 60℃에서 15초, 72℃에서 30 초 (40cycles). 상대적인 mRNA발현량은 ΔΔCt method를 이용하여 측정하였고 레퍼런스 유전자로는 β-actin을 사용하였다.

[표 2]

1-7: 동물 실험

동물실험에서는 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스가 사용되었다. 일주일의 적응 기간 후, 여섯 마리씩 랜덤으로 각 그룹의 케이지로 구분하였다. 시료는 DMSO에 녹여 최종적으로 14% DMSO가 되도록 생리식염수와 혼합하여 각 마리당 100 μl를 투여하였다. 대조군 그룹Ⅰ: 비만을 유도하지 않은 음성대조군), 모델 그룹 Ⅱ: 고지방식이로 비만 유도(HFD) + 비히클(14% DMSO 함유 생리식염수)만 투여한 양성대조군, ERMO 그룹 Ⅲ: 비만유도 + 20 mg/kg/day 의 ERMO (ERMO20), ERMO 그룹 Ⅳ: 비만유도 + 50 mg/kg/day 의 ERMO (ERMO50), ERMO 그룹 Ⅴ: 비만유도 + 100 mg/kg/day 의 ERMO (ERMO100), Orlistat 그룹 Ⅵ: 비만유도 + 10 mg/kg/day 의 Orlistat. 사육 환경은 22±1℃, 55%의 습도, 12시간 간격의 점등으로 엄격히 유지되었다. 모든 실험은 고려대학교 동물실험 윤리위원회의 허가하에 진행되었다(Approval No. KUIACUC-2018-11). 비만 유도를 위해 음성대조군을 제외한 모든 마우스들은 6주 간 고지방식이가 공급되었고, 7주 간 각 그룹에 해당하는 실험 물질을 경구투여 하였다. 정상 식이와 고지방 식이의 조성을 밑에 제공된 표에 나타내었다(표 3. 식이 섭취량과 체중은 매주 한번씩 측정하였으며 식이효율 (FER)은 다음과 같은 공식을 통해 계산되었다. FER = [체중 (g/day) / 식이섭취율 (g/day)].

[표 3]

1-8: 혈청 분석 및 조직 준비

실험 종료 전 실험동물들은 24시간 금식하였으며 아이소플루란 흡입을 통해 희생되었다. 혈액은 심장 채혈을 통해 수집하였으며 3000g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 내 TG (Triglyceride), TC (total cholesterol), HDL (high density lipoprotein cholesterol), GOT (glutamic oxaloacetic transaminase), GPT (glutamic pyruvic transaminase) 수치가 FUJI DRI-CHEM 4000i instrument 와 FUJI DRY-CHEM 슬라이드를 통해 측정되었다. LDL (Low density lipoprotein cholesterol)은 Frieldwann 방정식(LDL = [TC - (HDL + (TG/5))공식에 따라 계산되었다. 간과 부고환지방은 채취 즉시 세척하여 무게를 측정하였고 분석 전 까지 -80℃ 에 보관되었다.

1-9: 오일 레드 O 염색

오일 레드 O 염색은 간 내 지방축적률을 측정하기 위해 수행되었다. Korea Clinic for Clinic Pathology에 의뢰하여 진행하였으며 간단한 과정은 다음과 같다. 10% 포르말린에 고정된 간 조직은 액체질소를 이용해 급속 동결되어 박절되었다. 잘린 조직 (약5 μm) 슬라이드는 1% Oil red O 염색약으로 10분 간 염색되었으며, 핵은 헤마톡실린(hematoxylin) 염색약으로 염색되었다. 염색 후에는 두 번 세척하였고, 간 내 축적된 지방은 현미경의 통해 200배 확대하여 관찰되었다.

1-10: 정량 리얼타임 PCR

700ml의 AccuZol™ Total RNA Extraction Reagent를 20mg의 부고환지방에 첨가하여 균질화하였다 (Taco? Prep Bead beater 사용). 이후 과정은 세포에서 진행한 PCR 실험법과 동일하게 진행되었다.

1-11: 웨스턴 블랏 분석

단백질 추출을 위해 각 그룹의 부고환지방 샘플을 동량 채취하여 750 μl의 pro-prep protein extraction solution을 넣어주었다. 세포용해 유도를 위해 샘플은 20분간 아이스에서 배양되었다. 용해된 세포는 13000rpm에서 10분 간 원심분리 되었으며 오직 투명한 단백질 층만 취하여 새 튜브에 옮겨주었다. 완벽한 단백질 추출을 위해 이와 같은 과정을 2번 반복하였다. 단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 정량 하였으며, 실험에는 총 30 μg의 단백질이 사용되었다. 이 단백질 샘플은 99℃ 에서 10분 간 변성된 후 10% SDS-gel의 각 well에 로딩되었다. 전기영동을 통해 크기별로 분리된 단백질은 PVDF (polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼되었다. 비특이적인 단백질-항체 결합을 막기 위해 5% 비지방 스킴 밀크를 이용하여 상온에서 1시간 동안 블락킹 과정을 진행하였다. 멤브레인으로 옮겨진 단백질은 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS-T에 희석된 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응되었다. β-actin (1:5,000 dilution)은 대조군으로 사용되었다. PPARγ은 1:1,000, C/EBPα 1:500, SREBP-1 1:1,000, ATGL 1:1,000 희석, HSL 1:1,000, p-HSL 1:1000, ACC 1:500, p-ACC 1:500, FAS 1:1000, SCD-1 1:1000 비율로 희석하여 사용하였다. 1차 반응 후, PBS-T를 이용하여 세번 세척하고 약 1시간 동안 2차항체와 반응시켰다. 1:10000 비율로 희석한, 효소(horseradish peroxidase) 결합 Goat anti-mouse IgG (H+L) 항체는 anti-β-actin, anti-C/EBPα, anti-SREBP-1 확인을 위해 사용되었으며, 1:2000으로 희석된 효소(horseradish peroxidase) 결합 Goat anti-rabbit IgG (H+L) 항체는 항- PPARγ, 항 -ATGL, 항 -HSL, 항 -p-HSL, 항 -ACC, 항 -p-ACC, 항 -SCD-1 확인을 위한 이차항체로 사용되었다. 2차항체와의 반응 종료 후 다시 한번 PBS-T를 이용하여 세척 후 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate kit를 이용하여 이미지화 하였다. 단백질 밴드의 정량은 image J software를 통해 진행되었다.

1-12: 통계 분석

모든 실험들은 독립적으로 세번 진행되었다. 시험관 내 실험결과 값은 mean ± standard deviation (SD)로, 동물실험 결과 값은 mean ± standard error mean (SEM)로 표기하였다. 결과의 유의미한 차이를 평가하기 위해 SPSS프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석 (ANOVA)하였다. 사후분석은 Fisher's least significant difference (LSD)법을 사용하였으며 p값이 0.05 보다 작을 때, 유의하다고 판단하였다.

실시예 2: 세포 독성

다양한 농도의 ERMO를 분화된 3T3-L1세포에 처리하였을 때 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 세포생존율은 음성대조군과 비교하여 %로 계산하였다. 10, 20, 30 그리고 40 μg/ml의 ERMO를 처리하였을 때, 세포생존율은 각각 99.30 ± 2.04%, 98.41 ± 1.06%, 99.52 ± 1.49%, 98.02 ±1.75% 였다(도 2). 모든 농도에서 유의한 차이는 보이지 않았고, 이를 통해 실험에서 사용된 ERMO가 독성을 갖지 않음을 알 수 있다.

실시예 3: 상지 에탄올 추출물의 비만 억제 효과

3-1: 비만 관련 유전자 발현 확인

항비만 효과를 확인하기 위해 분화된 3T3-L1세포에서 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1, ACC, FAS, SCD-1, ATGL, HSL 의 mRNA발현량을 분석하였다. PPARγ, C/EBPα, 및 SREBP-1의 경우, 모델 그룹의 mRNA발현량은 음성대조군에 비해 유의하게 증가하였으며 10, 20, 40 μg/mL의 ERMO를 처리하였을 때 발현량이 농도의존적으로 감소하였다. 세포에ERMO (10, 20, 40 μg/mL) 처리 시 음성대조군과 비교하여, PPARγ 발현량은 각각 0.96, 0.78, 그리고0.50, C/EBPα 의 발현량은 각각0.92, 0.88, 그리고 0.71, SREBP-1 의 발현량은 각각 0.92, 0.70, 그리고 0.4으로 감소하였다. 지방합성대사에 관여하는 유전자들 역시 이와 비슷한 경향을 보였다 (도 3A, B, C).

대조군 그룹과 비교하여 10, 20, 40 μg/mL 농도의 ERMO를 처리하였을 때, ACC 의 발현량은 각각 0.78, 0.65, 0.38, FAS 은 각각 0.96, 0.85, 0.62, SCD-1 은 각각 0.84, 0.69, 0.43으로 감소하였다(도 2D, E, F). 반면, 지방분해관련 유전자들은 10, 20, 40 μg/mL 농도의 ERMO를 처리 하였을 때, 대조군 그룹에 비해 유의하게 증가하였다. ATGL 의 발현량은 각각 1.04, 1.16, 1.30, HSL 은 1.26, 1.43, 1.50으로 증가하였다 (도 3G, F).

3-2: 상지 에탄올 추출물의 체중 및 식이효율(Food efficiency ratio, FER)

실험이 진행된 14주 간, 매주 체중 변화를 기록하였다. 모델 그룹의 체중은 대조군 그룹에 비해 유의하게 증가하였다. 그러나, ERMO 혹은 Orlistat를 처리한 그룹은 모델 그룹에 비해 유의하게 체중이 감소하였다(도 4). 20, 50, 100 mg/kg/day 의 ERMO 와 orlistat (10 mg/kg/day) 를 경구 투여한 그룹의 체중은 모델 그룹 대비 각각 17.2%, 21.6%, 27.3%, 그리고 21.6% 감소하였다. 그룹간 식이 섭취량에는 유의한 차이가 없었으며 식이 섭취량과 체중을 통해 계산한 식이효율 (FER)의 경우 대조군 그룹에 비해 모델 그룹에서 유의하게 높은 것을 확인하였다. 이것은 고지방식이에 의해 체중이 증가하였음을 알 수 있다. 식이 효율은 ERMO와 orlistat를 처리하였을 때 약간 감소하였으며, 특히 ERMO50, ERMO100과 orlistat을 처리한 그룹은 모델 그룹보다 유의하게 수치가 감소하였다 (표 4). 이 결과를 통해 ERMO 가 고지방식이로 의해 유도된 체중증가를 억제해 준다는 것을 알 수 있다.

[표 4]

3-3: 상지 에탄올 추출물의 지방 축적 억제 효과

ERMO가 지방 축적에 미치는 영향을 확인하기 위해 실험 동물 희생 후 간 과 부고환지방을 적출하여 무게를 측정하였다. 모델 그룹의 부고환지방의 무게는 대조군 그룹에 비해 유의하게 증가하였으며 ERMO20을 제외한 나머지 ERMO, orlistat 처리그룹에서 유의하게 감소되었다.

간 무게 역시 대조군 그룹에 비해 모델 그룹에서 유의하게 증가하였고, 모든 농도의 ERMO처리 그룹과 orlistat처리 그룹에서 유의하게 감소하였다 (도 5). 특히 ERMO100 처리 그룹에서 가장 감소하였다.

3-4: 상지 에탄올 추출물의 혈청 지방 감소

고지방식이로 비만을 유도한 그룹의 Serum 내 TC, TG 수치는 대조군그룹에 비해 각각 1.5, 1.3배 증가하였다 (표 5). 증가된 TC 와 TG 수치는 ERMO 처리그룹에서 농도의존적으로 감소하였으며 orlistat 처리 그룹 역시 수치가 감소되었으며, ERMO20 그룹을 제외하고 모두 유의미한 감소였다. 특히 100 mg/kg 의 ERMO 처리그룹의 TC, TG 수치는 모델 그룹대비 21.6%, 33.4% 감소하였다. 모델 그룹의 HDL수치는 감소하고 LDL 수치는 증가하였다. ERMO-, orlistat처리 그룹의 HDL과 LDL 수치는 대조군그룹의 수치 값으로 회복하려는 경향을 보였다.

ERMO와 orlistat 가 갖는 독성을 평가하기 위해, GPT, GOT 수치를 측정하였다. GOT의 경우, 오직 orlistat처리 그룹만이 유의하게 높은 수치를 보였다. GPT 수치는 모델그룹과 orlistat 처리 그룹에서 다른 그룹에 비해 유의하게 높게 측정되었다 (표 5).

[표 5]

3-5: 상지 에탄올 추출물의 간 지방 축적 억제 효과

간 내 지방 축적률을 비교하기 위해 오일 레드 O 염색을 진행하였다. 모델 그룹의 지방축적률은 대조군 그룹에 비해 유의하게 높았으며 ERMO 처리 시 농도 의존적으로 지방축적률이 감소함을 확인하였다. 특히 ERMO100그룹과 orlistat그룹은 모델그룹 대비 각각 54%, 48% 감소하였다 (도 6).

3-6: 상지 에탄올 추출물의 비만 동물 모델에서 비만 관련 유전자 발현 억제 효과

ERMO가 고지방식이로 비만을 유도한 모델에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 그룹의 동물모델의 부고환지방에서 mRNA를 추출하였다. 지방세포분화에 관여하는 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1 의 경우, 모델그룹에서의 발현량은 대조군 그룹에 비해 유의하게 증가하였으며 모델그룹의 발현량을 1로 두었을 때, ERMO20-, ERMO50-, 및 ERMO100 처리 그룹은 PPARγ 의 경우 각각 0.68, 0.38, 0.23; C/EBPα 의 경우 각각 0.63, 0.52, 0.43; SREBP-1 의 경우 각각0.77, 0.55, 0.32으로 감소하였다. Orlistat처리 그룹의 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1 의 수치는 각각 0.22, 0.48, 0.27으로 감소하였다 (도 7A, B, C). 지방합성과정에 관여하는 유전자들도 비슷한 경향을 보였다. ERMO20, ERMO50, ERMO100 처리 시 ACC의 수치는 각각 모델그룹 대비1.06, 0.71, 0.54였으며 FAS의 수치는1.11, 0.76, 0.40; SCD-1 의 수치는 각각 0.94, 0.67, 0.34으로 감소하였다. Orlistat 처리 시ACC, FAS, SCD-1 의 수치는 모델그룹대비 각각 0.50, 0.49, 0.43이였다(도 7D, E, F). 반면, 지방분해관련 인자들은 ERMO20-, ERMO50-, -ERMO100-, orlistat-처리그룹에서 모델 그룹에 비해 수치가 증가하였다. ATGL의 수치는 ERMO20-, ERMO50-, -ERMO100-, orlistat를 처리하였을 때 각각 1.88, 2.22, 2.74, 1.84; HSL 의 수치는 2.08, 3.86, 4.73, 3.20 로 증가하였다 (도 7G, H).

3-7: 상지 에탄올 추출물의 비만 동물 모델에서 비만 관련 단백질 발현 억제 효과

ERMO가 지질대사에 관여하는 단백질에 미치는 영향을 확인하기 위해 부고환지방에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 분석을 진행하였다. 지방분화에 참여하는 단백질 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1의 발현은 대조군 그룹에 비해 모델 그룹에서 유의하게 증가하였으며 ERMO처리 시 단백질 발현량이 농도의존적으로 감소하였다. 모델 그룹의 단백질 발현량을 1로 둘 때 PPARγ 의 단백질 발현량은 각각 0.77, 0.62, 0.44 로 감소하였다. C/EBPα은 각각 0.96, 0.77, 0.59; SREBP-1는 각각 0.78, 0.61, 0.46 로 감소하였다. 약을 처리한 그룹의 각 타겟은 각각 0.58, 0.67, 0.61로 감소하였다 (도 8). 지방합성에 관여하는 단백질들의 발현은 모델 그룹과 비교하여, p-ACC/ACC 값은 ERMO20-, ERMO50-, ERMO100-, 그리고 orlistat 처리 그룹에서 각각 1.61, 1.96, 2.81, 2.45으로 증가하였다. FAS 의 경우, ERMO20-, ERMO50-, ERMO100-, 그리고 orlistat 처리 그룹에서 각각 0.75, 0.62, 0.54, 0.59 로 감소하였다. SCD-1 역시 ERMO20-, ERMO50-, ERMO100-, 그리고 orlistat처리 그룹에서 각각 0.85, 0.71, 0.65, 0.76로 감소하였다 (도 9). 지방분해에 관여하는 두 효소 ATGL 과 HSL 은 ERMO와 Orlistat 처리 시 그 활성이 모델 그룹에 비해 증가하였다. Orlistat의 효과는 ERMO보다 좋지 않았지만 모델 그룹에 비해 수치가 증가 하였다. ATGL 의 발현량은 ERMO20-, ERMO50-, ERMO100-, 그리고 orlistat 처리 그룹에서 각각 1.13, 1.50, 1.97, 1.67으로 증가하였으며, p-HSL/HSL 수치도 ERMO20-, ERMO50-, ERMO100-, 그리고 orlistat처리 그룹에서 각각 1.12, 1.32, 1.61, 그리고 1.58 로 증가하였다 (도 10). 특히 ERMO100 그룹의 효과가 매우 좋았다.

실시예 4 : 동물 독성 시험

상지 에탄올 추출물의 단회투여 독성 및 개략적인 치사량을 조사하기 위하여, SD 암수 rat를 사용하여 시험물질을 단회 경구투여하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다. 표 6을 보면, 모든 시험군의 실험동물에서 특이한 일반증상 및 사망동물은 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아 상지주정추출물의 LD50은 5,000 mg/kg 이상인 것으로 사료된다. 또한 사람에게 적용할 경우 안전계수 100으로 나눌 수 있고, 이 경우 50 mg/kg을 사람이 안전하게 섭취할 수 있음을 의미한다.

[표 6]

실시예 5: 식품 제조

하기 표 7과 같이 시험 제품을 제조하였다.

[표 7]

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 상지 에탄올 추출물은 지방세포 분화, 지방합성을 억제하고, 그리고 지방분해를 촉진함을 알 수 있다. 특히 상지 에탄올 추출물의 동물 실험 결과 및 임상 시험을 통해 식품 제조에 필요한 최적 함유량을 알 수 있었다.

Claims (7)

1. 55℃에서 건조된 상지를 70% 에탄올로 12시간 추출한 상지 에탄올 추출물 8 내지 16 mg/kg을 1일 기준 유효량으로 포함하고,
   상기 상지 에탄올 추출물은 상기 추출물 전체 중량 대비 옥시레스베라트롤을 14.5 내지 20 중량% 함유하는 것인 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물이 지방세포 분화 및 지방 합성을 억제하고, 그리고 지방 분해를 촉진하는 것인, 식품 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물이 음료, 환, 과립, 정제 및 캡슐로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 경구용 식품 조성물의 형태로 제조되는 것인, 식품 조성물.
   
5. 삭제
6. 55℃에서 건조된 상지를 70% 에탄올로 12시간 추출한 상지 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물로,
   상기 에탄올 추출물은 상기 추출물 전체 중량 대비 옥시레스베라트롤을 14.5 내지 20 중량%를 함유하고,
   상기 상지 에탄올 추출물이 1일 기준으로 480 내지 960 mg의 양으로 섭취되는 것인, 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
7. 삭제

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